KR20020048941A

KR20020048941A - 유착 형성을 억제하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20020048941A
Application number: KR1020027003796A
Authority: KR
Inventors: 체레쉬데이비드에이; 레씨브루스
Original assignee: 빙검 더글라스 에이.; 더 스크립스 리서치 인스티튜트; 프란시스 제이 메이어; 더 유니버시티 오브 노쓰 캐롤라이나 엣 채플 힐
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 2000-09-22
Publication date: 2002-06-24
Also published as: CN1399554A; JP2003509468A; EP1223962A1; AU7985000A; CA2384812A1; AU781442B2; MXPA02003079A; BR0014222A; WO2001021196A1; EP1223962A4

Abstract

본원에서는 환자에 있어서 수술후/창상후 유착 형성을 억제하거나 완화시키기 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 이러한 조성물 및 방법은 세포외 매트릭스 단백질(예: 피브로넥틴)에 결합하는 알파 V 베타 3 인테그린을 차단하거나 억제하는 길항제 분자를 사용한다.

Description

유착 형성을 억제하기 위한 방법 및 조성물{Method and compositions for inhibiting adhesion formation}

수술 개입은 치료를 실행하기 위해서 환자에게 상처를 입히는 것을 포함한다. 수술로부터 야기되는 한 가지 원치 않는 결과는 수술후 유착 형성이다. 의학적 의미로서 사용된 "유착"이란 용어는 두개의 표면 또는 부분의 접착 또는 결합 과정인 교착을 지칭한다. 예를 들어, 창상의 서로 마주보는 표면 또는 복막의 서로 마주보는 표면의 결합. 또한, 다수의 유착은 서로 마주보는 장(漿) 표면을 연결하는 염증성 밴드를 언급할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 유착은 또한 섬유성 유착을 포함하며, 이는 혈장 또는 림프의 삼출물 또는 혈액의 삼출로부터 야기된섬유소의 미세 사로 이루어진 유착이다. 상해 부위에서 또는 가끔 자발적으로 발생하는 섬유아세포 조직의 평활한 과성장인 켈로이드(Keloid)도 유착의 한 형태이다.

유착 발생은 수술후 이환율 및 사망률의 주요 원인인 것으로 보고되었다. 심각한 유착 형성과 관련된 대부분의 빈번한 수술 과정은 부인과, 심혈관 및 일반적 복부 수술이다. 이는 종래의 수술 뿐만 아니라 복강경 수술에 적용된다.

복강내 유착의 합병증은 장 폐색, 만성 또는 재발성 골반 통증, 여성의 불임증, 및 수술 시간 연장 및 수술후 합병증(추가 수술 과정이 필요한 경우)을 포함한다. 극단적인 경우, 쇠약 유착은 유착절리술, 외과적 절개 또는 유착의 용해(유착용해)에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 환자에서 유착 형성을 억제하기 위한 방법 및 조성물이 가장 유용하다.

동물 수술은, 동물의 정서적 가치 및 경제적 가치 둘다가 수의사의 기술 및 수행에 따라 증가하면서 더욱 일반적으로 되었다. 동물은 수술후 유착 형성 및 이로부터의 쇠약 효과라는 동일한 문제에 직면해 있다. 수술을 받은 동물에 대한 적합하고 인도적인 관리는 사람 진단 및 수술로부터 다수의 기술 및 방법을 동물에서 사용하기 위해 채택되는 것을 촉진하였다. 따라서, 동물에서 유착 형성을 억제하기 위한 방법 및 조성물을 수득하는 것이 마찬가지로 유용하다.

신체 장벽은, 대부분의 유착이 조직 표면 사이에서 섬유소 매트릭스의 발생에 의해 형성되기 시작하는 경우, 복막 치유 동안에 조직 병치를 제한함으로써 유착 형성을 방지하기 위해 시험되었다. 일반적으로, 신체 장벽, 막 또는 겔이 재복막화가 일어날 때까지 손상된 복막의 부착을 감소시켜 유착 형성을 억제하거나 방지하는데 사용되었다. 래트 모델 시스템에서, 재복막화는 약 칠(7)일이 소요된다. 래트 모델 시스템에서, 유착 형성을 방지하는데 36시간 이상 동안의 장벽 배치가 필요함이 밝혀졌다[참조: Harris et al., 1995, Surgery, 117:663-9].

다수의 보조제가 유착 방지용 동물 모델에서 시험되었지만, 현재 세가지 장벽만이 수술후 유착 형성을 감소시키기 위해 사람에게서 사용하는 것이 승인되었다. Interceed™(공급원: Johnson & Johnson Medical)는 산화된 재생 셀룰로스이며, Seprafilm™(공급원: Genzyme Corp.)은 개질된 카복시메틸셀룰로스와 착화된 개질된 히알루론산이며, Preclude™(공급원: W.L. Gore)는 신장된 폴리테트라플루오로에틸렌이다. Interceed™은 바람직하게는 혈액의 부재하에 사용된다. Preclude™는 심막 대용품으로서 승인되었지만, 생물재흡수성이 아니다. Seprafilm™은 복벽 및 자궁 절개에서의 사용이 승인되었다.

래트 시스템에서 시험된 가능한 항유착제는 링거 락테이트, 32% 덱스트란 70 용액, 및 1% 및 2% 개질된 카복시메틸셀룰로스 용액을 포함한다. 용액의 반은 손상부에 적용하고, 과량은 복부의 복강내에 고이게된다. 링거 락테이트는 효과적이지 않은데, 이는 복강내에서 신속하게 흡수되어 총 36시간의 임계 기간 동안 존재하지 않기 때문이다. 다소 점성인 기타의 용액이 더욱 효과적이다.

히알루론산(HA)은 복부-골반 및 정형외과 수술에서 장벽으로 사용되었다. 재흡수성 겔로서 개질된 HA 및 자동-가교결합된 폴리사카라이드(ACP)의 히알루로난계 겔이 또한 시험되었다. ACP인 히알루론산 유도체는 래빗 모델 시스템에서 복강경 유착 형성을 방지하는 것으로 입증되었으며 문헌[참조: Delaco et al., 1998, Fertility and Surgery, 69(2):318-323]에 의해 보고된 바 있다.

화학적으로 개질된 히알루로네이트 및 카복시메틸셀룰로스(HA/CMC) 겔 제형은 래트 모델 시스템에 적용되었다[참조: Leach et al., 1998, Fertility and Surgery, 69(3):415-418].

래빗 모델 시스템에서 유착 형성을 방지하는 폴리에틸렌 글리콜/폴리락트산(EG/LA) 박막의 평가가 수행되었다[참조: Rodgers et al., 1998, Fertility and Surgery, 69(3):403-408].

따라서, 의학 분야에 있어 동물에서 뿐만 아니라 사람에서 유착 형성을 억제하거나 방지하기에 유용한 물질 및 방법에 대한 요구가 지속되어왔다.

발명의 요약

본 발명은 사람을 포함하는 포유동물의 유착 형성을 억제하거나 완화시키는데 유용한 필수 조성물 및 방법을 제공한다.

창상 또는 수술 과정으로부터 초래된 유착은, 알파 V 베타 3(αvβ3) 인테그린 또는 세포외 매트릭스 단백질의 인테그린 결합 부위와 상호작용하여 포유동물 체내에서 αvβ3 인테그린이 세포외 매트릭스 단백질에 결합하는 것을 차단하는 길항제 분자로 창상 또는 수술 부위를 처리하여 억제하거나 적어도 완화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 길항제 분자는 단백질, 펩타이드(선형 뿐만 아니라 환형) 및 세포외 매트릭스 단백질(예: 피브로넥틴) 상의 αvβ3 인테그린 결합 부위를 모사하거나 αvβ3 인테그린 자체에 결합되어 세포외 매트릭스 단백질에 대한 결합을 방해하는 펩타이드 모사체(peptidomimetic)이다. 이러한 αvβ3 길항제 분자의 예는 모노클로날 항체 및 세포외 매트릭스 단백질 상의 αvβ3 결합 부위를 포함하거나 모사하거나 차단하거나, 또는 αvβ3 분자의 항원 에피토프에 특이적으로 결합하여 세포외 매트릭스 단백질에 대한 αvβ3 인테그린 결합의 억제가 달성되도록 하는 이의 생물 활성 부분 또는 단편이다. 한가지 이러한 모노클로날 항체 중 하나는 완전한 그 자체의 LM609 뿐만 아니라 이의 생물 활성 항원 결합 부분 또는 단편, 예를 들어, Fab, Fab2, Fv 및 이들의 혼합물이다. 모노클로날 항체 LM609의 쥐 뿐만 아니라 사람화 변형체 둘다가 본 발명의 목적에 적합하다.

또한, 피브로넥틴 상의 αvβ3 인테그린 결합 부위에 상응하는 아미노산 잔기 서열을 포함하며, 예를 들어, 아미노산 잔기 서열 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) 또는 이의 생물등가물을 포함할 수 있는 피브로넥틴 단편은 본 발명의 목적을 위한 αvβ3 길항제 분자로서 사용되어, 아미노산 잔기 서열 RGDS 또는 이의 생물 등가물에 의해 한정된 결합 부위를 갖는 피브로넥틴 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질에 αvβ3 인테그린이 결합하는 것을 중재할 수 있다.

또한, 소위 펩타이드 모사체, 즉 αvβ3 인테그린과의 상호작용에 비하여 상기 펩타이드를 모사하여 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 피브로넥틴 등에 결합되는 αvβ3 인테그린을 방해하는 비펩타이드 유기 화합물이 적합하다.

유착 형성은 수술 부위에 유착 억제량의 하나 이상의 상기 αvβ3 길항제 분자를 직접 또는 생리학적으로 적합한 담체 비히클 내에서 적용함으로써 억제하거나적어도 최소화시킨다. 이들 길항제의 적용은 복강내(i.p.) 투여, 피하(s.c.) 주사, 정맥내(i.v.) 투여 또는 다른 적합한 투여 경로를 통해 용이하게 달성된다.

적합한 담체 비히클은 액체 뿐만 아니라 생리학적으로 허용되는 흡수성 페이스트 및 고체일 수 있다. 길항제 분자는 수성 비히클 속에 용해되어 있거나 그 속에서 현탁액으로서 존재하는 길항제 분자를 함유하는 길항제 조성물로서 일반적으로 약 50마이크로그램/밀리리터(μg/ml)의 농도로 적용될 수 있다. 마찬가지로, 길항제 조성물은 용액 또는 현탁액 중의 억제제 분자에 의해 이루어진 흡수성 페이스트 또는 고체, 및 흡수성 젤라틴 스폰지 또는 분말일 수 있거나, 건조된 흡수성 하이드로겔 및 흡수성 히알루론산 유도체 등 및 담체 비히클로서 존재할 수 있다. αvβ3 길항제 조성물은 용기내에 함유된 억제제 조성물이 유착 형성을 억제하는데 사용될 수 있음을 지시하는 라벨이 제공된 적합한 크기의 용량 형태로 포장될 수 있다.

본 발명에 의해 고려되는 αvβ3 길항제는 세포외 매트릭스 단백질에 결합되거나 αvβ3 인테그린 분자에 결합될 수 있으나, 이러한 결합은 αvβ3 인테그린과 세포외 매트릭스 단백질 상의 이의 결합 부위 사이의 정상적 상호작용을 방해할 정도로 효과적이다. 이러한 세포외 매트릭스 단백질의 예는 피브로넥틴, 피브리노겐, 비트로넥틴, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand Factor), 라미닌, 콜라겐, 테나신, 오스테오폰틴 및 트롬보스폰딘 등이다.

수술후 유착 형성을 억제하기에 바람직한 방법은 수술 환자(사람 뿐만 아니라 동물)에게 유착 억제량의 αvβ3 인테그린 억제제 분자를 투여함을 포함한다.이러한 투여는 억제 조성물의 분취액을 조직 표면에 직접 또는 에어로졸 분무로서, 또는 패드, 겔, 용액 또는 현탁액 등을 통해 또는 적합한 담체 비히클로서 적용하여 유착 형성으로부터 보호하는 것을 포함한다.

정부 권리의 언급

본원에 기술된 연구는 부분적으로 NIH 지원금 HD 34824에 의해 부분적으로 지원된다. 미국 정부는 본 발명의 특정한 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 수술후/창상후 유착 형성 약제 및 유착 형성의 억제 분야에 관한 것이다.

유착 형성은 세포 유착 및 섬유아세포의 이동을 포함하여 창상 치유 다단계의 이상으로서 발생한다. 유착은 흔히 수술시에 복막 표면의 차단이 하부 기질 층을 노출시키는 경우에 외상 또는 출혈의 결과로서 발생한다. 후속적으로 이러한 노출은 키닌 및 히스티딘의 방출을 유도하며, 이는 다시 모세관 투과성을 증가시키고 염증성 세포를 함유하는 장액혈액상 삼출물을 방출시킨다. 피브린이 풍부한 이러한 삼출물은 손상된 표면 상에 혈병을 유도한다. 혈병을 용해시키지 않으면서, 염증성 세포 및 섬유아세포는 유착 형성을 초래하는 섬유소 풍부 세포외 매트릭스를 침윤시킨다.

세포외 매트릭스는, 세포가 유착되어 조직을 구성하는 경우 망을 형성하는 단백질의 상호작용 조직망으로 이루어진다. 세포외 매트릭스를 구성하는 거대분자는 주로 매트릭스내에서 세포에 의해 국소적으로 분비된다. 대부분의 연결 조직에서 이들 거대분자는 섬유아세포 또는 섬유아세포 계통으로부터의 세포(예: 연골아세포 또는 골아세포)에 의해 다량 분비된다. 매트릭스를 구성하는 세포외 거대분자의 두가지 주요 부류는 폴리사카라이드 글리코스아미노글리칸(GAG)이며, 이들이 일반적으로 프로테오글리칸 형태의 단백질 및 섬유상 단백질에 공유 결합되어 있다는 것이 밝혀졌다. 섬유상 단백질은 일반적으로 두가지 관능성 형태 중의 하나로서 고려된다: 주로 구조성(예: 콜라겐 및 엘라스틴) 또는 주로 유착성(예: 피브로넥틴 및 라미닌)[참조 문헌: The Molecular Biology of the Cell, 2nd ed. (Alberts et al., editors, Garland Publishing, Inc., New York, 1989) 802-824].

세포 유착은 태아 조직에서 및 세포외 매트릭스에서 세포 이동, 성장 및 분화를 조절할 뿐만 아니라 악성 종양의 형성, 염증, 면역 조절 및 지혈에 기여한다. 세포 유착 및 경막 세포 수용체의 매개체는 인테그린, 면역글로불린 초유전자 패밀리(family), 카데린, 셀렉틴, CD-44 관련 분자 및 경막(transmembrane) 프로테오글리칸을 포함한다[참조: Chothia & Jones, 1997, Ann. Rev. Biochem., 66:823-62]. 인테그린은 많은 리간드와 상호작용하는 결합 단백질의 중요한 부류이다. αvβ3 인테그린은 세포-세포 유착 및 이입에 중요한 것으로 동정된 막-결합된 당단백질이다. 인테그린은 세포외 매트릭스의 성분, 세포 표면 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리(superfamily) 수용체, 미생물의 표면 성분 및 특정 혈장 단백질의 성분을 포함하는 다양한 리간드에 결합된다[검토를 위한 문헌 참조: Loftus, J.C. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269(41):25235-25238].

하이브리도마 세포주 LM 609에 의해 생산된 쥐의 모노클로날(mAb) IgG 항체 LM 609는 인테그린 αvβ3에 특이적이다[참조: Cheresh et al., 1987, J. Biol. Chem., 262:17703-17711]. 쥐의 하이브리도마 LM609는 부다페스트 조약하의 국제 기탁기관으로서 기관[American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)]에 기탁되었으며, 1987년 9월 15일자로 ATCC 수탁번호 HB 9537를 부여받았다.

LM609 cDNA는 클로닝되었고, 이의 가용성 Fab 부분은 형질전환된 숙주 세포로부터 제조되었다. LM609 항체는 또한 사람화시켜 이의 면역원성을 감소시켰다(WO 99/29888).

αvβ3 길항제 분자로서 사용하기에 적합한 단백질 및 펩타이드는 피브로넥틴, 아미노산 잔기 서열 RGDS 또는 이의 생물 등가물 상의 αvβ3 상보성 결합 부위를 포함하는 것들이다. 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있다.

또한, αvβ3 인테그린 결합 부위 또는 세포외 매트릭스 단백질 상의 αvβ3 인테그린용 결합 부위에 실질적으로 상보성인 영역을 한정하는 무독성, 비펩타이드 유기 화합물이 적합하다.

사용시, 유착 형성을 억제하기 위해, αvβ3 인테그린 길항제 분자는 수술 부위에 직접 또는 에어로졸 분말로서 또는 액체(예: 물)일 수 있는 생리학적으로 적합한 담체 비히클 중에 단독으로 또는 페이스트 형태의 흡수성 분말과 함께 적용시킬 수 있다. 이러한 흡수성 분말의 예는 상품명 GELFOAM(제조원: Upjohn Co.)으로 시판되는 멸균 젤라틴 분말이다. 또는, αvβ3 인테그린 길항제 분자는 멸균 젤라틴 기포 또는 스폰지, 맥컬리(McAualley) 등의 미국 특허 제5,409,703호에 기술된 유형의 건조된 흡수성 하이드로겔 또는 히알루론산 유도체 상태로 수술 부위로 전달될 수 있다. 복강내(i.p.), 피하(s.c.) 또는 정맥내(i.v.) 투여용으로 바람직한 담체 비히클은 수성 비히클(예: 물 또는 식염수 수용액)이다.

유착 형성의 래빗 측벽 모델은 이미 기술된 바 있다[참조: Rogers et al., 1996, J. Invest. Surg., 9:388-91; Rodgers et al., 1998 상기]. 래빗은 래빗 체중 kg당 55mg의 케트아민 염산염 및 kg당 5mg의 크실라진의 혼합물로 근육내 마취시킨다. 멸균 수술용으로 제조한 후, 중심선 복강경 수술을 수행한다. 맹장 및 장을 체외로 이전시키고, 지압(指壓)하여 측벽 손상 영역과 접촉할 수 있는 모든 표면에 걸쳐 장막하조직 출혈되도록 한다. 이어서 손상된 내장을 4" 4x4-층 멸균 거즈를 사용하여, 점상 출혈이 관찰될 때까지 가볍게 마모시킨다. 이어서 맹장 및 장을 이의 정상 해부학적 위치로 복귀시킨다.

이러한 래빗 모델은 문헌에 기술된 유착 형성용의 표준화된 랫트 모델과 매우 유사하다[참조: Harris et al. (1995, 상기)]. 이러한 래트 모델에서, 복벽을 손상시키고 맹장을 마모시키고, 이를 10분 동안 자연 건조시키고, 두개의 손상된 표면을 밀폐하기 전에 접촉되게 위치시킨다. 래트를 나트륨 펜토바비탈(43mg/kg)을 사용하여 복강내로 마취시킨다. 복측 복부를 준비하고, 요도포르로 세척하고, 70% 알콜로 헹군다. 피부를 6cm로 중심선 절개하고, 피부를 함몰시킨다. 복벽을 4cm로 중심선 절개하는데, 우측 복벽은 제외한다. 중심선 절개에 측방향으로 1cm의 하부 근육의 표면 층을 포함하는 벽으로부터 벽측 복막의 1 x 2 cm 단편을 정확하게 절개한다. 이어서 맹장을 들어올리고 배치하여 밀폐시에 맹장이 복벽 결함과 접촉하도록 한다. 이후에, 맹장은 표준 방법으로 스캘펠 칼로로 긁어서 1 x 2cm 영역에 걸쳐 점상출혈의 균질한 표면이 되도록한다. 복벽 손상부도 마모시킨다. 복벽 및 맹장 손상부 둘다를 공기에 10분 동안 노출시킨다. 이어서 손상부를 접촉하도록 배치하고, 중심선 절개를 연속 4-0 폴리프로필렌 봉합으로 밀폐시키고, 피부는 4-0 실크로 밀폐시킨다[참조: Harris et al., 1995, 상기].

재생성 기관 유착을 연구하기 위한 기타 래빗 시스템은 래빗 자궁각 모델이다. 상기 모델에서, 중심선 절개를 수행하고 자궁각은 절개를 통해 드러낸다. 자궁각의 전체 원주 주위에서 약 5 cm 길이의 영역을 수술 거즈를 사용하여 스캘펠 칼로 12회 마모시킨다. 이러한 손상은 활성 출혈 영역의 부재하에 일반화된 홍반을 야기한다. 이어서 각을 복강내에 복귀시키고 상처를 밀폐시킨다.

복강경 수술 기기 및 기술의 출현으로 인하여 이러한 최소 침습 수술이 더욱 일반적으로 되었다. 그러나, 유착 형성은 여전히 이러한 복강경 수술로부터 가능한 합병증이다. 래빗 동물 모델은 복강경 유착 방지를 검사하는데 사용되어왔다[참조: Delaco et al., 1998, 상기]. 간단히, 이산화탄소 가스 통기를 위해 자동화 복식통기기를 사용하여, 베레스(Verres) 바늘을 복강에 삽입하여 중심선의 복벽에 꽃히게 한다. 이어서 투관침을 삽입하고, 동일한 위치의 복벽에 꽂히게한다. 이어서 크세논 300W 광원을 사용하여 투관침을 통해 복강에 관절경을 삽입한다. 모든 수술 과정은 내시경 마이크로카메라에 의해 수행한다. 복부를 검사한 후, 복강경수술용 가위 및 비외상성 겸자를 투관침을 사용하지 않고 2회의 측면 절개를 통해 삽입한다.

복막 또는 내부 표면에 대해 표준화된 손상은, 우측 자궁각의 2 x 2cm 영역을 30초간 표피박락시키고, 말단 우측 자궁각에서 1cm를 절개하고, 상기 병변의 전면의 복벽의 복막의 5 x 5cm 영역을 표피박락시켜 유도할 수 있다.

환자의 수술 부위에 전체 쥐의 LM 609 mAb를 투여할 수 있지만, 숙주 면역 반응이 쥐의 LM 609 단백질에 대해 유발되지 않도록, 장기간 또는 다수 사용에 대해 배제할 수 있다(즉, 사람 환자의 사람 항-마우스 항체, HAMA; 고양이 또는 개 항-마우스 항체 및 다른 처리된 동물에서의 기타 반응). 이는 Fab, Fab2 또는 Fv 작제물 또는 이들의 혼합물로 절단된 LM 609를 사용하여 부분적으로 최소화시킬 수 있다. 항체 단편(예: Fab, Fab2 또는 Fv)의 생성은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌에 교시되어 있다[참조: French, 1998, Methods in Molecular Biology, Immunochemical Protocols, 2nd Ed., 80:121-134]. 또한, 이들 항원 결합 단백질 및 인공 작제물(즉, 단쇄 Fv, scFv, scAb; 분자 인식 단위, MRU)을 제조하는 재조합 DNA 방법의 사용이 공지되어 있다[참조: 예를 들어, Verhoeyen et al., "Advances in antibody engineering" in Molecular Immunology, (IRL Press at Oxford University Press, Oxford, 1996) chapter 7].

사람 치료에 사용하기 위해서, 쥐의 LM 609 항체 또는 이의 부분을 단백질 구조에서 아미노산 잔기의 적절한 치환에 의해 사람화시켜 사람 단백질로서 나타나는 항체 표면의 면역원성 에피토프를 처리된 숙주로 변경시킬 수 있으며, 여기에서 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 잔기를 포함하는 결합 활성 부위의 항원 특이성이 보존되어 항원 에피토프 결합 특이성이 유지된다. 사람화 모노클로날 항체는 공지되어 있으며, 이미 당해 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, 발트만(Waldmann) 등(미국 특허 제5,502,167호)은 CDR의 아미노산 서열이 휴지기 및 활성화 T 세포에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체의 CDR의 서열로부터 유도되는 사람화 항체를 기술한다. 후겐붐(Hoogenboom) 등(미국 특허 제5,565,332호)은 중쇄 또는 경쇄의 선택적 돌연변이, 돌연변이된 쇄의 재조합 및 결합 활성에 대한 항원 선택성 선별과 관련되는, 사람 특성이 증가된 항체의 제조방법을 기술하고 있다. 아데어(Adair) 등(미국 특허 제5,859,205호)은 항체 중쇄 및 경쇄의 CDR을 수용체 골격 영역에 이식하는 특수한 방법을 기술하고 있다. 따라서, 활성 부위 형성 잔기를 암호화하는 LM 609 항체의 아미노산 잔기를 사람 항체 골격으로 이식함으로써 LM 609 항체의 결합 특이성을 갖지만 사람 항체의 항원성 외관을 갖는 키메라 항체를 생성시킬 수 있다. 추가로 쇄 재분류 및 항원 선택과 관련되는 CDR 이식을 최적화하기 위한 유일한 방법은 WO 99/29888(Barbas 등)에 기술되어 있다.

이러한 방법에 의해 발생하는 임의 친화성 감소와 이에 따른 결합 효율의 감소는 항원으로 선별하여 우수한 결합 작제물을 선택하고 다가 결합 작제물을 생성시킴으로써 최소화할 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 LM 609 항원 결합 활성 부위 또는 사람화 활성 부위를, 당해 분야에 공지된 화학적 링커를 사용하여 가교결합시킴으로써 차단제로서 더욱 효율적으로 작용할 수 있는 활성 부위의 이관능성 또는 다관능성 그룹을 형성시킬 수도 있다. 유사하게, 다수의 활성 부위를 고체 지지체(예: 미립자 및 대형 라텍스 중합체 또는 콜로이드성 비드 등)에 부착시킬 수도 있다. 전체 항체 또는 이의 단편 또는 작제물을 함유하는 활성 부위를 고체 지지체 시스템에 결합시키는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 왕[참조: Wang, 1998, Methods in Molecular Biology, Immunochemical Protocols, 2nd Ed., 80:365-376]은 세포 분류용 면역자기 비드의 사용을 기술하고 있으며, 이때 비드는 생물 반응성 분자(예: 항체, 스트렙타비딘, 렉틴 및 펩타이드)로 피복될 수 있다.

또한, 피브로넥틴 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질에 대한 αvβ3 인테그린의 결합을 방해하거나 다르게는 차단하여 유착의 발생에 필요한 접촉의 형성을 방해하는 항체를 생성함으로써 본 발명의 방법을 수행하거나 본 발명의 동일한 조성물을 제조할 수 있다. 이를 위해, 적합한 동물을 면역시켜 αvβ3 인테그린에 또는 피브로넥틴 또는 다른 세포외 매트릭스 단백질의 αvβ3 결합 부위에 특이적인 항체의 생성을 자극할 수 있다. 적합한 이러한 항체는 당해 분야에 공지된 통상적인 방법을 사용하는 항원 선별에 의해 선택할 수 있다. 적합하게 선택된 클론으로부터의 모노클로날 항체의 생성은 또한 익히 공지되어 있으며, 적합한 αvβ3 억제제 분자를 제조하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 방법에서 이러한 현존하거나 계속해서 생성되는 항체 중의 어느 하나를 치환하는 것은 본 발명의 범위내에 있으며, 결과 뿐만 아니라 수단이 동일하다.

본원에서 상기에 기술된 것 이외에, αvβ3 결합의 억제에 적합한 길항제 분자는 또한 통상적 선별에 의해 용이하게 선택할 수 있다. 이를 위해, 시험관내 선별 검정은 피브로넥틴 또는 다른 적합한 매트릭스 성분을 포함하는 제조된 세포외 매트릭스로의 세포 유착을 사용하여 작제할 수 있다. 최초 선별 시스템에서, 후보 분자를 투여할 수 있으며, 세포의 후속적 성향을 평가한다. 지지체에 대한 결합 감소, 또는 유착 형성을 반영하는 매트릭스 성분의 증식 억제는 추가 연구에 유망한 후보를 지시한다. 최초 선별은 화합물의 혼합물을 사용하여 수행하여 뱃치 스크린을 수행함으로써 시간 및 노력을 감소시킬 수 있다. 특정 화합물 혼합물의 특이적 결합 억제는 최초 결과가 성공적인 것으로 나타나는 경우 개별적으로 검정할 수 있다. 이러한 선별은 필요한 경우 충분히 자동화될 수 있다. 이러한 억제제 분자의 발견 방법과 무관하게, 이들 분자가 본 발명의 방법에 사용하기 위해 본 발명의 조성물로 적합하게 제형화된다는 것은 명백하다. 이상적으로 이러한 화합물의 사용에 최적인 농도는 LM 609 항체에 대한 농도와 적어도 유사하며 가능한 역효과 또는 독성 효과를 최소화한다.

세포외 매트릭스 단백질 분자의 αvβ3 인테그린 결합 부위에 특이적으로 결합하거나 이를 방해하는 길항제 분자는 본 발명의 수행에도 적합하다.

본 발명 및 이의 대부분의 양태는 다음 실시예에 의해 예시된다.

전체 쥐 mAb LM 609를 0.1 내지 10mM의 농도로 함유하는 용액을 사용하는 최초 시험은 래빗 자궁각 모델을 사용하여 수행한다. 이러한 시험용 용액을 사용하는 잇점은 신체 장벽과 달리, 신체 장벽의 정확한 배치 또는 (일부 경우) 장벽의 후속적인 제거가 필요하지 않다는 것이다. 용액은 복강내에 배치시켜 제한 또는 국재화 없이 전체 강에 주입할 수 있다. 따라서, mAb LM 609를 함유하는 치료 조성물의 투여는 공지된 신체 장벽의 배치에 의해서보다 더욱 용이하게 달성할 수 있으며 효능은 물리적 인자에 따라 거의 좌우되지 않는다.

복강경 수술은 "개방 및 밀폐" 허위 방법(허위, n=3) 또는 골반 마모가 의도적으로 표준화 방식으로 형성되는 방법(실험, n=18)을 갖도록 무작위로 분류된 21마리의 마취된 뉴 질랜드 화이트 래빗에 대해 수행한다. 중심선 복강경 수술을 실험 동물에 대해 수행하며, 측벽, 방광, 자궁 및 나팔관은 점상출혈이 발생할 때까지 200그릿 샌드페이퍼로 마모시킨다. 손상 후, 실험 그룹 중의 래빗을 2ml의 식염수(식염수 대조; 그룹(iii), n=6), 항-베타 1 항체 2㎖(항-베타 1; 1mg/ml, 그룹(ii), n=6) 또는 LM 609 2㎖(항-αvβ3; 1mg/ml; 그룹(i), n=6)를 무작위적으로 복강내 투여한다. 복벽은 근육용 3.0 폴리글락틴 910(비크릴; Vicryl) 및 4.0 폴리글락틴 910을 사용하여 두 층으로 밀폐시켜 피부를 피하 방식으로 밀폐시킨다.

동물은 12시간 명/암 주기로 사육하며, 1일당 먹이 150g를 공급하고 물은 자유로이 먹도록 한다. 래빗은 5자리 태그로 번호를 붙이고, 용액은 각각 A, B 및 C로 표지한다. 동물은 수술후 3주까지 50mg의 정맥내 펜토바비탈을 사용하여 희생시키고, 복강내 유착은 치료 동일성을 모르는 1명의 관찰자에 의해서, 문헌[참조: Blauer et al., 1988, Fertility & Sterility, 49:144-49]으로부터 변형된 점수 시스템을 사용하여 평가한다.

유착 점수 시스템

점수	설명
0	유착 없음
1	1회의 박막성 유착
2	1회 이상의 박막성 유착
3	1회의 조밀한 유착
4	1회 이상의 조밀한 유착

박막성 유착은 용이하게 파괴시킬 수 있는 것으로 정의된다. 조밀한 유착은용이하게 분리되지 않는 것이다.

통계학적 분석은 STATA를 사용하여 수행한다. 그룹간의 유착 점수의 차이는 집단의 동일성에 대해 α=0.05(p=0.02)로 하여 크루스칼-발리스(Kruskall-Wallis) 시험을 사용하여 측정한다. 이어서 각 그룹은 다른 그룹에 대해 두개의 샘플 윌콕손(Wilcoxon) 등급 합계 분석을 α=0.05로 사용하여 분석한다.

LM 609 처리 그룹에서 수득된 점수는 허위로 조작된 그룹에서 관찰된 것과 유사하며(p=0.11), 이는 처리가 유착 형성 감소에 효과적임을 입증한다. 결과는 대조 처리가 허위로 조작된 그룹, 식염수(p=0.05) 그룹 또는 항-베타 1 인테그린 그룹(p=0.03)과 비교하는 경우 효과적이지 않음을 나타낸다.

유착 점수

처리	점수
허위	001
식염수	444034
항-b1	432342
LM609	122013

본 발명의 많은 측면에서 충분히 기술되고 본원에서 청구된 본 발명은 본원의 교시에 따라 과도한 시험 없이 이루어지고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 상기 실시예에 의해 기술되었지만, 많은 변화 및 변형이 본원에 기술된 조성물 및 방법에, 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 이탈하지 않으면서 적용될 수 있음이 명백하다.

Claims

포유동물 체내에서 알파 V 베타 3 인테그린이 세포외 매트릭스 단백질에 결합하는 것을 차단하는 단계를 포함하여, 유착 형성을 억제하는 방법.
세포외 매트릭스 단백질에 결합하기 위한, 알파 V 베타 3 인테그린의 결합 부위를 차단하는 길항제 분자의 유착 억제량을 수술 환자에게 투여함을 포함하여, 수술후 유착 형성을 억제하는 방법.
제2항에 있어서, 세포외 매트릭스 단백질이 피브로넥틴인 방법.
제3항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부위를 가지는 방법.
제3항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체 LM 609인 방법.
제3항에 있어서, 길항제 분자가 Fab, Fab2, Fv 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부분인 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 생리학적으로 적합한 용액 중에 약 50mg/ml이상의 농도로 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체인 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 펩타이드인 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 펩타이드 모사체(peptidomimetic)인 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 단백질인 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 흡수성 고체 담체 비히클과 함께 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 흡수성 젤라틴 담체 비히클과 함께 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 담체 비히클로서의 페이스트와 함께 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 복강내 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 피하 투여되는 방법.
제2항에 있어서, 길항제 분자가 정맥내 투여되는 방법.
알파 V 베타 3 인테그린 상의 세포외 매트릭스 단백질에 결합하기 위한 결합 부위를 차단하는 길항제 분자, 및 이에 대해 생리학적으로 허용되는 흡수성 고체 담체 비히클을 포함하는, 유착 형성의 완화에 적합한 조성물.
제18항에 있어서, 세포외 매트릭스 단백질이 피브로넥틴인 조성물.
제19항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부위를 갖는 조성물.
제19항에 있어서, 길항제 분자가 쥐의 모노클로날 항체 LM 609인 조성물.
제19항에 있어서, 길항제 분자가 사람화 모노클로날 항체 LM 609인 조성물.
제19항에 있어서, 분자가 Fab, Fab2, Fv 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부분인 조성물.
제18항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체인 조성물.
제24항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체의 항원 결합 분절인 조성물.
제18항에 있어서, 흡수성 고체 담체 비히클이 젤라틴인 조성물.
제18항에 있어서, 길항제 분자가 단백질인 조성물.
제18항에 있어서, 길항제 분자가 펩타이드인 조성물.
제18항에 있어서, 길항제 분자가 펩타이드 모사체인 조성물.
수술후 유착의 완화에 적합하며, 세포외 매트릭스 단백질에 결합시키기 위한 알파 V 베타 3 인테그린 결합 부위를 차단하는 길항제 분자와 함께 이에 대한 생리학적으로 허용되는 담체 비히클을 함유하는 조성물의 포장된 용량 형태로서, 포장된 억제 조성물이 유착 형성을 억제하는데 사용될 수 있음을 지시하는 라벨을 추가로 포함하는 포장된 용량 형태.
제30항에 있어서, 세포외 매트릭스 단백질이 피브로넥틴인 포장된 용량 형태.
제31항에 있어서, 길항제 분자가 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부위를 갖는 포장된 용량 형태.
제31항에 있어서, 길항제 분자가 쥐의 모노클로날 항체 LM 609인 포장된 용량 형태.
제31항에 있어서, 길항제 분자가 사람화 모노클로날 항체 LM 609인 포장된 용량 형태.
제31항에 있어서, 길항제 분자가 Fab, Fab2, Fv 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 모노클로날 항체 LM 609의 항원 결합 부분인 포장된 용량 형태.