KR20020066776A - Formulation for oral delivery of insulin and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인슐린 (insulin)의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물, 유화제, 유기용매, 인슐린 및 산성 수용액으로 이루어지는 인슐린의 경구투여용 액상 및 분말제형을 제조함으로써, 종래에 비해 인슐린의 제형 내 봉입율 및 생체효율성이 우수하며, 경구투여가 가능하여 편리성이 향상된 인슐린의 경구투여용 제형과 그의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a formulation for oral administration of insulin and a method for preparing the same, and more particularly, a liquid for oral administration of insulin consisting of a monoglyceride compound, an emulsifier, an organic solvent, insulin and an acidic aqueous solution. And by preparing a powder formulation, compared to the prior art in the dosage and bioefficiency of the dosage form, and oral administration is possible to improve the convenience of oral dosage form of insulin and the preparation method thereof.
지질을 매개체로 한 약물전달체계는 원료 물질이 생체 적합성이므로 널리 활용되고 있다.Drug delivery systems using lipids are widely used because the raw materials are biocompatible.
일반적으로, 지질을 매개체로 한 약물 제형은 에멀젼이나 리포좀이 있다. 이 중 에멀젼 제형은 유화제를 이용하여 지방 유제 기제를 물에 분산시킨 제형으로서, 특히 수중유화형 (oil/water형) 에멀젼은 난용성 약물을 지방 유제 기제에 용해시켜 가용화시킬 수 있다. 또한, 리포좀 제형은 지질 이중막으로 이루어진 구형의 지질 소낭 (vesicle)들로 이루어져 있으며, 난용성 약물은 지질 이중막 소낭 안에 존재하고 이들 지질 이중막 소낭이 물에 용해되어 난용성 약물의 가용화가 이루어진다.In general, lipid-mediated drug formulations are emulsions or liposomes. Among them, the emulsion formulation is a formulation in which the fat emulsion base is dispersed in water using an emulsifier, and in particular, an oil / water emulsion can be solubilized by dissolving poorly soluble drugs in the fat emulsion base. In addition, the liposome formulation consists of spherical lipid vesicles consisting of lipid bilayers, and poorly soluble drugs are present in the lipid bilayer vesicles and these lipid bilayer vesicles are dissolved in water to solubilize poorly soluble drugs. .
한편, 지질을 이용한 제형에는 상기 두 가지 대표적인 제형 이외에도 1990년대 초 스웨덴 과학자들에 의해 개발된 큐보좀TM(CubosomeTM)이란 제형이 있다. 큐보좀TM제형은 모노글리세라이드 (monoglyceride)에 물을 가하면 자발적으로 형성되는 안정한 입방상 (cubic phase) 구조체를 유화제를 이용하여 물에 분산시킨 것이다 [미국 특허 제5,531,925호].On the other hand, formulations using lipid has the above two exemplary formulations in addition to the bit kyubo developed by the early 1990's Swedish scientists TM (Cubosome TM) is formulated. The cubosome TM formulation is a dispersion of a stable cubic phase structure which spontaneously forms when water is added to monoglyceride in water using an emulsifier (US Pat. No. 5,531,925).
큐보좀TM입자의 내부는 입방상을 이루는 3차원적 망상 구조 (network structure)로 되어 있는데, 유상과 수상이 각각 연속적인 3차원적 통로로 구성되어 있고 유상과 수상 통로의 경계면에 비교적 넓은 면적의 중간층 (interface)이 존재한다.Cubosome TM particles have a cubic three-dimensional network structure, consisting of a continuous three-dimensional passage of oil and water, each of which has a relatively large area at the interface between the oil and the water passages. There is an interface.
따라서 기존의 에멀젼 제형이나 리포좀 제형이 각각 지용성 또는 수용성 약물의 가용화만 가능했던데 반해, 큐보좀TM제형은 지용성, 수용성 약물 뿐만 아니라 양쪽성 약물까지 포함하여 보다 다양한 종류의 약물을 봉입하여 가용화시킬 수 있는 잇점이 있다.Thus, while conventional emulsion formulations or liposome formulations were only able to solubilize fat-soluble or water-soluble drugs, cubosome TM formulations could be encapsulated and solubilized in a wider variety of drugs including fat-soluble and water-soluble drugs as well as amphoteric drugs. There is an advantage.
큐보좀TM은 먼저 모노글리세라이드에 물과 유화제를 가하여 입방상의 점성이 강한 액상을 형성시키고 이것을 물에 분산시켜 제조하는데, 물에 분산시 큐보좀TM은 수 ㎛ 정도의 평균 입자 크기를 가지며 유화제의 비율이 높을 경우에는 1 ㎛ 이하의 입자 크기를 가질 수도 있다. 그러나, 약물의 가용화를 위해서는 좀더 미세한 큐보좀 입자를 얻어야 하므로 초음파 분쇄 (sonication), 미세유동화 (microfluidization), 균질화 (homogenization) 등의 방법을 통해 입방상의 점성이 강한 액상을 미세하게 분산시킨다.Cubosome TM is prepared by first adding water and emulsifier to monoglyceride to form a viscous viscous liquid and dispersing it in water. When dispersed in water, cubosome TM has an average particle size of several μm and If the ratio is high, it may have a particle size of 1 μm or less. However, in order to solubilize the drug, finer cubosome particles have to be obtained, and thus, the cubic viscous liquid is finely dispersed through ultrasonication, microfluidization, and homogenization.
상기와 같이, 기계적 도움을 받아 미세입자를 만들면 그 과정에 수반되는 고에너지 및 고온으로 인해 제형의 구성 성분이나 봉입된 물질이 물리화학적으로 불안정해지며, 초음파 분쇄시 공기와 격렬히 섞이게 되므로 구성 성분의 가수분해, 산화 등이 일어나는 문제점이 있다. 또한, 초음파 분쇄 등에 의해 균일한 작은 입자를 가진 분산액이 제조되어도 약 한달 정도의 시간이 경과하면 분산계가 불안정해지면서 입자의 응집 (aggregation)에 의해 상분리가 일어나는 문제점이 있다.As described above, when the microparticles are made with mechanical help, the high energy and high temperature accompanying the process make the components or encapsulated materials of the formulation physicochemically unstable, and are mixed violently with air during ultrasonic grinding. Hydrolysis, oxidation, etc. occur. In addition, even if a dispersion having uniform small particles is produced by ultrasonic grinding or the like, after about a month, the dispersion system becomes unstable and phase separation occurs due to aggregation of particles.
이와 같이, 큐보좀 제형은 종래 제형에 비해 향상된 특성을 가지면서도 제조시 미세입자로 만들기가 어려우며, 또한 만들어진 미세 입자는 안정성이 낮아 보관시 문제점이 있으므로 실제 약물을 가용화하는 제형으로는 제품화되지 못하고 있는 실정이다.As such, cubosome formulations have improved properties compared to conventional formulations, but are difficult to make into microparticles during manufacture, and the resulting microparticles have low stability and have problems in storage, so they are not commercialized as formulations that solubilize actual drugs. It is true.
한편, 생리활성 물질인 펩타이드와 단백질은 작은 분자량의 화합물로 이루어진 약물에 비해 특이적인 약리활성 기능 (specific function)을 가진 치료약물(therapeutics)이다.On the other hand, peptides and proteins, which are bioactive substances, are therapeutic agents having specific pharmacologically active functions (therapeutics) compared to drugs composed of small molecular weight compounds.
그러나, 단백질은 위장관 내에서 단백질 분해효소 (protease)에 의해 분해되어 아미노산 형태로 흡수되기 때문에 단백질의 약리적 효과를 기대할 수 없다. 또한, 약리활성을 갖는 단백질을 주사제로 이용하는 경우에도 제거율 (clearance rate)이 높아서 자주 주사를 해야하는 등 약물의 투여방법에 많은 문제가 있다.However, since the protein is digested by the protease in the gastrointestinal tract and absorbed in the amino acid form, the pharmacological effect of the protein cannot be expected. In addition, even when a protein having pharmacological activity is used as an injection, there are many problems in the method of administering the drug, such as high clearance rate and frequent injection.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 다양한 약물 전달 체계 (drug delivery system)에 대한 연구가 진행되고 있다. 이 중 시클로스포린 (cyclosporin)은 펩타이드 약물 중 유일하게 경구용 제제의 개발에 성공한 경우이다. 시클로스포린이 시판되는 제형은 크레모포어 (Cremophor) 에멀젼 (emulsion)의 예비 농축제 (pre-concentrate) 형태로서 물에 분산시켜 자발적으로 형성된 마이크로에멀젼 (microemulsion)이다 (미국 특허 제5,438,072호). 그러나, 시클로스포린을 제외하고는 현재 경구용으로 판매되고 있는 펩타이드 또는 단백질 제제는 없는 실정이다.In order to solve the above problems, research on various drug delivery systems (drug delivery system) is in progress. Among these, cyclosporin is the only case of successful development of oral preparations among peptide drugs. A commercial formulation of cyclosporine is a microemulsion spontaneously formed by dispersing in water as a pre-concentrate form of a Cremophor emulsion (US Pat. No. 5,438,072). However, there are no peptide or protein preparations currently being sold for oral except cyclosporin.
이는 펩타이드 또는 단백질의 봉입이 어렵고, 봉입이 된다고 하여도 봉입과정 또는 저장 중에 변성 (denaturation)이 쉽게 일어나 제제로서의 약리학적 효과가 감소되기 때문이다.This is because the encapsulation of the peptide or protein is difficult, and even if encapsulated, denaturation occurs easily during encapsulation or storage, thereby reducing the pharmacological effect as an agent.
인슐린 (insulin)은 인슐린 당뇨병 환자에게는 일생동안 투여해야 하는 약물로서, 현재까지 주로 피하주사에 의해 환자에게 투여되고 있다. 만약, 인슐린을 경구로 투여할 수 있다면 당뇨병의 치료에 획기적인 혁명적 진보를 가져올 것이다. 이에 따라 많은 세계적 제약회사와 연구팀들이 경구용 인슐린 제형을 개발하기 위해 많은 노력을 기울여 왔다. 그러나, 위장관 내에 인슐린 흡수의 한계점 때문에 경구용 인슐린 제형의 개발은 아직 초기 단계에 머무르고 있는 실정이다. 또한, 인슐린과 같은 치료적 펩타이드는 장내의 단백질 분해효소 (protease)에 의해 빠르게 분해되어 약물의 흡수 및 약리적 활성이 저하되는 문제가 있다.Insulin is a drug that should be administered to a diabetic patient for a lifetime. To date, insulin has been mainly administered to the patient by subcutaneous injection. If insulin could be administered orally, it would be a revolutionary breakthrough in the treatment of diabetes. As a result, many global pharmaceutical companies and research teams have made great efforts to develop oral insulin formulations. However, the development of oral insulin formulations is still in its infancy due to the limitations of insulin absorption in the gastrointestinal tract. In addition, therapeutic peptides, such as insulin, are rapidly degraded by the intestinal protease, which lowers the absorption and pharmacological activity of the drug.
이러한 문제점을 극복하기 위하여, 다양한 방법으로 인슐린을 보호하는 방법이 개발되었다. 예컨대, 인슐린을 리포좀 (liposome) 또는 고분자 마이크로스피어 (polymeric microsphere)에 봉입하여 투여하거나, 또는 단백질 분해효소 저해제 (protease inhibitor)를 함께 투여하여 인슐린의 분해를 억제하는 방법 등이 이용되고 있다.To overcome this problem, various methods of protecting insulin have been developed. For example, a method of encapsulating insulin in liposomes or polymeric microspheres or by administering a protease inhibitor together with a protease inhibitor is used.
그러나, 인슐린의 봉입에 사용되는 리포좀 등은 약물의 봉입효율이 낮고, 봉입과정 중 인슐린이 분해되는 등의 문제점으로 인하여 경구투여 시 그 효과가 미미한 단점이 있다.However, liposomes used for encapsulation of insulin have a disadvantage that the effect of the oral administration is insignificant due to low encapsulation efficiency of the drug and decomposing insulin during encapsulation.
또한, 단백질 분해효소 저해제를 병용 투여하는 경우에는 타 단백질의 분해도 억제되므로 이로 인한 부작용이 너무 심하기 때문에 임상적용이 현실적으로 어렵다.In addition, when the protease inhibitor is administered in combination, the degradation of other proteins is also suppressed, so the side effects are so severe that the clinical application is difficult.
이 외에도, 인슐린의 흡수를 높이기 위하여 장내 흡수 촉진제 (absorption enhancer)를 사용하는 방법이 있으나, 이때 사용되는 흡수 촉진제에 의한 부작용 역시 심각하다. 또한, 인슐린과 같은 단백질 약물의 장내 투과를 돕기 위하여 단백질의 접힘 (folding) 상태를 용해된 구체 (molten globule, MG)로 변화시켜 장내 투과성을 높이고자 한 노력도 있었다.In addition, there is a method of using an intestinal absorption enhancer to increase the absorption of insulin, but side effects caused by the absorption promoter used at this time are also serious. In addition, efforts have been made to increase the intestinal permeability by changing the folding state of the protein to molten globule (MG) in order to assist intestinal permeation of protein drugs such as insulin.
이와 같은 다양한 시도에도 불구하고 경구투여용 인슐린 제형은 현재까지 연구 초기 단계에 머물고 있으며, 실용화되기까지는 아직 요원한 실정이다.Despite these various attempts, oral insulin formulations are still in the early stages of research and are still far from practical use.
이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들이 발명한 대한민국 특허출원 제2000-12465호에서는 모노글리세라이드 (monoglyceride), 유화제 (emulsifier) 및 유기용매로 구성된 약물의 가용화용 조성물을 개발한 바 있다.In order to solve this problem, Korean Patent Application No. 2000-12465, which was invented by the present inventors, has developed a composition for solubilizing a drug composed of a monoglyceride, an emulsifier, and an organic solvent.
상기 가용화용 조성물은 여러 가지 물질, 특히 난용성 물질 및 양쪽성 물질 모두를 효과적으로 가용화시키는 것을 특징으로 하는데, 이 조성물은 물에 혼합한 후 흔들어 주거나 볼텍스 (vortex)하면 평균 입자의 크기가 500 nm 이하인 입자의 분산액을 쉽게 형성한다. 상기 가용화용 조성물은 약물의 분자량 및 극성에 따라 정도의 차이가 있지만 대부분의 약물을 높은 효율로 봉입한다. 하지만, 인슐린의 경우는 난용성 약물과 달리 상기 가용화용 조성물에 용해되지 않아 제제화에 어려움이 있으며, 인슐린은 모노글리세라이드 또는 유기용매와 혼합되지 않으므로 상기 가용화용 조성물과 혼합할 경우 석출되어 침전물을 형성하는 문제점이 제기되어 왔다.The solubilizing composition is characterized in that it effectively solubilizes a variety of materials, especially poorly soluble and amphoteric, which is mixed with water and shaken or vortexed to have an average particle size of 500 nm or less. Easily form dispersions of particles. The solubilizing composition has a degree of difference depending on the molecular weight and polarity of the drug, but most drugs are encapsulated with high efficiency. However, in the case of insulin, unlike poorly soluble drugs, it is difficult to be formulated because it is not dissolved in the composition for solubilization. Since insulin is not mixed with a monoglyceride or an organic solvent, it precipitates to form a precipitate when mixed with the composition for solubilization. The problem has been raised.
이와 같이, 종래의 큐보좀TM입자의 분산계는 안정성에서 문제가 있으며, 대한민국 특허출원 제2000-12465호의 발명은 난용성 물질은 쉽게 용해시키는 반면, 인슐린의 경우에는 용해되지 않고 입자형태로 응집물이 부유되므로 단일상을 이루지 못하는 문제점을 지니고 있어 인슐린을 효과적으로 제형에 봉입시키기 위한 제형의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.As described above, the conventional dispersion system of cubosome TM particles has a problem in stability, and the invention of Korean Patent Application No. 2000-12465 easily dissolves a poorly soluble substance, while in the case of insulin, it does not dissolve but floats aggregates in the form of particles. Therefore, there is a problem in that it does not form a single phase, so the development of a formulation for effectively encapsulating insulin in a formulation is urgently required.
따라서, 본 발명은 종래의 상기와 같은 문제점을 개선하기 위하여 연구 노력한 결과, 모노글리세라이드계 화합물, 유화제, 유기용매, 인슐린 및 산성 수용액을 이용하여 인슐린을 봉입한 경구투여용 제형을 제조함으로써, 본 발명에 따른 인슐린 함유 경구투여용 제형을 물과 혼합한 후 가볍게 흔들어 주는 최소한의 기계적 도움으로도 쉽게 분산되어 500 ㎚ 이하의 입자 분산액을 형성할 뿐 아니라, 이와 같은 분산과정 중에서도 인슐린의 봉입율이 매우 우수한 인슐린의 경구투여용 제형 및 그 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.Therefore, the present invention, as a result of research efforts to improve the problems as described above, by preparing a dosage form for oral administration of insulin using a monoglyceride compound, an emulsifier, an organic solvent, insulin and an acidic aqueous solution, After mixing the insulin-containing oral dosage form according to the invention with water and then gently shaking it with minimal mechanical assistance, it easily disperses to form a particle dispersion of 500 nm or less, and the encapsulation rate of insulin is very high even during this dispersion process. An object of the present invention is to provide an excellent dosage form for oral administration of insulin and a method of preparing the same.
도 1은 인슐린 (insulin)을 함유한 액상제형을 정상 수컷 랫트의 꼬리 정맥에 주사한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,1 is a graph measuring the relative blood glucose levels after injecting a liquid formulation containing insulin into the tail vein of a normal male rat,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액-●-; Dispersion of Insulin-Free Liquid Formulations of the Invention
- ○ - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린 (인슐린 농도 3 U/kg)-○-; Insulin dissolved in phosphate buffer (PBS) (insulin concentration 3 U / kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 3 U/kg)-▼-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 3 U / kg)
도 2는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 당뇨가 유발된 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,Figure 2 is a graph measuring the relative blood glucose levels after oral administration of a liquid formulation containing insulin of the present invention to a male rat induced diabetes.
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액-●-; Dispersion of Insulin-Free Liquid Formulations of the Invention
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 100 U/kg)-○-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 100 U / kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 50 U/kg)-▼-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 50 U / kg)
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 30 U/kg)-▽-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 30 U / kg)
도 3은 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상의 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,Figure 3 is a graph measuring the relative blood glucose levels after oral administration of a liquid formulation containing insulin of the present invention to normal male rats,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액-●-; Dispersion of Insulin-Free Liquid Formulations of the Invention
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 100 U/kg)-○-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 100 U / kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 50 U/kg)-▼-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 50 U / kg)
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 농도 30 U/kg)-▽-; Insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention (insulin concentration 30 U / kg)
도 4는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상 수컷 랫트에 경구투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,Figure 4 is a graph measuring the relative blood glucose levels after oral administration of a liquid formulation containing the insulin of the present invention to a normal male rat,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액-●-; Dispersion of Insulin-Free Liquid Formulations of the Invention
- ○ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 투여량 30 U/㎏)-○-; Dispersion of Insulin-Containing Liquid Formulation of the Invention (Insulin Dose 30 U / kg)
- ▼ - ; 본 발명의 올레산 (oleic acid)과 인슐린 함유 액상제형의 분산액 (인슐린 투여량 30 U/㎏)-▼-; Dispersion of oleic acid and insulin-containing liquid formulation of the present invention (insulin dose 30 U / kg)
도 5는 본 발명의 인슐린을 함유한 액상제형의 분산액을 정상 수컷 랫트의 십이지장 내 투여한 후 상대적 혈당치를 측정한 그래프이고,Figure 5 is a graph measuring the relative blood glucose levels after administration of the liquid formulation containing the insulin of the present invention in the duodenum of normal male rats,
- ● - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액-●-; Dispersion of Insulin-Free Liquid Formulations of the Invention
- ○ - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린 (인슐린 투여량 100 U/㎏)-○-; Insulin dissolved in phosphate buffer (PBS) (insulin dose 100 U / kg)
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 비함유 액상제형의 분산액과 인슐린 용액을 혼합한 혼합액-▼-; Mixed solution of the dispersion and insulin solution of the insulin-free liquid formulation of the present invention
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 인산염 완충용액 (PBS)에 분산시킨 분산액 (인슐린 투여량 100 U/㎏)-▽-; Dispersion obtained by dispersing the insulin-containing liquid formulation of the present invention in phosphate buffer solution (PBS) (insulin dose 100 U / kg)
- ■ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 담즙산에 분산시킨 분산액 (인슐린 투여량 100 U/㎏)-■-; Dispersion obtained by dispersing the insulin-containing liquid formulation of the present invention in bile acids (insulin dose 100 U / kg)
도 6은 인슐린을 함유한 액상제형의 약물 방출 속도를 나타낸 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the drug release rate of the liquid formulation containing insulin.
- ● - ; 인산염 완충용액 (PBS)에 용해된 인슐린-●-; Insulin dissolved in phosphate buffer (PBS)
- ○ - ; 종래 기술로 제조된 인슐린 함유 큐보좀TM(cubosomeTM) 제형-○-; Some containing the insulin produced by the prior art kyubo TM (cubosome TM) formulation
- ▼ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 물에 분산시킨 분산액-▼-; Dispersion obtained by dispersing the insulin-containing liquid formulation of the present invention in water
- ▽ - ; 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 담즙산 용액에 분산시킨 분산액-▽-; A dispersion in which the insulin-containing liquid formulation of the present invention is dispersed in a bile acid solution
본 발명은 유효성분으로서 인슐린 (insulin) 0.01 ∼ 20 중량%과 1 종 이상의 모노글리세라이드 (monoglyceride)계 화합물 9 ∼ 90 중량%, 1 종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 산성 수용액 0.01 ∼ 10 중량%, 유기용매 1 ∼ 90 중량% 및 첨가제 0 ∼ 5 중량%로 이루어지는 인슐린 경구투여용 액상제형을 그 특징으로 한다.The present invention is an active ingredient of 0.01 to 20% by weight of insulin, 9 to 90% by weight of one or more monoglyceride compounds, 0.01 to 90% by weight of one or more emulsifiers, and 0.01 to 10% by weight of an acidic aqueous solution. And liquid formulation for oral administration of insulin, which comprises 1 to 90% by weight of an organic solvent and 0 to 5% by weight of an additive.
본 발명은 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계; 상기 1단계에 산성 수용액을 소량 가하여 pH를 산성으로 조정하는 2단계; 상기 2단계에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가한 후 교반하여 완전히 용해시키는 3단계;상기 3단계에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 구성되는 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.The present invention comprises one step of dissolving at least one emulsifier in at least one organic solvent; Adding a small amount of an acidic aqueous solution to the first step to adjust the pH to an acid; Adding the insulin powder as an active ingredient in the second step, followed by stirring to completely dissolve it; four steps of preparing a viscous composition by adding one or more monoglyceride compounds to the third step; And a five step of removing the highly volatile organic solvent from the four-step viscous composition.
본 발명은 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계; 산성 수용액을 준비하여 여기에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가하여 용해시키는 2단계; 상기 1단계의 용액과 2단계의 용액을 혼합시키는 3단계; 상기 3단계의 혼합용액에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계;로 구성되는 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.The present invention comprises one step of dissolving at least one emulsifier in at least one organic solvent; Preparing an acidic aqueous solution and dissolving it by adding insulin powder as an active ingredient thereto; 3 steps of mixing the solution of the first step and the solution of the second step; Adding at least one monoglyceride compound to the mixed solution of step 3 to prepare a viscous composition; And 5 steps of removing the highly volatile organic solvent from the viscous composition of 4 steps.
본 발명은 상기 인슐린 경구투여용 액상제형을 0 ∼ 30% (w/v)의 동결건조 보호제와 함께 동결건조한 인슐린 경구투여용 분말제형을 또 다른 특징으로 한다.The present invention is another feature of the oral dosage form of insulin orally administered insulin lyophilized with 0 to 30% (w / v) lyophilized protective agent of the liquid dosage form for insulin oral administration.
본 발명은 또한, 상기 인슐린을 포함하는 액상제형을 물에 분산시켜 분산액을 제조하는 1단계; 및 상기 1단계의 분산액에 선택적으로 동결건조 보호제를 첨가하여 동결건조시키는 2단계;로 구성되는 인슐린 경구투여용 분말제형의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.The present invention also comprises the steps of preparing a dispersion by dispersing the liquid formulation containing the insulin in water; And two steps of lyophilizing by selectively adding a lyophilized protective agent to the dispersion of the first step.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Referring to the present invention in more detail as follows.
본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형은 유효성분으로서 인슐린 (insulin) 0.01 ∼ 20 중량%과 1 종 이상의 모노글리세라이드 (monoglyceride)계화합물 9 ∼ 90 중량%, 1 종 이상의 유화제 0.01 ∼ 90 중량%, 산성 수용액 0.01 ∼ 10 중량%, 유기용매 1 ∼ 90 중량% 및 첨가제 0 ∼ 5 중량%로 이루어진다.The liquid dosage form for oral administration of insulin according to the present invention includes 0.01 to 20% by weight of insulin, 9 to 90% by weight of one or more monoglyceride compounds, and 0.01 to 90% by weight of one or more emulsifiers. And 0.01 to 10% by weight of an acidic aqueous solution, 1 to 90% by weight of an organic solvent, and 0 to 5% by weight of an additive.
유효성분으로 사용되는 인슐린으로는 소 췌장 인슐린 (bovine pancreatic insulin), 인간 (human), 인간 재조합 (human recombinant), 돼지 췌장 (porcine pancreatic), arg-인슐린 (arg-insulin), 인슐린-바이오틴 (insulin-biotin), 인슐린-FITC (insulin-FITC), 리스프로 (LysPro, 미국 Eli Lilly), 폴리에틸렌 글리콜-인슐린 (polyethylene glycol-insulin, PEG-insulin) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 20 중량%가 바람직하다.Insulins used as active ingredients include bovine pancreatic insulin, human, human recombinant, porcine pancreatic, arg-insulin, and insulin-biotin. -biotin), insulin-FITC (insulin-FITC), LisPro (Elli Lilly, USA), polyethylene glycol-insulin (PEG-insulin) is preferred, and it is preferred to use As for content, 0.01-20 weight% is preferable.
상기 모노글리세라이드계 화합물은 포화 또는 불포화된 C10∼ C22인 모노글리세라이드계 화합물 중에서 1 종 이상 선택하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 9 ∼ 90 중량%가 바람직하다. 모노글리세라이드계 화합물로는 모노올레인 (Monoolein), 모노팔미톨레인 (Monopalmitolein), 모노미리스톨레인 (Monomyristolein), 모노일레이딘 (Monoelaidin) 및 모노이루이신 (Monoerucin)으로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 모노올레인이 좋다.The monoglyceride compound is one or more selected from saturated or unsaturated C 10 to C 22 monoglyceride compounds, the content of which is preferably 9 to 90% by weight in the entire liquid formulation. Monoglyceride-based compounds are selected from the group consisting of monooolein (Monoolein), monopalmititolein (Monopalmitolein), monomyristoleine (Monomyristolein), monoeilaidin (Monoelaidin) and monoirucine (Monoerucin) Preferably, more preferably monoolein.
유화제로는 인지질, 스핑고지질 (sphingolipid), 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제 및 담즙산 (bile acid) 중에서 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 90중량%가 바람직하다.The emulsifier is preferably selected from phospholipids, sphingolipids, nonionic surfactants, anionic surfactants, cationic surfactants and bile acids. The content of the emulsifier is 0.01 to 90 weight% is preferable.
상기 유화제로 사용되는 인지질로는 포스파티딜콜린 (Phosphatidyl Choline) 유도체, 포스파티딜에탄올아민 (Phosphatidyl ethanolamine) 유도체, 포스파티딜세린 (Phosphatidyl serine) 유도체, 친수성 고분자가 결합된 지질 (polymeric lipid)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.Phospholipids used as emulsifiers include those selected from the group consisting of phosphatidyl choline derivatives, phosphatidyl ethanolamine derivatives, phosphatidyl serine derivatives, and hydrophilic polymer-bound lipids. It is preferable.
상기 유화제로 사용되는 스핑고지질로는 세라마이드계 (ceramides), 세레브로사이드계 (cerebroside), 스핑고마이엘린계 (sphingomyelins)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.As the sphingolipid used as the emulsifier, it is preferable to use one selected from the group consisting of ceramides, cerebrosides, and sphingomyelins.
상기 유화제로 사용되는 비이온성 계면 활성제로는 폴록사머 (Poloxamer; Pluronic; 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체), 솔비탄 에스테르 (Sorbitan esters; Span), 폴리옥시에틸렌 솔비탄 (polyoxyethylene sorbitans; Tween), 폴리옥시에틸렌 에테르 (polyoxy ehtylene ethers; Brij)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.Nonionic surfactants used as emulsifiers include poloxamer (Pluronic; polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer), sorbitan esters (Span), polyoxyethylene sorbitans (Tween) Preference is given to using those selected from the group consisting of polyoxy ethylene ethers (Brij).
상기 유화제로 사용되는 음이온성 계면 활성제로는 포스파티딜세린 유도체, 포스파티딘산 (Phosphatidic acid) 유도체, 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.As the anionic surfactant used as the emulsifier, it is preferable to use one selected from the group consisting of phosphatidylserine derivatives, phosphatitidic acid derivatives and sodium dodecyl sulfate (SDS).
상기 유화제로 사용되는 양이온성 계면 활성제로는 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄 프로판 (1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane), 디메틸디옥타데실암모늄 클로라이드 (dimethyldioctadecylammonium chloride), N-[1-(1,2-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (N-[1-Cationic surfactants used as the emulsifier include 1,2-dioleyl-3-trimethylammonium propane, dimethyldioctadecylammonium chloride, N- [ 1- (1,2-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride (N- [1-
(1,2-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride), 1,2-디올레일-3-에틸포스포콜린 (1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine), 3β-[N-[(N',(1,2-dioleyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium chloride), 1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine (1,2-dioleyl-3-ethylphosphocholine), 3β- [N- [(N ',
N'-디메틸아미노)에탄]카바모일]콜레스테롤 (3β-[N-[(N',N'-dimethylaminoN'-dimethylamino) ethane] carbamoyl] cholesterol (3β- [N-[(N ', N'-dimethylamino)
)ethan)carbamoyl]chloresterol)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.Preference is given to using those selected from the group consisting of ethan) carbamoyl] chloresterol).
상기 유화제로 사용되는 담즙산으로는 콜린산 (cholic acid)과 그의 염 및 유도체, 데옥시콜린산 (Deoxycholic acid)과 그의 염 및 유도체, 리토콜린산 (Lithocholic acid)과 그의 염 및 유도체, 체노콜린산 (Chenocholic acid)과 그의 염 및 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하다.The bile acids used as emulsifiers include cholic acid and salts and derivatives thereof, deoxycholic acid and salts and derivatives thereof, lithocholic acid and salts and derivatives thereof and chenocholic acid. Preference is given to using those selected from the group consisting of (Chenocholic acid), salts and derivatives thereof.
산성 수용액으로는 염산, 인산, 탄산 수용액 또는 이들의 혼합용액 을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 0.01 ∼ 10 중량%가 바람직하다. 만일, 산성 수용액을 사용하지 않고 중성 또는 염기성 수용액을 사용하면 인슐린이 응집(aggregate)하여 제형에 용해되지 않는 문제가 발생한다.As the acidic aqueous solution, it is preferable to use hydrochloric acid, phosphoric acid, carbonic acid aqueous solution or a mixed solution thereof, and its content is preferably 0.01 to 10% by weight in the entire liquid formulation. If a neutral or basic aqueous solution is used without using an acidic aqueous solution, a problem arises in that the insulin does not aggregate and dissolve in the formulation.
또한 유기용매로는 알코올, 에틸렌글리콜 (ethylene glycol), 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜 (Polyethylene glycol), 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide) 및 이들의 혼합 용매로 구성된 군으로부터 선택된 것을 사용하는 것이 바람직하며, 전체 액상제형 중에 그 함유량은 1 ∼ 90 중량%가 바람직하다.In addition, it is preferable to use an organic solvent selected from the group consisting of alcohol, ethylene glycol, propylene glycol, polyethylene glycol, dimethylsulfoxide and mixed solvents thereof. As for the content in all liquid formulation, 1 to 90 weight% is preferable.
또한, 상기 액상제형에는 지방산, 지방산의 에스테르류, 지방산의 알코올류 등과 같은 통상적으로 사용 가능한 첨가제를 0 ∼ 5 중량% 함유시킬 수 있다.In addition, the liquid formulation may contain 0 to 5% by weight of commonly available additives such as fatty acids, esters of fatty acids, alcohols of fatty acids and the like.
본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법은The preparation method of the liquid dosage form for oral administration of insulin according to the present invention
1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;1) one step of dissolving at least one emulsifier in at least one organic solvent;
2) 상기 1단계에 산성 수용액을 소량 가하여 pH를 산성으로 조정하는 2단계;2) adjusting the pH to acid by adding a small amount of an acidic aqueous solution to the first step;
3) 상기 2단계에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가한 후 교반하여 완전히 용해시키는 3단계;3) adding the insulin powder as an active ingredient in the second step, followed by stirring to dissolve completely;
4) 상기 3단계에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및4) 4 steps of preparing a viscous composition by adding at least one monoglyceride compound to the 3 step; And
5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 이루어진다.5) 5 steps of removing the highly volatile organic solvent from the 4 steps of viscous composition.
또한, 본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형은 상기 방법의 일부공정순서만 달리하여서도 제조할 수 있는 바, 예컨대 상기 방법의 2단계와 3단계에서 인슐린 분말의 용해와 첨가순서만 달리하여 제조할 수 있는 바, 그 구체적인 방법으로는In addition, the liquid oral dosage form for insulin oral administration according to the present invention can be prepared even by changing only a partial process sequence of the method, for example, prepared by changing only the dissolution and addition order of insulin powder in steps 2 and 3 of the method. I can do that,
1) 1 종 이상의 유화제를 1 종 이상의 유기용매에 용해시키는 1단계;1) one step of dissolving at least one emulsifier in at least one organic solvent;
2) 산성 수용액을 준비하여 여기에 유효성분으로서 인슐린 분말을 첨가하여 용해시키는 2단계;2) preparing an acidic aqueous solution and dissolving it by adding insulin powder as an active ingredient thereto;
3) 상기 1단계의 용액과 2단계의 용액을 혼합시키는 3단계;3) three steps of mixing the solution of step 1 and the solution of step 2;
4) 상기 3단계의 혼합용액에 1 종 이상의 모노글리세라이드계 화합물을 가하여 점성의 조성물을 제조하는 4단계; 및4) four steps of preparing a viscous composition by adding at least one monoglyceride compound to the mixed solution of the three steps; And
5) 4단계의 점성의 조성물로부터 휘발성이 강한 유기용매를 제거하는 5단계로 이루어진다.5) 5 steps of removing the highly volatile organic solvent from the 4 steps of viscous composition.
이와같이, 본 발명에 따른 인슐린 경구투여용 액상제형의 제조방법은 상기 각 제조 단계의 순서와 방법을 약간씩 변형하여도 동일한 목적물을 제조할 수 있다.As described above, the method for preparing oral liquid insulin dosage form according to the present invention can produce the same target product even if the order and method of each preparation step are slightly modified.
또한, 본 발명에서는 상기 액상제형을 0 ∼ 30% (w/v)의 동결건조 보호제와 함께 동결건조하여 제조되는 인슐린 경구투여용 분말제형을 제공한다.In addition, the present invention provides a powder formulation for oral administration of insulin prepared by lyophilizing the liquid formulation with 0 to 30% (w / v) lyophilized protective agent.
구체적으로 상기 분말제형의 제조방법은Specifically, the preparation method of the powder formulation
1) 상기 인슐린을 포함하는 액상제형을 과량의 물에 분산시키는 1 단계; 및1) dispersing the liquid formulation containing the insulin in excess water; And
2) 상기 단계 1의 분산액에 선택적으로 동결건조 보호제를 첨가하여 동결건조시키는 2 단계;로 이루어진다.2) lyophilizing by selectively adding a lyophilized protective agent to the dispersion of step 1;
동결건조시 제형 내 성분의 변성을 방지하기 위하여 동결건조 보호제 (cryoprotectant)를 사용할 수도 있으며, 상기 액상제형에 대해 0 ∼ 30% (w/v) 첨가하는 것이 바람직하다. 동결건조 보호제로는 만니톨 (mannitol) 또는 트리할로오즈 (trehalose) 등의 당류, 아르기닌 (arginine) 등의 아미노산류, 알부민 등의 단백질류를 사용하는 것이 바람직하다.A lyophilizer may be used to prevent denaturation of components in the formulation during lyophilization, and 0 to 30% (w / v) is preferably added to the liquid formulation. As the lyophilized protective agent, sugars such as mannitol or trihalose, amino acids such as arginine, and proteins such as albumin are preferably used.
본 발명에 의한 상기 액상 및 분말제형은 손으로 흔들어 주는 등의 최소한의 기계적 도움에 의해 쉽게 물에 분산시킬 수 있으며, 분산계를 형성하는 입자의 크기는 일반적으로 200 ㎚ 정도이며, 유화제나 약물의 성질에 따라 500 ㎚ 이하로 형성되어 종래에 비해 매우 작은 크기를 형성할 수 있다. 특히, 입자의 형성시 가혹한 기계적 힘을 가할 필요가 없으므로 입자의 구성 성분이나 약물이 변성되는것을 방지할 수 있다.The liquid and powder formulations according to the present invention can be easily dispersed in water with minimal mechanical assistance such as shaking by hand, and the size of the particles forming the dispersion system is generally about 200 nm, and the properties of the emulsifier or drug As a result it is formed to 500 nm or less can form a very small size compared to the conventional. In particular, since it is not necessary to apply harsh mechanical forces in the formation of the particles, it is possible to prevent the component or drug of the particles from being denatured.
또한, 본 발명에 의한 제형은 상온 이하에서 밀봉하여 장기간 동안 안정하게 보관할 수 있으며, 사용하기 전에 물을 첨가하여 분산액을 제조할 수 있으므로 제형의 특성이 변하지 않고 상분리 현상 또한 일어나지 않는다. 특히 장기 보관의 경우, 분말제형은 유기용매 및 수분과 접촉하지 않으므로 더욱 바람직하다.In addition, the formulation according to the present invention can be stored at room temperature or below to be stably stored for a long time, and since the dispersion can be prepared by adding water before use, the properties of the formulation do not change and phase separation does not occur. Particularly in the case of long-term storage, the powder formulation is more preferable since it does not come into contact with the organic solvent and moisture.
이 외에도, 본 발명에 의한 제형은 상기의 간단한 제조공정 만으로도 50 ∼ 100% 정도의 인슐린 봉입율을 나타내므로 특히 약물 전달 체계에 유리하며, 본 발명에 의한 제형을 약물 전달 체계에 사용할 경우에는 경구투여, 구강내 투여, 점막투여, 비강내투여, 복강내 투여, 피하주사, 근육주사, 경피 투여, 정맥주사 등이 가능하며, 경구투여가 가장 바람직하다.In addition, since the formulation according to the present invention exhibits an insulin encapsulation rate of about 50 to 100% even by the simple manufacturing process, it is particularly advantageous for the drug delivery system, and when the formulation according to the present invention is used in the drug delivery system, oral administration , Oral administration, mucosal administration, intranasal administration, intraperitoneal administration, subcutaneous injection, intramuscular injection, transdermal administration, intravenous injection, etc. are possible, and oral administration is most preferred.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하겠는바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited by the examples.
실시예 1. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 1Example 1 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 1
1-1. 액상제형의 제조1-1. Preparation of Liquid Formulations
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매에 플루로닉 F-127 20 ㎎을 용해시켰다. 필요에 따라 40℃ 이하로 가온하여 용해시켰다. 여기에 1 N 염산용액 8 ㎕를 가하여 pH를 3.0 ∼ 4.0으로 맞춘 후 인슐린 분말 8 ㎎ (1 ㎎ ≡28.3 U)을 가하고 교반하여 용해시켰다. 맑은 용액이 형성되면 모노올레인 100 ㎎을 가하여 완전히 용해시키고 산소를 포함하지 않은 질소기체 (oxygen-free nitrogen gas)를 이용하여 퍼징 (purging)하거나 감압하에서 에탄올을 완전히 증발시켜 액상제형을 제조하였다.20 mg of Pluronic F-127 was dissolved in 280 mg of anhydrous ethanol and 280 mg of propylene glycol. If necessary, the mixture was heated to 40 ° C. or lower to dissolve it. 8 μl of a 1 N hydrochloric acid solution was added thereto to adjust the pH to 3.0 to 4.0, and then 8 mg of insulin powder (1 mg ≡28.3 U) was added and stirred to dissolve. When a clear solution was formed, 100 mg of monoolein was added to completely dissolve the solution, and a liquid formulation was prepared by purging with an oxygen-free nitrogen gas or completely evaporating ethanol under reduced pressure.
1-2. 액상제형의 특성 분석1-2. Characterization of liquid formulation
① 인산염 완충용액 (PBS, Phosphate buffered saline, pH 7.4) 3 ㎖에 상기 액상제형 10 ㎕를 첨가하고 잘 흔들어 혼합하여 분산액을 제조한 후 입자 크기 및 분산도 (polydispersity)를 측정하였다. 본 발명에서 입자의 크기는 말버른 제타사이저 (Malvern Zetasizer)를 이용한 광자 분광법 (Photon Correlation spectroscopy; QELS법)을 이용하여 측정하였으며 동일한 시료를 3회 측정하여 평균값을 구하였고, 분산도 (polydispersity)는 입자 크기의 일반적인 분포도로 알려진 정상 로그 분포도의 로그-스케일에서의 분산 정도로 나타내었다 (Orr, Encyclopedia of emulsion technology, 1, 369-404, 1985). 하기의 모든 실시예에서도 입자 크기 및 분산도 측정에 상기 방법을 사용하였다.① After adding 10 μl of the liquid formulation to 3 ml of phosphate buffered solution (PBS, Phosphate buffered saline, pH 7.4) and shaking well to prepare a dispersion solution, particle size and polydispersity were measured. In the present invention, the particle size was measured using Photon Correlation spectroscopy (QELS method) using a Malvern Zetasizer, and the average value was obtained by measuring the same sample three times, and polydispersity. Is shown as the degree of dispersion at log-scale of the normal log distribution known as the general distribution of particle size (Orr, Encyclopedia of emulsion technology, 1, 369-404, 1985). All the examples below also used the method for particle size and dispersion measurements.
그 결과, 상기 제형은 물에 잘 분산되었으며, 평균 입자도는 378.3 nm이고 분산도는 0.377이었다.As a result, the formulation was well dispersed in water with an average particle size of 378.3 nm and a dispersion degree of 0.377.
② 담즙산염 (bile salt)의 일종인 10-2M 소듐 데옥시콜레이트 (Sodium deoxycholate) 수용액 3 ㎖에 상기 액상제형 10 ㎕를 첨가하고 잘 흔들어 혼합하여 분산액을 제조한 후 상기와 동일한 방법으로 평균 입자도와 분산도를 측정하였다.② Add 10 μl of the liquid formulation to 3 ml of 10 −2 M sodium deoxycholate aqueous solution, a kind of bile salt, and shake well to prepare a dispersion, and then average particles in the same manner as described above. The degree of dispersion and the degree of dispersion were measured.
그 결과, 상기 제형 역시 물에 매우 잘 분산되었으며, 평균 입자도는 365.1nm이고 분산도는 0.431이었다.As a result, the formulation was also very well dispersed in water with an average particle size of 365.1 nm and a dispersion of 0.431.
③ 비교군으로 미국특허 제5,531,925호의 제조방법을 이용하여 인슐린을 포함하는 큐보좀TM(CubosomeTM) 용액을 제조하여 사용하였다. 구체적으로, 1 ㎖ 용량의 주사기에 각각 1) 모노올레인 100 ㎎과 플루로닉 F-127 20 ㎎의 혼합물 및 2) PBS (pH 7.4) 120 ㎎에 인슐린 8 ㎎을 용해시킨 수용액을 넣고 세방향 스톱코크 (three-way stopcock)로 연결한 후 100회 이상 혼합하여 (by pushing back-and-forth) 점성이 매우 강한 큐빅상 (cubic phase)을 제조한 뒤 편광현미경 (polarized light microscopy)으로 큐빅상을 확인하였다. 이와 같이 제조된 인슐린을 포함한 큐빅상에 PBS (pH 7.4) 1 ㎖을 가하면서 초음파 분쇄 (sonication)하여 분산액인 큐보좀TM용액을 제조한 후 상기와 동일한 방법으로 입자도를 측정하였다.③ the U.S. Patent No. 5,531,925 kyubo TM (Cubosome TM) solution, some containing insulin with a favorable method for producing a group were made using comparisons. Specifically, 1 ml of syringe, 1) a mixture of 100 mg of monoolein and 20 mg of Pluronic F-127, and 2) an aqueous solution in which 8 mg of insulin was dissolved in 120 mg of PBS (pH 7.4) was added. After connection with a three-way stopcock, the mixture is mixed 100 times or more (by pushing back-and-forth) to produce a highly viscous cubic phase, and then a cubic phase with a polarized light microscopy. It was confirmed. Thus, by adding 1 ml of PBS (pH 7.4) to the cubic containing insulin prepared by sonication, a cubosome TM solution as a dispersion was prepared, and the particle size was measured in the same manner as described above.
상기 분산액 100 ㎕를 PBS (pH 7.4) 3 ㎖에 희석하여 입자도를 측정한 결과, 평균 입자도는 148.5 nm이고 분산도는 0.178이었다. 비교군의 경우 초음파 분쇄를 하지 않은 경우에는 입자가 분산되지 않았고 볼텍스 (vortex)를 할 경우에는 수 mm 크기 이상의 입자가 관찰되었다The particle size was measured by diluting 100 µl of the dispersion in 3 ml of PBS (pH 7.4), and the average particle size was 148.5 nm and the dispersion degree was 0.178. In the comparison group, particles were not dispersed without ultrasonic grinding, and particles larger than several mm were observed in vortex.
실시예 2. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 2Example 2 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 2
2-1. 액상제형의 제조2-1. Preparation of Liquid Formulations
인슐린을 2 ㎎ 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.A liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 1, except that 2 mg of insulin was used.
2-2. 액상제형의 특성분석2-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균 입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우에는 평균 입자도가 259.3 ㎚이고 분산도는 0.174이었다. 또한, 10-2M 소듐 데옥시콜레이트 수용액에 분산시켰을 경우에는 평균 입자도가 250.3 ㎚이고 분산도는 0.351이었다.When the dispersion was prepared in liquid form and the average particle size was measured in the same manner as in Example 1-2, when dispersed in PBS (pH 7.4), the average particle size was 259.3 nm and the dispersion degree was 0.174. In addition, 10 -2 M sodium used when dispersed in sikyeoteul oxy cholate solution has an average particle size is 250.3 ㎚ and degree of dispersion was 0.351.
실시예 3. 인슐린을 첨가한 액상제형의 제조 3 (용매의 변화)Example 3 Preparation of Liquid Formulation with Insulin 3 (Change of Solvent)
3-1. 액상제형의 제조3-1. Preparation of Liquid Formulations
무수에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수에탄올 280 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.A liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 1, except that 280 mg of anhydrous ethanol was used instead of 280 mg of anhydrous ethanol and 280 mg of propylene glycol.
3-2. 액상제형의 특성 분석3-2. Characterization of liquid formulation
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 물에 매우 잘 분산되었으며 그 평균입자도가 188.9 ㎚, 분산도는 0.393이었다.As a result of preparing a liquid dispersion, the average particle size was measured in the same manner as in Example 1-2. When dispersed in PBS (pH 7.4), the dispersion was very well dispersed in water. The average particle size was 188.9 nm and the dispersion degree was 0.393. It was.
실시예 4. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 4Example 4 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 4
4-1. 액상제형의 제조4-1. Preparation of Liquid Formulations
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수 에탄올과 프로필렌글리콜을 각각 180 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.Liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 1, except that 180 mg of anhydrous ethanol and propylene glycol were used instead of 280 mg of anhydrous ethanol and 280 mg of anhydrous ethanol.
4-2. 액상제형의 특성분석4-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도가 307.6 ㎚, 분산도는 0.093이었다.As a result of preparing a liquid formulation dispersion liquid and measuring the average particle size in the same manner as in Example 1-2, the average particle size was 307.6 nm and the dispersion degree was 0.093 when dispersed in PBS (pH 7.4).
실시예 5. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 5Example 5 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 5
5-1. 액상제형의 제조5-1. Preparation of Liquid Formulations
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매 대신에 무수 에탄올과 프로필렌글리콜을 각각 120 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.Liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 1, except that 120 mg of anhydrous ethanol and propylene glycol were used instead of 280 mg of anhydrous ethanol and 280 mg of a mixed solvent.
5-2. 액상제형의 특성분석5-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도가 252.9 nm, 분산도는 0.135이었다.As a result of preparing a liquid formulation dispersion liquid and measuring the average particle size in the same manner as in Example 1-2, the average particle size was 252.9 nm and the dispersion degree was 0.135 when dispersed in PBS (pH 7.4).
실시예 6. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 6Example 6 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 6
6-1. 액상제형의 제조6-1. Preparation of Liquid Formulations
프로필렌글리콜 280 ㎎ 대신에 PEG400280 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.A liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 1, except that 280 mg of PEG 400 was used instead of 280 mg of propylene glycol.
6-2. 액상제형의 특성분석6-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 239.8 ㎚, 분산도는 0.223이었다.When the dispersion was prepared in liquid form and the average particle size was measured in the same manner as in Example 1-2, when dispersed in PBS (pH 7.4), the average particle size was 239.8 nm, the dispersion degree was 0.223.
실시예 7. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 7Example 7 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 7
7-1. 액상제형의 제조7-1. Preparation of Liquid Formulations
프로필렌글리콜 180 ㎎ 대신에 PEG400180 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.Liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 4, except that 180 mg of PEG 400 was used instead of 180 mg of propylene glycol.
7-2. 액상제형의 특성분석7-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 222.8 ㎚, 분산도는 0.278이었다.When the dispersion was prepared in liquid form and the average particle size was measured in the same manner as in Example 1-2, when dispersed in PBS (pH 7.4), the average particle size was 222.8 nm, the dispersion degree was 0.278.
실시예 8. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 8Example 8 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 8
8-1. 액상제형의 제조8-1. Preparation of Liquid Formulations
프로필렌 글리콜 120 ㎎ 대신에 PEG400120 ㎎을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 액상제형을 제조하였다.A liquid formulation was prepared in the same manner as in Example 5, except that 120 mg of PEG 400 was used instead of 120 mg of propylene glycol.
8-2. 액상제형의 특성분석8-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 229.8 ㎚, 분산도는 0.278이었다.When the dispersion was prepared in liquid form and the average particle size was measured in the same manner as in Example 1-2, when dispersed in PBS (pH 7.4), the average particle size was 229.8 nm, the dispersion degree was 0.278.
실시예 9. 인슐린을 포함하는 액상제형의 제조 9Example 9 Preparation of Liquid Formulation Including Insulin 9
9-1. 액상제형의 제조9-1. Preparation of Liquid Formulations
무수 에탄올 280 ㎎과 프로필렌글리콜 280 ㎎ 혼합용매에 플루로닉 F-127 20 ㎎을 용해시켰다. 필요에 따라 40℃ 이하로 가온하여 용해시켰다. 한편, 인슐린 분말 8 mg (1 mg≡28.3 U)을 1 N 염산용액을 가하여 pH를 3.0∼4.0으로 맞춘 PBS에 용해시켜 인슐린 용액 10 ㎕를 제조하였다. 상기 두 용액을 혼합한 맑은 용액에 모노올레인 100 ㎎을 가하여 완전히 용해시키고 산소를 포함하지 않은 질소기체 (oxygen-free nitrogen gas)를 이용하여 퍼징 (purging)하거나 감압하에서 에탄올을 완전히 증발시켜 액상제형을 제조하였다.20 mg of Pluronic F-127 was dissolved in 280 mg of anhydrous ethanol and 280 mg of propylene glycol. If necessary, the mixture was heated to 40 ° C. or lower to dissolve it. Meanwhile, 8 mg of insulin powder (1 mg × 28.3 U) was added to 1 N hydrochloric acid solution and dissolved in PBS having a pH of 3.0 to 4.0 to prepare 10 μl of the insulin solution. 100 mg of monoolein was added to the clear solution of the two solutions, completely dissolved, and purged with oxygen-free nitrogen gas or ethanol was completely evaporated under reduced pressure. Was prepared.
9-2. 액상제형의 특성분석9-2. Characterization of Liquid Formulations
액상제형의 분산액을 제조하여 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 평균입자도를 측정한 결과, PBS (pH 7.4)에 분산시켰을 경우 평균입자도는 268.6 ㎚, 분산도는 0.216이었다.As a result of preparing a liquid formulation dispersion liquid and measuring the average particle size in the same manner as in Example 1-2, the average particle size was 268.6 nm and the dispersion degree was 0.216 when dispersed in PBS (pH 7.4).
실시예 10. 흡수 촉진인자를 포함하는 인슐린 함유 액상제형의 제조Example 10 Preparation of Insulin-Containing Liquid Formulations Including Absorption Promoter
10-1. 액상제형의 제조10-1. Preparation of Liquid Formulations
상기 실시예 1-1에서 제조한 액상제형에 흡수 촉진인자로서 올레산 (oleic acid)을 2 ㎎ 첨가하여 액상제형을 제조하였다.The liquid formulation was prepared by adding 2 mg of oleic acid as an absorption promoter to the liquid formulation prepared in Example 1-1.
10-2. 액상제형의 특성분석10-2. Characterization of Liquid Formulations
상기 액상제형 10 ㎕를 PBS (pH 7.4) 3 ㎖에 분산시켜 제조한 분산액의 입자도를 실시예 1-2와 동일한 방법으로 측정한 결과, 평균 입자도는 276.1 nm이고 분산도는 0.334이었다.The particle size of the dispersion prepared by dispersing 10 μl of the liquid formulation in 3 ml of PBS (pH 7.4) was measured in the same manner as in Example 1-2. As a result, the average particle size was 276.1 nm and the dispersion degree was 0.334.
실시예 11. 인슐린을 포함하는 분말제형의 제조Example 11 Preparation of Powder Formula Containing Insulin
상기 실시예 1와 동일한 방법으로 제조된 인슐린을 포함하는 액상제형 0.1 ㎖을 5% 트리할로오즈 수용액 1 ㎖에 첨가하고 손으로 흔들어 분산시킨 후 동결건조하여 분말제형을 제조하였다. 상기 분말제형 약 3 ㎎을 각각 3 ㎖의 증류수 또는 0.01 M 소듐 데옥시콜레이트 (sodium deoxicholate, NaDC) 수용액에 재분산시켜 분산액을 만든 후 실시예 1과 동일한 방법으로 입자크기 및 분산도를 측정하였다.0.1 ml of a liquid formulation containing insulin prepared in the same manner as in Example 1 was added to 1 ml of a 5% aqueous solution of trihalose, shaken by hand, dispersed, and lyophilized to prepare a powder formulation. About 3 mg of each powder formulation was redispersed in 3 ml of distilled water or 0.01 M sodium deoxicholate (NaDC) aqueous solution to prepare a dispersion, and the particle size and dispersion were measured in the same manner as in Example 1.
그 결과, 상기 제형은 물에 잘 분산되었으며, 물에 분산시킬 때 평균 입자도는 358.3 nm이고 분산도는 0.326이며 0.01M NaDC 용액에 분산시키면 평균 입자도는218.2 nm이고 분산도는 0.182이었다.As a result, the formulation was well dispersed in water, and when dispersed in water, the average particle size was 358.3 nm, the dispersion degree was 0.326, and when dispersed in the 0.01 M NaDC solution, the average particle size was 218.2 nm and the dispersion degree was 0.182.
상기 실시예 1 ∼ 11에서 보면, 본 발명에 따른 인슐린을 포함하는 액상 및 분말 제형의 입자크기가 380 nm이하로 매우 작으므로, 본 발명에 따른 액상 및 분말 제형의 분산성이 우수함을 확인하였다.In Examples 1 to 11, since the particle size of the liquid and powder formulations containing insulin according to the present invention is very small, less than 380 nm, it was confirmed that the dispersion of the liquid and powder formulations according to the present invention is excellent.
시험예 1. 인슐린 봉입효율 측정Test Example 1 Measurement of Insulin Loading Efficiency
① 상기 실시예 1에서 제조한 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 제조된 분산액에 다시 PBS (pH 7.4)를 첨가하여 1/20로 희석시킨 후 상기 희석액 2 ㎖을 센트리콘 (Centricon, Millipore, MWCO 100,000)에 넣고 상대원심력 1000 g에서 30분간 원심분리하였다. 상기에서 분리된 맑은 여과액 내의 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA 방법)을 사용하여 측정함으로써 입자에 봉입된 인슐린의 양을 환산하였다. 비교군으로 상기 실시예 1의 ③에서 제조된 큐보좀TM용액의 입자 내 인슐린 봉입율을 동일한 방법으로 측정하였다.① 200 μl of the liquid formulation prepared in Example 1 was dispersed in 800 μl of PBS (pH 7.4) to measure insulin encapsulation efficiency into particles of the dispersion. After diluting to 1/20 by adding PBS (pH 7.4) to the dispersion thus prepared, 2 ml of the diluent was placed in centricon (Centricon, Millipore, MWCO 100,000) and centrifuged for 30 minutes at a relative centrifugal force of 1000 g. The amount of insulin encapsulated in the particles was converted by measuring the amount of insulin in the clear filtrate separated above using protein quantitation (BCA method). In comparison, the insulin encapsulation rate of the cubosome TM solution prepared in ③ of Example 1 was measured by the same method.
그 결과, 큐보좀TM용액의 입자 내 인슐린 봉입율은 10% 이내에 그쳐 90% 이상의 인슐린이 입자 내에 봉입되지 못한 채 용액에 용해되어 있음을 확인한 반면, 본 발명의 분산액의 입자 내 인슐린 봉입효율은 87.01%로 나타나 인슐린 봉입효율이 매우 우수하였다.As a result, it was confirmed that the intracellular insulin encapsulation rate of the cubosome TM solution was less than 10% so that more than 90% of the insulin was dissolved in the solution without being encapsulated in the particles, while the intracellular insulin encapsulation efficiency of the dispersion of the present invention was 87.01. Insulation efficiency was very good in%.
② 상기 실시예 2에서 제조한 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 제조된 분산액을 구멍 크기 (pore size)가 0.45 ㎛인 주사기 필터 (syringe filter)로 여과한 후 이를 다시 구멍 크기가 0.2 ㎛인 주사기 필터로 여과하였다. 상기 여액 내의 유리 인슐린 (free insulin)을 겔 통과 크로마토그래피 (Gel Permeation Chromatography, column : Ultrahydrogel 1000, Waters) 방법으로 측정하였다. 비교군으로 인슐린을 포함하지 않는 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 후 동일한 방법으로 얻은 여액을 사용하여 분산액 입자의 피크 (peak)를 확인하였다.② 200 μl of the liquid formulation prepared in Example 2 was dispersed in 800 μl of PBS (pH 7.4) to measure insulin encapsulation efficiency into particles of the dispersion. The dispersion thus prepared was filtered through a syringe filter having a pore size of 0.45 μm and then again filtered through a syringe filter having a pore size of 0.2 μm. Free insulin in the filtrate is gel permeation chromatography (Gel Permeation Chromatography, column: Ultrahydrogel 1000, Waters) method. In the comparative group, the liquid formulation containing no insulin was dispersed in PBS (pH 7.4), and the peak of the dispersion particles was confirmed using the filtrate obtained by the same method.
그 결과, 상기 실시예 2에서 제조된 액상제형으로부터 얻은 여액에서는 유리 인슐린의 피크가 검출되지 않았는데, 이러한 결과는 본 발명의 액상제형의 입자 내 인슐린 봉입효율이 100.0%임을 나타내는 것이다.As a result, the peak of free insulin was not detected in the filtrate obtained from the liquid formulation prepared in Example 2, which indicates that the insulin encapsulation efficiency of the liquid formulation of the present invention is 100.0%.
③ 상기 실시예 10에서 제조된 올레산을 포함한 인슐린 함유 액상제제 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 800 ㎕에 볼텍스하여 분산시켜 형성된 분산액의 입자 내로의 인슐린 봉입효율을 측정하였다. 이와 같이 형성된 분산액에 PBS (pH 7.4)를 가해 1/20로 희석한 후 상기 희석액 2 ㎖을 센트리콘 (Centricon , Millipore, MWCO 100,000)에 넣고 상대원심력 1000 g에서 30분간 원심분리하였다. 상기에서 분리된 맑은 여과액 내의 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA 방법)을 사용하여 측정함으로써 입자에 봉입된 인슐린의 양을 환산하였다.③ 200 μl of the insulin-containing liquid formulation containing oleic acid prepared in Example 10 was vortexed and dispersed in 800 μl of PBS (pH 7.4) to measure insulin encapsulation efficiency into particles. PBS (pH 7.4) was added to the dispersion thus diluted to dilute to 1/20, and 2 ml of the diluted solution was placed in centricon (Centricon, Millipore, MWCO 100,000) and centrifuged for 30 minutes at 1000 g of relative centrifugal force. The amount of insulin encapsulated in the particles was converted by measuring the amount of insulin in the clear filtrate separated above using protein quantitation (BCA method).
그 결과, 본 발명의 올레산을 포함한 인슐린 함유 액상제제의 입자 내 인슐린 봉입효율은 50%이었다.As a result, the insulin encapsulation efficiency of the insulin-containing liquid formulation containing oleic acid of the present invention was 50%.
시험예 2.Test Example 2. In vivoIn vivo 경구투여 실험 1Oral administration experiment 1
상기 실시예 1에서 제조된 액상제형으로 동물실험을 수행하였다.Animal experiment was performed with the liquid formulation prepared in Example 1.
2-1. 액상제형 내의 인슐린의 생리활성 보존여부 실험2-1. Preservation of Physiological Activity of Insulin in Liquid Formulations
인슐린을 포함한 액상제형 50 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.0 ㎖에 분산시켜 인슐린 농도 28.3 U/㎖의 분산액을 제조하였다. 상기 분산액의 평균 입자도는 345.8 nm이고 분산도는 0.341이었다. 인슐린 투여전의 정상 휘스터계 수컷 랫트 (Wistar rats, male, 6∼7주령)를 4시간 동안 절식시킨 후 꼬리 정맥 (tail vein)에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 이 값을 초기값으로 사용하였다. 측정직후 인슐린으로 3 U/Kg에 해당하는 만큼의 분산액을 꼬리 정맥으로 주사하였다. 본 발명의 인슐린을 포함하지 않은 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 분산액과 인슐린을 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 용액을 비교군으로 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.A 50 μl liquid formulation containing insulin was dispersed in 1.0 mL of PBS (pH 7.4) to prepare a dispersion having an insulin concentration of 28.3 U / mL. The average particle size of the dispersion was 345.8 nm and the dispersion was 0.341. Blood starch blood samples were measured from the tail vein after fasting for 4 hours in normal sterile male rats (6-7 weeks old) prior to insulin administration. . Immediately after the measurement, the amount of dispersion corresponding to 3 U / Kg was injected into the tail vein with insulin. The same experiment was performed using a dispersion in which a liquid formulation containing no insulin of the present invention was dispersed in PBS (pH 7.4) and a solution in which insulin was dissolved in PBS (pH 7.4) as a comparison group.
도 1에 나타난 바와 같이, PBS에 용해된 주사용 인슐린 용액과 비교한 결과 본 발명의 액상제형에 포함된 인슐린의 생리활성이 보존되어 있음을 관찰하였으므로, 본발명의 제형의 분산액을 하기의 동물실험에 사용하였다.As shown in Figure 1, as compared with the injectable insulin solution dissolved in PBS was observed that the physiological activity of the insulin contained in the liquid formulation of the present invention was preserved, the dispersion of the formulation of the present invention the following animal experiment Used for.
2-2. 당뇨 유도2-2. Diabetes induction
6주령의 휘스터계 수컷 랫트를 8∼10시간 동안 절식시킨 후 스트렙토조토신 (streptozotocin)과 알록산 모노하이드레이트 (alloxan monohydrate)가 용해된 일반 생리 식염수 (normal saline solution) 100 ㎎/㎏을 복강 내로 이틀 간격으로 3회 반복 주사하였다. 상기와 같이 처리된 랫트로부터 일주일 후 혈액을 채혈하여 혈당치를 측정하였고, 이들 중 비공복 상태에서의 혈당치가 400 ㎎/dL 이상으로 나타난 랫트를 당뇨가 유도된 것으로 간주하여 하기의 실험을 수행하였다.Fasting 6-week-old male rats for 8-10 hours and then intraperitoneally with 100 mg / kg of normal saline solution in which streptozotocin and alloxan monohydrate were dissolved Three injections were repeated at two-day intervals. One week later, blood was collected from the rats treated as described above, and blood glucose levels were measured. Among the rats, a blood glucose level of 400 mg / dL or more in the non-fasted state was considered to be induced with diabetes, and the following experiment was performed.
2-3. 액상제형의 경구투여 실험2-3. Oral Administration of Liquid Formulations
인슐린을 포함한 액상제형 50 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.0 ㎖에 분산시켜 인슐린 농도 28.3 U/㎖의 분산액을 제조하였다. 6∼7주령의 정상 랫트와 상기 시험예 2-2에서 선별된 당뇨가 유도된 랫트를 4시간 동안 절식시킨 후 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 상기 값을 약물투여 전 초기값으로 사용하였다. 상기 실험동물에 위 존데 (gastric sonde)를 사용하여 3% NaHCO3/PBS를 0.8 ㎖씩 경구투여하여 위산을 중화시켰다. 약 30분 후 상기에서 제조된 분산액을 인슐린 농도가 30, 50 및 100 U/㎏이 되도록 위 존데로 경구투여하였다. 비교군으로 인슐린을 포함하지 않은 액상제형의 분산액 및 인슐린/PBS 용액을 사용하여 동일한 방법으로 경구투여하였다. 약물투여 후 1, 2, 3, 4 및 6시간 째에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였다. 투여전 초기값을 100%로 하여 각 시간대의 혈당치를 환산하였다.A 50 μl liquid formulation containing insulin was dispersed in 1.0 mL of PBS (pH 7.4) to prepare a dispersion having an insulin concentration of 28.3 U / mL. After fasting for 4 hours in normal rats of 6 to 7 weeks and the diabetic-derived rats selected in Test Example 2-2, blood was collected from the tail vein to measure blood glucose levels. It was. The gastric acid was neutralized by oral administration of 0.8 ml of 3% NaHCO 3 / PBS using gastric sonde. After about 30 minutes, the dispersion prepared above was orally administered to the stomach with insulin concentrations of 30, 50 and 100 U / kg. Comparative groups were orally administered in the same manner using a liquid formulation without insulin and an insulin / PBS solution. At 1, 2, 3, 4 and 6 hours after drug administration, blood was collected from the tail vein to measure blood glucose levels. The blood glucose level of each time slot was converted to the initial value before administration as 100%.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액으로 인슐린이 100 U/㎏ 농도로 투여된 당뇨가 유발된 랫트 실험군에서는 초기 혈당치에 비하여 6시간 경과 후 80% 이상 감소되었고 30 및 50 U/㎏ 투여군에서도 40% 이상혈당치가 감소된 반면, 인슐린을 함유하지 않은 분산액만을 투여한 경우에는 혈당치가 크게 저하되지 않음을 확인하였다. 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 정상 랫트 실험군에서도 본 발명의 인슐린 함유 액상제형의 분산액으로 인슐린이 30∼100 U/㎏ 농도로 투여된 경우에 혈당치가 초기에 비하여 20∼50% 정도 감소하였으나, 인슐린을 함유하지 않은 분산액만을 투여한 경우에는 혈당치에 거의 변화가 나타나지 않았다. 또한, PBS 용액에 용해시킨 인슐린을 투여한 경우는 정상 랫트 및 당뇨가 유발된 랫트 실험군 모두에서 혈당이 저하되지 않았다.As shown in FIG. 2, in the diabetic rat-induced rat group in which insulin was administered at a concentration of 100 U / kg in the insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention, the blood glucose level was decreased by 80% or more after 6 hours, and 30 and 50 In the U / kg administration group, the blood glucose level was reduced by more than 40%, but the blood glucose level was not significantly reduced when only the dispersion containing no insulin was administered. In addition, as shown in Figure 3, even in the normal rat experimental group of the insulin-containing liquid formulation dispersion of the present invention, when the insulin was administered at a concentration of 30 to 100 U / kg, the blood glucose level was reduced by 20 to 50% compared to the initial, When only the dispersion containing no insulin was administered, there was little change in blood glucose level. In addition, the administration of insulin dissolved in PBS solution did not lower blood sugar levels in both normal rats and diabetic rats.
시험예 3.Test Example 3. In vivoIn vivo 경구투여 실험 2Oral administration experiment 2
상기 실시예 10에서 제조된 액상제형을 이용하여 상기 시험예 2와 동일한 방법으로 정상 랫트를 대상으로 실험하였다. 비교예로서 상기 실시예 1에서 제조된 인슐린함유 액상제형과 인슐린을 함유하지 않은 액상제형을 PBS (pH 7.4)에 분산시킨 분산액을 사용하여 동일한 실험을 수행하였다.Normal rats were tested in the same manner as in Test Example 2 using the liquid formulation prepared in Example 10. As a comparative example, the same experiment was carried out using the dispersion prepared by dispersing the insulin-containing liquid formulation prepared in Example 1 and the non-insulin liquid formulation in PBS (pH 7.4).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 인슐린 함유 액상제형을 정상 랫트에 경구투여한 경우에는 혈당치가 40% 정도 감소하였으나, 올레산을 함유한 인슐린 함유 액상제형의 분산액을 경구투여한 경우에는 인슐린 투여 후 2시간 만에 혈당치가 초기에 비하여 75% 이상 감소하여 흡수 촉진인자로서 첨가된 올레산 (oleic acid)으로 인하여 인슐린의 흡수가 촉진되었음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 4, when the insulin-containing liquid formulation of the present invention orally administered to normal rats, the blood glucose level was reduced by about 40%, but when orally administered the dispersion of the insulin-containing liquid formulation containing oleic acid After 2 hours of insulin administration, the blood glucose level was reduced by more than 75% compared with the initial stage, and it was confirmed that the absorption of insulin was promoted due to the addition of oleic acid as an absorption promoter.
시험예 4.Test Example 4. In vivoIn vivo 십이지장 내 투여실험Intraduodenal administration experiment
상기 실시예 2에서 제조된 액상제형으로 동물실험을 수행하였다.Animal experiment was performed with the liquid formulation prepared in Example 2.
4-1. 액상제형 내 인슐린의 생리활성 보존여부 실험4-1. Preservation of Physiological Activity of Insulin in Liquid Formulations
상기 시험예 12-1과 동일한 방법으로 액상제형 내의 인슐린 활성을 측정하여 액상제형내의 인슐린의 활성이 보존된 것을 확인한 후 분산액을 취하여 하기의 동물실험을 수행하였다.In the same manner as in Test Example 12-1, the insulin activity in the liquid formulation was measured to confirm that the activity of the insulin in the liquid formulation was preserved, and then a dispersion was performed to carry out the following animal experiment.
4-2. 분산액 제조4-2. Dispersion Preparation
상기 실시예 2에서 제조된 액상제형 200 ㎕를 PBS (pH 7.4) 또는 10-2M 소듐 데옥시콜레이트 수용액 800 ㎕에 분산시켜 인슐린 농도가 1 ㎎ (≡28.3U)/㎖인 분산액을 제조하였다.200 μl of the liquid formulation prepared in Example 2 was dispersed in 800 μl of PBS (pH 7.4) or 10 −2 M sodium deoxycholate aqueous solution to prepare a dispersion having an insulin concentration of 1 mg (28.3 U) / ml.
4-3. 분산액의 십이지장 내 투여실험4-3. Intraduodenal administration experiment of dispersion
16시간 동안 절식시킨 180∼220 g의 휘스터계 수컷 랫트에 우레탄 (Urethane)과 자일라진·HCl (xylazine·HCl)을 각각 1.0 g, 12 ㎎/㎖의 농도로 PBS (pH 7.4)에 용해시킨 후 상기 혼합액 1.0 ㎖/㎏을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 충분히 마취가 유도된 후 실험동물의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였고 이 값을 초기값으로 사용하였다. 실험동물을 수술대에 고정시키고 복부를 절개하여 십이지장을 노출시킨 후 26 게이지 바늘 (gauge needle)을 사용하여 분산액을 인슐린 농도가 100 U/㎏이 되도록 장관 내로 주입하였다. 절개부위를 봉합한 후 1, 2, 3, 4 및 6시간 째에 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당치를 측정하였다. 약물투여 전 초기값을 100%로 하여 각 시간대별 혈당치를 환산하였다. 비교군으로서 인슐린/PBS, 인슐린을 포함하지 않는 액상제제의 분산액, 인슐린 용액과 인슐린을 포함하지 않은 액상제제의 분산액의 혼합물을 상기와 동일한 방법으로 십이지장 내 투여하였다.180 to 220 g of Faster male rats fasted for 16 hours were dissolved in PBS (pH 7.4) at concentrations of 1.0 g and 12 mg / ml, respectively, of urethane and xylazine-HCl. Thereafter, 1.0 ml / kg of the mixed solution was intraperitoneally injected to anesthetize. After sufficient induction of anesthesia, blood was collected from the tail vein of the test animal and the blood glucose level was measured. The experimental animals were fixed on the operating table, the abdomen was cut to expose the duodenum, and the dispersion was injected into the intestinal tract so that the insulin concentration was 100 U / kg using a 26 gauge needle. At 1, 2, 3, 4 and 6 hours after closing the incision, blood was collected from the tail vein to measure blood glucose levels. The blood glucose level of each time slot was converted to an initial value of 100% before drug administration. As a comparative group, a mixture of insulin / PBS, a dispersion of a liquid formulation containing no insulin, and a dispersion of an insulin solution and a liquid formulation containing no insulin was administered in the duodenum in the same manner as above.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 담즙산염 (bile salt)의 일종인 10-2M 소듐 데옥시콜레이트 수용액에 인슐린 함유 액상제형을 분산시킨 경우에 정상 랫트에서의 혈당치가 20% 정도 감소하여 분산액으로 인산염 완충용액 보다 담즙산염을 사용하는 것이 더 효율적임을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 5, bile salts (bile salt) a type of 10 -2 M sodium deoxy dispersion blood glucose level is reduced by 20% in normal rats when dispersed insulin-containing liquid preparation to an aqueous solution of cholate As a result, it was found that bile salts were more efficient than phosphate buffers.
시험예 5.Test Example 5. In vitroIn vitro 인슐린 방출실험Insulin release test
상기 실시예 1에서 제조한 액상제형 400 ㎕를 PBS (pH 7.4) 1.6 ㎖에 분산시켜 분산액을 제조한 후 투석막 백 (dialysis bag, MWCO = 300,000, Spectra/Por, Spectrum Medical Industries, Inc. Laguna Hills, CA. 미국)에 넣고 양쪽을 클로져 (closure)로 묶은 뒤 10 ㎖의 인산염 완충용액 (Phosphate buffered saline, pH = 7.4)에 담가 37℃ 와동수조에서 방출실험을 수행하였다. 일정한 시간간격에 따라 투석막 백 외부의 인산염 완충용액을 취하여 방출되어 나온 인슐린의 양을 단백질 정량법 (BCA방법)으로 정량하였다.400 μl of the liquid formulation prepared in Example 1 was dispersed in 1.6 ml of PBS (pH 7.4) to prepare a dispersion, followed by dialysis membrane bag (MWCO = 300,000, Spectra / Por, Spectrum Medical Industries, Inc. Laguna Hills, CA. USA), both sides were tied with a closure, and then immersed in 10 ml of phosphate buffered saline (pH = 7.4) to perform a release experiment in a 37 ° C. vortex bath. The phosphate buffer solution outside the dialysis membrane bag was taken at regular intervals and the amount of released insulin was quantified by protein quantification (BCA method).
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 인슐린을 함유한 액상제형을 PBS 또는 담즙산염 수용액에 분산시킬 경우에는 70 % 이상의 인슐린이 방출되지 않고 입자내에 존재하는 반면, 큐보좀TM에 봉입된 인슐린은 모두 방출되었다.As a result, as shown in Fig. 6, when the liquid formulation containing insulin is dispersed in PBS or bile salt aqueous solution, more than 70% of the insulin is present in the particles without release, whereas all the insulin encapsulated in cubosome TM Released.
상기 시험예 1 ∼ 5에서 보면, 본 발명에 의한 인슐린 함유 제형의 분산액 내의 입자 내 인슐린 봉입효율에 매우 우수하며, 또한 본 발명에 따른 제형을 주사 또는 경구 투여시 탁월하게 혈당을 저하시킴을 확인하였다.In Test Examples 1 to 5, it was confirmed that the insulin encapsulation efficiency in the particles in the dispersion of the insulin-containing formulation according to the present invention was very excellent, and also the blood glucose was excellently lowered when the formulation according to the present invention was injected or orally. .
상술 한 바와 같이, 본 발명에 의한 인슐린 함유 경구투여용 제형은 손으로 흔들어 주는 등의 최소한의 기계적 도움에 의해 쉽게 분산되어 작고 균일한 입자를 형성하고, 제형의 입자 내 인슐린 봉입률이 매우 우수하여 주사 또는 경구 투여시 탁월하게 혈당을 저하시키므로 인슐린 전달 시스템에 유용하게 이용할 수 있다.As described above, the insulin-containing oral dosage form according to the present invention is easily dispersed with minimal mechanical assistance, such as shaking by hand, to form small and uniform particles, and the insulin encapsulation rate of the dosage form is very excellent. It can be usefully used in insulin delivery system because it lowers blood sugar exogenously upon injection or oral administration.
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