KR20010112840A - Diagnostic system based on the pattern analysis of functional proteins - Google Patents
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Abstract
본 발명은 본 발명은 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 단백질의 전기영동에 의한 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템은 단백질을 전기영동하여 표적 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 분석하고, 이를 건강한 개체의 연령별 성별의 표준 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 데이터 베이스화한 자료와 비교한 후, 질병에 특이적인 표적단백질의 변화를 확인하고 분석하는 단계를 포함한다. 본 발명의 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템은 단백질 칩(protein chip), 신약개발 및 효과의 검증, 의약품·식품의 안정성의 측정 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a diagnostic system using pattern analysis of functional proteins by electrophoresis of proteins that can be usefully used for the diagnosis of diseases. The diagnostic system using the pattern analysis of the functional protein of the present invention electrophores the protein to analyze the pattern and peptide sequence of the target protein, and compare the data with the database of the pattern and peptide sequence of the standard protein of age and sex of healthy individuals And then identifying and analyzing changes in the target protein specific to the disease. The diagnostic system using the pattern analysis of the functional protein of the present invention will be useful for protein chip, new drug development and effect verification, measurement of the stability of medicines and foods.
Description
본 발명은 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 단백질의 전기영동에 의한 기능성 단백질의 패턴분석을 통하여 질환을 동정하는 진단 시스템에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic system using pattern analysis of functional proteins. More specifically, the present invention relates to a diagnostic system for identifying diseases through pattern analysis of functional proteins by electrophoresis of proteins that can be usefully used for the diagnosis of diseases.
현재 거의 완성단계에 있는 게놈 프로젝트에 근거하여, 유전자 수준에서 생리작용 및 질환을 이해하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들면, 일부의 질환은 유전자 수준에서 단일 염기쌍의 치환의 원인으로 발병하기도 하는데, 겸상빈혈증(sickle-cell anemia)은 베타-헤모글로빈의 6번 위치에서 글루타민산(Glu)이 발린(Val)으로 치환될 경우에 발병한다. 그러나, 최근에 전체 질환의 대부분은 유전자 수준에서 발병하는 것이 아니라 단백질의 이상으로 인하여 기인되며, 질환 중 유전병이 차지하는 비율은 2 내지 3%에 불과하다는 것이 알려졌다. 게다가, 하나의 유전자가 번역후 수식(post-translational modification) 과정을 통하여 많은 폴리펩타이드를 만들어내고 있음이 알려짐에 따라, 유전자 수준의 DNA 또는 RNA와는 달리 단백질이 생리적인 상태를 표현하고 조절하는 최종물질이고, 대부분의 경우 단백질은 번역 그 자체보다 번역후 수식된 산물이 중요함이 밝혀졌다.Based on the genome project, which is nearing completion, studies are underway to understand physiology and disease at the genetic level. For example, some diseases are caused by substitution of a single base pair at the genetic level. Sickle-cell anemia is replaced by glutamic acid (Vlu) with valine at position 6 of beta-hemoglobin. Onset if possible. Recently, however, it has been found that most of the whole diseases are caused by abnormalities of proteins rather than onset at the genetic level, and the proportion of genetic diseases among diseases is only 2 to 3%. In addition, as one gene is known to produce many polypeptides through post-translational modification, the final material that expresses and regulates the physiological state of the protein, unlike gene-level DNA or RNA. In most cases, it has been found that proteins are more important to post-translationally modified products than to translation itself.
이에 따라, 현재까지 표적 유전자(marker DNA)를 탐색하여 질환과의 상관관계를 밝히려는 게노믹스(genomics) 기술은 세포내의 단백질의 기능, 내인적 또는 외인적 요소에 의한 세포의 변화에 따른 단백질 및 생리작용의 변화를 밝힐 수 없으며, 단백질 기능의 변화에 의하여 유발되는 질환을 진단하거나 치료할 수 없다는 단점이 노출되어 왔다.Accordingly, genomics technology to search for marker DNA and to correlate with disease is based on protein function and physiology due to changes in cells caused by the function of proteins in the cell, endogenous or exogenous factors. The disadvantages of not revealing changes in action and of not being able to diagnose or treat diseases caused by changes in protein function have been exposed.
따라서, 질환의 진단 및 치료를 위하여 단백질의 기능을 체계화하고, 이를 이용하여 단백질의 이상을 효과적으로 측정할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.Therefore, the necessity of developing a method for systematically measuring the function of proteins for the diagnosis and treatment of diseases and using them to effectively measure the abnormalities of proteins is emerging.
이에, 본 발명자들은 질환의 진단 및 치료를 위하여 단백질의 기능을 체계화하고 이를 이용하여 단백질의 이상을 효과적으로 측정할 수 있는 방법을 개발하고자 끊임없이 예의 노력연구한 결과, 인체 단백질의 전기영동에 의한 기능성 단백질의 패턴분석을 이용하여 진단 시스템을 구축함으로써 질환의 예방, 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have continually studied to develop a method for systematically measuring the function of proteins for the diagnosis and treatment of diseases and using the same to effectively measure protein abnormalities. By establishing a diagnostic system using a pattern analysis of the confirmation that it can be usefully used for the prevention, diagnosis and treatment of diseases, the present invention was completed.
결국, 본 발명의 주된 목적은 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템을 제공하는 것이다.After all, the main object of the present invention is to provide a diagnostic system using pattern analysis of functional proteins.
도 1은 정상인과 류마티스 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.Figure 1 is a photograph showing the results of electrophoresis of plasma proteins in normal people and rheumatic patients.
도 2는 정상인과 루퍼스 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.Figure 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of plasma proteins in normal people and lupus patients.
도 3a는 정상인의 혈장 단백질의 전기영동 결과이다.Figure 3a is the result of electrophoresis of plasma proteins in normal people.
도 3b는 베쳇씨 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과이다.Figure 3b is the result of electrophoresis of the plasma protein of Bennett patients.
도 4는 정상인의 위조직 단백질과 위암조직의 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.Figure 4 is a photograph showing the results of electrophoresis of gastric tissue protein and gastric cancer tissue protein of normal people.
본 발명의 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템은 분리된 단백질을 전기영동하여 표적 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 분석하고, 이를 건강한 개체의 연령별 성별의 표준 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 데이터 베이스화한 자료와 비교한 후, 질병에 특이적인 표적단백질의 변화를 확인하고 분석하는 단계를 포함한다: 이때, 단백질은 혈청, 뇨 등의 체액 및 조직으로부터 수득될 수 있으며, 전기영동은 양성전해질을 사용하는 IEF(ampholyte-based isoelectric focusing) 또는 IPG 스트립(immobilized pH gradient strip) IEF 등의 2차원적 전기영동의 방법으로 수행하고, 표적단백질의 패턴분석은 면역블랏팅 또는 염색으로 수행되어 분석된다. 이때, 단백질의 염색은 은염색, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색, 콜로디알 염색(collodial stain) 등의 염색방법 및 면역블랏팅(immunoblotting) 등의 당업계에 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.The diagnostic system using the pattern analysis of the functional protein of the present invention electrophores the isolated protein to analyze the pattern and peptide sequence of the target protein, and the data that the database of the pattern and peptide sequence of the standard protein of age and sex of healthy individuals And then identifying and analyzing changes in the target protein specific to the disease, wherein the protein can be obtained from body fluids and tissues, such as serum, urine, and the like, and electrophoresis is IEF using a positive electrolyte. (ampholyte-based isoelectric focusing) or IPG strips (immobilized pH gradient strip) by means of two-dimensional electrophoresis, such as IEF, the pattern analysis of the target protein is analyzed by immunoblotting or staining. At this time, the staining of the protein may be performed by a method commonly known in the art such as silver staining, Coomassie Brilliant Blue staining, collodial staining and the like and immunoblotting.
전기 패턴으로 나타나는 표적단백질은 바람직하게는 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization combined with time-of-flight) 질량분석기(mass spectrometry)를 사용하여 단백질의 변화를 분석할 수 있으며, 그 외에도 ESI(electrospray ionization) 질량분석기로도 분석할 수 있다. 상술한 질량분석기들 사용하면, 측정범위 50pmol 내지 100pmol에서 2차원적 겔에서 낮은 강도의 점으로도 측정이 가능할 뿐만 아니라 단백질의 번역후 수식이 분석가능하다.Target proteins represented by electrical patterns can preferably be analyzed for protein changes using a matrix-assisted laser desorption / ionization combined with time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry, in addition to ESI (electrospray ionization) can also be analyzed by mass spectrometry. Using the above-described mass spectrometers, not only the low intensity point in the two-dimensional gel in the measurement range 50pmol to 100pmol can be measured, but also post-translational modification of the protein can be analyzed.
한편, 2차원적 전기영동(2-dimensional electrophoresis, 이하 '2-DE'라 함)에 사용되는 단백질 시료는 전기영동을 수행하는 대신, HPLC를 통하여 추가로 분석되어 펩티드 서열의 정보를 얻을 수 있다. 이때, 펩티드 서열은 에드만 분해법(Edman degradation), post-sucrose-decay MALDI-MS에 의하여 분석될 수 있으며, ESI 질량분석기에서 절단화(fragmentation)를 통해서도 분석될 수 있다.Meanwhile, protein samples used for 2-dimensional electrophoresis (hereinafter referred to as '2-DE') may be further analyzed through HPLC to obtain peptide sequence information instead of performing electrophoresis. . In this case, the peptide sequence may be analyzed by Edman degradation, post-sucrose-decay MALDI-MS, and may also be analyzed by fragmentation in an ESI mass spectrometer.
MALDI 분석을 수행하는 경우에 있어서, 우선, 겔 상에서 쿠마시 G250(Coommassie G250)를 사용하여 염색된 점으로 나타나는 조각에서 색소를 제거하기 위하여, 50%(v/v)의 아세토니트릴, pH 7.8의 25mM NH4HCO3를 포함하는 탈염색 완충액을 사용하고, 겔 조각을 진공건조기에서 건조시킨 후, pH 7.8의 25mM NH4HCO3에 용해시킨 다음, 분석등급의 트립신(sequencing grade trypsin) 및 초음파처리를 수행하여, MALDI 판(Micromass TOF-SPEC)에 시료를 넣고, 70%(v/v) 아세토니트릴에 용해된 알파-시아노-4-하이드록시나민산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 10㎎/㎖, 1%(v/v) TFA가 포함된 매트릭스 용액을 첨가하여, 공기중에서 건조시킨 다음 MALDI-TOF로 분석하게 된다.In the case of performing MALDI analysis, first, in order to remove the pigment from the fragments that appear as stained points using Coomassie G250 on the gel, 50% (v / v) of acetonitrile, pH 7.8 Destaining buffer containing 25 mM NH 4 HCO 3 was used, the gel pieces were dried in a vacuum dryer, dissolved in 25 mM NH 4 HCO 3 at pH 7.8, followed by sequencing grade trypsin and sonication. The sample was placed in a MALDI plate (Micromass TOF-SPEC), and alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid dissolved in 70% (v / v) acetonitrile. A matrix solution containing 10 mg / ml, 1% (v / v) TFA was added, dried in air and analyzed by MALDI-TOF.
아울러, 겔 상에서 특징적으로 나타나는 단백질의 N-말단 분석에 있어서, 우선, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 2-DE의 겔로부터 단백질을 전기영동으로 이동시키고, 멤브레인을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색할 수 있으며, 염색된 단백질 부분을 정확히 절단한 후에, 단백질 분석기(protein sequencer, Applied Biosystems Inc., U.S.A.)로 단백질의 분석이 가능하다. 전기의 방법으로 분석된 펩티드 서열과 2차원적 전기영동의 결과 나타난 표적단백질의 패턴분석을 종합하여 데이타베이스를 구축할 수 있다.In addition, in the N-terminal analysis of the protein characteristically shown on the gel, first, the protein can be electrophoretically transferred from a 2-DE gel to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane, and the membrane can be stained with Coomassie Brilliant Blue. After accurate cleavage of the stained protein, the protein sequencer (Applied Biosystems Inc., USA) can analyze the protein. The database can be constructed by combining the peptide sequence analyzed by the foregoing method and the pattern analysis of the target protein resulting from the two-dimensional electrophoresis.
본 발명에 의하면, 암 환자를 비롯한 각종 질환자의 혈청, 뇨 등의 체액이나 조직으로 부터 수득한 단백질의 패턴분석에 의하여 질환의 진단, 예후, 치료 및 미래 발병 시기까지도 예측할 수 있으므로, 신약의 개발 및 의약품·식품의 안정성 검사에 널리 활용될 수 있을 것이다.According to the present invention, it is possible to predict the diagnosis, prognosis, treatment, and future onset time of the disease by analyzing patterns of proteins obtained from body fluids and tissues such as serum and urine of various disease patients including cancer patients. It can be widely used to test the stability of medicines and foods.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1: 혈장 단백질의 패턴분석 및 질환에 특징적인 단백질의 분석 Example 1 Pattern Analysis of Plasma Proteins and Analysis of Proteins Specific to Disease
실시예 1-1: 혈장 단백질 시료 준비 Example 1-1 Preparation of Plasma Protein Samples
연령별로 20대, 30대, 40대, 50대 및 60대 남녀 각각 20명씩 총 200인의 혈장시료, 류마치스성 피부 질환환자 5명의 혈장시료, 루퍼스 환자 5명의 혈장시료, 난치성 피부질환의 일종인 베쳇씨 질환(Behcet's disease)을 가진 환자 20명의 혈장시료 각각 3㎕를 10% SDS, 2.3%(w/v) DTT(dithiothreitol)가 포함된 세포용해완충액(cell lysis buffer) 50㎕와 혼합한 후, 95℃에서 5분간 가열하였다. 전기 혼합액 53㎕를 9M 유레아(urea), 5% CHAPS, 35mM Tris, 65mM DTT, 0.5%(w/v) 양성전해질(ampholyte), 0.002%(w/v) 브로모페놀 블루가 포함된 시료완충액 500㎕를 첨가하여 희석하였다. 이어, 30℃에서 1시간동안 방치하고 13,000rpm으로 15분간 원심분리한 후, IEF(isoelectric focusing) 분석에 사용하기 위하여 상층액 500㎕를 취하였다.Age 20, 20, 30, 40, 50, 60 and 20 men and women, 200 plasma samples, 5 plasma samples for rheumatoid skin diseases, 5 plasma samples for lupus patients, and a type of refractory skin disease. After mixing 3 μl of each 20 plasma samples of 20 patients with Behcet's disease with 50 μl of cell lysis buffer containing 10% SDS, 2.3% (w / v) dithiothreitol, Heated at 95 ° C. for 5 minutes. 53 μl of the electric mixture was added to the sample buffer containing 9M urea, 5% CHAPS, 35mM Tris, 65mM DTT, 0.5% (w / v) amphoteric, and 0.002% (w / v) bromophenol blue. 500 μl was added and diluted. Subsequently, the mixture was left at 30 ° C. for 1 hour, centrifuged at 13,000 rpm for 15 minutes, and 500 μl of supernatant was taken for use in IEF (isoelectric focusing) analysis.
실시예 1-2: IEF 및 SDS-PAGE Example 1-2 : IEF and SDS-PAGE
전기 수득한 각 시료의 상층액을 12시간 재수화(rehydration)시키고,Multiphor-Ⅱ(Amersham Pharmacia Biotech, Sweden) 상에서 18㎝의 pH 3-10NL IPG 스트립(IPG strip, immobilized pH gradient strip, Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)을 사용하여 150V로 1시간, 300V에서 1시간, 600V에서 1시간 및 3500V에서 20시간 동안 순차적으로 IEF(isoelectric focusing)를 수행하였다. 그런 다음, 각 시료의 IPG 스트립을 6M의 유레아, 2%(w/v) SDS, 1.875M 트리스, 20%(v/v)의 글리세롤, 5mM의 TBP 및 2.5%(w/v)의 아크릴아마이드로 구성된 용액에서 15분간 평형(equilibration)시킨 후, IPG 스트립을 20%(w/v)의 20 ×20 ×1.0㎝의 겔을 사용하여, 각각 10℃에서 30㎃로 5시간 동안 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 각각의 겔을 40%(v/v) 메탄올 수용액 상에서 5분동안 2회 세척한 후, 10%(v/v) 아세트산 및 4.5%(w/v) 소디움 아세테이트가 포함된 고정 용액(fixer)에서 30분 내지 1시간 고정시켰다. 이어, 30%(v/v) 메탄올 및 0.5%(w/v) 글루타르알데히드를 포함하는 고정 용액에서 1시간 동안 고정시킨 후, 암모니아 수용액상에서 15분간 세척하는 과정을 4회 수행하고, 점(spot)의 다양한 패턴으로 나타나는 표적단백질을 분석하였다.The supernatant of each sample obtained above was rehydrated for 12 hours, and 18 cm pH 3-10NL IPG strip (IPG strip, immobilized pH gradient strip, Amersham Pharmacia Biotech) on Multiphor-II (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). , Sweden) was sequentially performed for 1 hour at 150V, 1 hour at 300V, 1 hour at 600V and 20 hours at 3500V. The IPG strip of each sample was then subjected to 6M urea, 2% (w / v) SDS, 1.875M Tris, 20% (v / v) glycerol, 5 mM TBP and 2.5% (w / v) acrylamide After 15 minutes equilibration in a solution consisting of, IPG strips were electrophoresed for 5 hours at 10 DEG C. at 30 DEG C. using 20% (w / v) of 20 x 20 x 1.0 cm gel. After each electrophoresis gel was washed twice for 5 minutes in 40% (v / v) methanol aqueous solution, a fixed solution containing 10% (v / v) acetic acid and 4.5% (w / v) sodium acetate Fix in 30 minutes to 1 hour in the (fixer). Then, after fixing for 1 hour in a fixed solution containing 30% (v / v) methanol and 0.5% (w / v) glutaraldehyde, the process of washing for 15 minutes in an aqueous ammonia solution was carried out four times, Target proteins appearing in various patterns of spots were analyzed.
실시예 1-3: 류마티스 환자 검체의 혈장 단백질 분석 Example 1-3 Plasma Protein Analysis of Rheumatic Patient Samples
도 1은 정상인과 류마티스 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 1에서 보듯이, 류마티스환자 5명의 검체 모두에서 일반적인 검체 에서 볼 수 없었던 특이한 단백질 점(spot)인 "RM1"을 pI 5.5, 분자량 37kDa 위치에서 발견할 수 있었다. 이 단백질 점은 정상인과 다른 질환환자에서는 보이지않고 류마치스성 피부질환 환자에서만 특이하게 나타나므로, 혈장 단백질을 분석할 경우 "RM1"의 유무로 류마티스 질환을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.Figure 1 is a photograph showing the results of electrophoresis of plasma proteins in normal people and rheumatic patients. As shown in FIG. 1, in all five specimens of rheumatoid patients, "RM1", a unique protein spot that was not found in the general specimen, was found at the pI 5.5 and molecular weight of 37 kDa. This protein point is not seen in normal patients and other disease patients, and it is unique only in patients with rheumatic skin disease. Therefore, it can be seen that rheumatoid disease can be determined by analyzing the presence or absence of "RM1".
실시예 1-4: 루퍼스 환자 검체의 혈장 단백질 분석 Example 1-4 Plasma Protein Analysis of Rufus Patient Samples
도 2는 정상인과 루퍼스 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 루퍼스환자 5명의 검체 모두에서 특이한 단백질 점(spot)인 "R1"을 pI 5.6, 분자량 49kDa 위치에서 발견할 수 있었다. 이 단백질 점은 루퍼스 환자의 혈장 단백질의 경우, 정상인의 혈장 단백질에서 관찰되는 "R1"위치로부터 이동된 위치인 "R1'"에서 관찰됨을 알 수 있으므로, 혈장 단백질을 분석할 경우 "R1"의 위치변화를 관찰하여 루퍼스 질환을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.Figure 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of plasma proteins in normal people and lupus patients. As shown in FIG. 2, a specific protein spot “R1” was found at all of the five Rufus patients at a pH of 5.6 and a molecular weight of 49 kDa. This protein point is found in the "R1" position, which is a position shifted from the "R1" position in the plasma protein of the lupus patient, and thus the position of the "R1" position when the plasma protein is analyzed. Observation of the change showed that rufus disease could be judged.
실시예 1-5: 베쳇씨 환자의 혈장 단백질 패턴 분석 Example 1-5 Plasma Protein Pattern Analysis of Bennett Patients
도 3a는 정상인의 혈장 단백질의 전기영동 결과이고, 도 3b는 베쳇씨 환자의 혈장 단백질의 전기영동 결과이다. 도 3a 및 도 3b를 비교하면, 모든 베쳇씨 환자의 혈장 단백질에서는 정상인에서는 찾을 수 없는 특이한 단백질 점(spot)인 "B1"을 pI 4.6, 분자량 14kDa 위치에서 발견할 수 있었다. 이 단백질 점은 정상인, 류마치스 환자 및 루퍼스 환자의 혈장 단백질에서는 전혀 보이지 않고, 베쳇씨 환자에서만 특이하게 나타나므로, 혈장 단백질을 분석할 경우 "B1"의 유무로 베쳇씨 질환을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.Figure 3a is a result of the electrophoresis of the plasma protein of the normal person, Figure 3b is a result of the electrophoresis of the plasma protein of the Benson patient. Comparing FIGS. 3A and 3B, a specific protein spot "B1", which is not found in normal people in plasma proteins of all Benesic patients, could be found at pI 4.6 and molecular weight 14kDa. These protein points are not seen at all in the plasma proteins of normal, rheumatoid and lupus patients, and are specific to Benesit's patients, indicating that the analysis of plasma proteins can determine the presence of "B1" disease. Could.
이처럼 나타나는 B1을 동정하기 위하여, 베쳇씨 환자 혈장을 2차 전기 영동한 겔로부터 B1부분을 절취하여(1mm X 1mm), 탈색용액(100mM Tris-HCl, 50%(v/v) acetonitrile, pH 8.5) 200ul와 혼합한 다음, 37℃에서 30분간 진탕시키고, 4000rpm으로 15분간 원심분리하여 침전물을 수득한 후, 이를 건조시켰다. 이어, 단백질 분해용액(100mM Tris-HCl, pH 8.5, 100unit trypsin) 8ul를 첨가하고, 37℃에서 16시간 동안 진탕시키며 재수화한 다음, 추출용액(50%(v/v) acetonitrile, 20%(v/v)trifluoroacetic acid) 8ul를 첨가하고, 10분간 초음파분쇄(sonication)하였다. 이로부터, 시료 1ul를 취하여 MALDI 플레이트(micromass, UK)에 넣고, 메트릭스(matrix) 용액(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid 10mg/ml in 50%(v/v) acetonitrile, 0.1% TFA) 1ul를 첨가하여 혼합한 다음, 30분간 건조시켜 시료를 준비하였다. 이를 MALDI-TOF(Micromass, UK)로 분석하여 트립신으로 분해된 펩타이드 분자량을 알아내고, 분석 프로그램인 Msfit를 사용하여, 데이터 베이스에서 관계되는 단백질을 검색하였다. 그 결과, B1은 아포프로틴 A-1(apoprotein A-1)의 d아미노산 서열을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.In order to identify this B1, the B1 part was cut from the gel electrophoresis (1mm X 1mm) of the Bessier's plasma, and the decolorizing solution (100 mM Tris-HCl, 50% (v / v) acetonitrile, pH 8.5 ) Was mixed with 200ul and then shaken at 37 ° C for 30 minutes and centrifuged at 4000rpm for 15 minutes to obtain a precipitate, which was then dried. Then, 8 μl of protein degradation solution (100 mM Tris-HCl, pH 8.5, 100 unit trypsin) was added, shaken and rehydrated at 37 ° C. for 16 hours, followed by extraction solution (50% (v / v) acetonitrile, 20% ( 8 ul of v / v) trifluoroacetic acid) was added and sonicated for 10 minutes. From this, 1 ul of sample was taken and placed in a MALDI plate (micromass, UK), and 1 ul of a matrix solution (a-cyano-4-hydroxycinnamic acid 10 mg / ml in 50% (v / v) acetonitrile, 0.1% TFA) was added. Samples were prepared by adding and mixing and then drying for 30 minutes. This was analyzed by MALDI-TOF (Micromass, UK) to determine the molecular weight of the trypsin digested peptide, and searched for related proteins in the database using the analysis program Msfit. As a result, it was confirmed that B1 has the damino acid sequence of apoprotein A-1.
실시예 2: 위 조직 단백질의 패턴분석 및 질환에 특징적인 단백질의 분석 Example 2 Pattern Analysis of Gastric Tissue Proteins and Analysis of Proteins Specific to Disease
위암조직 100개 검체와 정상인의 위 조직 100개 검체로 부터 각각 100mg의 시료를 채취하고, 이들을 각각 SDS/DTT 분해완충용액(0.2M PMSF 10㎕/buffer 1㎖:10%(w/v) SDS, 2.3%(w/v) DTT(dithiothreitol)) 100㎕과 혼합하여 현탁시킨 후, 500㎕의 샘플완충용액(0.2M PMSF 10㎕, DTT stock 20㎕/buffer 1 ㎖:7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40mM Tris, 2mM TBP(TriButylPhosphine))을 첨가하고, 균질화시켰다. 이어, 48,000rpm, 4℃에서 30분 동안 원심분리하여, 상층액을 회수하고, 단백질을 정량하였다. 상층액 단백질 200ug에 샘플완충용액을 첨가하여 440ul의 부피로 맞춘 후, 엔도뉴클라제(endonuclease) 150unit을 첨가하고, 30℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어, 양성전해질(ampholyte)를 최종 농도 2%(w/v)가 되도록 첨가하고, 브로모페놀 블루가 0.002%(w/v)가 되도록 첨가한 후, 이를 실시예 1-2의 방법으로 2차원 전기영동한 다음, 정상인의 위조직 단백질과 위암조직의 단백질을 비교 분석하였다(참조: 도 4).100 mg samples were taken from 100 gastric cancer tissues and 100 gastric tissues of normal individuals, respectively, and these were respectively analyzed by SDS / DTT digestion buffer solution (0.2M PMSF 10µl / buffer 1ml: 10% (w / v) SDS). And suspended with 100 μl of 2.3% (w / v) dithiothreitol (DTT), followed by 500 μl of sample buffer solution (10 μl 0.2 M PMSF, 20 μl DTT stock 1 ml: 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM Tris, 2 mM TBP (TriButylPhosphine) was added and homogenized. Subsequently, the mixture was centrifuged at 48,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant, and the protein was quantified. After adding the sample buffer solution to 200 ug of the supernatant protein to a volume of 440 ul, 150 units of endonuclease was added and reacted at 30 ° C. for 1 hour. Subsequently, ampholyte was added to a final concentration of 2% (w / v) and bromophenol blue was added to 0.002% (w / v), followed by the method of Example 1-2. After dimensional electrophoresis, the protein of the stomach tissue and gastric cancer tissue of the normal person was analyzed (see Figure 4).
도 4는 정상인의 위조직 단백질과 위암조직의 단백질의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서 보듯이, 정상인의 위조직에서는 단백질 점(spot)인 "SN9"과 "SN10"을 pI 6.6 내지 7.5, 분자량 22kDa 위치에서 발견할 수 있었으나, 위암조직의 단백질에서는 "SN9"과 "SN10"을 찾을 수 없었다. 이 단백질 점은 정상인의 위조직에서는 항상 관찰되나, 위암조직의 단백질에서는 전혀 보이지 않으므로, 단백질을 분석할 경우 "SN9"과 "SN10"의 유무로 위암을 판단할 수 있음을 알 수 있었다.Figure 4 is a photograph showing the results of electrophoresis of gastric tissue protein and gastric cancer tissue protein of normal people. As shown in FIG. 4, the protein spots "SN9" and "SN10" were found at pI 6.6 to 7.5 and molecular weight of 22 kDa in normal gastric tissue, but in the stomach cancer tissue, "SN9" and "SN10". "I could not find. This protein point is always observed in normal human gastric tissue, but is not visible in gastric cancer tissue protein. Therefore, it can be seen that gastric cancer can be determined by the presence or absence of "SN9" and "SN10".
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 질환의 진단에 유용하게 사용될 수 있는 단백질의 전기영동에 의한 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템을 제공한다. 본 발명의 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템은 단백질을 전기영동하여 표적 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 분석하고, 이를 건강한 남녀의 연령별 성별의 표준 단백질의 패턴 및 펩티드 서열을 데이터 베이스화한 자료와 비교한 후, 각종 질병에 특이적인 표적단백질의 변화를 확인하고 분석하는 단계를 포함한다. 본 발명의 기능성 단백질의 패턴분석을 이용한 진단 시스템은 단백질 칩(protein chip), 신약개발 및 효과의 검증, 의약품·식품의 안정성의 측정 등에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.As described and demonstrated in detail above, the present invention provides a diagnostic system using pattern analysis of functional proteins by electrophoresis of proteins that can be usefully used for the diagnosis of diseases. The diagnostic system using the pattern analysis of the functional protein of the present invention electrophores the protein to analyze the pattern and peptide sequence of the target protein, and compare it with data obtained by the database of the pattern and peptide sequence of the standard protein of age and sex of healthy men and women After that, the method includes identifying and analyzing changes in target proteins specific to various diseases. The diagnostic system using the pattern analysis of the functional protein of the present invention will be useful for protein chip, new drug development and effect verification, measurement of the stability of medicines and foods.
Claims (6)
Applications Claiming Priority (2)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR0161256B1 (en) * | 1995-10-25 | 1999-03-30 | 카렌 에이. 함린 | A screening method for identifying ligands for target proteins |
| KR20000052802A (en) * | 1996-10-25 | 2000-08-25 | 모세 라르센 페터 | Proteome analysis for characterization of up- and down-regulated proteins in biological samples |
| KR20010041135A (en) * | 1998-02-20 | 2001-05-15 | 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 | Assay for specific strains of multiple disease related conformations of a protein |
-
2001
- 2001-06-13 KR KR1020010033080A patent/KR20010112840A/en not_active Application Discontinuation
Patent Citations (3)
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