KR20020059286A - Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder - Google Patents
Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder Download PDFInfo
- Publication number
- KR20020059286A KR20020059286A KR1020020032474A KR20020032474A KR20020059286A KR 20020059286 A KR20020059286 A KR 20020059286A KR 1020020032474 A KR1020020032474 A KR 1020020032474A KR 20020032474 A KR20020032474 A KR 20020032474A KR 20020059286 A KR20020059286 A KR 20020059286A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- plasmid dna
- medium
- cells
- binding
- silicic acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B42—BOOKBINDING; ALBUMS; FILES; SPECIAL PRINTED MATTER
- B42C—BOOKBINDING
- B42C3/00—Making booklets, pads, or form sets from multiple webs
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 규산염 광분으로부터 강알칼리 및 강산을 처리하여 만들어진 규산매질(matrix)을 이용해서 대장균 내에서의 클로닝(cloning)을 위해 필요한 플라스미드(plasmid) DNA를 추출하는 방법 및 추출 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a method and an extraction kit for extracting plasmid DNA required for cloning in Escherichia coli using a silicate medium prepared by treating strong alkali and strong acid from silicate mineral powder.
플라스미드 DNA를 추출하는 방법 및 추출 키트에 관한 종래 기술은 페놀을 사용하는 방법, 음이온 계면활성제와 고농도의 염화나트륨을 사용하는 방법 등이 제시되어 있다.Prior arts relating to methods for extracting plasmid DNA and extraction kits have suggested methods using phenol, methods using anionic surfactants and high concentrations of sodium chloride, and the like.
그러나 상기 종래 기술들은 추출과정에서 공해물질을 다량으로 발생시키며 문제점 및 이러한 공해 물질을 처리하기 위해서 많은 비용이 발생되는 문제점이 있다.However, the related arts generate a large amount of pollutants in the extraction process, and there is a problem in that a large cost is generated to treat such pollutants.
또한, 현재 사용되고 있는 거의 모든 DNA 추출용 키트들이 셀룰로오즈 (cellulose) 성분이 충진되어 있는 플라스틱 컬럼(column)과 플라스틱 1회용 주사기들을 사용하도록 제작되어 있어서 상당한량의 환경쓰레기가 배출되는 문제점이 있다.In addition, almost all currently used DNA extraction kits are manufactured to use a plastic column filled with cellulose and a plastic disposable syringe, which causes a considerable amount of environmental waste.
본 발명에 이루고자 하는 기술적 과제는 이산화규소(SiO2), 알루미늄염(), 철산염(), 칼륨염(), 나트륨염(), 칼슘염(CaO), 마그네슘염(MgO) 등의 미네랄 성분들로 구성되어 있는 규산염광분을 이용하여 플라스미드 DNA 추출률이 높고, 환경 친화적인 플라스미드 DNA 추출 방법 및 추출 키트를 제공하는 것이다.The technical problem to be achieved in the present invention is silicon dioxide (SiO 2), aluminum salt ( ), Ferrate ( ), Potassium salt ( ), Sodium salt ( The present invention provides a method for plasmid DNA extraction and extraction kit, which has a high plasmid DNA extraction rate and an environmentally friendly plasmid DNA extraction method using silicate minerals composed of mineral components such as calcium salt (CaO) and magnesium salt (MgO).
도 1은 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법의 흐름도.1 is a flow chart of a plasmid DNA extraction method using silicate light powder according to the present invention.
도 2는 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 키트의 구성도.Figure 2 is a block diagram of a plasmid DNA extraction kit using silicate light powder according to the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법 및 추출 키트를 이용한 서로 다른 두 종류의 플라스미드 DNA 추출 사진.Figure 3 is a plasmid DNA extraction method using a silicate light powder according to the present invention and two different types of plasmid DNA extraction using the extraction kit.
도 4는 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 추출 키트의 플라스미드 DNA 용출액의 증류수 혼합비율에 따른 추출된 플라스미드 DNA의 비교 사진.Figure 4 is a comparative photograph of the extracted plasmid DNA according to the distilled water mixing ratio of the plasmid DNA eluate of the plasmid DNA extraction kit according to the present invention.
도 5는 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 추출 키트의 플라스미드 DNA 침전액의 NaI 농도에 따른 규산매질과 플라스미드 DNA의 결합력을 비교한 사진.Figure 5 is a photograph comparing the binding force of the silicic acid medium and the plasmid DNA according to the NaI concentration of the plasmid DNA precipitate of the plasmid DNA extraction kit according to the present invention.
도 6은 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법 및 추출 키트를 이용한 수차례 추출을 통한 플라스미드 DNA의 농도비교 사진.Figure 6 is a plasmid DNA extraction method using a silicate light powder according to the present invention and a concentration comparison photo of plasmid DNA through several times extraction using the extraction kit.
상기 기술적 과제를 이루기 위한 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법은 (a) 상기 대장균이 배양된 배양액을 원심분리를 통하여 세포를 수획하고, 상기 수획된 세포를 현탁하는 세포 현탁 단계; (b) 상기 (a)단계에서 현탁된 세포의 세포막을 용해하는 세포 용해 단계; (c) 상기 (b)단계에서 세포막이 용해된 세포로 부터 플라스미드 DNA를 분리하는 플라스미드 DNA 분리 단계; (d) 상기 (c)단계에서 분리된 플라스미드 DNA가 침전되고, 상기 침전된 플라스미드 DNA가 규산매질과 결합하는 플라스미드 DNA 결합 단계; (e) 상기 (d)단계에서 플라스미드 DNA와 규산매질이 결합된 결합매질을 원심분리를 통하여 상기 결합매질을 수획하고, 상기 수획된 결합매질을 세척하는 결합매질 수획 및 세척 단계; (f) 상기 (e)단계에서 수획된 결합매질을 공기 중에서 건조하는 결합매질 건조 단계; 및 (g) 상기 (f)단계에서 건조된 결합매질로부터 플라스미드 DNA와 규산매질을 분리하여 플라스미드 DNA를 용출하고, 상기 용출된 플라스미드 DNA를 분리하여 수획하는 플라스미드 DNA 용출 및 수획 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.Plasmid DNA extraction method using a silicate light powder according to the present invention for achieving the above technical problem is (a) a cell suspension step of harvesting the cells by centrifugation of the culture medium cultured E. coli, and suspending the harvested cells; (b) a cell lysis step of lysing the cell membrane of the cells suspended in step (a); (C) plasmid DNA separation step of separating the plasmid DNA from the cell membrane lysed in step (b); (d) plasmid DNA binding step in which the plasmid DNA isolated in step (c) is precipitated and the precipitated plasmid DNA binds to a silicic acid medium; (e) harvesting and washing the binding medium for collecting the binding medium by centrifugation of the binding medium in which the plasmid DNA and the silicic acid medium are bound in step (d), and washing the collected binding medium; (f) a binding medium drying step of drying the binding medium collected in step (e) in air; And (g) plasmid DNA eluting and harvesting to separate the plasmid DNA from the binding medium dried in step (f) to elute the plasmid DNA and to separate and elute the eluted plasmid DNA. It features.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 규산염 광물을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법을 상세히 설명한다.Hereinafter, a plasmid DNA extraction method using silicate mineral according to the present invention with reference to the accompanying drawings will be described in detail.
도 1은 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법의 흐름도이다. 도 1에 도시한 바와 같이 본 발명 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법은 세포 수획 단계(S10), 세포 현탁 단계(S20), 세포 용해단계(S30), 플라스미드 DNA 분리 단계(S40), 플라스미드 DNA 결합 단계(S50), 결합매질 수획 및 세척 단계(S60), 결합매질 건조 단계(S70) 및 플라스미드 DNA 용출 및 수획 단계(S80)로 이루어진다.1 is a flowchart of a plasmid DNA extraction method using silicate light powder according to the present invention. As shown in Figure 1 plasmid DNA extraction method using the silicate light powder of the present invention cell harvesting step (S10), cell suspension step (S20), cell lysis step (S30), plasmid DNA separation step (S40), plasmid DNA binding Step (S50), binding medium harvesting and washing step (S60), binding medium drying step (S70) and plasmid DNA elution and harvesting step (S80).
또한, 도 2는 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 키트의 구성도이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 세포 현탁액(10), 세포 용해제(20), 중화용액(30), 플라스미드 DNA 침전액(40), 플라스미드 DNA 결합액(50), 세척액(60); 및 플라스미드 DNA 용출액(70)으로 구성된다.2 is a block diagram of a plasmid DNA extraction kit using silicate light powder according to the present invention. As shown in FIG. 2, the cell suspension 10, the cell lysate 20, the neutralization solution 30, the plasmid DNA precipitate 40, the plasmid DNA binding solution 50, the washing solution 60; And a plasmid DNA eluate 70.
또한, 상기 플라스미드 DNA 결합액(50)은 규산매질 0.3g당 증류수 500㎕의 비율로 조성되는 것이 바람직 하며, 상기 규산매질은 규산염광분, 강알카리용액, 강산용액, 수소, 산소 및 물을 혼합한 혼합액을 가열하여 제조하는 것이 바람직하다.In addition, the plasmid DNA binding solution 50 is preferably composed of 500 μl of distilled water per 0.3 g of the silicate medium, and the silicate medium is a mixture of silicate mineral, strong alkaline solution, strong acid solution, hydrogen, oxygen, and water. It is preferable to heat and mix a liquid mixture.
또한, 상기 규산염광분은 62.73% 이산화규소, 10.87% 알루미늄염, 1.41% 철산염, 4.58% 칼륨염, 1.31% 나트륨, 4.19% 칼슘염 및 0.11% 마그네슘염으로 조성되는 것이 바람직하다.In addition, the silicate mineral is preferably composed of 62.73% silicon dioxide, 10.87% aluminum salt, 1.41% ferric acid salt, 4.58% potassium salt, 1.31% sodium, 4.19% calcium salt and 0.11% magnesium salt.
상기 세포 수획 단계(S10)는 플라스미드가 들어있는 대장균 세포를 얻기 위하여 대장균 세포를 배양하고, 대장균 세포가 배양된 배양액 1.5㎖를 15,000rpm으로 20초간 원심분리를 하고, 원심분리된 배양액의 상등액을 제거하여 대장균 세포를 수획한다.In the cell harvesting step (S10), the E. coli cells are cultured to obtain E. coli cells containing the plasmid, centrifuged for 1.5 seconds in 1.5 ml of the culture medium in which E. coli cells are cultured, and the supernatant of the centrifuged culture is removed. E. coli cells are harvested.
상기 세포 현탁 단계(S20)는 상기 수획된 대장균 세포에 200㎕의 상기 세포 현탁액(10)을 투여하여 세포를 현탁시키다. 이때, 상기 세포 현탁액(10)은 50mM의pH 7.5인 Tris-HCl, 10mM의 EDTA 및 100㎍/㎖ RNaseA로 이루어지는 것이 바람직하다.In the cell suspension step (S20), 200 µl of the cell suspension 10 is administered to the harvested E. coli cells to suspend the cells. At this time, the cell suspension 10 is preferably composed of 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA and 100 μg / ml RNaseA.
상기 세포 용해 단계(S30)는 상기 세포 현탁액이 투여되어 현탁된 세포에 200㎕의 상기 세포 용해제(20)를 투여하여 대장균 세포의 세포막을 용해시킨다. 이때, 상기 세포 용해액은 0.2M의 수산화나트륨과 1%의 SDS로 이루어지는 것이 바람직하다.In the cell lysis step (S30), the cell suspension is administered to administer 200 μl of the cell lysate 20 to the suspended cells to dissolve the cell membrane of E. coli cells. At this time, the cell lysate is preferably composed of 0.2M sodium hydroxide and 1% SDS.
상기 플라스미드 DNA 분리 단계(S40)는 상기 세포 용해제(20)를 투여하여 세포막이 제거된 대장균 세포에 상기 중화용액(30)을 투여하여 세포를 중화시킨 후 5분간 원심분리를 하여 상등액만을 취하여 세포막 잔해와 변성된 단백질들을 제외한 플라스미드 DNA만을 분리해낸다. 이때, 상기 중화용액(30)은 1.32M의 pH 4.8인 아세트산칼륨으로 이루어지는 것이 바람직하다.In the plasmid DNA separation step (S40), the neutralizing solution 30 is administered to E. coli cells from which the cell membrane is removed by administering the cell lysate 20 to neutralize the cells. Isolate only the plasmid DNA, excluding the denatured proteins. At this time, the neutralization solution 30 is preferably made of potassium acetate having a pH of 4.8 of 1.32M.
상기 플라스미드 DNA 결합 단계(S50)는 상기 분리된 플라스미드 DNA에 600㎕의 플라스미드 DNA 침전액(40)를 투여하여 플라스미드 DNA를 침전시키고, 상기 플라스미드 DNA 결합액(50)을 투여하고, 플라스미드 DNA와 규산매질이 충분히 결합할 수 있도록 약 1분간 방치하여 결합매질을 형성한다. 이때, 상기 플라스미드 DNA 침전액(40)은 8M의 요오드나트륨으로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 플라스미드 DNA 결합액(50)은 0.3g의 규산매질과 증류수 500㎕로 이루어지는 것이 바람직하다.In the plasmid DNA binding step (S50), the plasmid DNA precipitate solution 40 is administered to the separated plasmid DNA to precipitate the plasmid DNA, the plasmid DNA binding solution 50 is administered, and the plasmid DNA and the silicic acid Leave for about 1 minute to form a binding medium so that the medium can sufficiently bind. At this time, the plasmid DNA precipitate 40 is preferably made of 8M sodium iodine, the plasmid DNA binding solution 50 is preferably composed of 0.3g of silicic acid medium and 500μl of distilled water.
상기 규산매질은 이산화규소 외에 알루미늄염, 철산염, 칼륨염, 나트륨염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 각종 미네랄 성분들로 구성되는 것이 바람직하며, 규산매질의 주성분이 규산염 광분에서 나오는 7∼20㎛ 의 방사에너지로 인하여 DNA가 깨어지는 현상을 제거하기 위하여 62.73% 이산화규소, 10.87% 알루미늄염, 1.41% 철산염, 4.58% 칼륨염, 1.31% 나트륨염, 4.19% 칼슘염, 0.11% 마그네슘염으로 구성된 규산염광분에 강알칼리 용액을 넣고 강산 용액을 가하면 무정형의 백색 겔상인 규산이 형성되는데 건조공기 속에 방치하였다가 가열 건조시켜서 제조되는 것이 바람직하다.The silicate medium is preferably composed of various mineral components such as aluminum salts, iron salts, potassium salts, sodium salts, calcium salts and magnesium salts in addition to silicon dioxide, the main component of the silicate medium is 7 to 20㎛ It is composed of 62.73% silicon dioxide, 10.87% aluminum salt, 1.41% ferric salt, 4.58% potassium salt, 1.31% sodium salt, 4.19% calcium salt and 0.11% magnesium salt to remove DNA breakage When a strong alkali solution is added to a silicate mineral powder and a strong acid solution is added, an amorphous white gel-like silicic acid is formed, which is preferably prepared by leaving it in dry air and heating to dry it.
(화학식)Formula
상기 화학식에서 알수 있듯이 강알카리 용액은 3N의 수산화나트륨을 이용하고, 강산 용액으로는 3N의 염산을 이용할 수가 있으나, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.As can be seen from the above formula, the strong alkali solution may use 3 N sodium hydroxide, and the strong acid solution may use 3 N hydrochloric acid, but is not necessarily limited thereto.
상기 결합매질 수획 및 세척 단계(S60)는 상기 형성된 결합매질을 수획하기 위하여 15,000rpm으로 5초간 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 700㎕의 세척액(60)을 투여하여 피펫팅(pipeting)으로 부드럽게 현탁을 한다. 상기와 같은 세척단계(S60)는 수회 반복하는 것이 바람직하며, 이때, 상기 세척액(60)은 200mM의 염화나트륨, 20mM의 pH 7.5인 Tris-HCl 및 5mM EDTA로 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 세척액은 95% 에탄올이 55% 에탄올이 되도록 희석을 한다.The binding medium harvesting and washing step (S60) is centrifuged at 15,000 rpm for 5 seconds to harvest the formed binding medium, and then the supernatant is removed and 700 μl of washing solution 60 is administered to gently pipetting. Suspension The washing step (S60) as described above is preferably repeated several times, wherein the washing solution 60 is preferably made of 200mM sodium chloride, 20mM pH 7.5 of Tris-HCl and 5mM EDTA, the washing solution is 95% Dilute ethanol to 55% ethanol.
상기 결합매질 건조 단계(S70)는 상기 세척된 결합매질을 공기 중에서 자연건조를 하거나 또는 진공 상태에서 건조를 하여 플라스미드 DNA와 규산매질의 결합체로 이루어진 결합매질 이외의 물질을 제거한다.In the binding medium drying step (S70), the washed binding medium is naturally dried in air or dried in a vacuum state to remove materials other than the binding medium consisting of a combination of plasmid DNA and silicic acid medium.
상기 플라스미드 DNA 용출 및 수획 단계(S80)는 상기 건조 단계(S70)를 거친 고순도의 결합매질에 50㎕의 상기 플라스미드 DNA 용출액(70)을 투여하여 플라스미드 DNA와 규산매질의 결합매질을 녹인 후, 13,000rpm으로 5초간 원심분리를 하고, 원심분리 후 상등액을 취하여 플라스미드 DNA와 규산매질을 분리하고, 분리된 플라스미드 DNA가 포함된 상등액을 취하여 플라스미드 DNA를 수획한다. 이때, 수획된 플라스미드 DNA는 아가로스 겔(agarose gel)을 통하여 100V, 30분간 전기영동을 하여 플라스미드 DNA를 확인한다. 이때, 상기 플라스미드 DNA용출액(70)은 10mM의 pH 8.0인 Tris-HCl 및 1mM의 EDTA로 이루어지는 것이 바람직하다.In the plasmid DNA elution and harvesting step (S80), 50 μl of the plasmid DNA eluate 70 was dissolved in a high purity binding medium after the drying step (S70) to dissolve the binding medium of the plasmid DNA and the silicic acid medium, and then 13,000. After centrifugation at rpm for 5 seconds, the supernatant is taken after centrifugation to separate the plasmid DNA and the silicic acid medium, and the supernatant containing the separated plasmid DNA is taken to harvest the plasmid DNA. At this time, the harvested plasmid DNA is subjected to electrophoresis at 100V for 30 minutes through an agarose gel to confirm plasmid DNA. At this time, the plasmid DNA eluate 70 is preferably composed of Tris-HCl and pH 1 EDM of 8.0 mM of 10mM.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하나, 본 발명의 권리범위가 실험예에만 국한되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to Examples and Experimental Examples, but the scope of the present invention is not limited to Experimental Examples.
(실험예 1)Experimental Example 1
두 종류의 플라스미드(pBluescriptSK+, pGEX4T-1)가 각각 들어 있는 대장균을 하룻밤 동안 혼탁 배양시키고 이들을 실험에 사용하였다. 참고로 pBluescriptSK+는 lac promoter를 가지고 있으며 pGEX4T-1은 trc promoter를 가지고 있고 각각 β-galactosidase fusion protein과 GST-fusion protein을 발현한다.Escherichia coli, each containing two kinds of plasmids (pBluescriptSK + and pGEX4T-1), was incubated overnight and used for the experiment. For reference, pBluescriptSK + has a lac promoter and pGEX4T-1 has a trc promoter and expresses β-galactosidase fusion protein and GST-fusion protein, respectively.
1) 상기와 같이 혼탁 배양된 세포를 각각 1.5 ml씩 취하여 마이크로원심분리용 튜브(micro-centrifuge tube)에 넣고 20초간 13,000 rpm으로 원심분리 하였다.1) 1.5 ml of the turbid culture cells were taken as described above, respectively, placed in a micro-centrifuge tube and centrifuged at 13,000 rpm for 20 seconds.
2) 상등액을 버리고 세포 현탁액(10) 200 ㎕를 넣고 완전하게 세포를 현탁시켰다.2) The supernatant was discarded, 200 µl of the cell suspension (10) was added, and the cells were completely suspended.
3) 현탁된 세포액에 세포 용해제(20) 200 ㎕를 넣고 부드럽게 위 아래로 5∼6번 튜브를 뒤집어 주었다.3) 200 μl of the cell lysate (20) was added to the suspended cell solution, and the tubes were gently inverted up and down 5-6 times.
4) 그 다음, 중화용액(30) 200 ㎕를 넣고 3)에서와 같이 위 아래로 5∼6번 튜브를 뒤집어 주었다.4) Then, 200 μl of the neutralization solution (30) was added and the tubes were turned upside down 5-6 times as in 3).
5) 13,000 rpm으로 5분간 원심 분리한 후 상등액 만을 취하여 새로운 마이크로원심분리용 튜브에 옮겼다.5) After centrifugation at 13,000 rpm for 5 minutes, only the supernatant was removed and transferred to a new microcentrifuge tube.
6) 5)까지 진행된 용액에 플라스미드 DNA 침전액(40) 600 ㎕ (NaI의 최종농도 4M이 되게)와 20 ㎕의 플라스미드 DNA 결합액(50)을 넣고 짧게 vortexing하여 혼합시킨 후, 약 1분간 방치하였다.6) Add 600 μl of plasmid DNA precipitate (40) (to final concentration of NaI to 4M) and 20 μl of plasmid DNA binding solution (50) in the solution that proceeded to 5), mix by short vortexing, and leave for about 1 minute. It was.
7) 13,000 rpm으로 5초간 원심 분리하고 상등액을 버린 후 700 ㎕의 DNA 세척액(60)을 넣고 현탁시킨 다음 다시 5초간 원심 분리를 시켰다. 이와 같은 과정을 세척과정이라 하며, 3번 반복 실시하였다.7) After centrifugation at 13,000 rpm for 5 seconds, the supernatant was discarded, 700 μl of DNA washing solution (60) was added and suspended, and then centrifuged again for 5 seconds. This process is called a washing process, and was repeated three times.
8) 세척과정이 끝나면 상등액을 완전하게 버리고 DNA와 결합되어 있는 규산매질(matrix) 즉, 결합매질을 건조시켰다.8) At the end of the washing process, the supernatant was completely discarded and the matrix, which is bound to DNA, was dried.
9) 최종적으로 50 ㎕의 플라스미드 DNA 용출액(70)을 넣어 현탁시킨 다음 13,000 rpm으로 5초간 원심 분리하여 상등액만을 취하였다.9) Finally, 50 μl of plasmid DNA eluate (70) was added and suspended, followed by centrifugation at 13,000 rpm for 5 seconds to obtain only the supernatant.
10)이와 같은 일련의 과정을 통해 얻어진 플라스미드 DNA를 100 V, 30분의 조건으로 전기영동을 통하여 DNA를 분리, UV 254 nm에서 확인하였다.10) The plasmid DNA obtained through this series of processes was separated by electrophoresis under conditions of 100 V and 30 minutes, and confirmed at UV 254 nm.
상기 실험예1을 통하여 추출된 플라스미드 DNA를 도 3 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법 및 추출 키트를 이용한 서로 다른 두종류의 플라스미드 DNA 추출 사진을 통하여 확인할 수 있다. 상기 도 3의 1은 pBluescriptSK+(2960 bp) 플라스미드 DNA이며, 2는 pGEX4T-1(4900 bp) 플라스미드 DNA이다.The plasmid DNA extracted through Experimental Example 1 can be confirmed through two different kinds of plasmid DNA extraction pictures using the plasmid DNA extraction method and the extraction kit using the silicate light powder according to the present invention. 3 is pBluescriptSK + (2960 bp) plasmid DNA and 2 is pGEX4T-1 (4900 bp) plasmid DNA.
(실험예 2)Experimental Example 2
플라스미드 pBluescriptSK+가 들어있는 대장균으로부터 실험예1과 동일한 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하는데 6)과정에서 넣는 플라스미드 DNA 결합액의 혼합비율만을 아래와 같은 조건으로 바꾸어 실시하였다.Extracting the plasmid DNA from E. coli containing the plasmid pBluescriptSK + using the same method as in Experimental Example 1 was carried out by changing only the mixing ratio of the plasmid DNA binding solution in step 6) under the following conditions.
상기의 조건으로 얻어진 각각의 플라스미드 DNA를 실험예1에서와 동일 조건으로 전기영동하여 DNA를 분리, 확인하였다.Each plasmid DNA obtained under the above conditions was electrophoresed under the same conditions as in Experimental Example 1 to isolate and confirm the DNA.
상기 실험예2를 통하여 추출된 플라스미드 DNA를 도 4 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 추출 키트의 플라스미드 DNA 결합액(50)의 증류수 혼합비율에 따른 추출된 플라스미드 DNA의 비교 사진을 통하여 확인할 수 있다.The plasmid DNA extracted through Experimental Example 2 can be confirmed through a comparison photograph of the extracted plasmid DNA according to the distilled water mixing ratio of the plasmid DNA binding solution 50 of the plasmid DNA extraction kit according to the present invention.
실험예 2에 사용된 규산매질은 모두 0.3 g으로 동일하며 혼합한 증류수의 양은 표 1과같이 달리하였다. 상기 도 4의 1은 조건 1, 2는 조건 3, 3은 조건 3, 4는 조건 4에 해당한다.The silicic acid medium used in Experimental Example 2 was all the same as 0.3 g and the amount of mixed distilled water was different as shown in Table 1. 4, 1 corresponds to condition 1, 2 corresponds to condition 3, 3 corresponds to condition 3, and 4 corresponds to condition 4.
(실험예 3)Experimental Example 3
플라스미드 pBluescriptSK+가 들어있는 대장균으로부터 실험예1과 동일한 방법을 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하는데 역시 6)과정에서 넣는 NaI의 농도만을 아래와 같은 조건으로 구분하여 실시하였다.Extracting the plasmid DNA from E. coli containing the plasmid pBluescriptSK + using the same method as in Experimental Example 1 was carried out by dividing only the concentration of NaI in the 6) process under the following conditions.
상기와 같은 조건으로 얻어진 각각의 플라스미드 DNA를 실험예1에서와 동일 조건으로 전기영동하여 DNA를 분리, 확인하였다.Each plasmid DNA obtained under the conditions described above was electrophoresed under the same conditions as in Experimental Example 1 to isolate and confirm the DNA.
상기 실험예3를 통하여 추출된 플라스미드 DNA를 도 5 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 추출 키트의 플라스미드 DNA 침전액(40)의 NaI 농도에 따른 규산매질과 플라스미드 DNA의 결합력을 비교한 사진을 통하여 확인할 수 있다. 상기 도 5의 1은 조건 1, 2는 조건 3, 3은 조건 3, 4는 조건 4, 5는 조건 5, 6은 조건 6, 7은 조건 7 및 8은 조건 8에 해당한다.The plasmid DNA extracted through Experimental Example 3 can be confirmed through a photograph comparing the binding force between the silicic acid medium and the plasmid DNA according to the NaI concentration of the plasmid DNA precipitate 40 of the plasmid DNA extraction kit according to the present invention. . 5 corresponds to condition 1, 2 to condition 3, 3 to condition 3, 4 to condition 4, 5 to condition 5, 6 to condition 6, 7 to condition 7 and 8 to condition 8.
(실험예 4)Experimental Example 4
실험예에 따른 결과가 얼마만큼 일관성 있게 얻어지는 가를 알아보기 위하여 동일한 조건의 실험을 3번에 나누어 실시하였으며 실험의 방법은 실험예1에서와 동일하다.In order to find out how consistently the results according to the experimental example are obtained, the experiments were carried out in three times under the same conditions. The experimental method was the same as in Experimental Example 1.
실험 별로 결과의 일관성을 보기 위해 사용되는 규산매질의 사용량도 4가지로 나누어 실시하였으며 상기와 같은 조건으로 얻어진 각각의 플라스미드 DNA를 실험예1에서와 동일 조건으로 전기영동하여 DNA를 분리, 확인하였다.The amount of silicic acid medium used in order to see the consistency of the results was also divided into four experiments. Each plasmid DNA obtained under the same conditions was electrophoresed under the same conditions as in Experimental Example 1 to isolate and confirm the DNA.
상기 실험예를 통하여 추출된 플라스미드 DNA를 도 6 본 발명에 따른 규산염 광분을 이용한 플라스미드 DNA 추출 방법 및 추출 키트를 이용한 수차례 추출을 통한 플라스미드 DNA의 농도비교 사진을 통하여 확인할 수 있다. 상기 도 6의 1~4는 실험 A, 5~8은 실험 B 및 9~12는 실험 C에 해당한다.The plasmid DNA extracted through the above experimental example can be confirmed through a concentration comparison photo of plasmid DNA through several times extraction using the plasmid DNA extraction method and the extraction kit using the silicate light powder according to the present invention. 6 to 1 are experiments A, 5 to 8 are experiments B, and 9 to 12 correspond to experiment C.
(실험예 5)Experimental Example 5
본 발명에 따른 플라스미드 DNA의 추출량을 종래의 추출키트와 실험을 통하여 비교하기 위하여, 본 발명은 실험예1과 동일하게 실시하며, 종래의 추출키트는 종래의 추출키트 사용법에 제시한 바와 같이 실험하였다.In order to compare the extraction amount of the plasmid DNA according to the present invention with the conventional extraction kit, the present invention was carried out in the same manner as in Experiment 1, and the conventional extraction kit was tested as shown in the conventional extraction kit usage. .
상기 표 4에서 알수 있듯이 본 발명에 따른 플라스미드 DNA 추출키트의 플라스미드 DNA 추출량이 현격히 높았다.As can be seen in Table 4, the plasmid DNA extraction amount of the plasmid DNA extraction kit according to the present invention was significantly higher.
특히, 규산매질과 증류수의 혼합이 0.3g당 500㎕의 비율을 이룰때 1.5ml 현탁배양된 세포로부터 추출된 플라스미드 DNA 농도가 27.5㎍으로 가장 높음을 확인할 수 있었다.In particular, when the mixture of silicic acid medium and distilled water reached a ratio of 500 μl per 0.3 g, the concentration of plasmid DNA extracted from 1.5 ml suspension cultured cells was the highest as 27.5 μg.
본 발명의 범위는 상기 본 발명의 상세한 설명 내지 실험예들에 한정되지 않으며, 첨부된 청구항들에 의하여 정의되는 본 발명의 범위내에서 당업자에 의하여 변형 또는 수정될 수 있다.The scope of the present invention is not limited to the above detailed description and experimental examples, but may be modified or modified by those skilled in the art within the scope of the present invention as defined by the appended claims.
상술한 바와 같이 본 발명에 따르면, 규산염광분으로부터 강알칼리 및 강산을 처리하여 만들어진 규산매질(matrix)을 이용해서 대장균 내에서의 클로닝(cloning)을 위해 필요한 플라스미드(plasmid) DNA를 추출함으로 인하여 손쉽고 경제적이며 신속하게 플라스미드 DNA를 추출할 수 있으며 기존 대부분의 키트에서 사용되고 있는 cellulose 성분이 들어있는 플라스틱 컬럼(column)과 1회용 플라스틱 주사기들을 추가적으로 사용할 필요가 없어서 이러한 폐기물들로 인한 환경오염을 막을 수 있고 DNA와의 결합체가 갖고 있는 성분들이 모두 미네랄 성분이므로 DNA 추출 이후에 배출되는 산물들이 비료로 이용될 수 있는 효과가 있다.As described above, according to the present invention, it is easy and economical to extract plasmid DNA necessary for cloning in E. coli using a silicate medium prepared by treating strong alkali and strong acid from silicate mineral. It is possible to extract plasmid DNA quickly and to avoid the environmental pollution caused by these wastes by eliminating the need for additional plastic column and disposable plastic syringes containing cellulose, which are used in most existing kits. Since the components of the binder are all minerals, the products released after DNA extraction can be used as fertilizer.
또한, 실험예5에서 알수 있듯이 종래의 DNA 추출키트에 비하여 DNA 추출률이 현격히 높은 효과가 있다.In addition, as can be seen in Experiment 5, the DNA extraction rate is significantly higher than the conventional DNA extraction kit.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020032474A KR20020059286A (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020020032474A KR20020059286A (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020059286A true KR20020059286A (en) | 2002-07-12 |
Family
ID=27726758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020020032474A KR20020059286A (en) | 2002-06-11 | 2002-06-11 | Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20020059286A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050061767A (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-23 | 삼성전자주식회사 | A method for isolating a nucleic acid using alumina |
| KR101106969B1 (en) * | 2008-05-30 | 2012-01-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | A Method for Purifying High-Quality Plasmid DNA Using Activated Charcoal |
| CN114507662A (en) * | 2022-03-22 | 2022-05-17 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | Binding solution and supercoiled plasmid large-extraction kit based on same |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175271A (en) * | 1989-07-10 | 1992-12-29 | University Of Kansas | Use of silica gel for DNA extraction with organic solvents |
| US5405951A (en) * | 1991-05-03 | 1995-04-11 | Becton Dickinson And Company | Solid phase extraction purification of DNA |
| US5523392A (en) * | 1992-11-13 | 1996-06-04 | Becton, Dickinson And Company | Purification of DNA on aluminum silicates, and phosphosilicates |
| US5693785A (en) * | 1992-02-13 | 1997-12-02 | Becton, Dickinson And Company | Purification of DNA on Hydroxylated Silicas |
| KR19990022612A (en) * | 1995-06-08 | 1999-03-25 | 퍼니스 챨스 엠 | DNA Extraction Method and Extraction Apparatus |
| US6342387B1 (en) * | 1997-09-22 | 2002-01-29 | Riken | Method for isolating DNA |
-
2002
- 2002-06-11 KR KR1020020032474A patent/KR20020059286A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5175271A (en) * | 1989-07-10 | 1992-12-29 | University Of Kansas | Use of silica gel for DNA extraction with organic solvents |
| US5405951A (en) * | 1991-05-03 | 1995-04-11 | Becton Dickinson And Company | Solid phase extraction purification of DNA |
| US5693785A (en) * | 1992-02-13 | 1997-12-02 | Becton, Dickinson And Company | Purification of DNA on Hydroxylated Silicas |
| US5523392A (en) * | 1992-11-13 | 1996-06-04 | Becton, Dickinson And Company | Purification of DNA on aluminum silicates, and phosphosilicates |
| KR19990022612A (en) * | 1995-06-08 | 1999-03-25 | 퍼니스 챨스 엠 | DNA Extraction Method and Extraction Apparatus |
| US6342387B1 (en) * | 1997-09-22 | 2002-01-29 | Riken | Method for isolating DNA |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20050061767A (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-23 | 삼성전자주식회사 | A method for isolating a nucleic acid using alumina |
| KR101106969B1 (en) * | 2008-05-30 | 2012-01-20 | 가톨릭대학교 산학협력단 | A Method for Purifying High-Quality Plasmid DNA Using Activated Charcoal |
| CN114507662A (en) * | 2022-03-22 | 2022-05-17 | 合肥欧创基因生物科技有限公司 | Binding solution and supercoiled plasmid large-extraction kit based on same |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6821757B2 (en) | Rapid and simple process for isolation of circular nucleic acids | |
| JP3696238B2 (en) | Nucleic acid purification composition and method | |
| Matos et al. | Isolation of PCR DNA fragments using aqueous two-phase systems | |
| JP2005525819A (en) | Methods for nucleic acid extraction and purification | |
| CN113388611B (en) | Kit for extracting stable bacterial genome DNA by paramagnetic particle method and extraction method thereof | |
| WO2003035903A1 (en) | Method for isolating dna from biological samples | |
| KR20210134639A (en) | Purification of biological molecules such as plasmid DNA using anion exchange chromatography | |
| JP4441262B2 (en) | Improved method for isolating nucleic acids | |
| Xu et al. | Altered nucleic acid partitioning during phenol extraction or silica adsorption by guanidinium and potassium salts | |
| EP4163371A1 (en) | Nucleic acid extraction method and application | |
| KR20020059286A (en) | Methods and kit for drawing out plasmid dna making use of a silicate powder | |
| CN113265395A (en) | Thallus lysate clarifying reagent and application thereof in plasmid extraction process | |
| Caramelo-Nunes et al. | Purification of plasmid DNA from clarified and non-clarified Escherichia coli lysates by berenil pseudo-affinity chromatography | |
| JP2000146911A (en) | Method for separating nucleic acid | |
| WO2018223657A1 (en) | Chaotropic agent and method for extracting genomic dna by using same | |
| JP5463492B2 (en) | Plasmid DNA extraction from microbial cells | |
| RU2650865C1 (en) | Set of reactives for dna purification | |
| JP4125605B2 (en) | Purification of plasmid DNA with hydroxyapatite without acetic acid | |
| KR101380909B1 (en) | Absorbents for purification of nucleic acid and a purification method using the absorbents | |
| EP1165579B1 (en) | Method for producing endotoxin-free nucleic acids | |
| JP5101102B2 (en) | Method for extracting nucleic acids | |
| US20090088560A1 (en) | Process for Nucleic Acid Purification | |
| RU2119954C1 (en) | Method of isolation and purification of nucleic acids | |
| CN112553274B (en) | Method for cutting DNA by soybean extract Bowman-Birk inhibitor | |
| US20240158777A1 (en) | Magnetic bead suspension reagent, method for purifying nucleic acid and method for sorting nucleic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |