KR20020063872A - Cationic dosper virosomes - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-센다이 바이러스 헤마글루티닌인 한가지이상의 활성 용해성 펩티드를 포함하는 양이온성 비로솜에 관하는데, 여기서 비로솜 막은 포스타티딜콜린(PC)이나 이의 유도체 및 선택적으로 포스파티딜에탄올아민(PE) 및/또는 다른 양이온성 지질로 구성되는 다른 지질과 함께, 전체 지질에 기초하여 5 내지 30wt%의 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드(DOSPER)를 함유한다. 상기 비로솜은 음으로 하전된 물질, 특히 핵산 화합물을 표적 세포에 전달하는데 매우 효과적이다. 또한, 본 발명은 비로솜을 제조하는 방법 및 진단, 미용, 의료 또는 과학적 목적에서 이의 용도에 관한다.The present invention relates to cationic virosomes comprising one or more active soluble peptides which are non-Sendai virus hemagglutinin, wherein the nonrosome membrane is phosphatidylcholine (PC) or a derivative thereof and optionally phosphatidylethanolamine (PE) And / or 5-30 wt% of 1,3-dioleyloxy-2- (6-carboxy-spermyl) -propylamide (DOSPER) based on total lipids, with other lipids consisting of other cationic lipids It contains. The virosomes are very effective in delivering negatively charged substances, in particular nucleic acid compounds, to target cells. The present invention also relates to methods of making virosomes and their use in diagnostic, cosmetic, medical or scientific purposes.
Description
WO92/13525는 인플루엔자 바이러스 기원의 바이러스 스파이크 단백질 및 세포-특이적 마커(예, 단클론항체)로 표적을 지향하는 인지질 이중층 막으로 구성되는 비로솜이 수용체-매개된 세포내이입에 의한 바이러스-유사 침투 기전으로 모델 막 및 동물 세포와 매우 효과적으로 융합한다고 기술한다. 이들 비로솜이 화학 물질 및 소요 약물을 표적 위치에 효과적으로 전달할 수 있긴 하지만, 음으로 하전된 핵산과 같은 하전된 분자의 안정적인 통합 및 전달과 관련하여 단점이 있다.WO92 / 13525 describes a virus-like infiltration mechanism by virosome receptor-mediated endocytosis consisting of a phospholipid bilayer membrane directed to a target with a viral spike protein of influenza virus origin and a cell-specific marker (eg monoclonal antibody). It is described as fusion with model membranes and animal cells very effectively. Although these virosomes can effectively deliver chemicals and required drugs to target sites, there are disadvantages associated with the stable integration and delivery of charged molecules such as negatively charged nucleic acids.
WO97/41834는 시험관내와 생체내 표적 세포에 대한 유전물질의 효율적인 세포-특이적 전달을 위한 양이온성 비로솜을 기술한다. 이는 또한, 이런 비로솜의 제조 방법 및 이들 비로솜의 사용 용도를 기술한다.WO97 / 41834 describes cationic virosomes for efficient cell-specific delivery of genetic material to target cells in vitro and in vivo. It also describes the preparation of such virosomes and the use of these virosomes.
본 발명의 요약Summary of the invention
본 발명은 WO97/41834에 기술된 발명의 개량 발명으로, 신규한 양이온성 비로솜에 관하는데, 이는 특이적인 막 조성으로 인해 음으로 하전된 소요의 물질, 바람직하게는 길고 짧은 DNA나 RNA 사슬, 올리고데옥시뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 펩티드 핵산(PNA), 리보자임(효소활성을 가진 RNA 분자), 유전자, 플라스미드, 벡터로 구성되는 유전물질을 효과적으로 적하할 수 있다. 다른 지질과 함께 DOSPER를 양이온성 지질로 이용하면, WO97/41834의 DOTAP 비로솜의 트랜스펙션 효율을 최대 10배까지 초과하는 고성능 비로솜을 생산할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 하지만, 이런 놀라운 효과는 DOSPER를 양이온성 지질로 이용하고, WO97/41834에 명시되고 청구된 양이온성 지질(DOTAP) 대 다른 지질의 공지된 비율과 상이한 비율로 DOSPER을 다른 지질과 혼합하는 경우에만 달성된다.The present invention is a further development of the invention described in WO97 / 41834, which relates to a novel cationic virosome, which is a negatively charged material, preferably long and short DNA or RNA chains, due to the specific membrane composition, Genetic materials consisting of oligodeoxynucleotides, ribonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs), ribozymes (RNA molecules with enzymatic activity), genes, plasmids and vectors can be effectively loaded. It has been found that using DOSPER as a cationic lipid together with other lipids can produce high performance virosomes that exceed the transfection efficiency of the DOTAP virosomes of WO97 / 41834 by up to 10 times. However, this surprising effect is achieved only when using DOSPER as a cationic lipid and mixing DOSPER with other lipids at a different rate than the known ratio of cationic lipids (DOTAP) to other lipids specified and claimed in WO97 / 41834. do.
본 발명은 생화학, 유전생명공학 및 유전자요법 분야에 속하고 또한 신규한 비로솜, 다시 말하면 소요 물질(특히, 유전 물질)의 표적 위치로의 효율적인 전달을 위하여 막에 바이러스 당단백질을 함유하는 리포좀성 양전하 소포 및 이들의 유용한 용도에 관한다. 본원의 양이온성 비로솜은 생체내 또는 시험관내 표적 세포에 대하여 음으로 하전된 화합물, 바람직하게는 유전자의 특이적인 또는 비-특이적인 비-감염성 전달에 특히 적합하다.The present invention belongs to the fields of biochemistry, genetic biotechnology and gene therapy and also contains liposomes containing viral glycoproteins in the membrane for efficient delivery of novel non-rosomes, ie, the required material (especially genetic material) to the target site. Positive charge vesicles and their useful uses. The cationic virosomes herein are particularly suitable for specific or non-specific non-infectious delivery of compounds, preferably genes, that are negatively charged to target cells in vivo or in vitro.
도 1은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 0.5㎖ 배지에서, 형질전환된 원시 사람 신장 배아세포주 293T의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.Figure 1 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. In 0.5 ml medium, 5 × 10 5 cells of transformed primitive human kidney embryonic cell line 293T are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도 2는 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 원숭이 섬유아세포 세포주 COS-1의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.2 shows the effect of transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of the monkey fibroblast cell line COS-1 are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도 3은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 0.5㎖ 배지에서, 사람 상피 경부 암종 세포주 HeLa의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.3 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. In 0.5 ml medium, 5 × 10 5 cells of the human epithelial cervical carcinoma cell line HeLa are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing the 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도 4는 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 생쥐 섬유아세포 세포주 NIH3T3의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.4 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of the mouse fibroblast cell line NIH3T3 are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing the 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도 5는 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 사람 만성 골수성 백혈병 세포주 K562의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.5 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of the human chronic myeloid leukemia cell line K562 are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing the 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도6은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 생쥐 골수종 세포주 P3의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOSPER-리포좀으로 트랜스펙션시킨다.6 shows the effect of transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of mouse myeloma cell line P3 are transfected with DOSPER-virosomes and DOSPER-liposomes bearing 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도7은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 세포주 COS-1, 293T, K562와 P3X63Ag8의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ을 보유하는 DOSPER-비로솜으로 트랜스펙션시킨다.Figure 7 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of cell lines COS-1, 293T, K562 and P3X63Ag8 are transfected with DOSPER-virosomes carrying 3 H-labeled plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ.
도 8은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 0.5㎖ 배지에서, 형질전환된 원시 사람 신장 배아세포주 293T의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ his(0.4㎍ DNA; 24,000 dpm = 100%)를 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOTAP-비로솜으로 트랜스펙션시킨다.8 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. In 0.5 ml medium, 5 × 10 5 cells of the transformed primitive human kidney embryonic cell line 293T were DOSPER with 3 H-labeled plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ his (0.4 μg DNA; 24,000 dpm = 100%). Transfection with Virosomes and DOTAP-Virosomes.
도 9는 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 0.5㎖ 배지에서, 사람 만성 골수성 백혈병 세포주 K562의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ his(0.4㎍ DNA; 24,000 dpm = 100%)를 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOTAP-비로솜으로 트랜스펙션시킨다.9 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. In 0.5 ml medium, 5 × 10 5 cells of human chronic myeloid leukemia cell line K562 were DOSPER-birosomes with 3 H-labeled plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ his (0.4 μg DNA; 24,000 dpm = 100%). And DOTAP-Virosome.
도10은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 0.5㎖ 배지에서, 하이브리드 비-분비성 생쥐 세포주 Sp2의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ his(0.4㎍ DNA; 24,000 dpm = 100%)를 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOTAP-비로솜으로 트랜스펙션시킨다.Figure 10 shows the effect of the transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. In 0.5 ml medium, 5x10 5 cells of the hybrid non-secreting mouse cell line Sp2 were DOSPER- with 3 H-labeled plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ his (0.4 μg DNA; 24,000 dpm = 100%). Transfect with Virosomes and DOTAP-Virosomes.
도 11은 흡수된 DNA-플라스미드의 함량에 대한 트랜스펙션 기간의 영향을 도시한다. 사람 상피 암종 세포주 HeLa의 5x105개 세포는3H-표지된 플라스미드 pGreen Lantern을 보유하는 DOSPER-비로솜 및 DOTAP-비로솜으로 트랜스펙션시킨다.11 shows the effect of transfection period on the content of uptake DNA-plasmid. 5 × 10 5 cells of the human epithelial carcinoma cell line HeLa are transfected with DOSPER-virosomes and DOTAP-virosomes with 3 H-labeled plasmid pGreen Lantern.
도 12는 각각 DOSPER 비로솜 또는 DOSPER 리포좀으로 트랜스펙션된 NIH3T3세포에서 β-갈락토시다제의 발현을 도시한다; 3가지 실험 A,B,C의 평균값.12 shows expression of β-galactosidase in NIH3T3 cells transfected with DOSPER virosomes or DOSPER liposomes, respectively; Average of three experiments A, B and C.
도 13은 상이한 농도의 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ를 이용한 DOSPER 비로솜(실험 A)으로 트랜스펙션되고 상이한 수량의 비로솜을 통하여 제공되는 NIH3T3과 293T 세포에서 β-갈락토시다제의 발현을 도시한다; 4일이후 단백질 수치(ng/㎎).FIG. 13 shows β-galactosidase in NIH3T3 and 293T cells transfected with DOSPER virosomes (Experiment A) using different concentrations of plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ and provided through different quantities of virosomes. Shows expression; Protein levels after 4 days (ng / mg).
본 발명에 따른 비로솜은 양이온성 지질의 존재로 인해 양전하를 띠는 소포 막으로 구성되는 지질 소포다. 이들은 또한, 바이러스 기원의 용해성(fusogenic) 펩티드, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌과 같은 바이러스 외피의 당단백질을 추가로 포함하는데, 상기 펩티드는 수용체-매개된 침투 기전으로 비로솜이 표적 세포에 통합되도록 한다. 이들은 선택적으로, 생체내 소요 표적 세포에 대한 우선적인 부착을 위하여 세포-특이적 마커를 포함할 수 있다.Virosomes according to the invention are lipid vesicles which consist of a membrane of positively charged vesicles due to the presence of cationic lipids. They also further comprise glycoproteins of viral envelopes, such as fusogenic peptides of viral origin, preferably influenza virus hemagglutinin, which peptides integrate into target cells by means of receptor-mediated infiltration. Be sure to These may optionally include cell-specific markers for preferential attachment to the desired target cells in vivo.
막에서 포스타티딜에탄올아민(PE)의 존재는 이중기능성 가교제(crosslinker)에 의해 이런 세포-특이적 마커를 비로솜에 고정시키는데 선호된다. 비로솜의 세포-특이적 표적화가 필요하지 않은 경우에(예, 시험관내 한정된 세포 배양액에서) 또는 세포-특이적 마커가 이중기능성 가교제이외의 다른 수단으로 막에 고정되는 경우에, PF는 비로솜 막에서 부재할 수 있다.The presence of phosphatidylethanolamine (PE) in the membrane is preferred for immobilizing such cell-specific markers on virosomes by a bifunctional crosslinker. In cases where cell-specific targeting of nonrosomes is not required (eg, in defined cell culture in vitro) or when cell-specific markers are immobilized on the membrane by means other than bifunctional crosslinkers, PFs May be absent from the membrane.
비로솜의 생체내 적용에서 선호되는 한 구체예에서, 본 발명은 또한 세포-특이적 마커, 예를 들면 표적 세포의 선택적 감지 및 결합에 유용한 단클론항체, F(ab')2와 Fab' 단편과 같은 항체단편, 사이토킨 및/또는 성장 인자의 양이온성 비로솜에 대한 비가역적 공유결합에 관한다. 이들은 외부로 돌출되고, 수용체 검출 및 결합과 관련된 완전한 기능활성을 보이도록 소포 막에 결합된다. 부위-지향적 교차-결합성 세포-특이적 마커를 포함하는 비로솜을 제조하는 적절한 방법은 WO97/41384의 실시예 1에 개시되어 있다. 상기 방법에 따른 세포-특이적 마커는 세정제의 존재하에 포스파티딜에탄올아민-가교제 분자, 예를 들면 N-[4-(p-말레이미도-페닐부티릴]-포스파티딜에탄올아민(MPB.PE)과 결합한다.In one embodiment preferred for in vivo application of virosomes, the invention also relates to cell-specific markers, such as the monoclonal antibodies, F (ab ') 2 and Fab' fragments, which are useful for the selective detection and binding of target cells. It relates to the irreversible covalent binding of the same antibody fragments, cytokines and / or growth factors to cationic virosomes. They protrude outward and bind to the vesicle membrane to show full functional activity associated with receptor detection and binding. Suitable methods for preparing virosomes comprising site-directed cross-linking cell-specific markers are disclosed in Example 1 of WO97 / 41384. The cell-specific marker according to this method binds to a phosphatidylethanolamine-crosslinker molecule, for example N- [4- (p-maleimido-phenylbutyryl] -phosphatidylethanolamine (MPB.PE) in the presence of a detergent. do.
가능한 최적의 결과를 달성하기 위하여, 분자내 S-S 결합의 단백분해 절단 또는 감소로 인한 불활성화를 회피하기 위한 재구성에 앞서 바이러스 당단백질을 조심스럽게 분리 및 정제하는 것이 바람직하다. 따라서, 공액된 마커(예, 마커-MPB.PE)는 활성화된 아가로즈 매트릭스, 바람직하게는 환원된 티오프로필 세파로즈 6B를 이용한 친화력 크로마토그래피로, 공액되지 않은 포스파티딜에탄올아민-가교제 분자(예, MPB.PE)로부터 분리하는 것이 바람직하다. 이후, 정제된 포스파티딜에탄올아민-가교제-마커분자 복합체의 분취량은 분해된 막 지질, 융합 펩티드, 다른 소요 성분의 혼합물을 함유하는 세정액에 첨가하는데, 이후 양이온성 비로솜이 형성된다.In order to achieve the best possible results, it is desirable to carefully isolate and purify viral glycoproteins prior to reconstitution to avoid inactivation due to proteolytic cleavage or reduction of intramolecular S-S bonds. Thus, conjugated markers (e.g. Marker-MPB.PE) are affinity chromatography using an activated agarose matrix, preferably reduced thiopropyl sepharose 6B, whereby unconjugated phosphatidylethanolamine-crosslinker molecules (e.g. Preferably from MPB.PE). An aliquot of the purified phosphatidylethanolamine-crosslinker-marker molecule complex is then added to a wash containing a mixture of degraded membrane lipids, fusion peptides, and other required components, followed by the formation of cationic virosomes.
비로솜의 분리에 앞서, 이중기능성 가교제를 인지질 및 세포-특이적 마커와 결합시키는 과정은 개별적인 과정으로 실시하는 것이 바람직하다. 이런 과정은 특히, 비로솜 막에 결합된 세포-특이적 마커와 관련된 비로솜 막의 표면 밀도를 좀더 효율적으로 조절하고 최적화하는 것을 가능하게 한다. 막에 함침된 또는 결합된 단백질 분자의 향상된 농도 조절은 융합 펩티드(예, 헤마글루티닌)의 불균형한 비율만큼이나 중요한데, 비로솜 막에서 세포-특이적 마커(예, Fab' 항체단편)는 이들의 선택적 특성을 감소 또는 파괴시키고, 심한 경우 소포의 응집과 침전을 초래할 수 있다.Prior to separation of the virosomes, the process of combining the bifunctional crosslinking agent with phospholipids and cell-specific markers is preferably performed separately. This process makes it possible, in particular, to more efficiently control and optimize the surface density of nonrosome membranes associated with cell-specific markers bound to nonrosome membranes. Improved concentration control of protein molecules impregnated or bound to the membrane is as important as the imbalanced proportion of fusion peptides (eg hemagglutinin), and cell-specific markers (eg Fab 'antibody fragments) in nonrosome membranes May reduce or destroy the selective properties of and, in severe cases, may lead to aggregation and sedimentation of the vesicles.
세포-특이적 마커로서 전체 항체 분자대신에 F(ab')2와 Fab' 항체단편을 이용하는 장점은 WO97/41834에서 폭넓게 기술한다. 본원의 세포-특이적 비로솜은 막에 위치한 세포-특이적 마커로 인해 다양한 세포형에 대하여 선택성을 발휘하고, 동시에 바이러스 용해성(fusogenic) 펩티드(예, 헤마글루티닌)로 인해 세포내이입에 의한 높은 세포 침투능을 보인다. TAG72, CEA, 17-1A, CA 19-9와 같은 종양-관련된 항원 또는 CD10(CALLA = 공통 급성 림프구성 백혈병 항원)과 CD20과 같은 백혈병-관련된 항원을 인식하는 Fab'단편을 가진 비로솜은 선택적으로, 좀더 바람직하게는 세포 표면에 전술한 항원을 보유하는 종양 또는 백혈병 세포와 결합한다.The advantages of using F (ab ') 2 and Fab' antibody fragments instead of whole antibody molecules as cell-specific markers are broadly described in WO97 / 41834. The cell-specific virosomes of the present invention exhibit selectivity for various cell types due to cell-specific markers located on the membrane, and at the same time for endocytosis due to viral fusogenic peptides (eg, hemagglutinin). High cell penetration. Virosomes with a Fab 'fragment that recognizes tumor-associated antigens such as TAG72, CEA, 17-1A, CA 19-9 or leukemia-associated antigens such as CD10 (CALLA = common acute lymphocytic leukemia antigen) and CD20 are optional. More preferably, a tumor or leukemia cell bearing the aforementioned antigens on the cell surface.
이런 신규한 소포 또는 비로솜은 음으로 하전된 소요의 물질, 바람직하게는 유전 물질을 표적 위치, 특히 시험관내와 생체내에서 동물과 사람의 세포 및 조직에 전달하는데 매우 효과적이다. 이런 신규한 비로솜은 증식(즉, 복제) 세포뿐만 아니라 비-증식(즉, 휴지)세포를 침투할 수 있기 때문에, 생명과학, 약리학, 의약 분야에서 연구 및/또는 진단의 도구 및 약물로서 다양하게 활용할 수 있다. 세포독성 약물 또는 핵산 물질의 전달을 위한 운반체로 본 발명에 따른 비로솜을 이용하는 경우, 다양한 병리학적 이상, 예를 들면 바이러스 감염, 암, 종양, 백혈병, 또는 유전적 결함에 기인하고 본 발명에 따른 비로솜을 활용한 유전자요법이 가능한 다른 질환에 적용하기 적합하다.These new vesicles or virosomes are very effective for delivering negatively charged substances of interest, preferably genetic material, to target cells, particularly in vitro and in vivo, to cells and tissues of animals and humans. Because these novel virosomes can penetrate non-proliferating (ie resting) cells as well as proliferating (ie replicating) cells, they are diverse as tools and drugs for research and / or diagnostics in the life sciences, pharmacology, and medicine. Can be utilized. When using virosomes according to the invention as carriers for the delivery of cytotoxic drugs or nucleic acid substances, they are attributable to various pathological abnormalities, for example viral infections, cancers, tumors, leukemias, or genetic defects and according to the invention. It is suitable for application to other diseases where virosome-based gene therapy is possible.
본 발명의 비로솜은 시험관내 또는 생체내에서 이용할 수 있다. 가령, 골수의 정화(purging)는 급성과 만성 백혈병을 비롯한 몇몇 종양의 치료에서 한 구성 요소로 활용된다. 현재, 골수는 면역학적 시약 및 화학요법적 약물과 같은 다양한 약품으로 백혈병 세포를 제거한다. 백혈병 세포에 성장 이점을 제공하고 종양유전자를 표적으로 하는 비로솜-포획된 ODN은 치료요법적으로 유용하고 정상 전구세포를 유지하면서 백혈병 세포를 제거하는데 있어 기존의 화학요법적 약물보다 훨씬 선택적이다.The virosomes of the present invention can be used in vitro or in vivo. For example, purging of bone marrow is used as a component in the treatment of several tumors, including acute and chronic leukemia. Currently, bone marrow removes leukemia cells with various drugs, such as immunological reagents and chemotherapy drugs. Non-rosome-captured ODN, which provides growth benefits to leukemia cells and targets oncogenes, is much more selective than conventional chemotherapeutic drugs in removing leukemia cells while being therapeutically useful and maintaining normal progenitor cells.
약물로 사용되는 경우에, 본 발명에 따른 비로솜은 일상적인 첨가제 및 제약학적으로 적합한 담체를 추가로 함유하는 제약학적 조성물의 일부가 될 수 있다. 제약학적 조성물은 주사용액으로 제조하는 것이 바람직하지만, 국소 또는 전신 투여를 위한 다른 형태의 제형, 예를 들면 에멀젼, 크림, 겔, 연고가 특정 목적에 이로울 수도 있다.When used as a medicament, the virosomes according to the invention may be part of a pharmaceutical composition further containing daily additives and a pharmaceutically suitable carrier. Pharmaceutical compositions are preferably prepared in injectable solutions, but other forms of formulation for topical or systemic administration, such as emulsions, creams, gels, ointments, may be beneficial for certain purposes.
따라서, 본 발명의 목적은 이런 치료로부터 혜택을 볼 수 있는 동물이나 사람 개체의 예방적 및/또는 치료적 처리에 적합한 제약학적 조성물을 제조하는데 본 발명의 비로솜을 이용하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 시험관내와 생체내 용도의 진단 키트 제조에 본 발명의 비로솜을 이용하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to use the virosomes of the present invention to prepare pharmaceutical compositions suitable for the prophylactic and / or therapeutic treatment of an animal or human individual who would benefit from such treatment. Another object of the present invention is to use the virosomes of the present invention for the production of diagnostic kits for in vitro and in vivo use.
본 발명의 소포는 WO97/41834의 실시예 1 내지 3과 6에 개시된 DOTAP 비로솜을 제조하는 공정중 임의 한가지와 유사한 공정으로 수득하지만, DOSPER이 DOTAP를 대체하고 최종 비로솜 막에서 DOSPER 농도가 비로솜의 전체 지질 함량의 30wt%를 초과하지 않는 범위내에서 하기에 정의된 바와 같이 조절되는 점은 예외로 한다.기본적으로, 본 발명에 따른 비로솜의 제조 방법은 다음의 단계로 구성된다:The vesicles of the present invention were obtained by a process similar to any one of the processes for preparing the DOTAP virosomes disclosed in Examples 1 to 3 and 6 of WO97 / 41834, but DOSPER replaced DOTAP and the DOSPER concentration in the final virosome membrane was With the exception of being controlled as defined below within a range not exceeding 30 wt% of the total lipid content of the cotton. Basically, the process for preparing virosomes according to the invention consists of the following steps:
a) 비-이온성 세정제를 함유하고 추가적으로 DOSPER, 다른 지질, 한가지이상의 활성 용해성(fusogenic) 펩티드를 함유하는 완충용액을 제조하고, 여기서 상기 펩티드는 수용체-매개된 식균작용 또는 세포내이입을 통하여, 표적 세포에 의해 소포가 흡수되도록 하는 비-센다이 바이러스 헤마글루티닌이다;a) preparing a buffer containing a non-ionic detergent and additionally containing DOSPER, another lipid, one or more active fusogenic peptides, wherein the peptides are via receptor-mediated phagocytosis or endocytosis, Non-Sendai virus hemagglutinin that allows vesicles to be taken up by target cells;
b) 전체 막 지질에 기초하여 지질 농도를 5 내지 30wt%의 DOSPER 및 95 내지 70wt%의 다른 지질로 조정하고, 여기서 상기 다른 지질은 포스파티딜콜린(PC) 또는 이의 유도체 및 선택적으로 포스파티딜에탄올아민(PE) 및/또는 DOSPER를 제외한 양이온성 지질로 구성되고;b) adjusting the lipid concentration to 5-30 wt% DOSPER and 95-70 wt% other lipids based on total membrane lipids, wherein the other lipids are phosphatidylcholine (PC) or derivatives thereof and optionally phosphatidylethanolamine (PE) And / or cationic lipids except DOSPER;
c) 희석으로 또는 미세담체 비드로 상기 용액을 처리하여 세정제를 제거하여, 양으로 하전된 지질 이중층 소포를 생성하고;c) treating the solution with dilution or with microcarrier beads to remove the detergent, resulting in positively charged lipid bilayer vesicles;
d) 표적 세포로 전달되는 일정량의 소요 약물 또는 물질을 소포에 통합하고, 여기서 상기 소요 약물 또는 물질은 가급적, 음으로 대전되고 염료, 미량원소, 화장용 약물, 제약학적 또는 생리학적 활성물질, 핵산 물질에서 선택된다.d) incorporating into the vesicle a quantity of the required drug or substance delivered to the target cell, wherein the required drug or substance is preferably negatively charged and contains dyes, trace elements, cosmetic drugs, pharmaceutical or physiologically active substances, nucleic acids Selected from the material.
비로솜의 생체내 적용에 적합한 본 발명의 다른 구체예에서, 적절한 이중기능성 가교제는 소포 막에 세포-특이적 마커를 비가역적으로 결합시키는데 사용된다. 비로솜의 세포에 대한 선택적 결합을 담당하는 세포-수용체로 지향하는 세포-특이적 마커는 완전한 생물학적 활성을 유지한 상태로 가교제와 결합시킨다. 가교제는 분자-복합체 형태로 사용되는 것이 바람직한데, 여기서 가교제는 특허청구범위에서 정의한 바와 같이 포스파티딜에탄올아민 및 세포-특이적 마커와 공유결합한다.In another embodiment of the invention suitable for in vivo application of virosomes, suitable bifunctional crosslinking agents are used to irreversibly bind cell-specific markers to the vesicle membrane. Cell-specific markers directed to cell-receptors responsible for the selective binding of non-rosomes to cells bind with crosslinkers while maintaining complete biological activity. The crosslinking agent is preferably used in the form of a molecule-complex, wherein the crosslinking agent covalently binds to phosphatidylethanolamine and cell-specific markers as defined in the claims.
"용해성 펩티드"는 비로솜 막 및 표적 세포의 지질막사이의 융합 반응을 유도 및/또는 촉진할 수 있는 단백질을 의미한다. 대부분의 경우에, 이는 융합 단백질을 포함하는 바이러스 스파이크 당단백질, 특히 바이러스 표면 스파이크의 완전한 헤마글루티닌 삼합체, 이의 단량체, 또는 기능성 융합 단백질을 보유하는 아단위체인 글리코펩티드 HA1과 HA2를 의미한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 이는 자연 공급원에서 분리된 또는 인공적으로 생산된 순수한 융합펩티드 자체를 의미한다. 본 발명의 특히 적절한 구체예에서, 융합펩티드를 보유하는 이들 폴리펩티드는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, 예를 들면 A-H1N1 아형중 한가지를 의미한다."Soluble peptide" means a protein capable of inducing and / or promoting a fusion reaction between a non-rosome membrane and a lipid membrane of a target cell. In most cases, this means viral spike glycoproteins, including fusion proteins, in particular the complete hemagglutinin trimer of viral surface spikes, monomers thereof, or subunits carrying functional fusion proteins, glycopeptides HA1 and HA2. . In another embodiment of the present invention, this means the pure fusion peptide itself or isolated from a natural source. In a particularly suitable embodiment of the invention, these polypeptides carrying the fusion peptide refer to one of the influenza virus hemagglutinin, eg, the A-H1N1 subtype.
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 대신에 또는 이에 더하여, 다른 바이러스로부터 기원한 헤마글루티닌을 본 발명에 따른 비로솜의 융합펩티드(단백질)로 사용할 수 있지만, 이들은 인플루엔자 헤마글루티닌과 동일한 pH-매개된 세포 침투 기전을 반드시 발휘해야 한다. 후보 헤마글루티닌에는 WO97/41834에 개시된 라브도바이러스, III형 파라인플루엔자 바이러스, 셈리키삼림 바이러스, 토가바이러스가 포함된다.Instead of or in addition to the influenza virus hemagglutinin, hemagglutinin originating from other viruses can be used as the fusion peptide (protein) of the virosomes according to the invention, but these are the same pH-mediated as influenza hemagglutinin. The mechanism of cellular infiltration must be exerted. Candidate hemagglutinins include the Lavdovirus, type III parainfluenza virus, Semiki forest virus, togavirus disclosed in WO97 / 41834.
"가교제"는 본 발명에 따라 만들어진 소포의 표면과 결합될 수 있고 펩티드와 결합할 수 있는 유기 헤테로이중기능성 분자를 의미한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 이런 분자는 포스파티딜에탄올아민의 아미노기와 결합하기 위한 N-하이드록시숙시니미드기 및 세포-특이적 마크(예, 단클론항체 단편)와의 공액을 위한말레이미드기를 보유한다. 적절한 가교제는 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사클로헥산-1-카르복실레이트, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포숙시니미드 에스테르, 숙시니미딜 4(p-말레이미도페닐)-부티레이트, 설포숙시니미딜 4(p-말레이미도페닐)부티레이트로 구성된다; 대안으로, 가교제는 N-하이드록시숙시니미드기 및 마커, 예를 들면 사이토킨[예, N-하이드록시숙시니미딜수베레이트(NHS-SA), N-하이드록시숙시니미딜-4-아지도벤조에이트(HASAB), N-숙시니미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(SANPAH), N-설포숙시니미딜-6-(4'-아지도-2-니트로페닐아미노)헥사노에이트]와 결합하는 광반응성 아지도기를 보유하는 분자일 수도 있다."Crosslinker" means an organic heterobifunctional molecule capable of binding to the surface of a vesicle made in accordance with the present invention and capable of binding to a peptide. In a suitable embodiment of the invention, such molecules carry N-hydroxysuccinimide groups for binding to the amino groups of phosphatidylethanolamine and maleimide groups for conjugation with cell-specific marks (eg monoclonal antibody fragments). . Suitable crosslinkers include succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) -sacclohexane-1-carboxylate, m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, m-maleimidobenzoyl-N-hydr Roxulfosuccinimide ester, succinimidyl 4 (p-maleimidophenyl) -butyrate, sulfosuccinimidyl 4 (p-maleimidophenyl) butyrate; Alternatively, the crosslinking agent may contain N-hydroxysuccinimide groups and markers such as cytokines such as N-hydroxysuccinimidyl suverate (NHS-SA), N-hydroxysuccinimidyl-4-azido Benzoate (HASAB), N-succinimidyl-6- (4'-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (SANPAH), N-sulfosuccinimidyl-6- (4'-azide Fig. 2-nitrophenylamino) hexanoate] may be a molecule having a photoreactive azido group.
가교제는 지질 + 가교제 + 세포-특이적 마커의 분자 복합체 형태로 사용하는 것이 바람직하다.The crosslinking agent is preferably used in the form of a molecular complex of lipid + crosslinking agent + cell-specific marker.
"세포-특이적 단백질" 또는 "세포-특이적 마커"는 각각, 가교제 또는 가교제-지질 복합체와 결합할 수 있고 추가적으로 표적 세포의 수용체와 결합할 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 적절한 구체예에서, 상기 분자는 단클론항체, 항체 단편, 사이토킨 또는 성장인자를 의미한다. 세포-특이적 마커는 표적 세포의 선택적 감지와 결합을 제공하고, 따라서 비로솜 막에 동시에 존재하는 용해성 펩티드의 작용을 향상시킨다. 적절한 항체단편은 F(ab')2와 Fab' 단편으로 구성되고, 세포-특이적 마커는 하기 표1에서 기재된 인터루킨과 다른 사이토킨을 추가로 보유할 수 있다."Cell-specific protein" or "cell-specific marker" refers to a protein capable of binding to a crosslinking agent or a crosslinking agent-lipid complex and additionally to a receptor of a target cell, respectively. In a suitable embodiment of the present invention, the molecule means monoclonal antibody, antibody fragment, cytokine or growth factor. Cell-specific markers provide for selective sensing and binding of target cells, thus enhancing the action of soluble peptides present simultaneously in non-rosome membranes. Suitable antibody fragments consist of F (ab ') 2 and Fab' fragments, and the cell-specific marker may further carry cytokines other than the interleukins described in Table 1 below.
본원에서 "양이온성 지질"은 양이온성 성분과 비극성 꼬리를 보유하는 유기 분자, 다시 말하면 수미식(head-to-tail) 친양쪽성체, 예를 들면 N-[(1,2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트릴메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)(Felgner et al.; Proc Natl Acad USA 84: 7413-7417, 1987), N-[(1,2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄메틸설페이트(DOTAP); 또는 N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실아미노프로피온아미딘(Ruysschaert et al.; Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:1622-1628, 1994)을 의미한다. 달리 명시하지 않는 경우, 여기에는 후술한 다가양이온성 지질이 포함된다.As used herein, “cationic lipid” refers to an organic molecule having a cationic component and a nonpolar tail, ie, a head-to-tail amphiphile, such as N-[(1,2,3-dioleyl). Oxy) propyl] -N, N, N-trimethylmethylammonium chloride (DOTMA) (Felgner et al .; Proc Natl Acad USA 84: 7413-7417, 1987), N-[(1,2,3-dioleoyloxy ) -Propyl] -N, N, N-trimethylammoniummethylsulfate (DOTAP); Or N-t-butyl-N'-tetradecyl-3-tetradecylaminopropionamidine (Ruysschaert et al .; Biochem. Biophys. Res. Commun. 203: 1622-1628, 1994). Unless otherwise specified, this includes the polycationic lipids described below.
"다가양이온성 지질"은 다가양이온성 성분 및 비극성 꼬리를 보유하는 유기 분자, 예를 들면 리포스페르민: 1,3-디팔미토일-2-포스파티딜에탄올아미도-스페르민(DPPES)과 디옥타데실아미도글리실 스페르민(DOGS)(Behr et al.; Proc. Natl. Acad. USA 86:6982-686, 1989); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판암모늄 트리플루오르아세테이트(DOSPA); 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드(DOSPER); N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-하이드록시에틸)-2,3-디올레일옥시-1,4-부탄디암모늄 요오드(THDOB)를 의미한다."Polycationic lipids" refer to organic molecules having a polycationic component and a nonpolar tail, such as liphosphfermine: 1,3-dipalmitoyl-2-phosphatidylethanolamido-spermine (DPPES) and Dioctadecylamidoglyl spermine (DOGS) (Behr et al .; Proc. Natl. Acad. USA 86: 6982-686, 1989); 2,3-dioleyloxy-N- [2 (sperminecarboxamido) ethyl] -N, N-dimethyl-1-propaneammonium trifluoroacetate (DOSPA); 1,3-dioleyloxy-2- (6-carboxy-spermil) -propylamide (DOSPER); N, N, N ', N'-tetramethyl-N, N'-bis (2-hydroxyethyl) -2,3-dioleyloxy-1,4-butanediammonium iodine (THDOB).
본 발명의 모든 비로솜은 필수적으로, DOSPER 및 한가지이상의 양으로 하전된 또는 중성의 고유 또는 합성 지질을 보유해야 한다. "양으로 하전된"은 지질이 생리 pH에서 양전하를 갖는 것을 의미한다. 따라서, "양으로 하전된" 지질, 막 또는 비로솜은 생리 pH에서 양전하 지질, 막 또는 비로솜을 의미한다. "중성 지질"은 생리 pH에서 극성을 나타내지 않고 콜레스테롤이나 이의 유도체 및/또는 분자내에 양전하와 음전하 영역을 보유하여 입체화학적으로 중성인 양쪽이온성 지질과 같은 지질로 구성된다.All virosomes of the present invention must have DOSPER and at least one positively charged or neutral intrinsic or synthetic lipid. "Positively charged" means that the lipid has a positive charge at physiological pH. Thus, “positively charged” lipids, membranes, or non-somes mean positively charged lipids, membranes, or non-somes at physiological pH. "Neutral lipids" consist of lipids such as stereochemically neutral zwitterionic lipids that are polar in physiological pH and have positive and negative charge regions in cholesterol or derivatives thereof and / or molecules.
본원에서 "음으로 하전된 물질"은 생리 pH에서 음전하를 갖는 임의의 소요 약물 또는 물질로 구성된다.A “negatively charged substance” herein consists of any required drug or substance that has a negative charge at physiological pH.
"소요 약물 또는 물질"에는 미용, 진단, 약학, 의학 또는 임의 다른 과학적 목적에 적용할 수 있는 임의의 화학적 물질, 화합물, 또는 화합물의 혼합물이 포함된다. 이런 물질은 생체내 또는 시험관내에서 분석적으로 모니터할 수 있는 화합물, 예를 들면 염료, 형광 염료, 방사능 혹은 다르게 표지된 화합물, 미량원소, 또는 마커 물질을 함유한다; 또한, 이들은 단백질이나 비-단백질 약물 또는 임의의 다른 제약학적 혹은 생리학적 활성 물질, 특히 통상적인 항-바이러스 또는 항-암 약물뿐만 아니라 본원에서 밝힌 핵산 화합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 비로솜은 생리 pH에서 양으로 하전되기 때문에, 여기에 중성 또는 음으로 하전된 소요 약물이나 물질을 적하하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이들이 비로솜으로의 가장 효율적이고 안정적인 통합을 가능하게 하기 때문이다."Required drug or substance" includes any chemical substance, compound, or mixture of compounds applicable to cosmetic, diagnostic, pharmaceutical, medical, or any other scientific purpose. Such materials contain compounds that can be analyzed analytically in vivo or in vitro, such as dyes, fluorescent dyes, radioactive or otherwise labeled compounds, trace elements, or marker materials; In addition, they may contain proteins or non-protein drugs or any other pharmaceutically or physiologically active substance, especially conventional anti-viral or anti-cancer drugs, as well as the nucleic acid compounds disclosed herein. Since the virosomes of the present invention are positively charged at physiological pH, it is desirable to add neutral or negatively charged required drugs or substances to them, since they allow for the most efficient and stable integration into the virosomes. Because.
본원에서 "핵산" 또는 "유전 물질"에는 짧은 DNA나 RNA 사슬, 데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 셀레노에이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트(OPTs), 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포라미데이트, 올리고데옥시리보뉴클레오티드 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산(PNAs), 리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드, 올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 2'-Ome-올리고리보뉴클레오티드 포스페이트, 2'-Ome-올리고리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트, 리보자임(효소활성을 가진 RNA 분자), 유전자, 플라스미드, 벡터(클로닝 운반체)가 포함된다."Nucleic acid" or "genetic material" herein includes short DNA or RNA chains, deoxyribonucleotides, oligodeoxyribonucleotides, oligodeoxyribonucleotide selenates, oligodeoxyribonucleotide phosphorothioates (OPTs), Oligodeoxyribonucleotide phosphoramidate, oligodeoxyribonucleotide methylphosphonate, peptide nucleic acids (PNAs), ribonucleotides, oligoribonucleotides, oligoribonucleotide phosphorothioates, 2'-Ome-oligoribonucleotide phosphates , 2'-Ome-oligoribonucleotide phosphorothioate, ribozymes (RNA molecules with enzymatic activity), genes, plasmids, vectors (cloning carriers).
본원에서 "비로솜"은 양이온성 지질 및 내부-가급적 수용성-공간으로 구성되는 이중층 막을 갖는 리포좀성 운반체를 의미하는데, 여기서 상기 막은 바이러스 단백질, 특히 바이러스 당단백질을 추가로 포함한다. 적절한 구체예에서, 바이러스 단백질은 완전한 생물융합활성을 갖는 한가지이상의 용해성 펩티드 또는 단백질, 특히 인플루엔자 A(예, A/Singapore)바이러스의 스파이크 당단백질 헤마글루티닌 및/또는 뉴우라미니다제로 구성된다. 인지하는 바와 같이, 이런 바이러스 단백질에는 본원에서 밝힌 인플루엔자 바이러스의 융합단백질에 상응하는 또는 이와 대등한 합성 아미노산서열이 포함된다. 막 지질은 전술한 양이온성 지질로 구성되지만, 다른 천연 및/또는 합성 지질, 바람직하게는 인지질(예, 포스파티딜콜린(PC)과 포스파티딜에탄올아민(PE))을 추가로 함유할 수 있다.By “birosome” herein is meant a liposome carrier having a bilayer membrane consisting of a cationic lipid and an inner-preferably water-soluble space, wherein the membrane further comprises a viral protein, in particular a viral glycoprotein. In a suitable embodiment, the viral protein consists of one or more soluble peptides or proteins with full biofusion activity, in particular the spike glycoprotein hemagglutinin and / or nuuraminidase of influenza A (eg A / Singapore) virus. As will be appreciated, such viral proteins include synthetic amino acid sequences corresponding to or equivalent to the fusion proteins of influenza viruses disclosed herein. The membrane lipids are composed of the cationic lipids described above, but may further contain other natural and / or synthetic lipids, preferably phospholipids (eg, phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE)).
본 발명의 양이온성 비로솜이 많은 경우에(특히, 시험관내 세포배양액 실험에서) 막에서 세포-특이적 마커없이 성공적으로 이용될 수 있지만, 생체내 적용시에는 전술한 바와 같이 막에서 한가지이상의 세포-특이적 마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 소포의 평균 직경은 전자 현미경 및 동적광산란 측정에서 120-180nm이다.Although the cationic virosomes of the present invention can be successfully used in many cases (especially in in vitro cell culture experiments) without cell-specific markers in membranes, in vivo applications more than one cell-in membrane as described above. It is preferred to further comprise specific markers. The average diameter of the vesicles is 120-180 nm in electron microscopy and dynamic light scattering measurements.
유전 물질을 비롯한 소요의 약물 또는 물질을 위한 운반체로 본 발명의 양이온성 비로솜을 이용함으로써, 독성에 기인한 원치않는 부작용을 예방 또는 적어도 현저하게 감소시킬 수 있다. 이런 유익한 효과는 본 발명의 양이온성 비로솜이 이전에 공지된 리포좀 또는 비로솜과 비교하여, 포획된 물질, 특히 음으로 하전된 물질(예, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 표적 세포로의 전달 및 좀더 중요하게는 트랜스펙션된 핵산 물질의 표적 세포에 의한 발현에서 훨씬 높은 활성과 효율을 갖기 때문에 가능하다.By using the cationic virosomes of the present invention as carriers for drugs or substances of interest, including genetic material, unwanted side effects due to toxicity can be prevented or at least significantly reduced. This beneficial effect is such that the cationic virosomes of the present invention are more importantly compared to previously known liposomes or virosomes, and more importantly, the delivery of the captured material, in particular negatively charged material (eg antisense oligonucleotides) to the target cell. Is possible because it has much higher activity and efficiency in expression by the target cell of the transfected nucleic acid material.
따라서, 본 발명의 목적은 특허청구범위 제1항에 정의된 DOSPER 비로솜 및 후속 제2항 내지 11항에서 구체예로 정의된 이의 변이체를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 제12항에서 정의된 바와 같이 다양한 용도에 적합한 담체와 함께 신규한 비로솜을 함유하는 조성물을 제공하는 것이다.It is therefore an object of the present invention to provide a DOSPER virosome as defined in claim 1 and variants thereof as defined in the following claims 2 to 11. Another object of the present invention is to provide a composition containing the novel virosomes with a carrier suitable for various uses as defined in claim 12.
본 발명의 또 다른 목적은 제13항에 정의된 바와 같이 신규한 비로솜을 만드는 방법 및 제14항 내지 제24항에서 정의된 이의 개변을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for making novel virosomes as defined in claim 13 and modifications thereof as defined in claims 14 to 24.
본 발명의 또 다른 목적은 제25항 내지 29항에 정의된 바와 같이 본 발명을 이용하는 좀더 구체적인 방법을 설시하고 청구하는 것이다.Another object of the present invention is to set forth and claim a more specific method of using the present invention as defined in claims 25-29.
본원 발명을 좀더 완벽하게 이해하도록 하기 위하여, 다음의 실체예를 제시한다. 이들 실시예는 설명을 목적으로 하고, 따라서 본 발명을 전혀 제한하지 않는다.To more fully understand the present invention, the following working examples are presented. These examples are for illustrative purposes and therefore do not limit the invention at all.
실시예 1: 인플루엔자 바이러스로부터 기원한 완전한 융합-활성 바이러스 헤마글루티닌으로 DOSPER 비로솜 제조Example 1 DOSPER Virosome Preparation with Complete Fusion-Active Virus Hemagglutinin Originating from Influenza Virus
인플루엔자 바이러스의 A/Singapore/6/86 균주에 기원한 헤마글루티닌(HA)은 Skehei와 Schild(1971), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 79:968-972에서 밝힌 바와 같이 분리한다. 간단히 말하면, 바이러스는 계란의 요막강에 성장시키고, 설탕 기울기 침강에서 원심분리로 2번 정제한다. 정제된 바이러스는 7.9㎎/㎖ NaCl, 4.4㎎/㎖ 트리소디움시트레이트-2H2O, 2.1㎎/㎖ 2-모르폴리노에탄 설폰산, 1.2㎎/㎖ N-하이드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄 설폰산 pH 7.3을 함유한 완충액에서 안정화시킨다. 345㎍ HA/㎖를 함유하는 53㎖의 바이러스 현탁액은 10분동안 100,000xg에서 원심분리로 펠렛한다. 145mM NaCl, 2.5mM HEPES, 54㎎/㎖ 비-이온성 세정제 옥타에틸렌글리콜 모노도데실에테르(OEG=C12E8)(pH 7.4)를 함유하는 7.7㎖의 완충 세정액을 인플루엔자 바이러스 펠렛에 첨가한다. 상기 펠렛은 실온에서 2분동안 초음파처리로 완전히 용해시킨다. 상기 용액은 1시간동안 100,000xg에서 원심분리한다. 수득된 상층액은 용해된 HA 삼합체(1.635㎎ HA/㎖) 및 미량의 뉴우라미니다제를 함유하고, 0.5-2㎎ DOSPER 및 5.5-4㎎(6㎎ 전체 지질의 나머지)의 디올레일포스파티딜콜린(DOPC)은 상기 상층액(6㎎ HA)에 첨가하고 용해시킨다. 용액은 0.2㎛ 필터를 통과시켜 멸균하고, 이후 1.15g의 멸균 미세담체 비드, 바람직하게는 바이오비드 SM2를 포함하는 유리 용기로 옮긴다. 상기 용기는 진탕기 REAX2(Heidolph, Kelheim, Germany)로 1시간동안 교반한다. 필요한 경우, 이런 과정은 0.58㎎ 바이오비드로 최대 3회 반복한다. 이들 과정이후에, DOSPER 비로솜의 약간 투명한 용액을 수득한다.Hemagglutinin (HA) originated from the A / Singapore / 6/86 strain of influenza virus (Skehei and Schild (1971), Proc. Natl. Acad. Isolate as described in Sci, USA 79: 968-972. In brief, the virus grows in the urethral cavity of the egg and is purified twice by centrifugation on sugar gradient sedimentation. Purified virus was 7.9 mg / ml NaCl, 4.4 mg / ml trisodium citrate-2H2O, 2.1 mg / ml 2-morpholinoethane sulfonic acid, 1.2 mg / ml N-hydroxyethyl-piperazine-N'- It is stabilized in a buffer containing 2-ethane sulfonic acid pH 7.3. 53 ml of viral suspension containing 345 μg HA / ml is pelleted by centrifugation at 100,000 × g for 10 minutes. 7.7 ml buffered buffer containing 145 mM NaCl, 2.5 mM HEPES, 54 mg / ml non-ionic detergent octaethyleneglycol monododecylether (OEG = C12E8) (pH 7.4) is added to influenza virus pellets. The pellet is completely dissolved by sonication for 2 minutes at room temperature. The solution is centrifuged at 100,000 × g for 1 hour. The supernatant obtained contains dissolved HA trimers (1.635 mg HA / ml) and trace amounts of nuuraminidase, and 0.5-2 mg DOSPER and 5.5-4 mg (rest of 6 mg total lipid) of dioleylphosphatidylcholine (DOPC) is added to and dissolved in the supernatant (6 mg HA). The solution is sterilized by passing through a 0.2 μm filter and then transferred to a glass vessel containing 1.15 g of sterile microcarrier beads, preferably biobead SM2. The vessel is stirred for 1 hour with shaker REAX2 (Heidolph, Kelheim, Germany). If necessary, this process is repeated up to three times with 0.58 mg biobead. After these procedures, a slightly clear solution of DOSPER virosome is obtained.
최적의 결과는 4.5㎎ DOPC당 1.5㎎ DOSPER(전체 지질의 25wt%)의 지질 비율을 보유하는 비로솜 제형에서 달성된다. 더 높은 DOSPER 농도(예, 30-35wt%)에서는 세정제 제거직후에 적절한 비로솜이 형성되지 않는다.Optimal results are achieved in virosome formulations having a lipid ratio of 1.5 mg DOSPER (25 wt% of total lipids) per 4.5 mg DOPC. At higher DOSPER concentrations (eg, 30-35 wt%) no suitable virosomes are formed immediately after detergent removal.
트랜스펙션 활성의 현저한 손실없이, DOPC를 PE(포스파티딜에탄올아민) 및/또는 다른 양이온성 지질(예, DOTAP 또는 DOSPA)로 부분적으로 대체할 수 있다.Without significant loss of transfection activity, DOPC can be partially replaced with PE (phosphatidylethanolamine) and / or other cationic lipids (eg DOTAP or DOSPA).
포스포로티오에이트 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 DOSPER 비로솜으로의 통합:Integration of phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides into DOSPER virosomes:
L-myc 유전자의 안티센스와 센스 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트는 트랜스펙션에서 양이온성 비로솜의 높은 효능을 입증하는 실례로서 활용한다. 5'-FITC-OPT는 포스포르아미디트 화학적 성상을 통하여 합성한다(Microsynth Gmbh, Balgach, Switzerland). 펜타데카머(5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3')와 펜타데카머(5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3')는 각각 안티센스 OPT와 센스 OPT로 사용한다. 안티센스 OPT 및 센스 OPT와 동일한 길이의 뉴클레오티드로 구성되는 혼성 서열 대조군(msc) OPT를 합성한다.Antisense and sense oligodeoxyribonucleotide phosphorothioates of the L-myc gene are used as examples demonstrating the high efficacy of cationic virosomes in transfection. 5'-FITC-OPT is synthesized via phosphoramidite chemical properties (Microsynth Gmbh, Balgach, Switzerland). Pentadecamer (5'-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3 ') and Pentadecamer (5'-FITC-GCGGACATGGACTAC-3') are used as antisense OPT and sense OPT, respectively. A hybrid sequence control (msc) OPT consisting of nucleotides of the same length as the antisense OPT and sense OPT is synthesized.
1㎖의 DOSPER 비로솜은 다음 각각에 첨가한다:1 ml of DOSPER virosome is added to each of the following:
a) 2㎎의 안티센스 FITC-OPT(1.3μmol);a) 2 mg antisense FITC-OPT (1.3 μmol);
b) 3.4㎎의 센스 FITC-OPT(1.3μmol)b) 3.4 mg sense FITC-OPT (1.3 μmol)
c) 3.1㎎의 msc FITC-OPT(1.3μmol).c) 3.1 mg msc FITC-OPT (1.3 μmol).
FITC-OPT는 용해시키고, 용액은 이후 26℃에서 2분동안 초음파처리한다. 포획되지 않은 FITC-OPT는 High Load Superdex 200 칼럼(Pharmacia, Sweden)에서 겔 여과로 비로솜으로부터 분리한다. 상기 칼럼은 멸균 PBS로 평형화시킨다. 포획된 FITC-OPT를 보유한 DOSPER 비로솜을 함유하는 틈새부피 분취량은 PBS로 용출하고 수거한다. 비로솜-포획된 FITC-OPT 농도는 0.1%(v/v) Triton X-100을 함유하는 0.1M NaOH에 비로솜을 완전히 용해시킨 이후, 형광광도분석법으로 측정한다. 형광 등급의 측정에서, 상기 세정액에 용해된 빈 DOSPER-비로솜의 형광은 0으로 설정한다.FITC-OPT is dissolved and the solution is then sonicated at 26 ° C. for 2 minutes. Uncaptured FITC-OPT is separated from virosomes by gel filtration on a High Load Superdex 200 column (Pharmacia, Sweden). The column is equilibrated with sterile PBS. Aliquots of crevice volumes containing DOSPER virosomes with captured FITC-OPT are eluted and collected in PBS. The nonrosome-captured FITC-OPT concentration was determined by fluorescence spectroscopy after complete dissolution of the nonrosome in 0.1M NaOH containing 0.1% (v / v) Triton X-100. In the measurement of the fluorescence grade, the fluorescence of the empty DOSPER-birosomes dissolved in the cleaning liquid is set to zero.
포스타티딜에탄올아민-이중기능성 가교제 분자복합체를 통한 비로솜에 Fab'-단편의 결합Binding of Fab'-fragments to Virosomes via a Phostatidylethanolamine-bifunctional Crosslinker Molecular Complex
2.8㎖의 시트르산 완충액(100mM NaCl, 40mM 시트르산, 35mM Na2HPO4.2H2O, 2mM EDTA, pH 5.5)에 녹인 뮤린 단클론성 안티-CD10-(AntiCALLA) 항체에서 기원한 3㎎의 Fab'는 0.5%의 n-옥틸-올리고-옥시에틸렌을 함유한 215㎕의 시트르산 완충액에 녹인 0.524㎎의 N-[4-(p-말레이미도-페닐)부티릴]포스파티딜에탄올아민(MPB.PB) 용액에 첨가한다. 이후, 혼합물은 부드럽게 교반하면서 4℃에서 16시간동안 질소하에 배양한다. 배양이후, 결합되지 않은 MPB.PB는 일단의 400㎕ 티오프로필 세파로즈 6B(Pharmacia, Sweden)로 제거한다. 혼합물은 실온에서 4시간동안 배양한다. 티오프로필 세파로즈 6B는 원심분리로 제거하고, 생성된 용액은 pH 7.0으로 중화시킨다. 중화된 용액은 OEG(54㎎/㎖)로 보충한다.3 mg of Fab 'originated from a murine monoclonal anti-CD10- (AntiCALLA) antibody dissolved in 2.8 ml of citric acid buffer (100 mM NaCl, 40 mM citric acid, 35 mM Na2HPO4.2H2O, 2 mM EDTA, pH 5.5) was 0.5% n- To a solution of 0.524 mg N- [4- (p-maleimido-phenyl) butyryl] phosphatidylethanolamine (MPB.PB) dissolved in 215 μl citric acid buffer containing octyl-oligo-oxyethylene. The mixture is then incubated under nitrogen at 4 ° C. for 16 hours with gentle stirring. After incubation, unbound MPB.PB is removed with a set of 400 μl thiopropyl Sepharose 6B (Pharmacia, Sweden). The mixture is incubated for 4 hours at room temperature. Thiopropyl Sepharose 6B is removed by centrifugation and the resulting solution is neutralized to pH 7.0. The neutralized solution is supplemented with OEG (54 mg / ml).
전술한 바와 같이 만들어진 용액은 DOSPER 비로솜의 제조 용액에 첨가한다. Fab'-MPB.PB 분자는 비로솜 형성동안 지질이중층으로 삽입된다.The solution made as described above is added to the preparation solution of DOSPER virosome. Fab'-MPB.PB molecules are inserted into the lipid bilayer during virosome formation.
DOSPER 비로솜의 현미경사진은 레이저광산란 측정에서 대략 120 내지 180nm의 평균 직경을 갖는 소포의 적합한 단층 구조를 증거한다. 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 스파이크가 명확하게 드러난다.Photomicrographs of DOSPER virosomes demonstrate a suitable monolayer structure of vesicles with an average diameter of approximately 120-180 nm in laser light scattering measurements. The HA protein spikes of influenza viruses are clearly visible.
본 발명에 따른 DOSPER 비로솜의 완전 용해활성은 Hoekstra et al.(1984), Biochemistry 23:5675-5681 및 L. Luscher et al.(1993), Arch. Virol. 130:317-326에 개시된 형광 탈소광(dequenching)에 기초한 정량 분석으로 확인한다. DOSER와 HA를 함유한 완충 OEG(C12E8) 용액을 형광 프로브의 박막 건조 필름에 첨가하고, 5 내지 10분동안 교반하여 상기 프로브를 용해시키고, 이후 상기 "...DOSPER 비로솜 제조"에서 밝힌 바와 같이 진행시켜, DOSPER 비로솜 막에 형광 프로브 옥타데실 로다민 B 클로라이드(R18)(Molecular Probes Inc., Eugene, USA)를 고밀도로 삽입한다. 희석된 소광 로다민은 모델 리포좀(DOSPER/DOPC:DOSPER 비로솜의 비율=1:20)을 보유한 로다민-표지된 DOSPER 비로솜의 배양으로 관찰한다. 형광은 각각 560nm 여기 파장과 590nm 방출 파장에서 Perkin-Elmer 1000 형광분석계로 측정한다.The complete dissolution activity of DOSPER virosomes according to the present invention is described by Hoekstra et al. (1984), Biochemistry 23: 5675-5681 and L. Luscher et al. (1993), Arch. Virol. Confirmation by quantitative analysis based on fluorescence dequenching disclosed in 130: 317-326. A buffered OEG (C 12 E 8 ) solution containing DOSER and HA was added to the thin film dry film of the fluorescent probe and stirred for 5-10 minutes to dissolve the probe, followed by the "preparing DOSPER virosome". Proceed as shown in the following, the DOSPER virosome membrane is inserted at high density with a fluorescent probe octadecyl rhodamine B chloride (R18) (Molecular Probes Inc., Eugene, USA). Diluted matted rhodamine was observed by incubation of the rhodamine-labeled DOSPER virosome with model liposomes (ratio of DOSPER / DOPC: DOSPER virosome = 1: 20). Fluorescence is measured with a Perkin-Elmer 1000 fluorometer at 560 nm excitation wavelength and 590 nm emission wavelength, respectively.
실시예 2: 세포에 의한 비로솜의 흡수Example 2: Uptake of Virosomes by Cells
33 H-표지된 플라스미드의 DOSPER 비로솜으로의 통합:Integration of H-labeled plasmids into DOSPER virosomes:
기본적으로, 핵산 화합물의 비로솜으로의 통합은 다음과 같은 3가지 방법으로 달성한다:Basically, integration of the nucleic acid compound into the virosome is achieved in three ways:
1. 투석: 핵산 화합물은 비로솜 형성동안 포획되는데, 여기서 세정제 옥틸-POE(Alexis Corp., Laeufelfingen, Switzerland)은 투석으로 제거한다.1. Dialysis: Nucleic acid compounds are captured during nonrosome formation, where detergent Octyl-POE (Alexis Corp., Laeufelfingen, Switzerland) is removed by dialysis.
2 바이오비드: 핵산 화합물은 비로솜 형성동안 포획되는데, 여기서 세정제 OEG는 미세담체, 예를 들면 바이오비드 SM2로 제거한다.2 Biobeads: Nucleic acid compounds are captured during virosome formation, where the detergent OEG is removed with microcarriers such as biobead SM2.
3. 초음파처리: 핵산 화합물은 양이온성 지질, 바람직하게는 DOSPER로 포획되고, 수득된 핵산-적하된 리포좀이나 리포좀 복합체, 바람직하게는 DOSPER 리포좀이나 지질 복합체는 초음파처리로 DOSPER 비로솜과 융합시킨다.3. Sonication: The nucleic acid compounds are captured with cationic lipids, preferably DOSPER, and the resulting nucleic acid-loaded liposomes or liposome complexes, preferably DOSPER liposomes or lipid complexes, are fused with DOSPER virosomes by sonication.
최적 통합율이 3번째 방법에서 얻어지기 때문에, 대부분의 실험에서 핵산 물질의 비로솜으로의 통합은 융합 방법을 활용하여 실시한다.Since the optimal integration rate is obtained in the third method, in most experiments the integration of the nucleic acid material into the virosome is carried out using the fusion method.
플라스미드 pGEEN LANTERNTM-1(GIBCO-BRL)은 트랜스펙션 효율의 정확한 정량을 위한 방사능 표지된 플라스미드를 얻기 위하여, 3H-메틸티미딘의 존재하에 대장균(E.coli)에서 생산한다. 플라스미드의 특이적 활성은 6.625x1010dpm/g(= 29.84 mCi/g)이다.Plasmid pGEEN LANTERN ™ -1 (GIBCO-BRL) is produced in E. coli in the presence of 3H-methylthymidine to obtain radiolabeled plasmids for accurate quantification of transfection efficiency. The specific activity of the plasmid is 6.625x10 10 dpm / g (= 29.84 mCi / g).
11.6㎍의3H 표지된 플라스미드(17.5㎕)는 480㎕ HEPES-NaCl-완충액에 용해시킨다. 116㎍ DOSPER(1㎍/㎕)를 첨가한 이후, 생성된 혼합물은 30초동안 초음파처리하고 15분동안 안정시킨다. 여기서, DOSPER와 플라스미드로 구성되는 지질 복합체가 형성된다. 대안으로, 지질 복합체 대신에, DOSPER와 플라스미드를 함유하는 OEG 완충액으로부터 통상적 방법으로 DOSPER 리포좀을 생산하고, 이후 투석 또는 세정제-흡수 미세담체로 세정제를 제거하고, 선택적으로 초음파처리하여 플라스미드가 적하된 DOSPER 리포좀을 생산할 수 있다.11.6 μg 3 H labeled plasmid (17.5 μl) is dissolved in 480 μl HEPES-NaCl-buffer. After addition of 116 μg DOSPER (1 μg / μl), the resulting mixture was sonicated for 30 seconds and allowed to settle for 15 minutes. Here, a lipid complex consisting of DOSPER and plasmid is formed. Alternatively, instead of the lipid complex, DOSPER liposomes are produced in a conventional manner from OEG buffer containing DOSPER and plasmid, and then the detergent is removed by dialysis or detergent-absorbing microcarriers and optionally sonicated to drop plasmid Liposomes can be produced.
플라스미드-적하된 지질 복합체 또는 리포좀을 함유하는 용액에, 93㎕의 선-제조된(실시예 1) 빈 DOSPER 비로솜을 첨가한다. 상기 혼합물은 1분동안 초음파처리로 DOSPER 비로솜 및 리포좀 또는 지질 복합체를 융합시켜, 비로솜으로 플라스미드를 통합시킨다. 소요 물질을 비로솜에 통합하는 이런 방법은 핵산 물질을 제외한 약물 또는 물질, 바람직하게는 음으로 대전된 물질의 통합에도 적용할 수 있다.To a solution containing plasmid-loaded lipid complex or liposome, 93 μl of pre-prepared (Example 1) empty DOSPER virosome is added. The mixture fuses the DOSPER virosomes and liposomes or lipid complexes by sonication for 1 minute to incorporate the plasmid into the virosomes. This method of incorporating the desired substance into the virosome is also applicable to the incorporation of drugs or substances, preferably negatively charged substances, with the exception of nucleic acid substances.
DOSPER 비로솜과 DOSPER 리포좀에 의한By DOSPER virosome and DOSPER liposome 33 H-표지된 플라스미드의 트랜스펙션 효율 비교:Comparison of transfection efficiency of H-labeled plasmids:
33㎍의 표지된 플라스미드 DNA는 DOSPER 비로솜에 포획시키고, 11.7㎍은 선-제조된 DOSPER 리포좀에 포획시킨다. 4가지 상이한 부착 세포주, 다시 말하면 HeLa, 293T, COS-1, NIH3T3 및 현탁배양한 다른 세포주 K562와 P3/NSI/1-Ag4-1은 DOSPER 비로솜과 DOSPER 리포좀으로 트랜스펙션시킨다.33 μg of labeled plasmid DNA is captured in DOSPER virosomes and 11.7 μg is captured in pre-made DOSPER liposomes. Four different adherent cell lines, ie HeLa, 293T, COS-1, NIH3T3 and other cell lines K562 and P3 / NSI / 1-Ag4-1 in suspension culture, were transfected with DOSPER virosomes and DOSPER liposomes.
각 세포형의 5x105개 세포는 37℃에서 2, 4, 6, 24시간동안 25㎕의 플라스미드-보유 DOSPER-비로솜 또는 플라스미드-보유 DOSPER-리포좀 용액과 함께, 500㎕(=0.5㎖)의 배지에 배양한다. DOSPER-비로솜과 DOSPER-리포좀의 첨가된 분취량은 26,500dpm(=100%)의 방사능에 상응하는 400ng의 표지된 플라스미드를 함유한다. 배양이후, 세포는 세척 및 용해시키고, 흡수된 방사능은 베타계수기로 측정한다. 5 × 10 5 cells of each cell type were obtained at 500 μL (= 0.5 mL) with 25 μL of plasmid-containing DOSPER-virosome or plasmid-containing DOSPER-liposomal solution at 37 ° C. for 2, 4, 6, 24 hours. Incubate in medium. The added aliquots of DOSPER-birosomes and DOSPER-liposomes contain 400 ng of labeled plasmid corresponding to 26,500 dpm (= 100%) of radioactivity. After incubation, the cells are washed and lysed and the absorbed radioactivity is measured by beta counter.
흡수된 플라스미드-DNA의 함량에 대한 트랜스펙션 기간(배양 기간)의 영향을 평가하고, 결과는 도1 내지 6에 도시한다. 상기 도면의 간단한 설명은 각 도면에서 세포주를 요약한다. 도1-6은 모든 세포형 및 배양 기간에서 DOSPER-비로솜이 DOSPER-리포좀에 비하여 트랜스펙션 효율이 우월하다는 분명하게 보여준다. DOSPER-리포좀 단독으로 좀더 오랜 시간(6시와 24시)동안 배양하여도, DNA 흡수는 거의 증가하지 않는 반면에, DOSPER-비로솜으로 좀더 오랜 시간 배양하면 DNA 흡수가 현저하게 증가한다. 이런 결과는 세포 수용체에 대한 바이러스 결합 리간드의 도움이 없는 경우에, 비로솜의 HA-매개된 흡수가 DOSPER-리포좀에 의해 유도된 흡수보다 훨씬 효율적이라는 것을 시사한다. DOSPER-비로솜의 경우에, 6-24시간의 배양 기간동안 DNA 흡수가 증가하면서도 DNA의 통합이 포화되지 않는다는 점은 흥미로운데, 이는 세포 표면에서 비로솜의 수용체-매개된 세포내이입에 의해 수용체가 제거된 이후에 이들 수용체의 급속한 복구에 기인하는 것으로 생각된다. 일반적으로, 부착 세포주(단층에서 성장)는 현탁배양액에서 성장하는 세포주에 비하여 좀더 효과적으로 트랜스펙션되는 것으로 밝혀졌다.The influence of the transfection period (culture period) on the content of absorbed plasmid-DNA is assessed and the results are shown in FIGS. The brief description of these figures summarizes the cell lines in each figure. 1-6 clearly show that DOSPER-virosomes are superior in transfection efficiency to DOSPER-liposomes in all cell types and culture periods. Incubation with DOSPER-liposomes alone for longer periods of time (6 hours and 24 hours) shows little increase in DNA uptake, whereas longer incubation with DOSPER-birosomes significantly increases DNA uptake. These results suggest that in the absence of viral binding ligands to cell receptors, HA-mediated uptake of virosomes is much more efficient than uptake induced by DOSPER-liposomes. In the case of DOSPER-birosomes, it is interesting to note that the incorporation of DNA does not saturate while increasing the DNA uptake during the 6-24 hour incubation period, which is caused by receptor-mediated endocytosis of the nonrosomes at the cell surface. It is believed that this is due to the rapid recovery of these receptors after they have been removed. In general, adherent cell lines (grown in monolayers) have been found to transfect more effectively than cell lines growing in suspension culture.
실시예 3: 진핵세포에 의한 플라스미드의 시간-의존한 흡수Example 3: Time-dependent Uptake of Plasmids by Eukaryotic Cells
실시예 2는 다른3H-표지된 플라스미드, 다시 말하면 pcDNA3.1/His B/lacZ(공급자: Invitrogen, Groningen, The Netherlands)로 반복한다. 세포주 COS-1, K562, 293T, P3X63Ag8은 상기 플라스미드로 적하된 DOSPER 비로솜으로 트랜스펙션시키고, 2, 4, 72시간동안 배양한다. 본 실험에서 DOSPER 리포좀과의 비교는 실시하지 않는다.Example 2 is repeated with another 3 H-labeled plasmid, ie pcDNA3.1 / His B / lacZ (Supplier: Invitrogen, Groningen, The Netherlands). Cell lines COS-1, K562, 293T, P3X63Ag8 were transfected with DOSPER virosome loaded with the plasmid and incubated for 2, 4, 72 hours. No comparison with DOSPER liposomes was done in this experiment.
결과는 도7에 도시한다. 이로부터, 본 발명의 비로솜을 사용하는 경우 배양 기간을 연장하면 표지된 플라스미드의 세포 흡수가 추가적으로 증가한다는 것을 알 수 있다. 실제로, 핵산 물질에 대한 고성능 전달 시스템으로 본 발명의 DOSPER 비로솜을 사용하는 경우, 핵산(예, 플라스미드) 전체 함량의 60-80%를 소요의 표적 세포에 전달할 수 있다. 모든 실험 세포주는 비로솜에 민감하고, 따라서 플라스미드 흡수에 민감하다.The results are shown in FIG. From this, it can be seen that the use of the virosome of the present invention further increases cell uptake of the labeled plasmid by extending the incubation period. Indeed, when using the DOSPER virosome of the present invention as a high performance delivery system for nucleic acid materials, 60-80% of the total content of nucleic acids (eg, plasmids) can be delivered to desired target cells. All experimental cell lines are nonrosome sensitive and therefore sensitive to plasmid uptake.
실시예 4: DOSPER 비로솜과 DOTAP 비로솜의 비교Example 4 Comparison of DOSPER Virosomes and DOTAP Virosomes
비로솜은 인플루엔자 A 바이러스로부터 알려진 HA-주도의 수용체-매개된 기전에 의해 포유동물 세포에 침투한다. HA의 고유 상태 및 용해활성이 적절히 유지되는 동안에, 비로솜 막의 지질 이중층의 화학적 성질이 중요한 역할을 수행한다는 것은 예상하지 못했다. 따라서, DOSPER 비로솜과 DOTAP 비로솜은 핵산 물질의 포유동물 세포로의 트랜스펙션에서 동일한 효율을 갖는 것으로 생각되었다.Virosomes penetrate mammalian cells by known HA-driven receptor-mediated mechanisms from influenza A viruses. While the inherent state and solubility of HA were properly maintained, it was not expected that the chemical properties of the lipid bilayer of the non-rosome membrane played an important role. Thus, DOSPER virosomes and DOTAP virosomes were thought to have the same efficiency in transfection of nucleic acid material into mammalian cells.
하지만, 놀랍게도 DOSPER와 DOTAP 비로솜의 트랜스펙션을 비교하는 실험에서 상이한 결과가 도출되었다, 다시 말하면 예상을 현저하게 벗어났다. 실험은 실시예 1과 2에 따라 실시하는데, 여기서 포획 및 트랜스펙션을 위하여 트리튬-표지된 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ를 이용한다. DOTAP 비로솜은 WO97/41834의 실시예 1에 따라 만들고, 플라스미드의 통합은 DOSPER 비로솜에서 밝힌 것과 동일한 과정으로 전술한 바와 같이 실시한다. DSPPER-비로솜에 대하여 실시예 2에서 밝힌것과 동일한 함량의3H-표지된 플라스미드를 DOTAP 비로솜으로 포획한다. 세포주 293T, K562, Sp2, HeLa는 상기 실시예 2에서 밝힌 것과 동일한 조건하에 DOSPER와 DOTAP 비로솜과 함께 배양한다.Surprisingly, however, experiments comparing the transfection of DOSPER and DOTAP virosomes yielded different results, in other words, significantly exceeding expectations. Experiments are carried out according to Examples 1 and 2, wherein tritium-labeled plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ is used for capture and transfection. DOTAP virosomes are made according to Example 1 of WO97 / 41834, and integration of the plasmids is carried out as described above in the same procedure as found in DOSPER virosomes. The same amount of 3 H-labeled plasmid as identified in Example 2 for DSPPER-birosome is captured with DOTAP virosome. Cell lines 293T, K562, Sp2, HeLa are incubated with DOSPER and DOTAP virosomes under the same conditions as identified in Example 2 above.
결과는 도8-11에 도시한다. 이들은 DOSPER 비로솜의 트랜스펙션 효율이 DOTAP 비로솜의 트랜스펙션 효율의 적어도 2배이고, 최대 10까지 높다는 것을 보여준다. 특히, 세포주 Sp2와 같은 현탁배양한 세포주에서 트랜스펙션 효율의 차이가 가장 명확하게 나타난다(도10). 이런 현상의 이유는 아직 알 수 없지만, 적어도 부분적으로는 2종류 지질의 상이한 화학적 성질에 기인할 것으로 생각되는데, DOSPER 분자의 극성 머리는 4개의 자유 아미노기를 보유하는 반면 DOSPER 분자의 극성 머리는 단지 1개의 자유 아미노기를 보유한다. 이론에 한정하지 않고, DOSPER 보유한 비로솜으로 음으로 하전된 물질, 예를 들면 플라스미드를 포획하면, 더 많은 양의 유용한 비로솜이 생성될 것으로 추측된다. 대조적으로, DOTAP-비로솜으로 플라스미드를 포획하면, 낮은 트랜스펙션 능력을 갖는 다수의 결함성 운반체가 생성될 것으로 생각된다. 2번째 추측은 표적 세포의 세포막에 대한 비로솜의 결합동안 DOSPER의 강화된 효과와 연관한다.The results are shown in Figures 8-11. They show that the transfection efficiency of DOSPER virosomes is at least twice the transfection efficiency of DOTAP virosomes and is high up to 10. In particular, the difference in transfection efficiency is most clearly seen in suspension-cultured cell lines such as cell line Sp2 (FIG. 10). The reason for this is still unknown, but at least in part is believed to be due to the different chemical properties of the two types of lipids. Free amino groups. Without wishing to be bound by theory, it is speculated that the capture of a negatively charged material, such as a plasmid, with a DOSPER retained non-rosome will produce a greater amount of useful virosome. In contrast, the capture of plasmids with DOTAP-Virosomes is believed to produce a number of defective carriers with low transfection capacity. A second conjecture is associated with the enhanced effect of DOSPER during binding of virosomes to the cell membrane of the target cell.
따라서, 상기 결과는 다가양이온성 지질 DOSPER가 현재 가장 일반적으로 사용되는 양이온성 지질 DOTAP에 비하여 격별하게 우월한 트랜스펙션 효능을 보인다는 것을 입증한다.Thus, the results demonstrate that the polycationic lipid DOSPER shows distinctly superior transfection efficacy compared to the most commonly used cationic lipid DOTAP.
실시예 5: 본 발명에 따른 비로솜으로 트랜스펙션된 이후의 유전자 발현Example 5: Gene expression after transfection with nonrosomes according to the invention
실시예 3의 실험에서, 비로솜 트랜스펙션을 통하여 플라스미드 pcDNA3.1/His B/lacZ를 흡수한 표적 세포에서 실행되는 β-갈락토시다제 발현의 β-Gal ELISA 키트(공급자: Boehringer Mannheim)를 이용한 정량 측정은 비로솜-전달된 플라스미드의 트랜스펙션 비율이 리포좀-전달된 리포좀의 트랜스펙션 비율보다 우월할 뿐만 아니라 표적 세포에서 이들의 발현 또한 우월하다는 것을 입증한다. 플라스미드의 표적 세포로의 트랜스펙션에서 DOSPER 리포좀 대신에 DOSPER 비로솜을 이용하는 경우. 동일 실험에서 20배 내지 40배 더 높은 발현이 산출되었다(도12).In the experiments of Example 3, a β-Gal ELISA kit of β-galactosidase expression (boehringer Mannheim), which is run on target cells that have taken up plasmid pcDNA3.1 / His B / lacZ via non-rosome transfection Quantitative measurements using VE demonstrate that the transfection rate of the non-rosome-delivered plasmids is not only superior to the transfection rate of liposome-delivered liposomes, but also their expression in target cells. When DOSPER virosomes are used instead of DOSPER liposomes in transfection of the plasmid into target cells. The same experiment yielded 20 to 40 times higher expression (FIG. 12).
또한, 비로솜내의 플라스미드 농도와 β-갈락토시다제 발현 수준에는 강한 상관관계가 존재하는 것으로 밝혀졌다.In addition, a strong correlation was found between plasmid concentration and β-galactosidase expression level in virosomes.
제형 2의 비로솜이 제형 1의 비로솜에 비하여 절반정도의 플라스미드를 보유하지만, 비로솜의 상대적 수치는 양 제형에서 대등하다.Although Virosome of Formulation 2 retains about half the plasmid compared to Virosome of Formula 1, the relative values of Virosome are comparable in both formulations.
제형 1은 본원에서 대부분의 실험에 사용되는 바람직한 비로솜 제형이다. 제형 3은 동일한 함량의 플라스미드를 보유하지만, 비로솜의 상대적 수치는 2배나 높다.Formulation 1 is the preferred virosome formulation used in most of the experiments herein. Formulation 3 has the same amount of plasmid, but the relative value of virosome is twice as high.
제형 4는 제형 1과 제형 2에서 밝힌 것과 동일한 개수의 비로솜에서, 훨씬 적은 함량의 플라스미드를 포획한다.Formulation 4 captures a much smaller amount of plasmid in the same number of virosomes as identified in Formulations 1 and 2.
제형 5는 제형 1 및 3과 동일한 함량의 플라스미드를 보유하지만, 비로솜의 상대적 수치는 제형 1보다 3배나 높다.Formulation 5 has the same amount of plasmid as formulations 1 and 3, but the relative value of virosome is three times higher than formulation 1.
도13에 도시한 결과는 경험적으로 선호되는 DOSPER 비로솜 제형이 최적이고, 제형 2, 3, 4에서 플라스미드 농도를 낮추어도 발현 수준이 증가하지 않는다는 것을 입증한다. 상기 제형 1과 유사한 비로솜 제형의 트랜스펙션으로 표적 세포를 과다적하하여 발현을 저해할 수 있다는 가설은 더 이상 유효하지 않다.The results shown in FIG. 13 demonstrate that empirically preferred DOSPER virosome formulations are optimal and that expression levels do not increase with lower plasmid concentrations in formulations 2, 3, and 4. The hypothesis that transfection of a virosome formulation similar to Formulation 1 above could inhibit expression by overloading target cells is no longer valid.
명세서에 사용된 약어Abbreviation used in the specification
2'-OMe 2'-O 메틸2'-OMe 2'-O Methyl
CALLA 공통 급성 림프아세포 백혈병 항원CALLA Common Acute Lymphoblastic Leukemia Antigen
CAT 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제CAT Chloramphenicol Acetyl Transferase
dpm 분해/분dpm decomposition / minute
DOSPER 1,3-디올레일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드DOSPER 1,3-Dioleyloxy-2- (6-carboxy-spermille) -propylamide
DOTAP N-[(1,2,3-디올레일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄메틸-DOTAP N-[(1,2,3-Dioleyloxy) -propyl] -N, N, N-trimethylammoniummethyl-
셀페이트Sulphate
FITC-OPT 플루레신 이소티오시아네이트-표지된FITC-OPT fluresin isothiocyanate-labeled
올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트Oligodeoxyribonucleotide Phosphorothioate
G418 Geneticin®디설파트(항생제 G418)G418 Geneticin ® Disulfate (antibiotic G418)
HA 헤마글루티닌HA hemagglutinin
MPB.PE N-[4-(p-말레이미도)-페닐부티릴]-포스파티딜에탄올아민MPB.PE N- [4- (p-maleimido) -phenylbutyryl] -phosphatidylethanolamine
(=가교제-인지질 복합체)(= Crosslinking agent-phospholipid complex)
msc 혼성 서열 대조군msc hybrid sequence control
NA 뉴우라미니다제NA New Uramidase
옥틸-POE n-옥틸-올리고-옥시에틸렌Octyl-POE n-octyl-oligo-oxyethylene
ODN 올리고데옥시뉴클레오티드ODN oligodeoxynucleotide
OEG 옥타에틸렌글리콜 모노도데실에테르(C12E8)OEG octaethylene glycol monododecyl ether (C12E8)
OPT 올리고데옥시리보뉴클레오티드 포스포로티오에이트OPT oligodeoxyribonucleotide phosphorothioate
PC 포스파티딜콜린PC Phosphatidylcholine
PE 포스파티딜에탄올아민PE phosphatidylethanolamine
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