KR20020038844A - 부루세라 ＲＢ51균의 8ｋＤａ 항원 및 이것의 정제방법,그 항원을 이용하여 부루세라 ＲＢ51의 항체를 검출하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 부루세라(Brucella abortus) RB51균의 표면에 존재하며, 면역원성이 우수하고, 특이성이 우수한 8kDa의 항원, 이 항원의 정제 방법 및 이 항원을 이용하여 부루세라 RB51균의 중화항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 8kDa의 항원은 조기에 체액성 면역반응을 유발시키면서 면역원성이 우수하며, 이를 토대로 확립된 분자량 8kDa의 항원을 정제하는 기법은 매우 단순하고 재현성이 우수하다. 또한 정제된 항원을 이용한 본 발명의 부루세라 RB51균의 항체를 검출하는 방법은 특이 정제항원을 사용하기 때문에 항원에 의한 비특이 반응을 최대한 줄일 수 있으며, 신속하고 간편하게 다량의 혈청을 쉽게 검색할 수 있어 RB51 백신을 접종하는 국가에서는 RB51 백신의 효용성을 제고할 수 있을 뿐만아니라 자연감염에 의한 부루세라 항체와 대별되기 때문에 부루세라 근절을 위해 정책적 유용성이 매우 높아서 부루세라병을 예방하고 조기에 근절시킬 수 있다.

Description

부루세라 ＲＢ51균의 8ｋＤａ 항원 및 이것의 정제방법, 그 항원을 이용하여 부루세라 ＲＢ51의 항체를 검출하는 방법{8kDa antigen of Brucella abortus strain RB51, a method for purification thereof and a method for detecting antibody utilizing antigen of Brucella abortus strain RB51}

본 발명은 부루세라(Brucella abortus) RB51균의 표면에 존재하며, 면역원성이 우수하고, 특이성이 우수한 8kDa의 항원, 이 항원의 정제 방법 및 이 항원을 이용하여 부루세라 RB51균의 중화항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

부루세라병은 가축뿐만 아니라 사람에도 감염되는 인수공통질병으로서 소를비롯한 다양한 종류의 숙주동물을 갖고 있으며, 전 세계적으로 발생하고 있는 질병이다. 이 병은 잠복기간이 3주일 내지 3개월로 비교적 긴 만성전염병으로 오염된 사료, 물 등을 통한 경구, 유두나 창상부위 등을 통해 체내에 침입하면 인접 임파절에 이르러 탐식세포 내에서 증식하고 임파절에 생존하던 균이 임신 4-6개월령 소의 태반에서 분비하는 호르몬(erythritol)에 의하여 혈류를 통해 태반에 도달하여 증식하며, 그 결과 임신 6-8개월에 전구증상 없이 유사산을 일으켜 양축농가에 막대한 경제적 손실을 초래한 질병으로서, 탐식세포 내 증식하는 부루세라 균(Brucella abortus)에 대한 효과적인 치료방법은 없다.

최근들어 미국 등 외국에서는 B. abortus strain 2308의 rough mutant인 lipopolysaccharide O-side chains이 결손된 B. abortus RB51 균주를 이용한 생균백신을 개발하여 부루세라병 예방에 사용하고 있다.

B. abortus RB51은 리팜핀(rifamoin)에 내성을 가지고 있으며, urease(+), glucose(+)이며 erythritol 존재시 잘 자라고 배양시 CO₂를 요구하지 않는 성상을 가지고 있는 균주로서, 자연 감염된 부루세라균의 항체를 검색하는 우유윤환반응(Milk ring test), 로즈벵갈 평판응집반응(Rose Bengal plate test), 표준평판응집반응(standard plate agglutination test), 표준시험관응집반응(standard tube agglutination test) 및 보체결합반응(complement fixation test)에서는 B. abortus RB51의 항체를 검색할 수 없어, 감염우와의 감별이 불가능하다.

따라서, 현재 RB51의 항체가를 측정할 수 있는 방법은 균체 항원을 이용한 dot-blot assay법이 유일한 방법[Olsen SC et al.,J Vet Diagn Invest, 9: 363-367, 1997; Olsen SC et al.Res Vet Sci, 66:101-105, 1999; Palmer MV et al.,Am J Vet Res. 58(5): 472-477, 1997]으로 알려져 있다.

그러나, 이 검사법은 ELISA법에 비해 사용되는 니트로셀룰로오스(NC) 막의 종류, 콘쥬게이트(conjugate)의 농도, 기질의 종류 및 반응시간에 따라 차이를 보여 진단방법의 설정이 어렵고 실험실간의 결과가 차이를 보이는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 균체를 이용한 dot-blot assay법이 갖고 있는 항원에 의한 비특이 반응을 최대한 줄일 수 있으며, 신속하고 간편하게 다량의 혈청을 쉽게 검색할 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 부루세라 RB51균의 표면에 존재하는 8kDa 항원이 면역원성이 우수하며, 특이성이 우수하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 부루세라 RB51균의 표면에 존재하며, 면역원성이 우수하고, 특이성이 우수한 8kDa의 항원을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항원을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항원을 이용하여 부루세라 RB51균의 중화항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 부루세라 RB51 예방약 접종 후, 주기적으로 6개월간 채혈한 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 한 결과이다.

레인 M : 분자량 마커, 레인 1 : 예방약 접종 전 채혈한 혈청, 레인 2 : 예방약 접종 26일 후 채혈한 혈청, 레인 3 : 예방약 접종 42일 후 채혈한 혈청, 레인 4 : 예방약 접종 55일 후 채혈한 혈청, 레인 5 : 예방약 접종 82일 후 채혈한 혈청, 레인 6 : 예방약 접종 96일 후 채혈한 혈청, 레인 7 : 예방약 접종 120일 후 채혈한 혈청, 레인 8 : 예방약 접종 134일 후 채혈한 혈청, 레인 9 : 예방약 접종 148일 후 채혈한 혈청, 레인 10 : 예방약 접종 162일 후 채혈한 혈청, 레인 11 : 예방약 접종 182일 후 채혈한 혈청

도 2는 웨스턴 블롯에 의해 RB51 예방약 접종 후 주기적으로 6개월간 채혈한 혈청을 이용하여 여러 부루세라 관련 혈청에 대한 8kDa 항원의 반응성을 확인한 결과이다.

레인 M : 분자량, 레인 1, 2, 3 : STAT법과 dot-blot assay법에서 모두 양성을 보인 혈청, 레인 4, 5, 6 : STAT법에서는 양성, dot-blot assay법에서는 모두 음성을 보인 혈청, 레인 7, 8, 9 : STAT법에서는 음성, dot-blot assay법에서는 양성을 보인 혈청, 레인 10, 11, 12 : STAT법과 dot-blot assay법에서 모두 음성을 보인 혈청

도 3은 사르코신 추출물의 슈퍼로스 12 HR 10/30 FPLC 크로마토그램이다.

도 4는 슈퍼로스 12 HR 10/30으로부터의 8kDa 항원을 포함하는 분획의 세파크릴 S-100 FPLC 크로마토그램이다.

도 5는 각각의 정제 과정을 통한 부루세라 RB51 8kDa 항원의 15% SDS-PAGE(A), silver stain과 웨스턴 블롯으로 분석(B)한 결과이다.

레인 M : 분자량 마커(시그마사), 레인 1 : 사르코신 추출물, 레인 2 : 슈퍼로스 12 컬럼 분획, 레인 3 : 세파크릴 S-100 컬럼 분획

도 6은 부루세라 RB51의 양성혈청 및 음성혈청을 판정하기 위한 E value의 ROC(receiver operating characteristic) 커브이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소 체내에서 면역원성이 높고,부루세라(Brucella abortus) RB51균으로부터 분리된 8kDa 항원을 제공하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 간편하면서도 재현성 있게 소 부루세라(Brucella abortus) RB51균으로부터 8kDa의 항원을 정제하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다. 정제방법은 (1) 소 부루세라(Brucella abortus) RB51균에 사르코신(sarcosine)을 처리하여 균체 표면의 항원을 추출하는 단계; (2) 황산암모늄을 사용하여 상기 추출물을 농축시키는 단계; (3) 농축된 추출물을 트리톤 X-100에 용해시킨 후, 슈퍼로스(Superose) 12 HR 10/30 컬럼을 통과시키는 단계; 및 (4) 상기 컬럼을 통과한 분획을 다시 세파크릴(Sephacryl) S-100 컬럼을 통과시키는 단계로 이루어진다. 이와 같은 방법으로 정제된 항원을 이용하여 부루세라 RB51균의 항체를 진단하는 방법은 종래 dot-blot assay법이 갖는 항원에 대한 비특이 반응을 최대한 줄일 수 있어 신속하고 간편하게 다량의 혈청을 쉽게 검색할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 부루세라 RB51균의 항체를 검출하는 방법을 구체적으로 설명하면 (1) 8kDa의 항원을 항원 흡착용 코팅완충용액을 사용하여 최적 항원 희석 농도로 희석한 후, 면역분석용 플레이트에 항원을 흡착시키는 단계; (2) 항원이 흡착된 플레이트를 차단완충용액(Blocking buffer solution)을 사용하여 차단하는 단계; (3) 가검 동물에서 채취된 혈액에서 혈청을 분리하여 희석한 다음, 상기 항원이 차단된 플레이트에 분주하여 혈청반응을 시키는 단계; (4) 플레이트를 세척하는 단계; (5) 토끼 항-소 IgG HRP를 차단완충용액으로 희석한 다음, 세척된 플레이트에 분주하여 토끼 항-소 콘쥬게이트 반응을 시키는 단계; (6) 플레이트를 세척한후, 발색제로 발색시키는 단계; 및 (7) 흡광도를 측정하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 본 발명이 들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 부루세라 RB51균의 항원분석

부루세라 RB51균(Brucella abortus RB51 strain : 미국 NVSL(national veterinary services laboratory)에서 분양받음)을 10% 소 혈청이 함유된 부루세라 한천배지에 접종한 다음, 3-5% CO₂조건하에서 36-48시간 동안 종균 배양하고, 같은 배지에서 36-48시간 동안 호기상태로 종균 배양하였다.

배양한 균을 플레이트당 인산염 완충액 식염수(phosphate buffered saline : PBS) 10㎖를 넣고, 10,000×g로 3회 원심세척하여 회수하였다. 회수된 균은 g(wet)당 PBS 50㎖로 부유시키고, 초음파 파쇄기(sonicator ; 75% max. output, 1.5sec pulse on & 1.0sec pulse off)로 10분 동안 초음파 파쇄한 후, 12,000×g로 30분 동안 원심분리한 상층액을 0.45㎛로 여과한 것을 항원으로 사용하였다.

초음파 파쇄된 항원을 15% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 150V로 1시간 동안 전기영동을 실시한 다음 SDS-PAGE에 의해 분리 전개된 초음파 파쇄 부루세라 RB51 균주의 항원을 함유한 겔을 전기영동 블롯팅 완충액(20mM Tris-Cl, pH 8.0, 150mM 글리신, 20% 메탄올) 내에서 니트로셀룰로오스 막(이하 'NC막'이라 함)에 1.0A로 3-4시간 동안 전사하였다. 초음파 파쇄된 항원들이 전사된 NC막을PBS(NaH₂PO₄0.23g, Na₂HPO₄1.15g, NaCl 9.0g/L, pH 7.2)로 2회 세척한 후, 차단 완충액(1% 스킴 밀크 함유 PBS)에 실온에서 1시간 동안 정지시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 여기에 부루세라 RB51 예방약을 접종한 후, 주기적으로 6개월 동안 채혈한 혈청을 차단완충액으로 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음 PBS를 넣고 3회 세척하였다. 다시 염소 항-소 IgG(H+L specific), 서양고추냉이 산화제 콘쥬게이트(KPL, Maryland, USA)를 차단완충액으로 1,000배 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, PBS로 4회 이상 세척한 후, 기질용액(3,3'-디아미노엔지딘; DAB(diaminobenzidine) 50㎎, 1% CoCl₂2㎖, PBS 98㎖, 30% H₂O₂0.1㎖)을 10-15분간 작용시켜 각 항원에 대한 면역원성을 분석하였으며, 표준 분자량 마커(시그마, St. Louis, MO, USA)는 0.5% Ponceau S(시그마)로 염색하여 항원의 크기를 산출하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1로부터, 부루세라 RB51 항원에는 64, 36, 34, 29, 18, 17 및 8kDa의 7개의 면역원성 항원이 존재함을 알 수 있다. 특히, RB51의 8kDa의 항원은 접종 3-4주령부터 강한 면역반응을 보인다는 것을 알 수 있다.

[실시예 2]

다양한 부루세라 관련 혈청(부루세라 RB51 예방약을 접종한 후, 4-5개월령의 개체들의 혈청, 야외 부루세라 양성혈청 및 야외 부루세라 음성 혈청)에 대하여 야외 부루세라 검색 확진법인 표준 시험관 응집 반응법(이하 'STAT법'이라 함), 부루세라 RB51 항체검사법인 dot-blot assay법을 실시하고, 웨스턴 블롯에 의한 8kDa항원과의 반응성을 조사하여, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

<표준시험관응집반응법; Standard tube agglutination test>

가검혈청 80, 40, 20, 10, 5㎕가 함유된 각각의 4부 시험관에 부루세라 시험용 진단액을(NVRQS, national veterinary research and quarantine service 자체생산) 0.5% 페놀이 함유된 식염수로 100배 희석하여 2㎖씩 넣고 잘 혼합한 다음 37℃에서 48시간 동안 반응시켜 응집이 일어나는 시험관의 희석배수를 항체가로 산정하고 100배 이상일 때 양성으로 판정하였다.

<Dot-blot assay법; dot enzyme-linked immunosorbent assay>

부루세라 RB51균은 10% 소 혈청이 함유된 부루세라 한천배지에 바시트라신(bacitracin) 25unit/㎖, 폴리믹신(polymixin) B 5unit/㎖, 날리디식 애시드(nalidixic acid) 5㎍/㎖, 반코마이신(vancomycin) 20㎍/㎖, 사이클로헥시마이드(cycloheximide) 100㎍/㎖이 첨가된 BPNV(bacitracin, polymixin, nalidixic acid, vancomycin)배지에서 37℃의 온도로 36-48시간 동안 배양한 후, 0.15M PBS로 균을 회수하여 3,000×g로 30분 동안 3회 원심세척하고, 균농도를 약 3×10¹¹CFU/㎖로 조정, 항온수조에서 65℃의 온도로 30분 동안 처리하여 사멸시키고, 다시 원심세척하여 4℃에 보관하였다. 최종 항원사용농도는 280㎚에서 OD 0.82±0.01로 TBS 완충액(Trisma base 0.47g, Trisma HCl 2.54g, NaCl 29.22g/ℓ, pH7.5)로 희석하여 사용하였다. NC막(Bio-Red)에 100㎕씩 분주하여 진공펌프를 이용하여 10분 동안 흡착한 다음, TBS로 1회 세척하고, 37℃에서 건조시켜 사용시까지 보관하였다.GTBS(0.25% 젤라틴 함유 TBS)에서 30분 동안 정치시키고, TBS로 1회 세척한 다음, 혈청을 GTBS로 1/20 희석하여 각 웰에 100㎕씩 분주, 30분 동안 반응시킨 다음 진공펌프를 이용하여 NC막을 통과시키고, TBST(0.05% 트윈 20 함유 TBS)로 5회 세척하였다. 콘쥬게이트(염소 항-소 혈청 IgG HRP, KPL)는 1/2,000배로 희석하여 30분간 반응시키고, TBST로 3회, TBS로 1회, 증류수로 1회 세척한 다음, 기질(TBS와 0.15% H₂O₂안에0.5㎎ 4-클로로-1-나프톨/㎖)을 넣어 3-5분간 반응시켜 암청색으로 발색하면 양성으로 판정하였다.

<웨스턴 블롯(Western blot)>

부루세라 RB51 예방약을 접종한 후, 4-5개월령의 개체들의 혈청, 야외 부루세라 양성혈청 및 야외 부루세라 음성 혈청을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 실시하여, 8kDa 항원에서의 반응성을 조사하였다.

[표 1]

그룹	시험 혈청수	STAT법	dot-blot assay	웨스턴 블롯법
		+	_	+	_	+	_
Ⅰ	16	_	16	12	4	12	4
Ⅱ	12	12	_	4	8	4	8
Ⅲ	15	_	15	1	14	_	15
Ⅰ : 부루세라 RB51 예방약을 접종한 후, 4-5개월령의 개체들의 혈청Ⅱ : 야외 부루세라 양성 혈청Ⅲ : 야외 부루세라 음성 혈청

표 1로부터, 부루세라 RB51 예방약을 접종한 후 4-5개월령의 개체 16두를 검사한 결과 모두 STAT에서 음성을 보였고, 그 중 12두에서 RB51양성을 보였으며, 8kDa 항원에 대한 반응성 역시 dot-blot assay와 각 개체별 성적이 일치하였음을 알 수 있다. 또한, 야외 부루세라 양성혈청 12두중 4두가 dot-blot assay에서 양성반응이 관찰되었으며, 이와 같은 성적은 8kDa 항원의 반응과도 일치한 성적을 보였다. 야외 부루세라 양성혈청에서 dot-blot assay법에 의해 양성을 보인 혈청은 STAT법에서 3,200배 이상의 항체가를 보이는 고도로 면역된 개체였다. 한편, 부루세라 음성혈청 15두 중 1두가 비특이반응에 의한 RB51 양성반응을 보였지만, 8kDa 항원에는 반응하지 않아 이 항원의 특이성이 확인되었다.

[실시예 3] 8kDa 항원의 정제

상기 실시예 1 및 2에 의해 면역원성과 특이성이 확인된 8kDa의 항원을 정제하였다. 실시예 1에서와 같이 10% 소혈청이 함유된 부루세라 한천 배지 50 플레이트(87×15㎜, 페트리디쉬)에 부루세라 RB51균을 접종한 다음, 48시간 동안 배양하여 4.48g(wet)의 균을 회수하였다. 여기에 1% 사르코신(sarcosine)용액을 동량 첨가하여 37℃ 진탕항온수조에서 30분간 균체 표면항원을 추출한 다음, 20,000×g로 30분 동안 원심분리하여, 상층액을 회수하였다. 상층액에 1% 트립신(1:250, Difco)을 용량의 1/10로 첨가하여 진탕항온수조에서 37℃의 온도로 30분 동안 반응시켜 단백질류를 분해하고, 여기에 단백질 분해효소 억제제(0.5M EDTA 4㎖, 50mM 1,10-phenathroline 2㎖, 1M 2-mercaptoethanol 2㎖/ℓ)를 첨가한 다음 0.45㎛로 여과하여, 균체 표면에서 사르코신에 용해되고, 트립신에 저항하는 항원을 추출하였다.

추출된 항원에 황산암모늄을 75% 수준으로 첨가하여 실온에서 1시간 동안 반응시키고, 3,000×g로 30분 동안 원심분리한 다음, 모세피펫을 이용하여 하층액을 조심스럽게 모두 제거하고 0.5% 트리톤 X-100이 함유된 0.15M PBS을 조금씩 첨가하여 상층액을 완전히 녹여 항원을 농축시켰다.

FPLC system을 이용한 겔 여과 컬럼으로 균체 표면에서 추출, 농축된 항원으로부터 8kDa 항원을 순수분리, 정제를 시도하였다. 즉, 추출, 농축된 항원을 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 0.15M PBS로 안정화된 슈퍼로스 12 HR 10/30 컬럼(Pharmacia, Sweden)에 1.0㎖을 주입하여 유속 0.5㎖/min으로 컬럼을 통과시켜 254㎚에서 흡광도를 측정하면서 1.0㎖씩 분액하였고, 그 결과 7개의 분액을 확인하였다(도 3참조). 그 다음, 각각의 분액을 15% SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 7개의 분획 중 첫 번째 분획에 대한 결과로, 이 분획에서 8kDa 항원이 가장 농후하게 분포되어 있다. 또한 이 분획에는 25-70kDa의 항원이 분포하고 있었으며, 웨스턴 블롯에서 확인한 결과, 부루세라 RB51 양성혈청에는 거의 면역반응을 보이지 않았다(도 5의 B참조). 그러나, 이 항원들은 야외 부루세라균 또는 다른 종류의 세균과 교차반응이나 비특이 반응이 일어날 우려가 있어 이들을 제거할 목적으로 추가 정제를 시도하였다.

직경 15㎜, 길이 1,200㎜의 빈 컬럼(아미콘)에 세파크릴 S-100 수지(Pharmacia, Sweden)를 충전시켜 컬럼을 만들고, 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 0.15M PBS로 안정화시켰다. 여기에 상기 슈퍼로스 12 컬럼에서 분획된 8kDa 항원 함유 분액 2.0㎖을 주입하여 유속 2.0㎖/min으로 컬럼을 통과시킴으로서 1차 정제시 함유된 다른 항원들을 제거하여 8kDa 항원을 정제하였다(도 4 참조). 정제된 항원을 15% SDS-PAGE로 전개하여 Silver stain과 웨스턴 블롯으로 항원의 순수성을 확인하였다(도 5의 A와 B참조).

도 4에서 보는 바와 같이, 슈퍼로스 12 컬럼으로 1차 정제된 항원을 세파크릴 S-100 컬럼(Ø15㎜×1200㎜)으로 2차 정제를 한 결과 하나의 단일 분획을 확인할 수 있었다.

그 결과, 도 5에서는 Silver strain과 웨스턴 블롯으로 1차 정제시 포함된 20-70kDa의 항원이 거의 제거되고, RB51균의 8kDa 항원이 순수하게 정제되었음을 확인하였다.

한편, 최종 정제된 8kDa의 항원을 Lowry방법에 준한 BCA lit(Pierce, Rockford, USA)를 사용하여 단백질량을 측정한 결과, 균체 g(wet)당 71.46㎍의 항원을 얻을 수 있었으며, 회수율은 0.0016%이었다(표 2참조).

[표 2]

정제 단계에 의한 단백질 농도와 회수율

정제 단계	단백질 농도	회수율(%)
사르코신 추출물	85.46㎍/ｇ(wet)	0.0187
슈퍼로즈 12 컬럼	101.23㎍/ｇ(wet)	0.0022
세파크릴 S-100 컬럼	71.46㎍/ｇ(wet)	0.0016

상기한 방법에 의해 정제된 8kDa항원의 성상은 부루세라 균체 표면에 존재하는 지단백질로 추정된다(표 3 참조). 즉, 1% 사르코신으로 부루세라 RB51 균체 표면에서 8kDa 항원을 추출할 수 있었으며, 이로부터 균체 외막에 존재하는 항원임을 유추할 수 있다. 또한 중성세제인 트리톤 X-100 처리시 증류수보다도 그 용해도가 증가하였고, 트립신 처리에 저항하는 것으로 보아 지질의 성질을 가지고 있으면서도 단백질 분해 효소 K에 불활화되어 단백질의 성질을 띄고 있음을 알 수 있었다.

[표 3]

처리	1% 사르코신(37℃, 30분)	1% 트립신(37℃, 30분)	트리톤 X-100 용해도	0.1% 단백질 분해효소 K (37℃, 1시간)
결과	추출물	저항	높은 용해성	50% 비활성
특성	박테리아 표면	지질	단백질

[실시예 4] 8kDa의 항원을 사용한 효소 면역 측정법(ELISA)

8kDa의 항원을 사용하여 효소면역학적 측정법(enzyme-liked immunosorbent assay, ELISA)으로 부루세라 RB51의 중화항체를 검출하여, 부루세라 RB51의 감염을 진단하는 방법은 다음과 같다.

(1) 상기 실시예 3에서 정제된 8kDa의 항원을 항원 흡착용 코팅완충용액(Na₂CO₃1.59g, NaHCO₃2.93g/ℓ, pH 9.6±0.1)을 사용하여 최적 항원희석농도로 희석하여 면역분석용 플레이트의 각 웰에 100㎕씩 분주한 후, 37℃에서 밤새 보전하여 항원을 흡착하였다.

최적 항원희석농도는 1.0-2.5㎍/㎖이다. 이는 통상적인 ELISA법에서의 항원의 희석농도는 0.5-10㎍/㎖이지만, 1.0-2.5㎍/㎖로 희석하는 경우 가장 반응성이 좋았기 때문이다.

(2) 흡착이 끝난 후, 플레이트를 TBS 완충용액으로 3회 세척한 후, 차단완충용액(Blocking buffer solution; 1%의 스킴 밀크를 함유하는 TBS 완충용액)을 플레이트에 120㎕씩 분주한 후, 37℃에서 1시간 동안 차단하고, TBST 완충용액으로 3회 세척하였다.

(3) 가검 동물에서 채취된 혈액에서 혈청을 분리한 다음, 혈청 15㎕를 차단완충용액 285㎕를 사용하여 다른 희석용 플레이트에서 희석하였다.

(4) 항원이 부착된 플레이트의 차단반응이 끝나면, 차단용액을 버리고, 상기한 농도로 희석된 가검 혈청을 100㎕씩 분주하였다.

(5) 혈청이 분주된 플레이트를 37℃에서 1시간 30분 동안 배양한 후, TBST완충용액으로 3회 세척하였다.

(6) 토끼 항-소 IgG HRP(시스마사)를 TBS 완충용액을 사용하여 1 : 5,000의 비율로 희석한 후, 세척된 플레이트에 100㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.

(7) 반응 후 플레이트를 TBST 완충용액으로 3회 이상 세척한 후, 기질로 ABST(KPL)을 100㎕씩 분주하여 실온에 약 30분 동안 반응시키고 4% SDS(sodium dedocyl sulfate)을 50㎕씩 분주하여 반응을 정지시킨다.

(8) 정지된 플레이트 내 반응을 ELISA reader를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하여 결과를 판정하였다.

시험 결과의 산출 E value = S-N/P-N(P : 양성 혈청 O.D를 의미, N : 음성 혈청 O.D를 의미, S : 샘플 혈청 O.D를 의미)로 하였으며, 반복 실험을 통해 실험 결과의 신뢰도를 높이기 위해 유효조건을 설정하였다. 유효조건은 P/N이 4.5∼7.5[M(6.0±SD(1.5)]이어야 하며, 이때 N은 0.114[M(0.103)+SD(0.011)]이하 이어야 한다. 한편, 결과판정을 위해 양성혈청 146두, 음성혈청 200두를 대상으로 E value에 대한 ROC(receiver operating characteristic) 커브를 작성하여 결과판정을 0.9로 설정하였다(도 6). 그 결과, ELISA 진단법의 특이도와 민감도는 각각 95.0% 및 98.6%로 나타났다.

6) 검출 효율 비교

가검혈청 1,376점에 대하여 현재 부루세라 RB51의 감염의 진단에 사용되고 있는 dot-blot assay법과 본 발명에 따른 방법으로 부루세라 RB51의 감염을 측정하고, 이들 사이의 관계를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

	dot-blot assay법	상관 관계
	양성		음성
ELISA법	양성	337	37	337/374(90.1%)
	음성	52	950	950/1002(94.8%)
민감성/특이성	(민감성) 86.6%	(특이성) 96.3%	1287/1376(93.5%)

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법과 공지의 dot-blot assay법과 93.5%의 높은 상관관계를 나타내므로, 본 발명의 방법은 부루세라 RB51의 검사에 보다 효율적으로 사용될 수 있다.

이상에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 8kDa의 항원은 조기에 체액성 면역반응을 유발시키면서 면역원성이 우수하며, 이를 토대로 확립된 분자량 8kDa의 항원을 정제하는 기법은 매우 단순하고 재현성이 우수하다. 또한 정제된 항원을 이용한 본 발명의 부루세라 RB51균의 중화항체를 검출하는 방법은 특이 정제항원을 사용하기 때문에 항원에 의한 비특이 반응을 최대한 줄일 수 있으며, 신속하고 간편하게 다량의 혈청을 쉽게 검색할 수 있어 RB51 백신을 접종하는 국가에서는 RB51 백신의 효용성을 제고할 수 있을 뿐만아니라 자연감염에 의한 부루세라 항체와 대별되기 때문에 부루세라 근절을 위해 정책적 유용성이 매우 높아서 부루세라병을 예방하고 조기에 근절시킬 수 있다.

Claims (3)

1. 소 부루세라(Brucella abortus) RB51균의 표면에 존재하는 8kDa 항원.
2. 소 부루세라(Brucella abortus) RB51균으로부터 청구항 1항의 8kDa의 항원을 정제하는 방법으로서, 하기의 (1)-(4)단계를 포함함을 특징으로 하는 정제 방법.

   (1) 소 부루세라(Brucella abortus) RB51균에 사르코신(sarcosine)을 처리하여 균체표면의 항원을 추출하는 단계;

   (2) 황산암모늄을 사용하여 상기 추출물을 농축시키는 단계;

   (3) 농축된 추출물을 트리톤 X-100에 용해시킨 후, 슈퍼로스(Superose) 12 HR 10/30컬럼을 통과시키는 단계; 및

   (4) 상기 컬럼을 통과한 분획을 다시 세파크릴(Sepjacryl) S-100 컬럼을 통과시키는 단계
3. (1) 청구항 1항의 8kDa의 항원을 항원 흡착용 코팅완충용액을 사용하여 최적 항원희석농도로 희석한 후, 면역분석용 플레이트에 항원을 흡착시키는 단계;

   (2) 항원이 흡착된 플레이트를 차단완충용액(Blocking buffer solution)을 사용하여 차단하는 단계;

   (3) 가검 동물에서 채취된 혈액에서 혈청을 분리하여 희석한 다음, 상기 항원이 차단된 플레이트에 분주하여 혈청반응을 시키는 단계;

   (4) 플레이트를 세척하는 단계;

   (5) 토끼 항-소 IgG HRP를 차단완충용액으로 희석한 다음, 세척된 플레이트에 분주하여 토끼 항-소 콘쥬게이트 반응을 시키는 단계;

   (6) 플레이트를 세척한 후, 발색제로 발색시키는 단계; 및

   (7) 흡광도를 측정하는 단계;

   를 포함함을 특징으로 하는 부루세라 RB51 중화항체 검출방법.