KR20020020295A - A Method for Detecting Senescent Cell, a Compostion for Restoring a Physiological Function of Senescent Cell and a Method for Restoring a Physiological Function of Senescent Cell Using Amphiphysin - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 포유동물의 노화된 세포의 검출방법, 노화된 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암피파이신 1 단백질 및 유전자를 이용한 노화 세포의 검출방법, 노화 세포의 기능성 회복용 조성물 및 노화 세포의 기능 회복 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting aged cells in mammals, a composition for functional recovery of aged cells, and a method for restoring functional functions of senescent cells, and more particularly, a method for detecting senescent cells using ampiphycin 1 protein and gene. The present invention relates to a composition for functional recovery of senescent cells and a method for functional recovery of senescent cells.
노화의 기전 및 원인에 대한 많은 가설들이 1950년대 이래 꾸준히 발표되어 왔고, 현재 여러 관점에서 이에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이러한 노화에 대한 가설은 다음과 같이 크게 두 부류로 나눌 수 있다:Many hypotheses about the mechanism and cause of aging have been published since the 1950s, and research is being actively conducted from various viewpoints. These hypotheses about aging can be divided into two broad categories:
첫 번째 가설은 노화의 손상 축적설(Damage accumulation theory of aging)이라 호칭되는 것으로서, 노화를 손상의 축적에 의해 유도되는 현상으로 해석한다.The first hypothesis is called the damage accumulation theory of aging, which interprets aging as a phenomenon induced by the accumulation of damage.
상기 가설을 상설하면, 개체가 살아가면서 지속적으로 노출되는 여러 환경적 위해 요소 및 유리 산소(oxygen radical)와 같은 자체의 대사과정에서 생성되는 위해 산물에 의해 세포가 손상되고, 이러한 손상의 대부분은 생체 내 손상 수복기전에 의해 수복된다. 그러나, 생체내 수복기능을 능가하여 수복되지 못한 손상은 지속적으로 축적되어 세포막의 지질이나 여러 단백질 등에 변성을 발생시켜 그 기능을 저하시키고, 직접 또는 간접적으로 DNA에 손상을 입히기도 하며, 미토콘드리아에도 영향을 미쳐 그 기능을 저하시키게 된다. 상기 가설은 유리 산소 이론(free radical theory of aging: Harman D,Proc. Natl. Acad. Sci., 78, 7124-7128(1981)), 교결합 이론(crosslinking theory of aging: Bjorksten J.,J. Am. Geriatr Soc., 16, 408-423(1968)), 미토콘드리아 이론(mitochondrial theory of aging: Lee CM et al.,Free Radic. Biol. Med., 22, 1259-1269(1997); Wallace DC et al.,Biofactors, 7, 187-190(1998)) 등 여러 이론으로 설명되고 있다.The hypothesis suggests that cells are damaged by harmful products produced by their metabolism, such as various environmental hazards and free radicals that are constantly exposed to the individual's life, and most of these damage is caused by living organisms. It is repaired by my damage repair mechanism. However, unrepaired damage that surpasses restorative function in vivo continues to accumulate, causing denaturation of lipids and proteins in cell membranes, degrading its function, damaging DNA directly or indirectly, and affecting mitochondria. Will deteriorate its function. The hypothesis is based on free radical theory of aging: Harman D, Proc. Natl. Acad. Sci. , 78, 7124-7128 (1981), crosslinking theory of aging: Bjorksten J., J. Ameria Geriatr Soc. , 16, 408-423 (1968)), mitochondrial theory of aging: Lee CM et al., Free Radic. Biol. Med. , 22, 1259-1269 (1997); Wallace DC et al., Biofactors , 7, 187-190 (1998)).
노화에 대한 두 번째 가설은 노화 예정설(Genetic program theory of aging)이라 호칭되는 것으로서, 이 가설에 따르면 모든 개체의 유전자 내에 일종의 생물학적 시계(biological clock)가 내재되어 있고, 그 유전적 프로그램에 따라 개체의 발달 및 성장과 함께 노화가 일어난다.The second hypothesis on aging is called the genetic program theory of aging, which states that there is a kind of biological clock in the genes of all individuals, and according to that genetic program, Aging occurs with development and growth.
상기 가설을 상설하면, 노화를 일으키는 특정 노화 유전자가 존재하고, 그 유전자의 발현을 통해 노화 과정이 진행되며, 이는 출생 당시부터 이미 유전자 내에 프로그램 되어 있다는 것이다. 대표적인 노화 예정설로는 틸로미어 가설(Telomere hypothesis of aging)이 있다. 틸로미어 가설은 세포가 분열하면서 틸로미어의 길이가 계속 짧아지게 되고, 일정 길이 이상으로 그 길이가 짧아지게 되면 노화에 이르게 된다는 것으로, 현재까지 가장 유력하게 받아들여지고 있는 노화의 가설 중 하나이다 (Harley CB et al.,Curr. Opin. Genet. Dev., 5, 249-255(1995)).In the hypothesis, there is a specific aging gene that causes aging, and the aging process proceeds through the expression of the gene, which is already programmed in the gene from the time of birth. A typical premature aging hypothesis is the Telomere hypothesis of aging. The Tillomere hypothesis is that as the cells divide, the length of the tilommere continues to shorten, and if the length becomes shorter than a certain length, it leads to aging, which is one of the most accepted hypotheses of aging (Harley CB). et al., Curr. Opin. Genet. Dev. , 5, 249-255 (1995)).
상술한 바와 같이 노화에 대하여 여러 가지의 가설이 제시되어 있으나, 아직까지 노화의 모든 면을 완전하게 설명해 줄 수 있는 가설은 없다. 이는, 노화 자체가 워낙 여러 생리적 변화를 수반하여 나타나는 현상이기 때문이며, 현재는 두 가설 모두 상호 보완적으로 받아들여지고 있다.As mentioned above, various hypotheses about aging have been proposed, but there are no hypotheses that can fully explain all aspects of aging. This is because aging itself is a phenomenon that is accompanied by various physiological changes, and both hypotheses are now complementarily accepted.
한편, 개체의 노화를 이해하기 위해서는 세포 수준에서의 노화, 즉 세포 노화(cellular senescence)에 대한 연구를 통해 그 분자적 기전을 규명하는 것이 필요하다. 세포 노화에 대한 연구결과에 의하면, 노화 세포는 G1 세포기에 정지되어 더 이상 생리적 성장인자들에 의해 S 세포기로 진입하지 못한다. 노화된 세포가 나타내는 두 번째 특징은, 여러 기능의 저하로서, 최종 분화된 세포의 양상을 나타낸다(Goldstein,Science, 249:1129-1133(1990); Campisi J.,Cell, 84:497-500(1996)). 세 번째로 노화된 세포들은 아포프토시스성 세포 사멸(apoptotic-programmed-cell death)에 대해 저항성을 나타낸다(Wang E.,Cancer Res., 55:2284-2292(1995)).On the other hand, in order to understand the aging of the individual it is necessary to identify the molecular mechanism through the study of aging at the cellular level, that is, cellular senescence (cellular senescence). Studies on cellular aging indicate that senescent cells are arrested in the G1 cell phase and no longer enter the S cell phase by physiological growth factors. The second characteristic of senescent cells is the deterioration of several functions, indicating the appearance of final differentiated cells (Goldstein, Science , 249: 1129-1133 (1990); Campisi J., Cell , 84: 497-500) 1996). Third, aged cells are resistant to apoptotic-programmed-cell death (Wang E., Cancer Res. , 55: 2284-2292 (1995)).
세포 노화에 대한 많은 연구는, 개체의 노화 현상이 잘 반영되는 것으로 보고되고 있는(Campisi J.,Cell, 84:497-500(1996)), 사람 섬유아세포를 이용하여 이루어지고 있다.Many studies of cellular aging have been done using human fibroblasts, which have been reported to reflect aging phenomena in individuals (Campisi J., Cell , 84: 497-500 (1996)).
엔도사이토시스는 세포의 여러 기능 수행에 있어 매우 중요한 기전으로서, 작은 소분자로부터 크게는 전체 세포에 이르기까지의 물질을 세포 내로 유입하는 과정을 말한다. 엔도사이토시스는 항원 표지(antigen presentation), 영양소의 섭취, 아포프토시스 세포의 제거, 병원체 침입, 수용체 조절, 고혈압, 시냅스 전달, 세포 신호전달 조절 등의 여러 중요한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 엔도사이토시스의 여러 기전 가운데, 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스는 세포가 세포 외의 트랜스페린, LDL 등의 영양소, EGF와 같은 성장인자 등 여러 수용성 리간드 들을 세포 내로 받아들이고, 그 특정 수용체를 세포 내로 유입하여 그 기능을 조절하는 가장 대표적 기전이다(Pearse BM and Robinson MS,Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 6:151-171(1990); Schmid SL,Annu. Re. Biochem., 66:511-548(1997)).Endocytosis is a very important mechanism for performing various functions of cells, and refers to the process of introducing substances from small small molecules to large whole cells into cells. Endocytosis is known to perform several important functions such as antigen presentation, nutrient intake, removal of apoptosis cells, pathogen invasion, receptor regulation, hypertension, synaptic transmission, and cellular signaling. Among the mechanisms of endocytosis, cell membrane receptor-mediated endocytosis is a cell that accepts various water-soluble ligands such as extracellular transferrin, nutrients such as LDL, and growth factors such as EGF into the cell, and induces specific receptors into the cell. (Bearse BM and Robinson MS, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. , 6: 151-171 (1990); Schmid SL, Annu. Re. Biochem. , 66: 511-548) 1997)).
세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스 과정 중 일부를 요약하면 다음과 같다: 수용체에 리간드가 와서 결합하면 수용체의 세포질쪽 말단부에 AP(assembly protein)2 단백질이 결합하게 된다. 이렇게 결합한 AP2 단백질은 세포질에 존재하던 클라트린 단백질을 세포막으로 이동시키고, 이렇게 형성된 클라트린 그물망에 다이나민(dynamin)이 와서 목을 형성, 클라트린 피복 소포의 버딩이 이루어지게 되고, 이렇게 버딩된 피복 소포로부터 클라트린과 AP2 단백질이 떨어져 나가게 되면수용체와 세포막은 다시 원 세포막으로 돌아가 재순환된다.Some of the membrane-receptor-mediated endocytosis processes are summarized as follows: When a ligand comes in and binds to the receptor, the assembly protein (AP) 2 binds to the cytoplasmic end of the receptor. The combined AP2 protein transfers the clathrin protein present in the cytoplasm to the cell membrane, and dynamin enters the neck of the clathrin network thus formed to form a neck, thereby budding clathrin coated vesicles. When the clathrin and AP2 proteins are released from the vesicles, the receptors and cell membranes are returned to the original cell membranes and recycled.
한편, 상기 다이나민이 클라트린 피복 소포의 목 부분에 와서 결합하는데는 암피파이신(amphiphysin)이라는 또 다른 단백질이 필요하다(Wigge P. and McMahon HT.,TINS, 21:339-344(1998)). 암피파이신의 여러 아형 중 하나인 암피파이신 1의 SH3 도메인과 다이나민의 프롤린-풍부 도메인이 서로 결합한다는 보고를 통해 암피파이신 1 단백질이 클라트린 매개성 엔도사이토시스에서 중요한 역할을 할 것이라는 가능성이 처음 제기 되었다(David C. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 93:331-335(1996)).Meanwhile, another protein called amphiphysin is required for the dynamin to come and bind to the neck of the clathrin-coated vesicles (Wigge P. and McMahon HT., TINS , 21: 339-344 (1998)). . The possibility that the ampiphycin 1 protein will play an important role in clathrin-mediated endocytosis through reports that one of several subtypes of ampiphycin, the SH3 domain of ampiphycin 1 and the proline-rich domain of dynamin, bind to each other This was first raised (David C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 93: 331-335 (1996)).
또한 암피파이신 1 단백질은 COS-7 세포에서도 발현되어 그 기능을 수행함이 보고되어 있고(Wigge P. et al.,Cell, 8:2003-2015(1997)), 이와 같은 결과들은 암피파이신이 뇌에서 뿐만 아니라 다른 장기의 좀 더 일반적인 클라트린 매개성 엔도사이토시스에 있어 실질적인 기능을 수행할 것임을 시사한다(Wigge P. and McMahon HT.,TINS, 21:339-344(1998)).In addition, it has been reported that the ampiphycin 1 protein is expressed in COS-7 cells and performs its function (Wigge P. et al., Cell , 8: 2003-2015 (1997)). It suggests that it will perform a substantial function in the more general clathrin-mediated endocytosis of the brain as well as other organs (Wigge P. and McMahon HT., TINS , 21: 339-344 (1998)).
암피파이신의 다른 아형인 암피파이신 2 는 암피파이신 1 단백질과 유사하게 SH3 도메인을 가지고 있고, 다이나민과 결합하는 것이인 비트로에서 확인되었으며, 암피파이신 1과 세포 내 같은 위치에 존재하며 동시-면역침전됨이 확인되었다. 따라서, 암피파이신 1과 암피파이신 2는 세포 내에서 안정적인 헤테로다이머로 존재하고 있을 것으로 추측되며, 이러한 암피파이신 1-2 헤테로다이머는 다이나민을 클라트린 피복 소포로 불러들여서 피트의 함몰에 중요한 역할을 할 것으로 추측된다.Amphifisin 2, another subtype of ampiphycin, has an SH3 domain, similar to the ampiphycin 1 protein, has been identified in vitro for binding to dynamin, and is present at the same location in the cell as Co-immunoprecipitation was confirmed. Thus, it is presumed that Ampapisin 1 and Ampapisin 2 exist as stable heterodimers in the cell, and these Ampapisin 1-2 heterodimers bring Dynamine into the clathrin-covered vesicles, causing the pit to sink. It is assumed to play an important role.
상술한 바와 같이 세포 노화 시에는 다양한 생리적 기능의 저하가 수반되는 것으로 보고되고 있으나 현재까지도 세포 노화에 대한 분자적 규명은 미진한 상태이고, 더욱이 노화된 세포를 정확히 확인할 수 있는 특정 표지에 대한 요구도 대두되고 있는 실정이다.As described above, cell aging has been reported to involve various physiological deterioration, but until now, the molecular identification of cell aging is insufficient, and there is a need for a specific label that can accurately identify aging cells. It's happening.
본 발명자들은 세포 노화 시에 외부 반응에 대한 반응성이 현저히 저하된다는 공지의 보고에 착안하여, 세포막 수용체성 엔도사이토시스의 기능이 영향을 받을 것으로 추정하고 그 기능의 저하를 관찰하고, 엔도사이토시스에 관여하는 단백질 중 하나가 세포 노화에 대한 표지로서의 역할을 수행할 수 있으며, 엔도사이토시스의 기능을 수복하는 물질로서 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.The present inventors focus on known reports that the responsiveness to an external reaction is remarkably reduced upon cellular aging, presuming that the function of the cell membrane receptor endocytosis will be affected, and the degradation of the function is observed. The present invention was completed by confirming that one of the proteins involved can serve as a label for cellular aging and can be used as a substance for restoring the function of endocytosis.
따라서, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공하는 데에 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for detecting senescent cells in a mammal.
또한, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 제공하는 데에 있다.It is also an object of the present invention to provide a composition for functional recovery of senescent cells of a mammal.
한편, 본 발명의 목적은 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 제공하는 데에 있다.On the other hand, it is an object of the present invention to provide a method for restoring the function of senescent cells in a mammal.
또한, 본 발명의 목적은 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 제공하는 데있다.It is also an object of the present invention to provide a composition for inducing aging of mammalian cells.
도 1은 젊은 세포 및 노화 세포에서의 트랜스페린의 세포 내 운반을 보여주는 콘포칼 현미경 사진,1 is a confocal micrograph showing the intracellular transport of transferrin in young and senescent cells,
도 2는 젊은 세포 및 노화 세포에서의 시간에 따른 트랜스페린의 세포내 운반을 보여주는 콘포칼 현미경 사진,2 is a confocal micrograph showing intracellular transport of transferrin over time in young and senescent cells,
도 3은 젊은 세포 및 노화 세포에서의 트랜스페린에 대한 펄스-채이싱 결과를 보여주는 콘포칼 현미경 사진,3 is a confocal micrograph showing pulse-chasing results for transferrin in young and senescent cells,
도 4는 인위적으로 노화가 유도된 세포에서의 트랜스페린의 세포내 운반 여부를 확인한 콘포칼 현미경 사진,4 is a confocal micrograph confirming whether intracellular transport of transferrin in artificially induced aging cells,
도 5는 암피파이신 1에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 사진,Figure 5 is a photograph showing the results of Western blotting for ampifiycin 1,
도 6은 암피파이신 1에 대한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타내는 또 다른 사진,Figure 6 is another picture showing the results of Western blotting for ampiphycin 1,
도 7은 암피파이신 1의 mRNA에 대한 노던 블롯팅 결과를 나타내는 사진,Figure 7 is a photograph showing the northern blotting results for the mRNA of ampifiycin 1,
도 8은 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pGEX-2T 벡터의 제한효소지도,8 is a restriction map of a pGEX-2T vector containing an ampiphycin 1 gene,
도 9는 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터의 제한효소지도,9 is a restriction map of a pcDNA 3 vector containing an ampiphycin 1 gene,
도 10은 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터가 미세주입된 세포의 형광 현미경 사진,10 is a fluorescence micrograph of a cell microinjected with a pcDNA 3 vector comprising an ampiphycin 1 gene,
도 11은 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자를 포함하는 pcDNA 3 벡터의 제한효소지도,11 is a restriction map of a pcDNA 3 vector comprising a dominant negative ampiphycin 1 gene,
도 12는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자에 의해 형질 전환된 세포에서의 트랜스페린의 세포내 운반 여부를 확인한 콘포칼 현미경 사진.12 is a confocal micrograph confirming the intracellular transport of transferrin in cells transformed with the dominant negative ampiphycin 1 gene.
본 발명은 포유동물의 세포 내에 존재하는 암피파이신 1 단백질의 함량의 감소를 측정하여 실시되는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for detecting senescent cells in a mammal, which is carried out by measuring a decrease in the amount of ampificin 1 protein present in a mammalian cell.
본 발명은 포유동물의 세포 내에 존재하는 암피파이신 1 단백질의 mRNA의 함량의 감소를 측정하여 실시되는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 다른 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for detecting senescent cells of a mammal, which is carried out by measuring a decrease in the mRNA content of Ampapisin 1 protein present in a mammalian cell.
본 발명은 포유동물 세포의 엔도사이토시스 기능을 확인하는 단계를 포함하는 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 다른 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for detecting senescent cells of a mammal, comprising the step of confirming the endocytosis function of the mammalian cell.
본 발명은 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 또 다른 특징으로 한다.The present invention further provides a composition for restoring functional senescence of mammalian senescent cells using the expression vector for eukaryotic cells having the ampiphycin 1 gene as an active ingredient.
본 발명은 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 노화된 동물세포내로 도입하는 단계를 포함하는 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 다른 특징으로 한다.The present invention is characterized by a method for restoring the function of a mammalian senescent cell, comprising the step of introducing an expression vector for a eukaryotic cell having an ampiphycin 1 gene into an aging animal cell.
본 발명은 도미넌트 네가티브 (dominant negative) 암피파이신 1 유전자를 갖는 진핵세포용 발현벡터를 유효성분으로 하는 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물을 다른 특징으로 한다.The present invention is characterized by another composition for inducing aging of mammalian cells using an expression vector for eukaryotic cells having a dominant negative ampiphycin 1 gene as an active ingredient.
이와 같은 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다:The present invention is described in detail as follows:
본 발명자들은 포유동물의 노화 세포에서 세포막 수용체성 엔도사이토시스의기능이 현저하게 감소되고, 이는 암피파이신 1 단백질의 세포 내 함량의 감소에 따른 것임을 확인하였다.The present inventors have found that the function of cell membrane receptor endocytosis in mammalian senescent cells is markedly reduced, which is due to the decrease in the intracellular content of ampificin 1 protein.
따라서, 본 발명의 노화 세포의 검출방법은, 동물세포내 암피파이신 1 단백질 함량 감소의 측정을 통해 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 웨스턴 블롯팅에 의해 실시된다.Therefore, the detection method of the senescent cells of the present invention is preferably carried out through the measurement of the decrease in the amount of ampifiycin 1 protein in animal cells, more preferably by western blotting.
상기 암피파이신 1 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅 방법은 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다(참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 108-121, CRC press). 한편, 상기 웨스턴 블롯팅 방법은 바람직하게는 (ⅰ) 포유동물의 세포 시료를 용해하는 단계; (ⅱ) 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; (ⅲ) 수득된 단백질을 SDS 및 2-머르캅토에탄올을 포함하는 용액으로 변성시키는 단계; (ⅳ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; (ⅴ) SDS-PAGE가 완료된 겔 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅵ) NC 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항 암피파이신 1 항체를 반응시키는 단계; (ⅶ) 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 1차 항체와의 결합능을 갖는 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; (ⅷ) 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅸ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.Western blotting method for detecting the Amppaisin 1 protein can be used conventionally performed methods (see Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine , 108-121, CRC) press). On the other hand, the Western blotting method is preferably (i) lysing a cell sample of a mammal; (Ii) obtaining a protein from the lysed cells; (Iii) denaturing the obtained protein with a solution comprising SDS and 2-mercaptoethanol; (Iii) SDS-PAGE the denatured protein; (Iii) transferring the denatured protein on the gel complete with SDS-PAGE to the NC membrane; (Iii) reacting the protein on the NC membrane with an anti-ampypicin 1 antibody that is a primary antibody; (Iii) reacting the secondary antibody with the primary antibody to which the enzyme catalyzing the color reaction is bound; (Iii) inducing a color reaction by adding a substrate of an enzyme bound to the secondary antibody; And (iii) measuring the degree of color development developed by the color reaction.
상기 발색반응을 촉매하는 효소는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀 등이 이용된다.Enzymes that catalyze the color reaction include, but are not limited to, alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase, and the like. In addition, when using alkaline phosphatase, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), ECF substrate, etc. are used, and when using a horse radish peroxidase, Chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, luminol and the like are used as the substrate.
한편, 본 발명자들은 포유동물의 세포가 노화 단계로 진입하게 되면, 세포내 암피파이신 1 단백질의 양이 급격하게 감소된다는 것을 확인하였고, 이에 상기 본 발명의 방법은 정성적인 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 노화 세포를 대상으로 한 상기한 웨스턴 블롯팅에 의해 최종적으로 형성되는 겔 상의 밴드는 그 세기 및 두께가 육안으로도 용이하게 감지할 수 있을 정도로 현저하게 감소하게 된다. 따라서, 웨스턴 블롯팅에 의한 겔 상의 밴드 중, 노화 상태를 검출하고자 하는 세포 시료의 밴드의 세기 및 두께를 대조군인 정상 세포의 밴드의 세기 및 두께와 육안으로 관찰ㆍ비교하여 노화 여부를 확인할 수 있다.On the other hand, the inventors have confirmed that when the mammalian cell enters the aging stage, the amount of intracellular ampifiycin 1 protein is drastically reduced, and thus the method of the present invention can be carried out in a qualitative manner. . For example, the band on the gel finally formed by the above-described western blotting on senescent cells is markedly reduced in strength and thickness so that it can be easily detected by the naked eye. Therefore, the intensity and thickness of the band of the cell sample to detect the aging state among the bands on the gel by Western blotting can be visually observed and compared with the intensity and thickness of the band of the normal cell as a control group to confirm the aging. .
더불어, 상기한 본 발명의 방법은 정량적인 방법으로도 실시할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 블롯팅을 실시한 다음, 발색된 밴드를 갖는 NC 멤브레인을 직접적으로 덴시토미터(densitometor)로 읽거나, 또는 발광 기질을 이용하는 경우(예: 루미놀)에는 필름으로 현상하여 그 필름을 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 노화 여부를 확인한다. 예컨대, 약 40 ㎍의 단백질을 분석하는 경우에는 젊은 세포와 비교하여 45배 이상 발현이 감소된 경우에는 세포가 노화된 것으로 구분할 수 있다.In addition, the above-described method of the present invention can also be carried out in a quantitative manner, in which case, after blotting, the NC membrane having the colored band is read directly by a densitometor. Or, if a light emitting substrate is used (eg luminol), the film is developed into a film and the film is read by a densitometer to quantify the difference to determine whether aging occurs. For example, when analyzing about 40 μg of protein, the cells may be classified as aging when expression is reduced by 45-fold or more compared with young cells.
본 발명자는 상술한 노화 세포에서의 암피파이신 1 단백질 함량의 감소가암피파이신 1mRNA의 감소에 따른 것임을 확인하였다. 따라서, 또 다른 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 암피파이신 1 단백질에 대한 세포내 mRNA의 함량의 감소를 측정함으로써 실시하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는암피파이신 1mRNA의 함량 감소의 측정은 노던 블롯팅에 의해 실시한다.The present inventors confirmed that the above-described decrease in ampiphycin 1 protein content in senescent cells was due to the decrease in ampipaicin 1 mRNA. Therefore, another method for detecting senescent cells of the present invention is preferably carried out by measuring a decrease in the amount of intracellular mRNA for the Ampapisin 1 protein, and more preferably a measure of the decrease in the amount of Ampapisin 1 mRNA. Is performed by northern blotting.
상기 암피파이신 1 단백질의 mRNA를 검출하기 위한 노던 블롯팅은 종래 일반적으로 실시되는 방법을 이용할 수 있다(참조: Peter B. Kaufma et al.,Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, 102-108, CRC press). 한편, 상기 노던 블롯팅 방법은 바람직하게는 (ⅰ) 포유동물의 세포 시료로 부터 RNA를 수득하는 단계; (ⅱ) 수득한 RNA를 전기영동하는 단계; (ⅲ) 전기영동이 완료된 겔 상의 RNA를 나일론 또는 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅳ) 암피파이신 1 단백질의 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드 탐짐자와 상기 전이된 mRNA의 혼성화 반응 단계; 및 (ⅴ) 혼성화 반응이 종결된 겔의 자동방사선 사진을 얻는 단계를 포함한다.Northern blotting for detecting mRNA of the Ampapisin 1 protein may be performed using conventionally performed methods (see Peter B. Kaufma et al., Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine , 102-108, CRC press). On the other hand, the northern blotting method is preferably (i) obtaining RNA from a mammalian cell sample; (Ii) electrophoresis of the obtained RNA; (Iii) transferring the RNA on the electrophoresis-completed gel to a nylon or NC membrane; (Iii) a hybridization reaction of the radiolabeled oligonucleotide probe having a sequence complementary to the mRNA of the ampiphycin 1 protein and the transferred mRNA; And (iii) obtaining an autoradiography picture of the gel where the hybridization reaction is terminated.
한편, 포유동물의 세포가 노화 단계로 진입하게 되면, 세포내암피파이신 1mRNA의 양이 급격하게 감소되므로, 상기 본 발명의 방법은 정성적인 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 노화 세포를 대상으로 한 상기한 노던 블롯팅에 의해 최종적으로 형성되는 겔 상의 밴드는 그 세기 및 두께가 육안으로도 용이하게 감지할 수 있을 정도로 현저하게 감소하게 된다. 따라서, 노던 블롯팅에 의한 겔상의 밴드 중, 노화 상태를 검출하고자 하는 세포 시료의 밴드의 세기 및 두께를 대조군인 정상 세포의 밴드의 세기 및 두께와 육안으로 관찰ㆍ비교하여 노화 여부를 확인할 수있다.On the other hand, when the mammalian cell enters the aging stage, the amount of intracellular ampifiycin 1 mRNA is drastically reduced, the method of the present invention can be carried out by a qualitative method. For example, the band on the gel finally formed by the above Northern blotting on senescent cells is significantly reduced in strength and thickness so that it can be easily detected by the naked eye. Therefore, the intensity and thickness of the band of the cell sample to detect the aging state among the bands on the gel by Northern blotting can be visually observed and compared with the intensity and thickness of the band of the normal cell as a control group to confirm the aging. .
더불어, 상기한 본 발명의 방법은 정량적인 방법으로도 실시할 수 있으며, 이러한 방법에 의하는 경우에는 최종적으로 얻은 자동방사선 사진에서의 밴드를 덴시토미터로 읽어 그 차이를 정량화하여 노화 여부를 확인한다. 예컨대, 50 ㎍의 RNA를 분석하는 경우에는, 젊은 세포와 비교하여 15배 이상 밴드의 세기가 감소된 경우에는 세포가 노화된 것으로 구분할 수 있다.In addition, the above-described method of the present invention can also be carried out by a quantitative method, and in this case, the bands in the finally obtained autoradiography are read with a densitometer to quantify the difference to confirm aging. do. For example, when analyzing 50 μg of RNA, the cells may be classified as aging when the intensity of the band is reduced by more than 15 times compared to the young cells.
본 발명의 노화세포의 검출방법 가운데, 엔도사이토시스의 기능을 직접 확인하는 방법은 엔도사이토시스에 의해 세포내로 운반되는 수용체 (예: 트랜스페린, MHC, 트랜스코발부민 Ⅱ, EGF, 면역 복합체 등) 또는 수용체에 결합되는 리간드가 세포내로 운반되는 정도를 확인함으로써 이루어진다.Among the methods for detecting senescent cells of the present invention, a method for directly confirming the function of endocytosis is a receptor (eg, transferrin, MHC, transcobalbumin II, EGF, immune complex, etc.) that is carried intracellularly by endocytosis. Or by determining the extent to which the ligand bound to the receptor is transported into the cell.
예컨대, 트랜스페린에 형광물질을 표지하고, 형광물질 표지된 트랜스페린이 세포내로 운반되는 지 여부를 형광현미경 등으로 관찰하여 엔도사이토시스가 이루어졌는지를 확인하게 된다.For example, the fluorescent substance is labeled on the transferrin, and whether or not the fluorescent substance-labeled transferrin is transported into the cell is observed by a fluorescence microscope or the like to confirm whether endocytosis is achieved.
본 발명의 노화된 세포의 기능성 회복용 조성물에 있어서, 진핵세포용 발현벡터에 삽입된 암피파이신 1 유전자는 바람직하게는, 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖고, 보다 바람직하게는, 서열 1에 기재된 염기 서열중 111번째 염기 서열부터 2195번째 염기 서열을 갖는다.In the composition for functional recovery of aged cells of the present invention, the ampiphycin 1 gene inserted into the expression vector for eukaryotic cells preferably has a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and more preferably. And, from base 111 in the base sequence described in SEQ ID NO: 1 to the 2195 base sequence.
한편, 암피파이신 1 유전자를 동물 세포 내로 안전하게 운반하고, 이를 세포내에서 발현시키는 진핵세포용 발현벡터는 동물을 숙주로 하는 바이러스의 프로모터 및 폴리아데닐화 시그널을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 발현벡터는 현재 일반적으로 사용되고 있는 pcDNA 3(Invitrogen사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pSI(Promega사; SV 40 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pCI(Promega사; 시토메갈로 바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함), pREP7(Invitrogen사; RSV 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 시그날을 포함) 등이 있다.On the other hand, the expression vector for eukaryotic cells that safely transports the ampiphycin 1 gene into an animal cell and expresses it in the cell preferably includes a promoter and a polyadenylation signal of a virus as an animal host. Expression vectors that can be used in the present invention are currently commonly used pcDNA 3 (Invitrogen; including cytomegalo virus promoter and polyadenylation signal), pSI (Promega; SV 40 promoter and polyadenylation signal) , pCI (including Promega; cytomegalovirus promoter and polyadenylation signal), pREP7 (Invitrogen; including RSV promoter and SV40 polyadenylation signal).
본 발명의 포유동물의 노화된 세포의 기능 회복 방법에 있어서, 암피파이신 1 유전자를 포함하는 발현벡터의 동물세포 내로의 도입은 미세 주입법(참조: Capecchi, M.R.,Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 공동-침전법(참조: Graham, F.L. et al.,Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al.,EMBO J., 1:841(1982)) 및 양 이온성 리포좀 이용법(Wong, T.K. et al.,Gene, 10:87(1980)) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the method for restoring the function of the aged cells of the mammal of the present invention, the introduction of the expression vector containing the ampiphycin 1 gene into the animal cells may be performed by micro-injection (see Capecchi, MR, Cell , 22: 479 (1980)). ), Calcium phosphate co-precipitation (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 (1973)), electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982) ) And cationic liposomal methods (Wong, TK et al., Gene , 10:87 (1980)) and the like, but are not limited thereto.
본 발명의 포유동물 세포의 노화 유도용 조성물에서, 상기 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 단백질은 암피파이신 1 단백질의 기능을 차단하는 것으로서, 암피파이신 1에서 AP2 및 클라트린 결합자리에 해당하는 부위이다(Shupliakov, O. et al.,Science, 276:259(1997); Wigge P.,Curr. Biol., 7:554(1997)). 본 발명의 노화 유도용 조성물에서, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자는 바람직하게는서열 2에 기재된 아미노산 서열중 250번째 서열부터 588번째 서열을 코딩하는 서열을 갖고, 보다 바람직하게는 서열 1에 기재된 염기서열중 858번째 서열부터 1874번째 서열을 갖는다.In the composition for inducing aging of a mammalian cell of the present invention, the dominant negative ampiphycin 1 protein blocks the function of the ampiphycin 1 protein, and is a site corresponding to AP2 and clathrin binding site in ampiphycin 1 (Shupliakov, O. et al., Science , 276: 259 (1997); Wigge P., Curr. Biol. , 7: 554 (1997)). In the composition for inducing aging of the present invention, the dominant negative ampiphycin 1 gene preferably has a sequence encoding the 250th to 588th sequences of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 2, and more preferably the base described in SEQ ID NO: 1 Have a 874th to 1874th sequence of the sequence.
한편, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자을 세포내로 운반하는 데 사용되는 벡터 및 운반하는 방법은 상기 암피파이신 1 유전자에 기재된 내용과 동일하다.On the other hand, the vector used for carrying the dominant negative ampiphycin 1 gene and the method of carrying it are the same as that described in the said amphibiin 1 gene.
상술한 바와 같이, 본 발명자는 세포의 노화 상태 여부는 엔도사이토시스의 기능을 조사함으로써 보다 정확하게 판단할 수 있음을 처음으로 확인했고, 암피파이신-1 단백질 및 이의 mRNA가 노화에 대한 생체내 바이오 마커로서 각별하게 이용될 수 있음을 처음으로 확인하였다.As described above, the inventors have confirmed for the first time that the aging state of the cells can be more accurately determined by examining the function of endocytosis. It was confirmed for the first time that it can be used especially as a marker.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it is to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. Will be self-evident.
실시예 1: 세포 배양Example 1: Cell Culture
Ⅰ.표피 섬유아세포(foreskin fibroblasts)의 배양 I. Culture of Foreskin Fibroblasts
표피 섬유아세포의 분리 및 배양은 Boyce와 Ham의 방법(Boyce ST. and Ham RG., J. Invest. Dermato., 81:33-40(1983))에 따라 다음과 같이 실시하였다: 먼저, 7세 된 남아로부터 표피를 얻고, 이를 얇게 벗겨내어 절편으로 한 다음, 표피 절편을 0.25%의 콜라겐나아제가 포함된 항크스 염 용액(Hank's salt solution: Gibco BRL사) 10 ㎖에 넣고, 90분동안 5% CO2,37℃의 항온 배양기에서 배양시킨 후 상피와 진피를 서로 분리하였다.Isolation and culture of epidermal fibroblasts were performed according to Boyce and Ham's method (Boyce ST. And Ham RG., J. Invest. Dermato., 81: 33-40 (1983)): First, 7 years old The epidermis is obtained from the boy, thinned and sliced, and then the epidermal section is placed in 10 ml of Hank's salt solution (Gibco BRL) containing 0.25% collagenase and 5% for 90 minutes. After incubation in a constant temperature incubator of CO 2, 37 ℃ epithelium and dermis were separated from each other.
이어, 분리해 낸 진피에 0.25%의 트립신 용액 1 ㎖을 첨가하고, 항생제인 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖과 페닐실린(Gibco BRL사) 100 유니트/㎖, 그리고 태아 소혈청(fetal bovine serum: FBS, Gibco BRL사)을 10% 넣은 DMEM 세포 배양배지(Dulbecco's modified Eagle medium: Sigma사) 10 ㎖에 넣은 다음, 37℃ 항온 배양기에서 10분동안 배양하였다.Subsequently, 1 ml of 0.25% trypsin solution was added to the separated dermis, 100 µg / ml of antibiotics streptomycin, 100 units / ml of phenylsilin (Gibco BRL), and fetal bovine serum (FBS, Gibco BRL) was added to 10 ml of DMEM cell culture medium (Dulbecco's modified Eagle medium, Sigma) containing 10%, and then incubated in a 37 ° C. incubator for 10 minutes.
상기 과정에 의해 얻은 표피 섬유아세포를 10 ㎖의 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, 상기의 DMEM(10% FBS, 항생제 포함) 세포 배양 배지에서 계대 배양을 다음과 같이 계속하여 실시하였다: 항온 배양기는 5% CO2농도 및 37℃를 항시 유지하도록 하였고, DMEM 배지는 매 3일 마다 교환하였으며, 세포 배양 접시 표면적의 80-90%가 채워졌을 때 1:4로 계대 배양을 실시하였다. 세포를 계대 배양할 때마다 1:4로 배양한 것을 두 번 군락 더블링(population doubling)한 것으로 하여 군락 더블링 수준(population doubling level: PDL)의 수를 2씩 증가시켜 기록하였다.The epidermal fibroblasts obtained by the above procedure were washed with 10 ml of PBS (phosphate buffered saline), and then passaged in DMEM (10% FBS, including antibiotics) cell culture medium was continued as follows: The incubator was kept at 5% CO 2 concentration and 37 ° C. at all times, the DMEM medium was changed every 3 days, and passaged 1: 4 when 80-90% of the cell culture dish surface area was filled. Each time the cells were subcultured, the number of population doubling levels (PDLs) was increased by 2, as the population doubling was performed twice with a population of 1: 4.
Ⅱ.폐 섬유아세포(fetal lung fibroblast)의 배양 Ⅱ. Culture of lung lung fibroblast
폐 섬유아세포인 IMR-90 세포는 PDL이 25된 것을 상업적으로 구입하여 사용하였다(ATCC, #CCL186). 배양은 상기한 피부 섬유아세포와 동일한 방법으로 실시하였다.Pulmonary fibroblasts, IMR-90 cells, were commercially available from PDL 25 (ATCC, # CCL186). The culture was carried out in the same manner as the skin fibroblasts described above.
실시예 2: 사람 섬유아세포의 인위적 노화 유도Example 2: Induction of Artificial Aging of Human Fibroblasts
Ⅰ.H 2 O 2 에 의한 인위적 노화 유도 I. Induction of Artificial Aging by H 2 O 2
먼저, 상기 실시예 1에서 계대 배양된 PDL 16의 어린 피부 섬유아세포를 DMEM를 포함하는 세포 배양 접시에 깔고 세포 배양 항온기(37℃, 5% CO2, humidified)에서 일주일간 유지하여 세포들이 G1 세포기에 정지되도록 하였다. 한편, G1 세포기에 정지되었는지 여부는 다음과 같이 확인하였다: 세포를 70% 빙냉 에탄올로 고정한 후, PI 염색 용액(PBS에 50 ㎍/㎖의 RNase A와 50 ㎍/㎖의 프로피듐 요오디드가 포함)으로 실온에서 30분간 진탕하며 세포를 염색하였다. 이를 FACS(Fluorescence-activated cell sorter)를 이용하여 DNA가 각각 2n 상태와 4n 상태에 어떤 비율로 나타나는지 확인함으로서 세포기를 확인하였다. G1 세포기의 경우 대부분의 DNA 염색양상이 2n 상태에 나타난다.First, the young skin fibroblasts of PDL 16 passaged in Example 1 were placed in a cell culture dish containing DMEM and maintained for one week in a cell culture incubator (37 ° C., 5% CO 2 , humidified), whereby the cells were G1 cells. It was allowed to stop at the time. On the other hand, it was confirmed whether the cells were stopped in the G1 cell group as follows: After fixing the cells with 70% ice-cold ethanol, the PI staining solution (containing 50 μg / ml of RNase A and 50 μg / ml of propidium iodide in PBS) Cells were stained with shaking at room temperature for 30 minutes. The cell phase was confirmed by using a FACS (Fluorescence-activated cell sorter) to determine the proportion of DNA in the 2n state and 4n state, respectively. In the G1 cell phase, most of the DNA staining pattern appears in the 2n state.
G1 세포기에 정지된 피부 섬유아세포에 H2O2를 400 μM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양한 후 PBS 10 ㎖로 2회 세척하였다. 이어, 이를 1:4로 계대 배양한다음 정상적 세포배양 조건(37℃, 5% CO2, humidified)에서 배양을 지속하였다.Dermal fibroblasts stopped at the G1 cell phase were treated with H 2 O 2 at a concentration of 400 μM, incubated for 3 hours, and washed twice with 10 ml of PBS. Subsequently, it was passaged 1: 4 and the culture was continued under normal cell culture conditions (37 ° C., 5% CO 2 , humidified).
H2O2를 처리한 후 7일 이후부터 세포 노화의 지표로 사용되고 있는 노화관련 β-갈락토시다아제(senescence associated β-galactosidase) 활성 염색을 하여 세포가 노화상태에 들어간 것을 확인하고 실험에 사용하였다. β-갈락토시다아제 활성 염색은 하기 실시예 3과 같이 실시하였다.After 7 days after treatment with H 2 O 2 , senescence associated β-galactosidase activity staining, which has been used as an indicator of cell aging, was used to confirm that cells have entered an aging state. It was. β-galactosidase activity staining was performed as in Example 3 below.
Ⅱ.히드록시우레아에 의한 인위적 노화 유도 Ⅱ. Induction of Artificial Aging by Hydroxyurea
우선, 상기 실시예 1에서 계대 배양된 PDL 16의 피부 섬유아세포를 DMEM를 포함하는 세포 배양 접시에 약 60% 차도록 깔고 14시간 동안 세포 배양기에서(37℃, 5% CO2, humidified) 배양하였다. 이어, 히드록시우레아를 400 μM 농도로 처리하고 배양을 지속하였다. 배양 배지는 매 3일 마다 교환하였고, 배지를 교환할 때마다 히드록시우레아를 400 μM 농도로 새롭게 첨가해 주었다. 히드록시우레아를 처리한 후 14일 후부터 노화관련 β-갈락토시다아제 활성 염색을 하기실시예 3과 같이 실시하여 노화상태에 진입했는지 여부를 확인하고 실험에 사용하였다.First, skin fibroblasts of PDL 16 passaged in Example 1 were plated about 60% in a cell culture dish containing DMEM, and cultured in a cell incubator for 14 hours (37 ° C., 5% CO 2 , humidified). The hydroxyurea was then treated to a 400 μM concentration and the culture continued. The culture medium was changed every 3 days, and hydroxyurea was added fresh at 400 μM concentration every time the medium was changed. After 14 days of treatment with hydroxyurea, aging-related β-galactosidase activity staining was performed as in Example 3 to check whether the aging state was entered and used in the experiment.
실시예 3: 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색Example 3: Aging Related β-galactosidase Activity Staining
본 발명에서 이용되는 세포의 노화 여부는 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성 염색을 실시하여 확인하였고, 상기 염색은 Dimri 등의 방법(Dimri GP. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., 92:9363-9367(1995))에 따라 다음과 같이 수행하였다:우선, 세포를 PBS 10 ㎖로 2번 세척한 후, 2% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS 10 ㎖로 다시 한번 세척하고, β-갈락토시다아제 활성 염색 용액(1 ㎎/㎖의 X-Gal, 40 mM 시트르산/소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM NaCl 및 2 mM MgCl2) 5 ㎖을 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 동안 반응시켰다.반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양 접시를 싸서 배양하였다. 최종적으로, 위상차 현미경으로 발색 정도를 확인하였다.Aging of the cells used in the present invention was confirmed by carrying out aging-related β-galactosidase activity staining, and the staining was performed by Dimri et al. (Dimri GP. Et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 92: 9363-9367 (1995)): First, cells were washed twice with 10 ml of PBS and then fixed for 3-5 minutes at 2% formaldehyde at room temperature. The immobilized cells were washed once again with 10 ml of PBS, β-galactosidase active staining solution (1 mg / ml X-Gal, 40 mM citrate / sodium phosphate, pH 6.0), 5 mM potassium ferrocyanide, 5 ml of 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl and 2 mM MgCl 2 ) were added and reacted in a 37 ° C. incubator for 12-16 hours. The culture dish with foil foil to prevent light from entering during the reaction. Wrapped and incubated. Finally, the degree of color development was confirmed by a phase contrast microscope.
사람 표피 섬유아세포의 경우에는 PDL 50, IMR 90의 경우에는 PDL 65부터 β-갈락토시다아제 활성이 나타났고, 상기 실시예 2에서 H2O2로 처리한 경우에는 처리 후 10일 이후부터, 히드록시우레아로 처리한 경우에는 처리 후 14-20일 이후부터 β-갈락토시다아제 활성이 나타나 세포가 노화로 진입했음을 확인할 수 있었다.In the case of human epidermal fibroblasts, PDL 50 and IMR 90 showed β-galactosidase activity from PDL 65, and when treated with H 2 O 2 in Example 2, 10 days after the treatment, In the case of treatment with hydroxyurea, β-galactosidase activity appeared from 14-20 days after the treatment, indicating that the cells entered aging.
실시예 4: 엔도사이토시스의 기능 확인Example 4 Confirmation of the Function of Endocytosis
Ⅰ.노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 저하 관찰 I. Observation of functional degradation of endocytosis in senescent cells
노화 세포에서 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스의 기능에 변화가 있는지를 확인하기 위하여 트랜스페린의 운반 여부를 다음과 같이 관찰하였다: 우선, 세포를 커버 글라스 위에 깐 후, 세포 배양기(37℃, 5% CO2, humidified)에서 배양한 뒤, 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린(Molecular Probe사)을 25 ㎍/㎖ 농도로5분간 처리하였다. 이어, 빙냉 PBS 10 ㎖로 세척한 뒤, PBS내 4% 파라포름알데히드(pH 7.4) 10 ㎖로 실온에서 10분간 고정하였다. 최종적으로, 트랜스페린의 운반 정도는 콘포칼 현미경(Biorad사, #MRC1024)을 이용하여 여기 파장 568 ㎚에서 관찰하였고, 그 결과는 첨부한 도 1에서 확인할 수 있다.To determine whether there is a change in the function of cell membrane receptor mediated endocytosis in senescent cells, the transfer of transferrin was observed as follows: First, the cells were placed on a cover glass, followed by a cell incubator (37 ° C., 5% CO). 2 , humidified), and then treated with tetramethyltamine-conjugated transferrin (Molecular Probe) at a concentration of 25 µg / ml for 5 minutes. Then, washed with 10 ml of ice-cold PBS, and then fixed with 10 ml of 4% paraformaldehyde (pH 7.4) in PBS for 10 minutes at room temperature. Finally, the transfer degree of transferrin was observed at an excitation wavelength of 568 nm using a confocal microscope (Biorad, # MRC1024), and the results can be confirmed in the accompanying FIG. 1.
도 1에서, A는 PDL이 각각 20 및 54인 표피 섬유아세포의 젊은 세포, 노화 세포이고, B는 PDL이 각각 32 및 68인 IMR-90 세포이다. 도 1에서 볼 수 있듯이, 젊은 섬유아세포 및 젊은 IMR-90 세포의 경우는 트랜스페린이 세포 내로 운반되어 핵 주위에 모여있는 양상을 나타내었는데, 이는 세포 내 운반 시에 나타나는 전형적인 모양으로 보고된 바 있다. 이와는 반대로, 노화 세포에서는 이러한 양상을 관찰할 수 없었다.In Fig. 1, A is a young cell of senescent fibroblasts with PDL of 20 and 54, senescent cells, and B is an IMR-90 cell with PDL of 32 and 68, respectively. As can be seen in Figure 1, in the case of young fibroblasts and young IMR-90 cells, transferrins were transported into cells and collected around the nucleus, which has been reported as a typical shape appearing during intracellular transport. In contrast, this pattern could not be observed in senescent cells.
Ⅱ.시간에 따른 트랜스페린 운반의 관찰 Ⅱ. Observation of transferrin transport over time
표피 섬유아세포에 대한 상기 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린 25 ㎍/㎖의 처리 시간을 10, 20, 40 및 60분으로 연장하여 상기 실시예와 동일하게 실험을 수행하였고, 그 실험 결과는 첨부한 도 2와 같다. 도 2에서 Y, M 및 O는 PDL이 각각 24, 38 및 54인 젊은 세포, 중간 세포 및 노화 세포를 나타낸다. 도 2에서 확인할 수 있듯이, PDL 24 및 38의 젊은 세포들에서는 트랜스페린 운반이 효과적으로 발생하여 10분부터 세포내의 핵 주변에 그 형광상이 나타났고, 시간이 경과함에 따라 지속적으로 운반된 트랜스페린이 축적되어 더 많은 형광이 관찰되었다. 이에 반해 노화 세포에서는 60분 동안 배양한 후에도 세포 내로 운반된 형광이 나타나지않았다.The experiment was carried out in the same manner as in the above example by extending the treatment time of 25 μg / ml of the tetramethyltamine-conjugated transferrin to epidermal fibroblasts to 10, 20, 40 and 60 minutes, and the experimental results are shown in the accompanying drawings. Same as 2. 2, Y, M and O represent young, intermediate and senescent cells with PDLs of 24, 38 and 54, respectively. As can be seen in Figure 2, in the young cells of PDL 24 and 38, transferrin transfer occurred effectively, and its fluorescent image appeared around the nucleus in the cell from 10 minutes, and the transported transferrin continuously accumulated over time. Many fluorescences were observed. In contrast, in senescent cells, the fluorescence delivered into the cells did not appear even after 60 minutes of incubation.
Ⅲ.트랜스페린 운반의 펄스-체이싱 III. Pulse-chasing of transferrin transport
IMR 90 폐 섬유아세포에 5분 동안 25 ㎍/㎖ 농도로 로다민-접합 트랜스페린을 처리하고 난 다음, PBS로 세척하고 로다민-접합 트랜스페린이 결여딘 정상 배지를 넣고 5분, 10분 및 20분간 체이스싱하여 배양을 계속하였다. 그런 다음, 상기한 바와 같이 고정하고, 트랜스페린의 운반 정도를 콘포칼 현미경을 이용하여 관찰하였고, 그 결과는 첨부 도 3이다. 도 3에서, Y, M 및 O는 PDL이 각각 26, 48 및 72인 젊은 세포, 중간 세포 및 노화 세포를 나타낸다.IMR 90 pulmonary fibroblasts were treated with rhodamine-conjugated transferrin at a concentration of 25 μg / ml for 5 minutes, then washed with PBS and loaded with normal media lacking rhodamine-conjugated transferrin for 5 minutes, 10 minutes and 20 minutes. The culture was continued by chasing. Then, the fixation was carried out as described above, and the transporting degree of transferrin was observed using a confocal microscope, and the result is shown in FIG. 3. In Figure 3, Y, M and O represent young cells, intermediate cells and senescent cells with PDLs of 26, 48 and 72, respectively.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 젊은 세포의 경우에는 5분만에 트랜스페린을 세포내 골지세망계 부위에 위치시켜 5분 펄스 후 고정시켰을때 이미 그 형광이 핵 주변에서 관찰되었고, 10분 경과후에는 세포내에서 처리되어 그 형광상이 확산되어 나타났다. 이에 반해 PDL 48의 IMR 90 세포의 경우에는, 트랜스페린 운반이 지연되어 10분이 되었을 때 세포내 골지세망계 부위에 형광상이 약하게 나타나고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 운반은 시간이 지연되어 나타날 뿐 아니라, 그 양 또한 젊은 세포에 비해 매우 적은 양으로 관찰되었다. 한편, PDL 72 세포에서는 시간이 경과하여도 트랜스페린의 운반 자체가 이루어지지 않았다.As shown in FIG. 3, in the case of young cells, fluorescence was already observed around the nucleus when the transferrin was placed in the intracellular Golgi reticulum in 5 minutes and fixed after 5 minutes pulse. The fluorescent image was diffused and appeared. On the other hand, in the case of IMR 90 cells of PDL 48, it was confirmed that the fluorescent image was weakly expressed in the intracellular Golgi reticulum site when the transferrin was delayed for 10 minutes. Not only did this transport appear delayed, but the amount was also observed in very small amounts compared to young cells. On the other hand, in the PDL 72 cells, the transfer of transferrin itself did not take place over time.
Ⅳ.인위적 유도된 노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 확인 Ⅳ. Confirmation of Endocytosis Function in Artificially Induced Aging Cells
상기 실시예 2에서 인위적으로 노화가 유도된 세포에 상기와 같이 25 ㎍/㎖의 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린를 처리하여, 엔도사이토시스의 기능을 확인하였고, 그 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 계대 배양을 통한 자연적 노화에서 뿐 아니라 H2O2나 히드록시우레아를 처리하여 얻은 인위적 노화 세포에서도 세포막 수용체성 엔도사이토시스 기능이 저하되어 있음을 확인할 수 있었다.In Example 2, 25 μg / ml of tetramethyltamine-conjugated transferrin was treated to artificially induced aging cells to confirm the function of endocytosis, and the results are shown in FIG. 4. As can be seen in Figure 4, not only in the natural aging through subculture, but also in artificial senescent cells obtained by treatment with H 2 O 2 or hydroxyurea was confirmed that the cell membrane receptor endocytosis function is reduced.
본 실시예를 통해 사람 섬유아세포가 노화되면 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스 기능이 저하되어 트랜스페린과 같은 리간드를 세포 내로 유입하지 못한다는 사실을 확인하였다.In this example, aging of human fibroblasts confirmed that cell membrane receptor-mediated endocytosis function was reduced, and thus ligands such as transferrin could not be introduced into the cells.
실시예 5: 세포막 수용체 매개성 엔도사이토시스에 관여하는 단백질 발현 분석Example 5: Analysis of protein expression involved in cell membrane receptor mediated endocytosis
상기 실시예 4에서 확인된 노화 세포에서의 엔도사이토시스의 기능 저하를 분자적 차원에서 규명하기 위하여 수용체 매개성 엔도사이토시스에 관여하는 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 실험을 통해 다음과 같이 확인하였다:Expression of proteins involved in receptor mediated endocytosis in order to identify functionally the endocytosis in senescent cells confirmed in Example 4 on a molecular level was confirmed by Western blot experiment as follows:
PDL이 서로 상이한 섬유아세포를 세포 용해 완충액(1% 트리톤 X-100, 0.5% NP-40, 50 mM 트리스(pH7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO4, 1 mM NaF 및 1 mM PMSF)을 이용하여 용해하고, 이를 4℃에서 14000×g로 10분 동안 원심분리한 다음, 그 상층액을 취하였다. 이렇게 얻은 세포 추출액을 브래드포드법(Bradford, M.,Anal. Biochem. 72:248-254(1976))을 이용하여 단백질 정량한 다음, 동량(40 ㎍)의 단백질을 취하여 5X SDS 시료 완충액(60 mM Tris-Cl(pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머르캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)을 첨가하고 5분간 끓여 변성시켰다.Fibroblasts with different PDLs were treated with cell lysis buffer (1% Triton X-100, 0.5% NP-40, 50 mM Tris, pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO 4 , 1 mM NaF and 1 mM PMSF), which were centrifuged at 14000 × g for 10 minutes at 4 ° C., and then the supernatant was taken. The cell extracts thus obtained were quantitated for protein using the Bradford method (Bradford, M., Anal. Biochem . 72: 248-254 (1976)), and then the same amount (40 μg) of the protein was taken to obtain 5X SDS sample buffer (60 mM Tris-Cl (pH6.8), 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) was added and boiled for 5 minutes to denature.
10-15 ㎍ 단백질을 포함하는 각 추출액을 전기영동 키트(Biorad사)를 이용하여 8% 폴리아크릴아미드 겔 위에서 전기영동을 하여 분리시키고, 분리된 단백질을 트랜스퍼 키트(Biorad사)를 이용하여 전기블롯팅 완충용액(20 mM Tris/150 mM 글리세린)내에서 겔로부터 NC 멤브레인(Protran사)으로 전이시켰다. 이 블롯을 5% 탈지분유(Difco사)를 포함하는 TTBS(Tris buffered saline with Tween 20)로 1시간 동안 블롯킹시킨 후 희석된 검출하고자 하는 단백질에 대한 1차 항체와 1시간 동안 반응시켰다.Each extract containing 10-15 μg protein was separated by electrophoresis on an 8% polyacrylamide gel using an electrophoresis kit (Biorad), and the separated protein was electrophoresed using a transfer kit (Biorad). Transfer from gel to NC membrane (Protran) in lotting buffer (20 mM Tris / 150 mM glycerin). This blot was blocked with Tri buffered saline with Tween 20 (TTBS) containing 5% skim milk powder (Difco) for 1 hour and then reacted with the primary antibody against the protein to be diluted for 1 hour.
상기 1차 항체로 사용된 항체 가운데, 항다이나민 항체, 항α-아답틴 항체, 항β-아답틴 항체 및 항클라트린 중사슬 항체는 Transduction Laboratory사로부터 구입한 것이고, 마우스 단일클론 항암피파이신 1 항체는 충북대학교 의과대학, 김승렬 선생님으로부터 얻은 것이며, 항포스포티로신 항체와 항트랜스페린 수용체 항체는 Santa Cruz사로부터 구입한 것이다.Among the antibodies used as the primary antibody, antidynamin antibody, antiα-adaptin antibody, antiβ-adaptin antibody and anticlathrin heavy chain antibody were purchased from Transduction Laboratory, and mouse monoclonal anti-amplifine 1 Antibodies were obtained from Chungbuk National University School of Medicine, Dr. Kim Seung-ryul, and antiphosphotyrosine and antitransferrin receptor antibodies were purchased from Santa Cruz.
상기 과정에 의해 형성된 면역 복합체의 존재는 호스 래디쉬 페록시다아제가 연결된 토끼 항마우스 항체(Pierce사)와 페록시다아제의 기질을 포함하는 ECL(enhanced chemiluminiscence) 키트(Amersham사, #RPN2108)를 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 5과 같다.The presence of the immune complex formed by the above procedure was carried out using an enhanced chemiluminiscence (ECL) kit (Amersham, # RPN2108) comprising a rabbit anti-mouse antibody (Pierce) to which the horse radish peroxidase was linked and a substrate of the peroxidase. It confirmed using, and the result is as shown in FIG.
도 5에서 확인할 수 있듯이, 트랜스페린 수용체(CD71), 클라트린 중사슬,α-아답틴, β-아답틴 및 다이나민의 발현은 세포 노화에 관계 없이 거의 변화가 없었다. 한편, 사람 표피 섬유아세포 및 IMR 90 세포 각각에서 노화가 되었을 때 암피파이신 1 단백질의 발현이 크게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.As can be seen in Figure 5, the expression of transferrin receptor (CD71), clathrin heavy chain, α-adaptin, β-adaptin and dynamin showed little change regardless of cell aging. On the other hand, it was confirmed that the expression of ampificin 1 protein was greatly reduced when aging in each of human epidermal fibroblasts and IMR 90 cells.
한편, 상기 웨스턴 블롯을 실시예 2에서 실시하였던 H2O2및 히드록시우레아로부터 유도된 노화세포에 대하여도 동일하게 실시한 경우, 계대 배양을 통해 자연적으로 발생된 노화세포와 동일한 실험결과를 얻을 수 있었다(참조: 도 6).On the other hand, when the same Western blot for the aging cells derived from H 2 O 2 and hydroxyurea carried out in Example 2, the same experimental results as the naturally occurring aging cells through passage culture can be obtained. (See FIG. 6).
실시예 6: RNA 분리 및 노던 블롯 분석Example 6: RNA Isolation and Northern Blot Analysis
상기 실시예 5에서 확인한 세포 노화시 암피파이신 1 단백질의 발현 감소가 단백질 자체의 안정성 감소로부터 야기된 것인지, 단백질을 발현하는 유전자의 전사단계에서 감소된 것인지를 확인하기 위하여 노던 블롯팅을 다음과 같이 실시하였다:Northern blotting was carried out to confirm whether the decrease in the expression of the ampiphycin 1 protein during cell aging confirmed in Example 5 was caused by a decrease in the stability of the protein itself or was reduced in the transcriptional phase of the gene expressing the protein. It was done as follows:
산 구아니디늄 티오시아네이드-페놀-클로로포름 이용방법(Chomczynski 및 Sacchi, 1987)에 따라 상기 실시예 1의 사람 표피 섬유아세포로부터 RNA를 분리하고, 포름알데히드 시료 완충액(5X MOPS, 포름알데히드 17.5%, 포름아미드 50%)과 혼합한 다음 전기영동 키트(Hoefer사)를 이용하여 1% 아가로스 겔에서 포름알데히드 겔 전기영동을 시행하였다.RNA was isolated from the human epidermal fibroblasts of Example 1 according to the method of using acid guanidinium thiocyanide-phenol-chloroform (Chomczynski and Sacchi, 1987) and formaldehyde sample buffer (5X MOPS, formaldehyde 17.5%, Formamide gel electrophoresis was performed on a 1% agarose gel using an electrophoresis kit (Hoefer).
전기영동이 종료된 다음, 나일론 멤브레인에 RNA를 전이시키고, 자동 UV 교호결합제(Stratagen사)를 이용하여 RNA를 멤브레인에 교호결합시켰다. 그 후,32P방사선 표지된 탐침자(암피파이신 1 cDNA의 111~1116을 포함)와 혼성화 반응을 시킨 다음, 최종적으로 자동방사선 사진을 얻었고, 그 결과는 첨부 도 7과 같다.After electrophoresis was completed, RNA was transferred to the nylon membrane, and RNA was crosslinked to the membrane using an automatic UV crosslinker (Stratagen). Thereafter, hybridization reaction was performed with a 32 P radiolabeled probe (including 111 to 1116 of Amphipyin 1 cDNA), and finally, autoradiography was obtained, and the results are shown in FIG. 7.
도 7에서 Y는 PDL이 27, M은 PDL이 36 그리고 O는 PDL이 60인 표피 섬유 아세포이다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 노화가 진행됨에 따라암피파이신 1mRNA 양이 감소됨을 확인할 수 있었고, 결국 노화에 따른 암피파이신 1의 감소는 전사단계에서 그 조절이 이루어지고 있음을 알 수 있었다.In FIG. 7, Y is PDL 27, M is PDL 36 and O is 60 epidermal fibroblasts. As can be seen in Figure 7, it can be seen that as the aging progressed, the amount of ampiphycin 1 mRNA was reduced, and eventually, the decrease in ampipaicin 1 due to aging was found to be regulated at the transcriptional stage.
실시예 7: 암피파이신 1 유전자의 클로닝Example 7: Cloning of Amphipysin 1 Gene
첨부한 서열 1을 갖는 암피파이신 1 유전자의 cDNA가 GST 퓨젼 단백질로 pGEX-2T 벡터(Pharmacia 사)의 BamHI과 EcoRI 위치에 클로닝 되어 있는 벡터를 충북대학교 의과대학으로부터 입수하였고, 그 제한효소 지도는 첨부한 도 8과 같다. 상기 벡터를 PCR 주형으로 하여 암피파이신 1 발현벡터를 클로닝하였다. PCR에서 사용될 프라이머는 제이 엘 과학(제노텍(주))에 의뢰하여 제작하였고, 그 서열은 전방향 프라이머인 경우에는 5'AACTGT CCACC ATG GCC GAC ATC AAG ACG GGC 3'이고; 및 역방향 프라이머인 경우에는 5' GGATCC CTA ATC TAA GCG TCG GGT 3'이다. 상기 전방향 프라이머 서열에서 AACTGT는 Hind Ⅲ 절단위치이고, CCACC는 코자크(kozak) 서열이며, ATG는 출발코돈으로 되는 부분이다. 상기 역방향 프라이머 서열에서 GGATCC는 Bam HI 절단 위치이고, CTA는 정지 코돈으로 되는 부분이다.A cDNA of the ampiphycin 1 gene having the attached SEQ ID NO: 1 was cloned at the BamHI and EcoRI positions of the pGEX-2T vector (Pharmacia) as a GST fusion protein from Chungbuk National University College of Medicine. As shown in FIG. 8. The amphibiycin 1 expression vector was cloned using the vector as a PCR template. The primer to be used in the PCR was prepared by J. L. Science (Genotech Co., Ltd.), and the sequence was 5 'AACTGT CCACC ATG GCC GAC ATC AAG ACG GGC 3' for the forward primer; And 5 'GGATCC CTA ATC TAA GCG TCG GGT 3' for reverse primer. In the forward primer sequence, AACTGT is the Hind III cleavage site, CCACC is the kozak sequence, and ATG is the starting codon. In the reverse primer sequence, GGATCC is the Bam HI cleavage site and CTA is the portion that becomes the stop codon.
상기 프라이머를 이용하여 코자크 서열을 포함하는 암피파이신 1 유전자cDNA의 전장을 다음과 같이 PCR로 증폭하였다: PCR은 Pyrobest Taq 중합효소(Takara사)를 사용하여 수행하였다. 어닐링은 55℃에서 30초간 수행하였고, 연장반응은 72℃에서 1분 30초간 수행하였다. 변성은 92℃에서 30초간으로 하여 총 40 사이클을 수행하였다.The primers were used to amplify the full length of the ampiphycin 1 gene cDNA containing the Cossack sequence by PCR as follows: PCR was performed using Pyrobest Taq polymerase (Takara). Annealing was carried out at 55 ° C. for 30 seconds, and extension reaction was performed at 72 ° C. for 1 minute 30 seconds. The denaturation was performed at 92 ° C. for 30 seconds for a total of 40 cycles.
상기 PCR에 의해 증폭된 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 섬유아세포에 주입하기 위하여, 진핵세포 발현벡터인 pcDNA 3(Invitrogen사; 시토메갈로바이러스 프로모터 및 폴리아데닐화 시그날을 포함) 벡터에 다음과 같이 서브 클로닝하였다: 우선, PCR 산물을 pT7 blue 벡터(Novagen 사)에 클로닝하여 염기 서열을 확인한 후, 이를 Hind Ⅲ와 Bam HI 제한효소로 처리하여 pcDNA3 벡터에 서브 클로닝하였다. 최종적으로 제조된 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 포함하는 pcDNA 3의 제한효소 지도는 도 9에 나타내었다.In order to inject the cDNA of the ampiphycin 1 gene amplified by the PCR into the fibroblasts, the eukaryotic expression vector pcDNA 3 (Invitrogen, Inc .; cytomegalovirus promoter and polyadenylation signal) vector as follows Cloning: First, the PCR product was cloned into pT7 blue vector (Novagen) to confirm its base sequence, and then subcloned into pcDNA3 vector by treatment with Hind III and Bam HI restriction enzymes. The restriction map of pcDNA 3 including cDNA of the finally prepared ampiphycin 1 gene is shown in FIG. 9.
실시예 8: 암피파이신 1 유전자에 의한 노화 세포의 세포막 수용체성 엔도 사이토시스의 회복Example 8: Restoration of Cell Membrane Receptor Endocytosis of Aging Cells by Amphifasin 1 Gene
Ⅰ.암피파이신 1 유전자의 미세주입(microinjection) I. Microinjection of Amphipyin 1 Gene
우선, 실시예 1의 PDL이 58인 노화된 사람 표피 섬유아세포를 커버 글라스 위에 깔고 24시간 동안 FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지로 세포 배양기(37℃, 5% CO2, humidified)에서 배양하였다.First, aged human epidermal fibroblasts with a PDL of Example 1 were placed on a cover glass and cultured in a cell incubator (37 ° C., 5% CO 2, humidified) in DMEM medium containing no FBS for 24 hours.
이어, 상기 실시예 7에서 pcDNA 3 벡터에 클로닝된 암피파이신 1 유전자(10ng/㎖) 10-14ℓ및 토끼 IgG (Sigma사, 5 ㎎/㎖) 10-14ℓ를 노화 세포의 핵에 다음과 같이 미세 주입하였다: 미세주입을 위해 DNA를 미세주입 버퍼-A(50mM HEPES, pH7.2, 100mM KCl, 50mM NaPO4)에 10 ng/㎖로 희석하였다. 희석한 DNA를 유리 모세바늘에 넣고 마이크로인젝터(Transjector5246: Eppendorf사)와 마이크로매너퓰레이터5171(Eppendorf사)를 사용하여 세포 핵에 미세 주입하였다. 유리 모세바늘은 주사바늘 제조장치(KOPF vertical pipette puller model 720)로 제작하여 사용하였다.Then, following the above Example 7 with cancer who is FIFA 1 gene cloned into the pcDNA 3 vector in (10ng / ㎖) 10 -14 ℓ and rabbit IgG (Sigma Co., 5 ㎎ / ㎖) 10 -14 ℓ in the nucleus of senescent cells Microinjection as follows: DNA was diluted to 10 ng / ml in microinjection buffer-A (50 mM HEPES, pH7.2, 100 mM KCl, 50 mM NaPO 4) for microinjection. Diluted DNA was put in a glass capillary needle and finely injected into the cell nucleus using a microinjector (Transjector 5246: Eppendorf) and a micromanipulator 591 (Eppendorf). The glass capillary needle was manufactured and used with a needle manufacturing apparatus (KOPF vertical pipette puller model 720).
Ⅱ.미세 주입된 세포에서의 암피파이신 1의 발현 확인 Ⅱ. Expression of Amphipathin 1 in Microinjected Cells
미세 주입된 세포에서 암피파이신 1의 발현 여부를 다음과 같이 중복 면역 형광 염색을 실시하여 확인하였다: 우선, 미세 주입후 24시간 동안 FBS가 없는 DMEM 배지에서 커버 글라스 위에 키운 세포를 3.7% 파라포름알데히드 용액(in PBS)으로 고정한 후, 1% BSA가 포함된 PBS로 실온에서 15분간 블록킹하였다. 그 후 1차 항체로서 충북대학교 의과대학으로부터 얻은 마우스 단일클론 항암피파이신 1 항체를 PBS로 100배 희석하여 세포에 가하였다. 이를 37℃에서 1시간동안 습윤 챔버에 넣어 방치한 후, PBS로 5분간 세 번씩 세척하였다. 그 후 2차 항체로 FITC(Fluorescein isothiocyanate)-접합 항마우스 IgG(Jackson Laboratory사)를 PBS로 100배 희석하여 빛을 차단하고 실온에서 습윤 챔버에 넣어 방치하였다. 이를 앞서와 마찬가지로 PBS로 5분씩 세 번 세척하였다. 또한, 상기 2차 항체 배양시 항토끼 IgG에 대한 항체에 로다민이 표지된 2차 항체(Jackson Laboratory사: 1:100 희석)를 함께 배양하여 중복 면역 형광 염색을 수행하였고, 그 상은 형광 현미경(Zeiss사,Axiovert25, CFL451210)으로 관찰하였으며, 결과는 도 10과 같다.The expression of ampiphycin 1 in the microinjected cells was confirmed by performing duplicate immunofluorescence staining as follows: First, cells grown on the cover glass in DMEM medium without FBS for 24 hours after microinjection were 3.7% paraformed. After fixing with an aldehyde solution (in PBS), blocking with PBS containing 1% BSA for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the mouse monoclonal anticancer pysin 1 antibody obtained from Chungbuk National University College of Medicine as a primary antibody was diluted 100-fold with PBS and added to the cells. It was placed in a humid chamber for 1 hour at 37 ° C. and then washed three times with PBS for 5 minutes. Thereafter, FITC (Fluorescein isothiocyanate) -conjugated anti-mouse IgG (Jackson Laboratory) was diluted 100-fold with PBS to block light and placed in a humid chamber at room temperature. This was washed three times with PBS for 5 minutes as before. In addition, the secondary antibody was cultured with an antibody against anti-rabbit IgG labeled with rhodamine-labeled secondary antibody (Jackson Laboratory: 1: 100 dilution) to perform overlapping immunofluorescence staining, and the image was fluorescence microscope (Zeiss). 4, Axiovert25, CFL451210), and the results are shown in FIG. 10.
도 10에서 볼 수 있듯이, 토끼 IgG는 2차 항체에 결합되어 있는 로다민에 의해 적색 형광으로 확인할 수 있고, 암피파이신 1은 2차 항체에 결합되어 있는 FITC에 의해 녹색 형광으로 확인할 수 있다. 암피파이신 1의 존재를 나타내는 녹색 형광은 세포질에서 관찰되었다.As can be seen in Figure 10, rabbit IgG can be identified by red fluorescence by rhodamine bound to the secondary antibody, amphibiin 1 can be confirmed by green fluorescence by FITC bound to the secondary antibody. Green fluorescence indicating the presence of ampiphycin 1 was observed in the cytoplasm.
Ⅲ.세포막 수용체성 엔도사이토시스의 회복의 확인 III. Confirmation of recovery of cell membrane receptor endocytosis
미세 주입된 세포를 FBS가 들어있지 않은 DMEM 배지에서 세포 배양 항온기(37℃, 5% CO2, humidified)에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 테트라메틸로다민-접합 트랜스페린을 125 ng/㎖ 농도로 30분동안 처리하고, 빙냉 PBS 10 ㎖로 세척한 다음, PBS내 4% 파라포름알데히드(pH 7.4) 10 ㎖로 실온에서 10분간 고정하였다.Microinjected cells were incubated for 24 hours in a cell culture incubator (37 ° C., 5% CO 2 , humidified) in DMEM medium without FBS. Then, tetramethyltamine-conjugated transferrin was treated for 30 minutes at 125 ng / ml concentration, washed with 10 ml of ice-cold PBS, and then fixed for 10 minutes at room temperature with 10 ml of 4% paraformaldehyde (pH 7.4) in PBS. It was.
그런 다음, 미세 주입된 세포를 확인하기 위하여 상기한 바와 같이, 형광표지 항체를 이용하여 형광 염색하였다. 그리고 나서, 형광 현미경(Zeiss사, Axiovert 100)으로 미세 주입된 세포의 확인 및 트랜스페린의 운반 여부를 관찰하였으며, 그 결과는 표 1과 같다:Then, to confirm the micro-injected cells, as described above, the fluorescent staining using a fluorescent label antibody. Then, the fluorescence microscope (Zeiss, Axiovert 100) was confirmed to confirm the micro-injected cells and the transfer of transferrin, the results are shown in Table 1:
상기 표 1에서 확인할 수 있듯이, pcDNA 3 벡터가 모크(mock)로 미세 주입한 세포와 비교하여, 암피파이신 1 유전자가 포함된 pcDNA 3 벡터를 미세주입한 세포에서 트랜스페린의 세포 내 운반이 크게 증가됨을 알 수 있다.As can be seen in Table 1, the intracellular transport of transferrin is significantly increased in the cells microinjected with the pcDNA 3 vector containing the ampiphycin 1 gene compared to the cells microinjected with the pcDNA 3 vector into the mock. It can be seen.
실시예 9: 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 클로닝Example 9 Cloning of the Dominant Negative Ampapisin 1 Gene
암피파이신 1 단백질의 기능을 차단하는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 (Shupliakov, O. et al.,Science, 276:259(1997); Wigge P.,Curr. Biol., 7:554(1997)) 유전자를 클로닝하기 위하여, 서열 1에 기재된 암피파이신 1 유전자를 주형으로 하여 250-588번째의 아미노산에 해당하는 cDNA만을 선택적으로 PCR을 수행하였다. PCR에서 사용될 프라이머는 제이 엘 과학(제노텍(주))에 의뢰하여 제작하였고, 그 서열은 전방향 프라이머인 경우에는 5'AACTGT CCACC ATG AGT GATTCG GGT CCT CTC CGC 3'이고; 및 역방향 프라이머인 경우에는 5' GGATCC CTA CTG CTC CGT AGC CAG CTC CGG 3'이다.Dominant Negative Amppaisin 1 Blocking the Function of Ampapisin 1 Protein (Shupliakov, O. et al., Science , 276: 259 (1997); Wigge P., Curr. Biol. , 7: 554 (1997)) In order to clone the gene, PCR was selectively carried out using only the cDNA corresponding to the 250-588th amino acid, using the ampiphycin 1 gene described in SEQ ID NO: 1 as a template. Primers to be used in PCR were prepared by J. L. Science (Gennotek Co., Ltd.), the sequence is 5 'AACTGT CCACC ATG AGT GATTCG GGT CCT CTC CGC 3' in the case of the forward primer; And 5 'GGATCC CTA CTG CTC CGT AGC CAG CTC CGG 3' for reverse primers.
상기 프라이머를 이용하여 코자크 서열을 포함하는 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 상기 실시예 7과 동일하게 PCR로 증폭하였다.The primers were used to amplify the cDNA of the dominant negative ampiphycin 1 gene including the cossack sequence by PCR in the same manner as in Example 7.
상기 PCR에 의해 증폭된 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 섬유아세포에 주입하기 위하여, 진핵세포 발현벡터인 pcDNA 3(Invitrogen사) 벡터에 상기 실시예 7과 동일하게 서브 클로닝하였고, 최종적으로 제조된 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 cDNA를 포함하는 pcDNA 3의 제한효소 지도는 도 11과 같다.In order to inject the cDNA of the dominant negative ampiphycin 1 gene amplified by the PCR into fibroblasts, it was subcloned in the same manner as in Example 7 to the pcDNA 3 (Invitrogen) vector, which is an eukaryotic expression vector, and finally prepared. The restriction map of pcDNA 3 containing the cDNA of the dominant negative ampiphycin 1 gene was shown in FIG. 11.
실시예 10: 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자에 의한 젊은 세포의 세포막 수Example 10 Number of Cell Membranes in Young Cells by Dominant Negative Amphifasin 1 Gene
용체성 엔도사이토시스의 기능 억제Inhibition of Soluble Endocytosis
상기 실시예 9에서 제작된 벡터를 이용하여 사람 섬유아세포의 젊은 세포 (PDL 16)에 다음과 같이 형질 전환을 실시하였다: 세포를 반지름 60 ㎜ 디쉬에 깔고 18시간 동안 배양하였다. 이어, 상기 실시예 9에서 제조한 발현벡터 2 ㎍ 및 pEGFP-N1 벡터 (Clontech사) 0.5 ㎍을 DMEM과 플러스 시약 8 ㎕와 혼합한 후, 실온에서 15분 동안 방치하였다. 그런 다음, 리포펙타민 (Gibco-BRL사)과 DMEM 의 혼합물을 상기 DNA 시료와 잘 혼합한 다음, 실온에서 15분 동안 방치하였다. 그리고 나서, 다시 DMEM 배지 2 ㎖을 가하여 총 부피가 2.5 ㎖이 되도록 한 다음 상기 세포에 처리하고, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 경과한 다음, 20%의 FBS를 함유하는 DMEM 2.5 ㎖을 가하고, 40시간 동안 배양하였다.The vector produced in Example 9 was transformed into the young cells of human fibroblasts (PDL 16) as follows: The cells were placed in a 60 mm radius dish and incubated for 18 hours. Subsequently, 2 μg of the expression vector prepared in Example 9 and 0.5 μg of the pEGFP-N1 vector (Clontech) were mixed with DMEM and 8 μl of a positive reagent, and then left at room temperature for 15 minutes. Then, a mixture of lipofectamine (Gibco-BRL) and DMEM was mixed well with the DNA sample and then left at room temperature for 15 minutes. Then, 2 ml of DMEM medium was added again to make the total volume 2.5 ml, and then treated with the cells, and incubated at 37 ° C. for 3 hours. After 3 hours, 2.5 ml of DMEM containing 20% FBS was added and incubated for 40 hours.
이어, 로다민-접합 트랜스페린을 25 ㎍/㎖의 농도로 10분 동안 처리한 다음, 콘포칼 현미경(Biorad사, #MRC1024)으로 관찰하여 EGFP의 형광 (녹색)이 관찰되는세포 (형질 전환이 발생된 세포)와 그렇지 않은 세포 (형질전환이 발생되지 않은 세포)에서의 트렌스페린의 운반 여부를 확인하였고, 그 결과는 도 12와 같다.Subsequently, Rhodamine-conjugated transferrin was treated for 10 minutes at a concentration of 25 μg / ml, followed by confocal microscopy (Biorad, # MRC1024), in which fluorescence (green) of EGFP was observed (transformation occurred). It was confirmed whether the transfer of the transferrin in the cells) and the cells not (transformation did not occur), the results are as shown in FIG.
첨부 도 12에서 확인할 수 있듯이, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 cDNA가 삽입된 벡터와 pEGFP-N1 벡터로 동시 형질 전환된 세포 (왼쪽 패널 사진)에서는 로다민-접합 트랜스페린의 적색 형광이 관찰되지 않았고, 즉 로다민-접합 트랜스페린의 세포내 운반이 발생되지 않았으며, 형질 전환되지 않은 세포 (오른쪽 패널 사진)에서는 로다민-접합 트랜스페린의 적색 형광이 관찰되었다.As can be seen in FIG. 12, red fluorescence of rhodamine-conjugated transferrin was not observed in the cells co-transformed with the pEGFP-N1 vector and the vector with the dominant negative ampiphycin 1 cDNA inserted, i.e. No intracellular delivery of rhodamine-conjugated transferrin occurred, and red fluorescence of rhodamine-conjugated transferrin was observed in untransformed cells (right panel photo).
즉, 도미넌트 네가티브 암피파이신 1 유전자의 발현에 의해 세포막 수용체성 엔도사이토시스의 기능이 억제되고, 이에 세포의 노화상태를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.In other words, it was confirmed that the expression of the dominant negative ampiphycin 1 gene inhibits the function of the cell membrane receptor endocytosis, thereby inducing the aging state of the cells.
본 발명은 포유동물의 노화 세포의 검출방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물을 제공한다. 한편, 본 발명은 포유동물의 노화 세포의 기능 회복 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포유동물의 노화 유도용 조성물을 제공한다. 본 발명의 노화 세포의 검출방법은 노화에 직접적으로 관련된 단백질 및 이의 mRNA를 이용함으로써 노화 세포를 보다 정확히 확인할 수 있고, 본 발명의 노화 세포의 기능성 회복용 조성물은 노화 세포의 기능 감소에 관련된 물질을 직접적으로 이용하므로, 노화 세포의 기능성 회복을 효과적으로 할 수 있다.The present invention provides a method for detecting senescent cells in a mammal. The present invention also provides a composition for functional recovery of senescent cells of a mammal. On the other hand, the present invention provides a method for restoring the function of senescent cells in a mammal. The present invention also provides a composition for inducing aging of a mammal. The method for detecting senescent cells of the present invention can more accurately identify senescent cells by using proteins and mRNAs thereof that are directly related to aging. Since it is used directly, the functional recovery of senescent cells can be effectively.
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