KR20020031530A - 항암제 내성 관련 유전자 서열 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항암제 내성에 관련된 유전자 서열 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세히 말하면, 본 발명은 항암제 내성에 관여하는 신규한 DNA 서열과 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 DNA 서열은 암 환자 개개인의 항암제에 대한 내성 유무를 진단하여 최적 항암제 맞춤 처방을 할 수 있는 킷트 또는 DNA 칩 등에서의 소재로 이용되며, 효과적인 항암제 또는 항암제 내성을 효과적으로 극복하는 약제의 개발 과정에서 약제의 표적 인자 (drug target)로서 이용할 수 있다.

Description

항암제 내성 관련 유전자 서열 및 이의 용도 {DNA SEQUENCES RELATING TO ANTI-CANCER DRUG RESISTANCE AND THEIR USE}

본 발명은 항암제 내성에 관련된 유전자 서열 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세히 말하면, 본 발명은 항암제 내성에 관여하는 신규한 DNA 서열과 이러한 DNA 서열의 용도에 관한 것이다.

암은 우리나라 성인의 사망 원인 중 제1위 또는 제2위를 다투는 중요한 질환으로서, 많은 연구에도 불구하고 암환자의 약 과반수 이상이 결국에는 암으로 사망하는 실정이다. 현재까지 유효한 것으로 알려져 있는 암 치료 방법으로는 수술, 방사선 치료법 및 항암제 치료법이 있는 데, 이 중에서 수술과 방사선 치료법은 절제 부위 또는 방사선 조사 부위에만 효과가 있는 국소 요법이고, 항암제 치료 요법은 전신에 효과를 나타내는 전신 요법이라는 점에서 차이가 있다.

일반적으로, 암은 국소에서 발병하여 전신으로 전이되는 질환으로서, 아주 조기에 발견된 경우를 제외하고는 이미 어느 정도의 전신 전이가 존재한다. 따라서, 아무리 효과적인 국소 치료법을 사용한다 하더라도 다시 재발할 확률이 높다는 사실은, 대부분의 암 환자의 치료에 수술 및 방사선 치료와 같은 국소 치료법 뿐만 아니라 전신 치료법인 항암제 치료법이 필요함을 말해준다. 따라서, 현재로서는 암에 대한 치료 효과를 향상시키기 위해서는 조기 진단에 의한 근치적 수술의 확대가 필요할 뿐만 아니라, 수술이 불가능한 환자 또는 수술 후 재발의 위험이 높은 환자에 대해 효과적인 항암제 치료 방법의 개발이 필요하다.

그러나, 현재까지 많은 항암제의 개발에도 불구하고, 항암제만으로 완치가 가능한 암은 백혈병, 악성 림프종, 고환암 등 소수의 암에 불과한데, 그 이유는 항암제를 이용한 암 치료시 항암제에 암 세포가 반응을 하지 않거나 초기에는 효과적으로 종양이 줄어들지만 치료 도중 또는 치료 후에 항암제 치료에 대한 내성이 생기기 때문이다. 또한, 방사선 치료의 경우에도 항암제 치료와 마찬가지로, 암 세포가 방사선 치료에 대해서도 내성을 나타내게 되어 방사선 치료만으로 암을 완전히 제거할 수 있는 경우 역시 드문 실정이다.

한편, 항암제 치료에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 WHO에서 제정한 기준에 따라 4가지로 분류되는 데, (1) 종양이 모두 소실되고 4주 이상 지속된 경우 (완전 반응, complete response); (2) 종양의 크기가 50% 이상 감소하는 경우 (부분 반응, partial response); (3) 종양의 크기가 50% 미만 감소하는 경우 (불변, stable disease); 및 (4) 종양의 크기가 25% 이상 증가하는 경우 (진행, progressive disease)이다 {참조: 류백렬 등, 대한혈액학회지 33: 54-64, 1998}.

일반적으로 "항암제에 대한 내성" 이란, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 즉, 상기한 WHO의 기준을 토대로 하면, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 [상기 (3) 및 (4)의 경우], 초기에는 암 치료 효과가 있으나 [상기 (1) 및 (2)의 경우] 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것[상기 (3) 및 (4)의 경우]을 의미한다.

상기한 항암제 치료에 대한 내성과 관련하여, 암 환자가 한 종류의 항암제에 대해서만 내성을 갖는 경우라도 그 환자의 암 세포는 다른 항암제에 대해서도 교차내성 (cross-resistance)을 보이는 경우가 빈번한 데, 이로 인해 항암제 치료가 실패하는 경우가 많다. 이를 "다약제 내성 (multidrug resistance)"이라고 한다 {참조: Souviron Rodriguez, A. et al. An Med Interna, 14(3): 145-153, 1997; Stavrovskaya A. A. Biochemistry (Moscow), 65: 95-106, 2000}.

따라서, 효과적인 항암제 치료를 위해서는 상기한 바와 같은 항암제에 대한 암세포의 내성을 극복하여야 하며, 이를 위해서는 항암제에 대한 암세포의 내성에 관련된 유전자를 우선적으로 규명할 필요가 있다. 지금까지 밝혀진 몇몇 항암제 내성 관련 유전자 중에서 잘 알려져 있는 것으로는, "P-당단백질 (P-glycoprotein : PgP)" 및 "다약제 내성 관련 단백질(Multidrug Resistance-associated Protein, MRP)"이 있다. 하지만, 상기 PgP 및 MRP는 일부 암 환자의 항암제 내성과 관련성은 있으나, 이들만으로 항암제 내성 기전이 모두 밝혀진 것은 아니므로 임상적으로 항암제 내성 유무를 유효하게 예측하기는 어렵다 {참조: Bosch, I. and Croop, J. Biochimica et Biophysica Acta, 1288: F37-F54, 1996.}. 또 다른 항암제 내성 관련 유전자로 공지되어 있는 "디하이드로피리미딘 디하이드로게나제 (dihydropyrimidine dehydrogenase, DPYD)"의 경우, 60 종류의 암 세포주에서의 이의 발현과 항암제 5-FU에 대한 내성간에 밀접한 연관성이 있는 것으로 알려져 있으나 {참조: Scherf, U. et al., Nature Genetics, 24:236-244, 2000}, 실제 암 환자의 경우에서는 일치하지 않았다 {참조: McLeod, H.L. et al., Br. J. Cancer 77: 461-465, 1998}. 또한, 항암제의 암세포 살해 효과의 적어도 일부는 세포의 apoptosis에 의한다는 최근의 보고에 따라, 여러 연구자들이 항암제에 의한apoptosis의 기전 및 apoptosis에 대한 내성 기전에 대해 연구를 통해, p53 및 bcl-2 등의 유전자 산물이 apoptosis에 관여함이 보고되었으나, 그 기전이 아직 확실히 밝혀져 있지 않은 실정이다 {참조: Haq, R. and Zanke, B. Cancer and Metastasis Review, 17: 233-239, 1998}.

이와 같이, 현재로는 항암제 내성 기전이 제대로 규명되어 있지 않아서 항암제 치료에 어려움이 많은 데, 이는 실제 암환자에서의 항암제 내성에는 여러 기전들이 상호 복합적으로 작용하기 때문에 개별적인 몇몇 유전자로는 항암제 내성 기전을 제대로 파악할 수 없기 때문이다. 그러나, 항암제와 관련된 유전자의 기능이 향후에 다양하게 연구됨에 따라, 이러한 유전자 기능을 이용하여 개개인의 효과적인 항암제 치료를 가능하게 하는 기술이 개발되면, 개개인의 drug-metabolizing genes, transporters, receptors, drug targets의 유전자 발현을 통하여 환자 개개인의 항암제 치료 효과를 극대화하고 독성을 줄이는 처방이 가능하게 될 것이다 {참조: Evans, W.E. 및 Relling M.V., Science, 286:487-491, 1999}.

따라서, 가능한 한 많은 종류의 항암제 내성 관련 유전자를 밝혀내서, 소정의 암환자의 항암제 내성 유무를 진단하고 효과적인 항암제 내성 극복 약제를 검색하는 데에 이러한 유전자를 이용할 필요성이 요구되는 것이다.

본 발명의 목적은 항암제 내성에 관련된 신규한 유전자 서열을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 항암제 내성 관련 유전자를 이용하는 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로는, 예를 들어, 본 발명의 유전자 서열을 이용하여 암 환자 개개인에 따라 항암제에 대한 내성 유무를 진단하고, 암 환자 개개인에 따라 항암제 맞춤 처방을 가능케 하는 킷트 또는 DNA 칩 등에서 본 발명의 유전자 서열을 이용하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 예를 들어, 효과적인 항암제 또는 항암제 내성을 극복할 수 있는 약제의 개발 과정에 본 발명의 유전자 서열을 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 항암제 치료에 민감한 암 조직과 계속적인 항암제 치료로 인해 내성을 가지게 된 암 조직에서 디퍼랜샬 디스플래이 폴리머레이즈 체인 반응 (Differential-Display Polymerase Chain Reaction) 기법을 이용하여, 상기 두 암 조직의 유전자 발현 양상을 서로 비교한 도면이다. 왼쪽 래인은 항암제 내성이 나타나기 전의 암 조직을 사용한 것이고, 오른 쪽 래인은 동일한 환자에서 항암제 내성이 나타난 이후에 얻은 암 조직을 사용한 것이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 항암제 치료에 내성을 나타내는 암 조직에서 본 발명의 DNA 서열의 발현이 증가 또는 감소함을 관찰할 수 있다 (화살표 → : 감소 , 화살표 ← : 증가).

도 2에서는 본 발명의 DNA 서열 (서열번호 1, 2, 4, 7, 25, 117, 137)이 항암제 내성 세포주에서 실제로 그 발현이 증가되었음을 확인한 결과를 보여주고 있다 {여기서, SNU638는 위암 세포주; SW620는 대장암 세포주; NCI-H211는 폐암 세포주; C는 항암제 내성을 갖지 않는 모세포; 5Fu는 5-FU 내성 세포주; AD는 아드리아마이신 내성 세포주; CDDP는 시스플라틴 내성 세포주}.

본 발명에서는 항암제 내성과 관련된 신규한 유전자 서열을 제공한다. 보다 상세히 말하면, 본 발명에서는 항암제 내성과 관련된 서열 번호 1 내지 90의 DNA 서열, 및 서열 번호 91 내지 292의 DNA 서열을 제공한다.

상기한 서열 번호 1 내지 292의 유전자 서열은 인간의 세포에서 추출한 cDNA 서열로서, 이의 수득 방법에 대해서는 하기에서 상세히 설명한다. 서열 목록 1 내지 292에서, n은 4가지 염기 A, T, G, C 중의 어느 하나이다.

본 발명의 항암제 내성 관련 DNA 서열의 수득 방법을 요약하면 다음과 같다:

각각 2명씩의 폐암 환자 및 두경부암 환자로부터, 항암제 치료이전에 항암제 치료에 민감한 암조직과 항암제 치료가 계속되면서 항암제에 반응을 보이지 않는 (즉, 항암제에 대한 내성을 갖는) 암 조직을 각각 얻은 후, mRNA를 분리한 후에 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 제작하고나서, 제작된 cDNA를 Differential Display of PCR (DD-PCR) 기법 {참조: Liang, P 및 Pardee, A., Science, 257:967-971, 1992}을 이용하여 항암제 내성을 나타내기 이전과 이후의 암 조직에서 유전자 발현이 증가 또는 감소한 유전자를 발견하였다 (도 1 참조). 그리고 나서, 유전자 발현이 증가 또는 감소-발현이 증가한 경우 (서열 번호 1 내지 72, 및 91 내지 266) 및 발현이 감소한 경우 (서열 번호 73 내지 90, 및 267 내지 292)-한 cDNA를 전기영동 젤로부터 면도칼을 이용하여 채취한 후, PCR 방법으로 cDNA를 증폭하였다. 증폭된 cDNA를 pGEM-Teasy 플라스미드에 서브 클로닝한 후, 그 염기 서열을 염기 서열 자동 분석기를 이용하여 각 유전자의 염기 서열을 규명하였다. 본 발명의 항암제 내성 관련 DNA 서열의 수득 방법에 대해서는, 하기 실시예에서 구체적으로 설명해주고 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 DNA 서열은 항암제 치료에 대해 내성을 나타내는 암조직에서 그 발현 정도가 증가 또는 감소하였다. 따라서, 이와 같은 발현 관계를 근거로, 본 발명의 DNA 서열은 암 환자 개개인에 따른 항암제에 대한 내성 유무를 진단하는 데 이용되며, 암 환자에 따라 항암제 맞춤 처방을 가능케 하는 킷트 또는 DNA 칩 등에 이용된다. 또한, 본 발명은 효과적인 항암제 또는 항암제 내성을 극복할 수 있는 약제의 개발 과정에 본 발명의 DNA 서열을 이용하는 방법을 제공한다.

실시예

실시예 1: 조직 시료의 제조 및 RNA 추출

우선, 각각 2명씩의 폐암 환자 및 두경부암 환자로부터, 항암제 치료이전에 항암제 치료에 민감한 암조직과 항암제 치료가 계속되면서 항암제에 반응을 보이지 않는 (즉, 항암제에 대한 내성을 갖는) 암 조직을 시료 조직으로 사용하였다. 본시료 조직으로서, 폐암 환자의 경우, 초기의 항암제 치료에는 종양의 크기가 50% 이상 줄어들었으나 (부분 반응), 6개월의 시간이 경과하면서 계속되는 항암제 치료에 반응하지 않고 종양의 크기가 커지는 (진행) 환자로부터 내시경을 이용하여 얻은 암조직을 사용하였다. 두경부암 환자의 경우, 초기 항암제 치료에 의하여 종양이 소멸되었지만 (완전 반응), 이후에 재발이 된 암 환자 중에서 항암제 치료에 반응이 없는 (불변) 환자로부터 얻은 암 조직을 사용하였다.

상기 폐암 환자 2명과 두경부암 환자 2명의 암조직을 빙냉 염수 용액으로 세정하고, 액체 질소 중에 신속히 동결시켜 RNA 단리에 필요할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 동결된 암조직들을 액체 질소로 잘게 썰고, RNA를 TRI zol 시약(GIBCO/BRL, Grand Island, NY)으로 페놀/클로로포름법을 사용하여 제조원의 지시에 따라 분리하였다.

실시예 2: Differential Display of Polymerase Chain Reaction (DD-PCR)

분리된 모든 RNA는 RNase-free DNase (GenHunter Corp., Nashville, TN)를 처리하여 시료에서 DNA를 제거한다. RNA 0.2㎍에 역전사효소 버퍼 4.0 l, DEPC 처리된 물 9.4㎕, dNTP (250 μM) 1.6㎕, 3' 프라이머 (AAGCTTTTTTTTTTTG 또는 AAGCTTTTTTTTTTTC 또는 AAGCTTTTTTTTTTTA) 2㎕를 넣고 65℃에서 5분간 반응시킨 후, 역전사효소 1㎕를 넣고 37℃에서 60분간 반응시킨다. 그리고 나서, 75℃에서 5분간 반응시켜, 효소를 비-활성화시킨다. 이어서, 상보 DNA 시료 2㎕에 물 9.2㎕, 10X PCR 버퍼 2㎕, dNTP(25 μM) 1.6㎕, GenHunter 회사에서 구입한 3' 프라이머 (2 μM) 1.6㎕, α-[³⁵S] dATP 1㎕, Taq 중합효소 0.2㎕를 넣고 94℃에서 30초, 40℃에서 2분, 72℃에서 30초를 40번 반복한 후, 72℃에서 5분간 반응시킨다. 반응 후 시료 3.5㎕에 loading 염색약 2㎕를 섞고, 80℃에서 2분간 방치한 후에 6% denaturing polyacrylamide gel에서 변화된 발현 양상을 관찰한다 (도 1 참조).

실시예 3: 유전자의 분리 및 재-증폭

실시예 3-1: 발현이 증가한 유전자의 분리 및 증폭

발현이 증가한 DNA를 젤 상에서 면도칼을 사용하여 오려낸 후, 물 100㎕를 넣은 후 15분 동안 끓인다. 시료를 원심 분리한 후, 상층액에 3M 아세트산 나트륨 10㎕, 글리코겐 (10 mg/㎕) 5㎕, 100% 알콜 450㎕를 넣은 후, -80℃ 냉동고에 30분 동안 보관한다. 시료를 원심 분리한 후, 침전물에 10㎕의 물을 넣어 이 중에서 4㎕를 취하여 PCR을 재-시행한다.

실시예 3-2: 발현이 감소한 유전자의 분리 및 증폭

발현이 감소한 DNA를 젤 상에서 면도칼을 사용하여 오려낸 후 물, 100㎕를 넣은 후 15분 동안 끓인다. 시료를 원심 분리한 후, 상층액에 3M 아세트산 나트륨 10㎕, 글리코겐 (10 mg/㎕) 5㎕, 100% 알콜 450㎕를 넣은 후, -80℃ 냉동고에 30분 동안 보관한다. 시료를 원심 분리한 후, 침전물에 10㎕의 물을 넣어 이 중에서 4㎕를 취하여 PCR을 재-시행한다.

실시예 4: 서브-클로닝

재-증폭된 DNA를 2㎕를 취하여, pGEM-Teasy 플라스미드 (Promega) 1㎕, 접합버퍼 2㎕, 라이게이즈 1㎕, H₂O 4㎕에 섞은 후 접합(ligation) 반응을 수행한다. 16℃에서 6시간 동안 반응시킨 후, 이 중에서 4㎕를 대장균에 형질전환시킨다. 재-증폭된 DNA를 포함하는 대장균은 플라스미드를 추출하였다.

실시예 5: 염기 서열 결정

현재 널리 사용되어지고 있는 염기 서열 자동 분석기 (Perkin-Elmer)를 사용하여, 상기 서브-클로닝된 본 발명의 DNA 서열을 결정하였다 (참조: 서열 번호 1 내지 292).

실시예 6: 내성 세포주의 제조

인간 위암 세포주 (SNU638)는 한국 세포주 은행 (서울대 암연구소 소재)에서 구입하였으며, 폐암 세포주 (NCI-H211)와 대장암 세포주 (SW620)는 ATCC에서 구입하였다. 상기 암 세포주를 10% 태아송아지 혈청, 페니실린 100 units/ml, 및 스트렙토마이신 100㎍/ml을 함유하는 RPMI 배양 배지(GIBCO/BRL, Grand Island, NY)에서 배양시켰다. 시스플라틴 및 5-FU에 내성을 갖는 위암 세포주, 시스플라틴에 내성을 갖는 폐암 세포주, 및 아드리아마이신에 내성을 갖는 대장암 세포주는 문헌{참조: Chung, YM et al. Cancer Letters, 159: 95-101, 2000} 에 제시된 방법에 따라 본 발명자가 제조하였다. 즉, 5-FU, 시스플라틴 및 아드리아마이신의 농도를 상기의 3가지 암 세포주의 성장을 10% 억제할 수 있는 농도로 처리하였다. 이 때, 살아남는 세포에 항암제 농도를 2배 증가시켰다. 이와 같은 방법으로, 폐암 및 대장암 세포주의 경우에는 4회 반복하여 6개월 동안 항암제 농도를 계속 증가시켰으며, 위암 세포주의 경우에는 8회 반복하여 1년 동안 항암제 농도를 계속 증가시켰다. 이렇게 항암제를 처리한 후에 살아남은 항암제 내성 세포주 콜로니를 취하여, 본 발명의 항암제 내성 유전자 확인 실험에 이용하였다.

실시예 7: 노던 블로팅

실시예 6에서 사용된 위암 세포주 (SNU638), 폐암 세포주 (NCI-H211), 대장암 세포주 (SW620); 및 실시예 6에서 제조한 항암제 내성 암 세포주 (즉, 시스플라틴 및 5-FU에 내성을 갖는 위암 세포주, 시스플라틴에 내성을 갖는 폐암 세포주, 및 아드리아마이신에 내성을 갖는 대장암 세포주)로부터 각각 RNA를 분리한다. 분리된 RNA는 1% agarose gel 상에서 순도를 확인한다. 각각의 RNA 20㎍을 취하여 6% 포름 알데하이드가 포함된 1% agarose gel에 전기영동을 한다. 전기영동 후, RNA를 Nylon membrane에 16시간 동안 transfer한 후, 자외선을 이용하여 RNA를 membrane에 cross-linking 시킨다. DD-PCR에 의하여 발견된 DNA fragment를 agarose gel 상에서 용출한 후, random labeling kit (Boeringer Manheim, Germany)를 이용하여 [³²P] dCTP로 labeling한다. [³²P] dCTP로 labeling된 DNA를 nylon membrane과 16시간 동안 혼성화시킨다. Nylon membrane을 0.1XSSC, 0.1% SDS 용액으로 50℃에서 15분간 3번 세척한 후, X-ray Film을 이용하여 현상한다 [참고문헌: Chomczynski, P., et al., Anal. Bochem. 162:156-159, 1987].

이 결과는 도 2에서 구체적으로 보여주고 있다. 도 2에서는, 항암제 내성 세포주에서 본 발명의 DNA 서열(서열 번호 1, 2, 4, 7, 25, 117 및 137)의 발현 변화를 노던 블롯팅 (Northern blotting) 기법을 이용하여 조사한 결과를 보여주고 있다. 도 2에서 보는 바와 같이, 서열 번호 1의 DNA 서열은 5-FU 항암제에 내성을 갖는 세포주에서 발현이 증가하였으며, 서열 번호 2, 7, 25 및 117의 DNA 서열은 아드리아마이신 항암제에 내성을 갖는 세포주에서 발현이 증가하였고, 서열번호 4의 DNA 서열은 시스플라틴, 5-FU 및 아드리아마이신 항암제에 내성을 갖는 세포주에서 발현이 증가하였으며, 서열번호 137의 DNA 서열은 시스플라틴 항암제에 내성을 갖는 세포주에서 발현이 증가하였음을 확인하였다.

본 발명에서 제공되는 항암제 내성에 관련된 DNA 서열은, 암 환자 개개인에 따라 항암제에 대한 내성 유무를 진단하여 암 환자에 따라 항암제 맞춤 처방을 가능케 하는 킷트 또는 DNA 칩 등을 제조하는 데 유용하다. 또한, 본 발명의 항암제 내성 관련 DNA 서열은 항암제 또는 항암제 내성 극복 약제의 개발 과정에 효과적으로 이용할 수 있다.

Claims (6)

1. 서열 번호 1 내지 90 중에서 어느 하나의 DNA 서열.
2. 서열 번호 1 내지 90 중 어느 하나 이상의 DNA 서열을 이용한, DNA 칩 또는 항암제 내성 진단용 킷트의 제조 방법.
3. 서열 번호 1 내지 90 중 어느 하나 이상의 DNA 서열을 이용하여, 항암제 또는 항암제 내성 극복 약제를 검색하는 방법.
4. 서열 번호 91 내지 292 중에서 어느 하나의 DNA 서열.
5. 서열 번호 91 내지 292 중 어느 하나 이상의 DNA 서열을 이용한, DNA 칩 또는 항암제 내성 진단용 킷트의 제조 방법.
6. 서열 번호 91 내지 292 중 어느 하나 이상의 DNA 서열을 이용하여, 항암제 또는 항암제 내성 극복 약제를 검색하는 방법.