KR20020008404A - 간질환의 치료를 위한 치료용 화합물의 동정 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간질환, 바람직하게는 알콜-유도 간염의 치료를 위한 잠재적인 치료용 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 간질환의 치료, 특히 알콜-유도 간질환의 치료에 있어서의 본 발명의 방법을 포유동물에게 이용하는 방법, 상기한 방법을 이용하여 동정된 치료용 화합물 및 중국 약초인 CH-100의 이용하는 방법을 개시한다.

Description

간질환의 치료를 위한 치료용 화합물의 동정 방법{A method of indetifying therapeutic compounds for a treatment of hepatic disorders}

간질환은 서구 국가들에서 이병률(騫喀蹇)의 주요 요인이다. 예를 들어, C형 간염은 혈액 오염으로 전염되며, 현재 많은 사례들은 일반적인 혈액 검사전 수혈로 인해 감염된 것으로 나타나고 있다. 대부분의 새로운 사례들은 발병 약물(중독성)과 관련되어 있다. 감염된 환자의 약 80 %는 만성 간염(20 %는 간경화증)으로 발전되고, 약 10 %는 종국에 간암으로 발전된다. 최근까지, 유일한 유효 치료 요법으로 인터페론이 있으나, 값이 비싸고, 비경구로 투여해야하며, 많은 부작용이 있어 그 가치에 있어서 한계가 있다.

알콜 소비가 간질환을 일으킬 수 있다. 정상적인 면역기능, 특히 세포 매개 면역에 영향을 준다^1-3. T 세포가 알콜 관련 질병의 진행에 있어서 중요한 역할을 한다^4-6. 사람과 동물의 알콜성 간질환에 관한 연구에 따르면, T 세포 증식이 생체외에서 콘카나발린 A(Con A) 또는 파이토헤마글루티닌(PHA)과 같은 마이토젠에 반응하여 크게 변화되는 것으로 밝혀졌다^7-9. 알콜을 먹인 랫트 또는 마우스에서, Con A에 대한 혈액 T 세포의 증식 반응이 저하되는 반면, PHA에 대한 반응은 향상되었고, CD4⁺T 보조세포가 반응 세포 유형이었다^2,3,8,10. 이는 에탄올에 노출시킨 후, T 세포 활성 수준¹⁰, 반응 세포 유형³및 사이토카인 분비 양상¹¹모두가 아마도 알콜 관련 간질환에 관여함을 암시한다. 수크로스 또는 등칼로리 수크로스를 먹인 랫트와 비교하면, 에탄올을 먹인 랫트는 Con A를 주입했을 때 간문맥과 중추 정맥 영역에서 CD4⁺T 세포와 CD8⁺T 세포의 침윤을 동반하는 보다 심각한 간괴사를 일으켰다. 이러한 랫트에서는 세포 배양시 높은 수준의 TNF-α및 IL-6을 분비하는 활성 간 관련 CD4⁺T 세포 수의 증가가 관찰되었다^4-6. 알콜을 먹인 랫트는 간 손상 개시 시점에서의 T 림프구의 역할을 연구하는 기본적인 연구 도구로서 사용되어 왔다.

에탄올에 노출시킨 후, T 세포 활성 수준, 반응 세포 유형 및 사이토카인 분비 양상 모두가 알콜 관련 간질환에 관여한다고 가정하면, 이러한 질병은 특성상 복잡함을 알 수 있다. 아직 확인되지 않은 많은 인자들이 간질환의 발현에 연루된 것으로 보인다. 따라서, 간질환의 개시와 진행에 관여하는 정확한 세포적 및 생화학적 기전과 상호작용을 밝히기 위한 보다 많은 연구가 요구된다. 더 나아가, 알콜-유도 간염에 관여하는 정확한 세포적 및 생화학적 기전과 상호작용은 C형 간염 및 자가면역 간질환과 같은 병원균-매개 간염에 관여하는 정확한 기전과 서로 다른것으로 보인다.

많은 간질환의 치료는 만족스럽지 않은 것이 사실이며, 개선된 치료제가 긴급히 요구된다. 그 결과, 잠재적으로 유용한 화합물의 치료적 가치를 예측하기 위한 적합한 방법, 특히 동물 모델에서의 방법 또한 요구된다.

본 발명의 목적은 선행 기술의 단점을 극복할 수 있는, 적어도 어느 정도는 실질적으로 개선할 수 있는 동물 모델, 방법 및 치료용 화합물을 제공하는 것이며, 또는 유용한 대체물을 제공할 것이다.

본 발명은 치료용 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 간질환의 치료를 위한 치료용 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 양면 및 신규한 것으로 간주해야할 다른 양면은 첨부된 도면을 참조하여 단지 일예로서 제시된 하기 서술로부터 분명해질 것이다.

도 1은 중국 약초가 혈장 LPS수준에 미치는 효과를 나타내는 도면이다.

에탄올을 소비하고 Con A를 주사한 후 0.4 및 8 주째에 혈장 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 수준을 측정하고(장 손상이 지표임), 이를 2 % 수크로스 또는 등칼로리 수크로스 음료를 먹이고, Con A를 주사한 랫트로부터 얻은 값과 비교하였다. 결과는 4 마리의 동물에 대한 LPS(pg/ml)의 평균값 ±SE(표준오차)를 나타낸다. * 및 **는 대조군과 비교한 알콜을 먹인 랫트의 p < 0.05와 p < 0.01을 각각 나타낸다. 시간 0은 Con A를 주사하지 않은 동물로부터 얻은 값을 나타낸다.

도 2는 Con A를 주사한 후 혈장내 혈장 알라닌 아미노전이효소(alanine aminotransferase, ALT)수준을 나타내는 도면이다.

알콜을 먹인 랫트로부터 다양한 시간에 혈장내 ALT수준을 측정하고, 이를 2 % 수크로스 또는 등칼로리 수크로스 음료를 먹이고 Con A를 주사한 랫트로부터 얻은 값과 비교하였다. 결과는 4 마리의 동물에 대한 아미노전이효소 활성(U/L)의 평균값 ±SE를 나타낸다. ** 및 ***는 대조군과 비교한 알콜을 먹인 랫트의 p < 0.01와 p < 0.001을 각각 나타낸다. 시간 0은 PBS를 주사한 동물로부터 얻은 값을 나타낸다.

도 3은 Con A를 주사한, 약초 또는 위약을 처리한 랫트의 혈청 TNF-α수준을 나타내는 도면이다.

알콜을 먹인 랫트로부터 다양한 시간에 혈청내 TNF-α수준을 측정하였고, 이를 2 % 수크로스 또는 등칼로리 수크로스 음료를 먹이고, Con A를 주사한 랫트로부터 얻은 값과 비교하였다. 각 점은 4 마리의 동물에 대한 평균값 ±SE를 나타낸다. ** 및 ***는 대조군과 비교한 각각 p < 0.01와 p < 0.001을 각각 나타낸다. 시간 0은 PBS를 주사한 동물로부터 얻은 값을 나타낸다.

도 4는 Con A 또는 PBS를 주사한 후 약초 또는 위약 처리한 랫트에서 간-관련 CD4 ⁺ T 세포에 의한 TNF-α생산을 나타내는 도면이다.

Con A 또는 PBS를 주사한 후 24 시간째에 랫트로부터 단리한 간-관련 CD4⁺T 세포를 Con A(5 ㎍/mL) 존재 하에 배양하였다. 24 시간 후, 배양 상청액에서 TNF-α를 측정하였다. 각 점은 4 마리의 동물에 대한 평균값 ±SE를 나타낸다. * 및 **는 대조군과 비교한 각각 p < 0.05와 p < 0.01을 나타낸다.

알콜을 투여한 포유동물 및 콘카나발린 A(Con A)와 같은 약제가 간질환을 치료하기 위해 디자인된 치료용 물질의 동정을 위한 모델로서 유용한 것으로 밝혀졌다.

또한 중국 약초인 CH-100이 알콜-유도 간염의 치료에 특히 유용한 것으로 밝혀졌다.

첫번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 포유동물에게 간질환을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들을 투여하고;

(b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(c) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 표준에 대한 효과와 비교하는 것을 포함하는 포함하는 포유동물에서 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

두번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 포유동물에게 알콜을 투여하고;

(b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(c) 상기 포유동물에게 간질환을 유도하는 것으로 알려진 제제를 투여하고;

(d) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

세번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 포유동물에게 알콜을 투여하고;

(b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(c) 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

네번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 포유동물에게 알콜을 투여하고;

(b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(c) 상기 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

(d) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

다섯번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 공여자 포유동물에게 알콜을 투여하고;

(b) 상기 공여자 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

(c) 수용자 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(d) 상기 공여자 포유동물로부터 간내 T 세포를 단리하여 상기 수용자에게 전이시키고;

(e) 상기 수용자 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

여섯번째 양면에 따르면, 본 발명은

(a) 공여자 포유동물에게 알콜을 투여하고;

(b) 상기 공여자 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

(c) 상기 공여자 포유동물로부터 간내 T 세포를 단리하여 상기 수용자에게 전이시키고;

(d) 상기 수용자 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

(e) 상기 수용자 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다.

필요하다면, 수용자 포유동물에 공여자의 T 세포를 전이한 후, T 세포 활성화제를 또한 투여할 수 있다.

본원에서 언급되는 포유동물은 바람직하게는 설치류로서, 가장 바람직한 설치류는 랫트이다. 그러나, 당업자라면, 여러가지 다른 포유동물이 본 발명에서 사용될 수 있음을 인정할 것이다.

간질환은 T 림프구가 간으로 이동하여 유도된 것이 바람직하며, 보다 바람직한 것은 간질환이 알콜성 간염인 것이다.

T 림프구는 TNFα를 분비하는 것이 바람직하다.

본원에서 언급되는 간질환을 유도하는 것으로 알려진 약제는 바람직하게는 알콜과 조인자(cofactor)이다. 상기 조인자가 T 세포 활성화제인 것이 바람직하다. 상기의 방법에서 알콜이 특이적으로 첫번째로 투여되는 경우, 뒤이어 투여되며 간질환을 유도하는 것으로 알려진 언급된 제제가 T 세포 활성화제이다.

본 발명의 방법에서 알콜이 사용되는 경우, 알콜은 물 중의 에탄올 용액으로 투여되는 것이 바람직하다. 상기 용액은 2 내지 40 % 에탄올(부피/부피)을 함유하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은 상기 용액이 5 내지 40 % 에탄올(부피/부피)을 함유하는 것이다. 상기 포유동물에게 에탄올에 적응할 수 있는 충분한 기간동안 에탄올의 농도를 증가시켜 가며 먹이는 것이 바람직하다. 알콜 농도가 적응기간 동안 물 중의 에탄올이 약 5 %(부피/부피)부터 약 40 %까지의 범위를 갖는 것이 바람직하다. 상기 적응 기간은 약 7 주가 바람직하다.

본원에서 조인자가 언급되어 있는 경우, 상기는 T 세포 활성제인 것이 바람직하다. 본원에 언급된 상기 T 세포 활성제는 콘카나발린 A(Con A)이 바람직하다. 그러나, 당업자라면 다른 화합물 예를 들어, 내독소 또한 유용할 수 있다는 것을이해할 것이다.

Con A는 단일 투여량으로 투여하는 것이 바람직하다, 단일 투여량은 체중 kg 당 1 내지 40 mg인 것이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 단일 투여량이 5 내지 30 mg/kg이 것이고, 가장 바람직한 것은 20 mg/kg인 것이다. Con A는 인산염 완충용액에 용해된 것이 바람직하다. Con A를 주사로 투여하는 것이 바람직하다.

본원에서 언급된 치료용 화합물은 알콜-유도 간염 또는 병원균-매개 간질환을 치료하기 위하여 구상된 것이다. 병원균-매개 간질환은 바이러스 또는 세균 감염 등으로 인하여 발생한 간질환을 말하며, 예를 들면, B형 간염 또는 C형 간염이다. 그러나, 당업자라면 자가면역성 간염을 포함하는 다른 유형의 간질환 역시 고려될 수 있음을 인정할 것이다.

일곱번째 양면에 따르면, 본 발명은 본원에서 기재된 방법 중 어느 한 방법을 이용하여 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는데 사용된 포유 동물을 제공한다.

여덟번째 양면에 따르면, 본 발명은 상기한 실시태양 중 어느 한 방법에 의하여 동정된 간질환의 치료에 사용하기 위한 치료용 화합물 또는 치료용 조성물을 제공한다.

화합물은 상기 기재한 바와 같이, 알콜-유도 간염 또는 병원균-매개 간질환을 치료하는데 유용한 1 종 이상의 활성 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자라면 다른 유형의 간질환 치료 또한 고려될 수 있음을 이해할 것이다.

열번째 양면에 따르면, 본 발명은 간질환, 바람직하게는 알콜-유도 간염의치료에 있어서의 CH-100의 용도를 제공한다.

CH-100은 하기의 경로 중 하나로 투여할 수 있다:구강, 전신(예, 경피적, 비강내 또는 좌약에 의함) 또는 비경구(예, 근육내, 정맥내 또는 피하) 투여. 그러나, 바람직한 투여 방법은 남용 정도에 따라서 조정될 수 있는 편리한 일일 투여요법을 이용하는 구강투여이다. CH-100 및 임의의 약학적으로 허용되는 부형제 등을 함유하는 조성물은 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 반고형체, 분말, 서방형 제제, 용액, 현탁액, 엘릭서, 에어로졸, 또는 임의의 다른 적당한 조성물의 형태를 취할 수 있다. CH-100은 또한 사람의 상태에 유익할 수 있는 다른 제제와의 병용도 가능하다.

CH-100은 본원의 실시예에 기재되는 섭생에 따라 그것을 필요로 하는 포유동물에게 구강으로 투여하는 것이 바람직하다. 보다 바람직한 것은 포유동물, 바람직하게는 사람을 다음의 섭생을 이용하여 치료하는 것이다.

6 개월 동안 매일 CH-100의 5 회 투여량(유효 약초가 약 340 mg)을 구강 투여.

그러나, 본 발명과 관련된 분야의 당업자라면, 포유동믈에게 투여되는 CH-100의 투여량과 투여 섭생이 각 경우에 나타나는 사실에 따라 변화될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 고려하여야 할 사항들은 예를 들어, CH-100에 대한 개체의 선호성 또는 관용성, 특정 개체에서의 질병의 심각도, 질병의 진행 단계, 투여가 단순히 예방 목적인지의 여부, 및 개체의 대체적인 건강 상태 등을 포함한다. 또한, 투여 섭생은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조정할 수 있다. 예를 들면, 여러개로 분할된 투여량을 주별 단위 또는 월별 단위로 또는 다른 적합한 시간 간격으로 투여할 수 있으며, 또는 상황의 위급한 정도에 따라 투여량을 비례하여 감소 또는 증가시켜 투여할 수 있다. 또한, 간 기능과 당업계에 잘 알려진 혈액학적 시험을 수행함으로써 상황의 위급 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본원의 내용중에서, "에탄올에 적응"이란 용어는 정상적으로는 동물에게 허용될 수 없는 농도, 예를 들면, 랫트의 경우, 약 40 % 알콜(부피/부피)의 알콜 용액의 수용을 유도하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 제약학적으로 허용되는 부형제는 일반적으로 안전하고, 무독성이며 생물학적으로나 다른쪽으로 바람직하지 않은 것이 아닌, 제약학적 조성물을 제조하는 데 유용한 부형제를 의미하며, 사람의 제약학적 사용 뿐 아니라 수의학적 사용에도 허용될 수 있는 부형제를 포함한다. 제약학적으로 허용되는 부형제는 본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같이 1 종 및 1 종 이상의 부형제를 포함한다.

"선결한 기준(predetermined standard)"이란 용어는 본원에서 사용된 바와 같이, 잠재적인 치료용 화합물의 투여를 보류하고 있는 실험군 포유동물과 실질적으로 동일한 상태(예를 들면, 환경적, 칼로리 섭취 등)에 있는 대조군 포유동물을 말한다. 다수의 대조군 포유동물을 사용하는 것이 바람직한데, 그 각각에게는 간질환을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들과 함께 병용 투여하거나 또는 그런 약제를 투여하지 않는다. 이 때, 하기의 실시예에 기재되는 바와 같이, 적당한 상응하는 조건으로 처리한 실험군 포유동물 또한 다수 이용될 것이다. 이러한 전략은 잘못된 실험 결과가 초래될 확률을 최소화하기 위한 것이다. 또한, 본 발명과 관련된 분야의 당업자라면, 실험적 인공물을 최소화하기 위하여 실험적인 절차는 대조군 포유동물과 실험군 포유동물 모두에게 동시에 수행하는 것이 바람직함을 이해할 것이다. 그러나, 본 발명에 따른 잠재적인 치료용 화합물을 동정하는 방법을 착수하기 전 또는 그 이후에 수행하여 대조군 포유동물로부터 얻은 데이타는 역시 사용될 수 있다.

또한, 본원에서 언급되는 "치료(treatment)"는 가장 넓은 의미로 보아야 한다. "치료"라는 용어는 반드시 환자가 완전히 회복될 때까지 처리된 것을 의미하는 것만은 아니다. 따라서, "치료"는 특정 상태의 증상 또는 심각성을 개선시키거나, 또는 특정 상태로 발전될 위험을 감소시키는 것 그리고, 예방적 조치를 포함한다.

하기 설명은 본 발명에 대한 실험 기준을 요약한 것이며, 특히 그의 바람직한 형태를 예시한 것이다.

실시예 1: 만성 알콜 투여 동물 모델

암컷 위스타 랫트를 뉴캐슬 대학(호주, 뉴캐슬)의 센트럴 애니멀 하우스(Central Animal House)로부터 공급받았다. 실험 동물들을 12 시간 빛-어둠 주기를 갖는 온도 조절 환경에서 개개의 벽걸이 철망 장안에 수용하고, 연구 기간 내내 랫트 사료 및 음료를 자유롭게 허용하였다. 동물들(그룹 당 3 - 6 마리)에게 이미 개시된 섭생¹²에 따라 물중의 40 % 에탄올(v/v), 등칼로리 수크로스 또는 2 % 수크로스를 먹였다. 알콜을 섭취하는 랫트에게는 처음 첫 1 주 동안은 물중의 5 % 에탄올(v/v)을 먹이고, 6 내지 8 주 기간 동안에는 물중의 에탄올 농도를 40 % 에탄올 농도로 증가시킨 것을 먹여서 에탄올에 적응하게 하였다. 대조군의 등칼로리 군에서 각 랫트에게 동일한 칼로리 섭취를 제공하기 위하여, 사료와 음료는 등칼로리 군에 있는 각 랫트의 칼로리 섭취에 따라 조절하였다. 두번째 대조군 동물에게는 랫트 사료와 2 % 수크로스 용액을 무제한으로 허용하였다. 본 연구에서 기술한동물 프로토콜은 뉴캐슬 대학의 동물연구 윤리 위원회에 의해 승인을 받았으며 위원회의 지침에 따라 수행하였다.

실시예 2: 중국 약초의 공급

중국 약초인 CH-100(Cathay Herbal Laboratories Pty Ltd., 호주 서리힐즈)은 19 가지의 다른 통상의 약초를 함유하며, 본 연구의 모델의 기능을 증명하는데 사용되었다. 이 약제(4 정제/kg 체중/일)는 랫트사료의 20 - 30 g에 배합하고, 랫트를 40 % 에탄올 용액을 성취한 후, 8 주 기간 동안 매일 먹이는데, 8 주 내내 40 % 에탄올을 유지하였다.

실시예 3: Con A 유도 간염 모델

콘카나발린 A(Con A)(Pharmacia AB, Laboratory Sepatation Division, 스웨덴 웁살라)를 인산염 완충용액(PBS, Bioscience, 호주 시드니) 30 ㎕에 용해한 20 mg/kg체중의 투여량으로 각각의 랫트에게 꼬리 정맥으로 투여하였다. Con A는 40 % 알콜을 공급한지 8 주 후에 주사하였다. Con A 주사 후에도 랫트는 계속 알콜을 섭취하게 하였다. 동물의 무게를 재고 Con A를 공급한지 24 시간 후에 희생시켰다. 시간 0의 대조군으로 사용된 한 그룹은 Con A를 공급받지 않았다. 체중을 재고, 조직학적 검사 및 CD4⁺T 세포 연구를 위해 간에 관류하고 제거하였다.

실시예 4: 간 관류에 의한 간내 단핵구 세포 단리

랫트를 케타민(Parnell Laboratories Pty Ltd. 호주 뉴캐슬 알렉산드리아)과 Rompun(Bayer Australia Ltd 호주 뉴캐슬 피러비)(1:1 v/v, 0.08 - 0.12 mL/100 g체중)를 복강내로 주사하여 마취시켰다. 간은 그자리에서 0.1 % EDTA(Prolabo, 프랑스 파리 뤼필르 12)를 함유하는 멸균 PBS을 10 cm H₂O의 압력하에 유속 10 mL/분으로 간문맥을 통하여 전관류함으로써 간내혈액을 제거하였다. 이어서, PBS/EDTA 용액 300 mL를 40 cm H₂O의 압력 하에(유속 30 mL/분) 관류하였다. 하대정맥으로부터 수집한 관류액(약 300 mL)을 1500 rpm으로 15 분간 원심분리하였다. 상청액을 버린 후에, 세포를 5 % FCS(Trace Scientific, 호주 뉴캐슬 시드니)를 함유하는 RPMI 1640 배지 3 mL에 부유하였다. 상기 세포 부유액을 Ficoll/Paque 밀도구배(Pharmacia, 스웨덴 웁살라) 상에 분주하였다. 1500 rpm으로 20 분간 원심분리한 후, 세포를 중간 경계면에서 수거하여, PBS로 3 회 세척하고, RPMI/5 % FCS 배지로 재부유하였다.

실시예 5: 간-관련 CD4 ⁺ T 세포 단리

간-관련 림프구를 마우스의 항-rat CD4⁺(W3/25)(Serotec, 영국 옥스포드)로 4 ℃에서 45 분 동안 처리하여 표지하였다. 세포를 차가운 PBS로 250 x g에서 10 분간 원심분리하여 2 회 세척하였다. 원심분리 후, 세포들을 FITC-콘쥬게이티드 F(ab')₂가 결합된 F(ab')₂토끼 항-마우스 이소타입-특이성 면역글로불린(DAKO, 덴마크 글로스트럽)으로 표지하였다. 20 분 동안 배양한 후, 세포를 RPMI 1640 배지 3 mL로 부유하였다. 마지막으로, FACScan Cell Sorter를 사용하여 간-관련 CD4⁺T 세포를 분리하였다. 세포 생존률은 트리판 블루 염색법으로 결정했을 때 > 99 % 이었다.

실시예 6: 간-관련 림프구에 의한 사이토카인 생산

간-관련 CD4⁺T 세포를 5 % FCS, L-글루타민(2 mM), 및 페니실린/스트렙토마이신(50 ㎍/mL)을 함유하는 RPMI 1640 배지 mL당 1 x 10⁶세포수로 Con A(5 ㎍/mL)와 함께 편평한 바닥의 96 well 평판에서 5 % CO₂존재하에 배양하였다. 24 시간 후, 상청액을 수집하여 원심분리한 다음, TNF 분석시 사용할 때까지 70 ℃에 보관하였다.

실시예 7: 사이토카인 분석

TNF-α는 시판중인 ELISA 키트(Genzyme Diagnostics, 미국 매사추세츠주 캠브릿지)를 이용하여 측정하였다. 민감도의 한계값은 15 pg/mL이었다.

실시예 8: 혈장 아미노전이효소 활성 분석

혈장은 Con A 주사 후 다양한 시간에 개개의 랫트로부터 수득하였다. 혈장 아미노전이효소 활성은 이색발색 분석기(bichromatic analyzer)(호주 뉴캐슬, 존헌터 병원 생화학과)를 이용하여 표준 측광법으로 측정하였다.

실시예 9: 혈장 LPS 분석

랫트가 실험에 들어간 0 주(week 0), 40 %에탄올 소비 후 4 주 및 8 주째에 혈장을 수집하였다. LPS수준은 LAL(limulus amebocyte lysate)(Cape Cod Inc, Woods Hole, MA, 미국)분석법을 이용하여 측정하였다. 이 검사는 제조자가 제공한 지시사항에 따라 정확하게 수행하였다.

실시예 10: 간 병리학 및 면역 조직병리학

간을 10 % 포르말린으로 고정하고, 파라핀에 포매하고, 절편을 제작하고, 조직학 검사를 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. CD4⁺와 CD8⁺T 세포의 면역염색은 각각에 대한 마우스의 단클론 항체를 이용하여 수행하였다. 절편을 고추냉이 퍼옥시다제 토끼 항-마우스 면역글로불린으로 처리하여 배양하고, 아비딘-비오틴 키트(Zymed, 미국 캘리포니아주, 사우쓰 샌프란시스코)로 발색하였다. 모든 조직학 및 면역염색 절편은 검사한 동물의 상태를 알지 못하는 2 인이 검토하였다.

통계학적 분석

결과는 평균값 ±SE(표준오차)로 표시하였다. Student's test를 이용하여 통계학적 분석을 수행하였으며, 0.05 미만의 p 값을 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 11: 약초가 체중 증가, 간의 무게, 체중에 대한 간 무게의 비율, 및 Con A를 투여한 만성 에탄올 소비 랫트에서의 LPS수준에 미치는 효과

체중, 간의 무게 및 체중에 대한 간 무게의 비율의 데이타는 본 발명자의 에탄올을 먹인 랫트에서의 선행 연구의 것과 유사하였다. 간의 무게와 체중에 대한 간 무게의 비율이 약초로 치료한 후 Con A 투여한 에탄올을 먹인 랫트에서 감소하는 경향이 있지만 유의한 차이는 없었다(데이타는 제시하지 않음). 혈청 에탄올 수준은 알콜을 먹인 랫트에서 지속적으로 20 mmol/L 이상이었다. 혈청 LPS수준은 약초치료를 한 에탄올을 먹인 랫트와 비교해서, 약초치료를 하지 않은 에탄올을 먹인 랫트에서 유의하게 증가하였다(도 1).

실시예 12: 약초가 혈장 아미노전이효소 수준에 미치는 영향

Con A를 주사한 후, 혈장 아미노전이효소(ALT) 수준은 12 시간만에 뚜렷한 증가가 있슴을 확인할 수 있었는데, 위약 투여군의 경우는 24 시간(도 2)째에 최고 피크가 관찰되었다. 알콜을 먹인 랫트에서의 혈장 ALT 수준이 대조군의 그것보다 높았으나(p < 0.01), 2 % 수크로스와 등칼로리 수크로스 투여군 사이의 유의한 차이는 보이지 않았다. 반대로, ALT 수준은 약초 처리군에서 유의하게 낮았다(도 2)(p < 0.01).

실시예 13: 약초가 혈장 TNFα수준에 미치는 효과

약초 치료를 하지 않은 모든 Con A 처리군에서 Con A를 주사한 후 4 시간 째에 혈장 TNF-α수준의 갑작스런 증가가 관찰되엇다. 이는 24 시간 후에 기준점 수준까지 점진적으로 감소하였다(도 3). Con A를 단일 주사하고 혈장 TNF-α수준에서의 현저한 증가가 혈장 ALT수준에서의 증가보다 일찍 발견되었다. 알콜을 먹인 랫트에서의 TNF-α수준이 두개의 수크로스 대조군과 비교하여 높지만 두 대조군 사이의 유의한 차이는 없었다(도 3). 흥미롭게도, TNF-α수준이 Con A 처리 후 위약을 처리한 랫트보다 약초치료 랫트에서 유의하게 낮았다(도 3).

실시예 14: 간-관련 CD4 ⁺ T 세포의 배양액 중의 TNFα분비

도 4에서 보듯이, Con A가 자극한 간-관련 CD4⁺T 세포에 의한 TNF-α의 분비가 위약 처리군에서 Con A 주사한 후 24 시간 째에 현저하게 증가하였다. 간-관련 CD4⁺T 세포에 의한 TNF-α 생산은 위약 처리군에서 Con A 주사한 후 24 시간 째에 현저하게 증가하였다. Con A와 함께 배양된 간-관련 CD4⁺T 세포에 의한 TNF-α생산이 약초치료를 하지 않고 Con A 를 처리한, 에탄올에 노출된 랫트에서 현저하게 높았다. 반대로, CD4⁺T 림프구가 분비한 TNF-α수준이 Con A 주사 후 위약 처리군보다 약초 치료군에서 현저하게 낮았다.

실시예 15: 간 병리학 및 면역조직학

광학 현미경으로 다음에 따라 0 내지 4의 점수를 기록하고(괴사, 1, 2, 3 구역의 각각의 세포침윤, 및 지방 변화), 그 결과를 표 1에 요약하였다. Con A 투여 후 약초치료를 하지 않은 알콜을 먹인 랫트에서, 간 병리의 현저한 변화가 있었는데, 두개의 대조군과 비교하여 세포성 침윤을 동반한 간 세포의 괴사가 두드러졌다. 이는 주로 간문맥 부위, 중추정맥 주변 및 간소엽에 있는 단핵구 및 호중구로 구성되었다. 병소괴사 및 소엽 괴사는 괴사 영역 주변에서 발견되는 염증성 세포로 관찰된다. 병리학적 변화는 위약 처리군과 비교하여 약초 처리군에서 유의하게 감소하였다.

마우스 항 CD4⁺단클론 항체로 면역염색한 것은 두개의 대조군과 비교하였을 때 약초 치료를 하지 않은 에탄올을 먹인 랫트에서 Con A주사한 지 24 시간 후에 간문맥 및 중추 정맥 부위에서 더 많은 CD4⁺T 세포를 관찰하였다. 그러나, 약초치료 후에는, 에탄올을 먹인 랫트 및 두개의 대조군에서 더 적은 CD4⁺T 세포수를 확인하였다.

표 1: CH 100 또는 위약을 먹이고 표와 같이 처리한 동물의 간 병리학 결과

군	약초	위약
알콜+Con A n=17	1.7 + 0.9	7.2 + 2.7 p<0.000
등칼로리 + Con A n=4	31.9 + 0.6	5 p<0.44
2 % + Con A n=6	3.8 + 1.5	8.3 + 2.0 p<0.001
알콜 + PBS n=3	0	0
등칼로리 + PBS n=3	0	0
2 % + PBS n=3	0	0

실시예 16: 관심있는 화합물에 의한 알콜 간섭 회피

동물내 알콜의 존재는 간질환의 치료에 이로운 효과를 제공할 수 있는 특정 화합물의 효과를 간섭할 수 있다. 상기한 모델은 손상이 유도된 간에 T 세포를 전이시키는 것에 의존하기 때문에, 이는 그러한 화합물을 시험하는 기회를 제공한다. 상기한 대로 공여자 랫트에게 알콜과 T 세포 활성화제를 투여한다. 간내 T 세포를 제거하여, 본원에서 참고문헌으로 인용된 Cao 등이 개시한 바와 같이¹⁵수용자 랫트에게 주입한다. 수용자 랫트는 공여자의 세포를 주입받기 전 관심있는 화합물로 "초기감작(primed)" 되거나, 또는 세포를 받은 후 상기 화합물로 처리할 수 있다. 분석은 기술한 방식대로 수행한다. 결과적으로, 수용자 랫트에게 알콜 투여에 대한 필요성이 경감되고, 알콜과 관심있는 화합물 간의 간섭을 회피할 수 있다.

CH 100 약초 조성

약초 성분 mg(360 mg 테블릿에서 추출)

Artemisiafrigida(초본) 32

Saliva milnorrrhiza(뿌리) 32

Taraxacun mongolicum(초본) 28

Astragalua membranaccus 24

Loranthusparasiticus(줄기) 24

Paeconia lactiflora(뿌리) 24

Codonopsispilosula(뿌리) 20

Glecchoma longituba(초본) 20

Polygonum cuspidatum(뿌리) 20

Bupleurumfalcatum(뿌리) 16

Crataeguspinnatifida(열매) 16

Gentiana scabra(전체 열매) 16

Lycium babarum(열매) 16

Zizyphusjujuba(열매) 16

Curcuma longa(열매) 16

Glycyrrhiza uralensis(뿌리) 12

Polyporus umbelletus(뿌리) 18

Poria cocos(뿌리) 14

Pana-cpseudoginseng(뿌리) 4

독자가 본 발명을 부적당한 실험 없이 실시할 수 있도록 하기 위해 본 발명을 구체적인 실시예를 참조로 하여 본원에 기재하였다. 그러나, 당 분야의 통상의지식을 가진 자라면, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 특정 범위가지 많은 성분 및 변수를 변화시키거나 조정할 수 있으며, 본 발명은 다른 많은 형태로 실현될 수 있음을 쉽게 알 수 있을 것이다. 또한, 제목이나 서두는 독자가 본 명세서를 보다 잘 이해하도록 하기 위해 제시한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

마지막으로, 본문에서 특별히 언급하지 않은 한, 본 명세서 및 청구항에서 "포함하다(comprise)"라는 단어 및 "comprises"와 "comprising"과 같은 변형은 명시한 정수나 단계, 또는 정수나 단계들의 군을 포함하는 동시에 다른 정수 또는 단계, 또는 정수 또는 단계들의 군을 배제하지 않음을 양지해야 할 것이다.

참조문헌

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2. Roselle GA, Mendenhall CL, Chedid A, Moritz TE, Gartside P; The Veterans Affairs Cooperative Study Groups 119 and 275: Alcohol modulation of immune function: clinical and experimental data; Alcoholism, Clinical and Experimental Research 19(3): 551-554, 1995.

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7. Winnock M, Barcine MG, Lukomaska B, Huet S, Saric J, Balabaud C, Bioulac-Sage P: Human liver-associated lymphocytes: A review. J Gastroenterology and Hepatology 10: S43-S46, 1995.

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15. Cao Q, Batey R, Pang G and Clancy R(1991) Ethanol-modified T cell activation mediates liver injury in rats administered Con A. (in print)

Claims (28)

1. (a) 포유동물에게 간질환을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들을 투여하고;

   (b) 상기 포유 동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

   (c) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 간질환을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들이 알콜 및 조인자를 포함하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 조인자가 T 세포 활성화제인 방법.
4. (a) 포유동물에게 알콜을 투여하고;

   (b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

   (c) 상기 포유동물에게 간질환을 유도하는 것으로 알려진 제제를 투여하고;

   (d) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 조인자가 T 세포 활성화제인 방법.
6. 제 5 항에 있어서, T 세포 활성화제가 콘카나발린 A인 방법.
7. (a) 포유동물에게 T 세포 매개 간 손상을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들을 투여하고;

   (b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

   (c) 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, T 세포 매개 간 손상을 유도하는 것으로 알려진 약제 또는 약제들이 알콜 및 T 세포 활성화제를 포함하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, T 세포 활성화제가 콘카나발린 A인 방법.
10. (a) 포유동물에게 알콜을 투여하고;

    (b) 상기 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

    (c) 상기 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

    (d) 간질환의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
11. 제 10 항에 있어서, T 세포 활성화제가 콘카나발린 A인 방법.
12. (a) 공여자 포유동물에게 알콜을 투여하고;

    (b) 상기 공여자 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

    (c) 수용자 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

    (d) 상기 공여자 포유동물로부터 간내(intrahepatic)의 T 세포를 분리하여 상기 수용자에게 전이시키고;

    (e) 상기 수용자 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, T 세포 활성화제가 콘카나발린 A인 방법.
14. (a) 공여자 포유동물에게 알콜을 투여하고;

    (b) 상기 공여자 포유동물에게 T 세포 활성화 제제를 투여하고;

    (c) 상기 공여자 포유동물로부터 간내의 T 세포를 분리하여 수용자에게 전이시키고;

    (d) 상기 수용자 포유동물에게 잠재적인 치료용 화합물을 투여하고;

    (e) 상기 수용자 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 발병에 대한 상기 화합물의 효과를 선결한 기준과 비교하는 것을 포함하는 포유동물에서 T 세포 매개 간 손상의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 공여자로부터 T 세포를 전이시킨 후, 수용자 포유동물에게 T 세포 활성화제를 또한 투여하는 방법.
16. 제 14 항 또는 제 15 항의 어느 한 항에 있어서, T 세포 활성화제가 콘카나발린 A인 방법.
17. 제 2 항 내지 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 15 항의 어느 한 항에 있어서, 알콜은 물중 에탄올 용액으로 투여하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 용액이 2 내지 40 % 에탄올(v/v), 바람직하게는 5 내지 40 % 에탄올(v/v)인 방법.
19. 제 17 항에 있어서, 포유동물이 에탄올에 적응할 수 있는 충분한 기간 동안 에탄올의 농도를 증가시켜 공급하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 포유동물이 에탄올에 적응할 수 있는 충분한 기간 동안 알콜 농도가 물 중의 에탄올이 약 5 %(부피/부피) 내지 약 40 %까지의 범위인 방법.
21. 제 19 항 또는 제 20 항의 어느 한 항에 있어서, 에탄올에 적응할 수 있는 충분한 기간이 약 7 주인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 2 항, 제 6 항, 제 9 항, 제 11 항, 제 13 항 또는 제 16 항의 어느 한 항에 있어서, 콘카나발린 A를 체중 kg 당 1 내지 40 mg인 단일 투여량으로 투여하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 단일 투여량이 5 내지 30 mg/kg이고, 바람직하게는 20 mg/kg인 방법.
24. 제 1 항 내지 제 23 항의 어느 한 항의 방법을 이용하여 간질환의 예방적 또는 치료적 치료에 유용한 화합물을 동정할 때 사용된 포유동믈.
25. 제 1 항 내지 제 23 항의 어느 한 항의 방법으로 동정된 간질환의 치료에 유용한 치료용 화합물 또는 조성물.
26. 제 25 항에 있어서, 화합물이 알콜-유도 간염; 병원균-매개 간염; 및 자가면역성 간염으로부터 선택된, 간질환의 치료에 유용한 1 종 이상의 활성 성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 치료용 화합물:
27. 간질환, 바람직하게는 알콜-유도 간염의 치료에 있어서의 CH-100의 용도.
28. 간질환, 바람직하게는 알콜-유도 간염의 치료를 위한 의약 제조에 있어서의 CH-100의 용도.