KR20010111986A - Novel streptomyces sp. wl-2 strain producing xylanase - Google Patents

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Abstract

본 발명은 자일라나제(xylanase)를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 WL-2 (Streptomycessp. WL-2) 균주와 이 균주가 생산하는 중성 자일라나제에 관한 것으로 본 발명은 토양으로부터 헤미셀룰로즈 분해능이 우수한 스트렙토마이세스 속 균주를 분리하고 동정하여 스트렙토마이세스 속 WL-2 (Streptomycessp. WL-2) KCTC 0801BP 균주로 명명하고 이 균주를 알파-셀룰로즈와 엿당 또는 귀리 자일란과 엿당이 함유된 배지내에서 배양하여 소맥 자일란의 분해에 적합하고 산성 자일라나제 대체 용도로 동물의 장내와 가까운 중성에서 반응성이 높은 사료첨가용 효소로 사용되는 자일라나제를 대량으로 생산하는 뛰어난 효과가 있다.The present invention relates to a novel Streptomyces sp. WL-2 strain that produces xylanase and neutral xylanase produced by the strain, and the present invention relates to hemicellulose from soil. Streptomyces sp. WL-2 ( Streptomyces sp. WL-2) KCTC 0801BP strain was isolated and identified as a bacterium of high resolution, and was identified as alpha-cellulose and maltose or oat xylan and maltose. It is excellent in producing large amount of xylanase, which is suitable for the degradation of wheat xylan by culturing in the medium and used as a feed additive enzyme in a neutral to near-intestinal neutrality, which is suitable for the degradation of wheat xylan.

Description

자일라나제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주{Novel Streptomyces sp. WL-2 strain producing xylanase}Novel Streptomyces sp. Novel Streptomyces sp. WL-2 strain producing xylanase}

본 발명은 자일라나제(xylanase)를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 ＷＬ-2 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 속 균주를 토양에서 분리, 동정하고 이를 배양하여 중성에서 활성이 높은 단위 동물의 사료첨가용 자일라나제(xylanase)의 생산에 관한 것이다.The present invention relates to a novel Streptomyces genus VL-2 strain producing xylanase. More specifically, the present invention relates to the production of xylanase for feed addition of a unit animal having high neutral to high activity by isolating, identifying and culturing a novel Streptomyces sp.

미생물이 생산하는 다양한 효소중에서 자일라나제는 현재 그 이용성이 매우 높으며 앞으로도 그 용도로 다양하게 개발될 것으로 기대되는 효소이다. 이 효소의 이용 가능성 중 가장 중요한 것은 지구상에서 가장 풍부하며 태양에너지에 의해 재생가능한 생물자원인 식물성 섬유물질을 분해하고 당화하여 에너지 자원화하는 것인데 이는 향후 더 많은 연구가 있어야만 실용화가 가능한 분야이고, 현재 실용화되고 있는 것들로는 고급용지의 생산 및 폐지재생, 과일음료 및 맥주의 혼탁물 제거, 커피와 식물성 기름 및 전분의 추출 그리고 본 발명에서 주로 언급하게 될 단위동물의 사료이용율 증대 등과 같은 산업적 응용을 들 수 있다.Among the various enzymes produced by microorganisms, xylanase is an enzyme that is highly available at present and is expected to be developed for various purposes in the future. The most important use of this enzyme is to decompose and glycate vegetable fiber material, the most abundant and renewable energy resource on the planet, which is renewable energy by solar energy. These include industrial applications such as production and recycling of high-quality paper, removal of turbidity from fruit drinks and beer, extraction of coffee and vegetable oils and starches, and increased feed utilization of unit animals, which will be mentioned mainly in the present invention. Can be.

최근들어 사료첨가용 효소로서 자일라나제의 유용성이 증대되고 있다. 주로 동물의 에너지 대사에 필요한 탄수화물과 소량의 단백질을 공급하는 사료용 곡물에는 대부분의 단위동물이 이용하지 못하는 섬유질을 함유하고 있다. 곡물중의 식이섬유는 비전분성 다당류와 리그닌으로 구성되며 식물의 세포벽을 구성하는 성분으로 식물의 세포벽은 세포의 제일 바깥쪽의 셀룰로즈 층과 그 내부의 알곡 전체를 감싸는 헤미셀룰로즈 및 베타-글루칸으로 구성된 비전분성 다당류와 리그닌이 합쳐져서 이루어진다. 이 비전분성 다당류는 가축의 소화효소에 의해 분해되지도 않을 뿐만 아니라 곡물중의 전분이나 단백질을 감싸고 있기 때문에 가축이 영양소를 이용하는 효율을 떨어뜨리고 있다. 또한 소장에서는 비전분성 다당류가 걸쭉한 겔 상태로 끈적끈적하게 녹아 있어 그나마 소화효소가 영양소로 접근하는 것을 방해하고 소화관내 소화물의 흐름을 저해한다. 이에 따라 미생물이 소화물에 부착하여 이상발효를 일으켜 영양분의 손실을 가져오게 된다.Recently, the usefulness of xylanase as an enzyme for feed addition is increasing. Feed grains, which primarily provide carbohydrates and small amounts of protein for animal metabolism, contain fiber that is not available to most animal units. Dietary fiber in cereals is composed of non-starch polysaccharides and lignin and constitutes the cell wall of the plant. The cell wall of the plant is composed of hemicellulose and beta-glucans covering the entire outer layer of cellulose and the whole grains inside the cells. It is a combination of non-starch polysaccharides and lignin. Not only are these non-starch polysaccharides degraded by livestock digestive enzymes, but they also cover starches and proteins in grains, making them less efficient at using nutrients. In addition, in the small intestine, non-starchy polysaccharides are thickly dissolved in a thick gel, which prevents digestive enzymes from accessing nutrients and inhibits digestion in the digestive tract. As a result, microorganisms adhere to the digestion, causing abnormal fermentation, resulting in loss of nutrients.

자일라나제(xylanase)를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로즈 층을 가수분해하여 알곡내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태가 개선될 수 있다. 특히 헤미셀룰로즈 함량이 높은 소맥제품을 사료로 사용할 경우 가축에 연변이나 적리 현상이 일어나기 쉬운데 자일라나제는 이러한 현상을 예방할 수 있고 사료적 가치를 올려줄 뿐만 아니라 소맥제품의 품질의 편차를 개선하여 소맥제품을 안정적인 사료원료로 사용할 수 있게 하여 사료첨가용 효소로 그 가치가 높다. 따라서 자일라나제는 돼지와 닭과 같은 단위동물의 사료 첨가용 효소로 매우 중요하게 취급되고 있는데, 최근 선진국뿐 아니라 생활환경과 소득이 개선된 많은 국가의 국민들이 육류의 소비가 늘고 있어 가축사육을 위한 사료자원의 다양화와 사료효율의 개선은 매우 중요하게 다루어지게 되었다.The addition of xylanase to the grain feed can hydrolyze the hemicellulose layer surrounding the grains, thereby increasing the availability of nutrients in the grains and improving the condition of the intestinal digest of livestock. In particular, when the wheat products with high hemicellulose content are used as feed, it is easy to cause stool or reddening in livestock. The product can be used as a stable feedstock and its value as a feed additive enzyme. Therefore, xylanase is considered to be an important enzyme for the addition of unit animals such as pigs and chickens. Recently, not only developed countries, but also people of many countries with improved living conditions and incomes are raising the consumption of livestock and raising livestock. Diversification of feed stocks and improvement of feed efficiency became very important.

사료첨가용 자일라나제의 생산에 사용되고 있는 미생물은 곰팡이를 들 수 있으며 곰팡이 중에서도 트리코더마 (Trichoderma) 속 균주들이 주로 이용되는데 이들의 효소 생산성은 자일라나제를 생산하는 세균의 효소 생산성에 비해 대체로 우수하며 주로 산성조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 자일라나제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이다. 따라서 pH 5.0 부근에서 활성이 높은 곰팡이 유래의 자일라나제보다는 산도가 중성 부근의 조건에서 활성이 높은 자일라나제가 사료첨가용 효소로 요구되고 있다.The microorganisms used for the production of feed xylanases are molds. Among the fungi, strains of the genus Trichoderma are mainly used. Their enzyme productivity is generally superior to the enzyme productivity of bacteria that produce xylanase. It mainly shows maximum activity under acidic conditions. However, although the physiological conditions of the digestive system of pigs and chickens vary from site to site, the pH condition after the small intestine to which xylanase should act is around 6.5. Therefore, xylanase, which has high activity under acidic conditions, is required as an enzyme for feed addition, rather than xylanase derived from mold, which has high activity near pH 5.0.

산도가 중성 부근에서 활성이 높은 자일라나제를 생산하는 세균으로는 애로모나스 (Aeromonas) 속, 바실러스 (Bacillus) 속, 클로스트리디움 (Clostrdium) 속, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 속 등에 속하는 다양한 종류의 세균이 있으며 세균에 따라 생산하는 자일라나제의 반응특성이 다양하다. 또 헤미셀룰로즈의 주 성분인 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세가지 종류의 효소 즉 엔도자일라나제 (endo-β-xylanase), 엑소자일라나제 (exo-β-xylanase) 및 자일로시다제 (β-xylosidase)가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나제계 효소로 통칭한다. 한편, 본 발명에서는 이들 효소중 첫 번째 엔도자일라나제에 중점을 두었으며 이후 이 효소를 편의상 자일라나제로 칭함을 전제해 둔다.Bacteria to pH produces xylene Rana the high activity at around neutral are difficulties Pseudomonas (Aeromonas) genus Bacillus (Bacillus) genus, Clostridium (Clostrdium), A variety of belong like in Streptomyces (Streptomyces) There are bacteria and the reaction characteristics of xylanase produced by the bacteria vary. In order to completely decompose and glycosylate xylan, the main component of hemicellulose, there are generally three types of enzymes: endo-β-xylanase, exo-β-xylanase, and xylose. It is known that the agent (β-xylosidase) must work together, and they are collectively called xylanase enzymes. On the other hand, the present invention focuses on the first endocyanase among these enzymes, and then assumes that the enzyme is called xylanase for convenience.

그러나 아직까지 중성 산도에서 활성이 높은 자일라나제의 생산방법에 대해 보고된 바는 없었다. 따라서 본 발명자들은 중성 산도에서 활성이 높은 자일라나제를 생산하는 새로운 스트렙토마이세스 속 균주를 토양으로부터 분리하여 이를 동정하였으며, 알파-셀룰로즈와 자일란, 엿당 등이 분리균의 효소 생산성을 높인다는 것을 확인하였고, 상기 균주를 배양하여 사료첨가용으로 유용한 자일라나제를 대량생산함으로써 본 발명을 완성하였다.However, there have been no reports on the production of xylanase, which is highly active at neutral pH. Therefore, the present inventors have identified a new strain of Streptomyces genus that produces xylanase with high activity at neutral pH from soil, and identified that alpha-cellulose, xylan, maltose, etc. enhance the enzyme productivity of the isolate. The present invention was completed by culturing the strain and mass-producing xylanase useful for feed addition.

따라서 본 발명의 목적은 자일라나제를 생산하는 신규한 스트렙토마이세스 속 균주를 토양으로부터 분리, 동정하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 토양으로 부터 분리, 동정한 상기 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하여 사료첨가용으로 유용하며 중성 산도에서 활성이 높은 자일라나제를 대량 생산하는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 자일라나제가 첨가된 가축사료를 제공함에 있다.Therefore, an object of the present invention is to provide a novel strain of Streptomyces genus that produces xylanase from the soil and to identify and identify. Another object of the present invention is to provide a method for cultivating the strains of Streptomyces sp. Isolated from soil and cultivating it, which is useful for feed addition and mass-producing xylanase having high activity at neutral pH. Still another object of the present invention is to provide a livestock feed added with xylanase produced by the above method.

본 발명의 상기 목적은 토양으로부터 다수의 방선균을 분리한 후 액체배지에접종하여 자일라나제 활성이 높은 균주를 선발하여 선발된 균주의 균학적 특성과 생산된 자일라나제의 특성을 조사하고, 선발된 균주의 배양 배지 조성에 따른 자일라나제의 생산성과 자일라나제에 의한 소맥부산물인 밀기울의 분해능을 분석하여 사료첨가용으로서의 유용성을 확인하고, 사료를 제조함으로써 달성하였다.The object of the present invention is to isolate a large number of actinomycetes from the soil and inoculate the liquid medium to select the strains with high xylanase activity to investigate the mycological characteristics of the selected strains and the characteristics of the produced xylanase, The productivity of xylanase and the resolution of wheat bran, a by-product of wheat, by xylanase were analyzed according to the culture medium composition of the isolated strains.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다 .Hereinafter, the configuration of the present invention will be described.

도 1은 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2)균주의 전자현미경 사진도이다. 도 2는 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 중성 자일라나제의 반응온도와 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이다 도 3은 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 스트렙토마이세스 속 균주의 배양배지와 탄소원을 달리하여 조성한 배지에서 각각 배양하면서 배양시간에 따른 중성자일라나제 활성을 나타낸 그래프이다.1 is an electron micrograph of the strain Streptomyces sp. WL-2 of the present invention. Figure 2 is a graph showing the activity according to the reaction temperature and pH of the neutral xylanase produced by the streptomyces genus WL-2 strain of the present invention Figure 3 is streptomyces genus WL-2 strain of the present invention It is a graph showing the neutronylase activity according to the incubation time while culturing each of the culture medium and the culture medium of different strains of carbon source.

본 발명은 토양시료를 방선균 분리용 배지에 도말하여 형성된 방선균 콜로니를 각각 복합배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양한 후 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 귀리 자일란의 분해능이 우수한 균주들을 선별하여 자일라나제를 생산하는 미생물을 선발하는 단계; 상기 선발된 균주의 형태적, 배양적, 생화학적 특성을 조사하여 동정하는 단계; 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2) 균주가 생산하는 효소인 자일라나제를 반응온도와 pH를 달리하면서 효소반응시켜 최적 활성온도와 최적 활성 pH를 조사하는 단계; 고분자 탄소원인 알파아밀로오즈와 귀리 자일란을 첨가한 배지에서 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 배양하면서 자일라나제 활성을 조사하여 자일라나제 생산성에 미치는 탄소원의 영향을 조사하는 단계; 상기 단계의 배지중의 포도당 대신 다른 종류의 탄소원을 첨가하여 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2) 균주를 배양하면서 일정시간마다 자일라나제의 활성을 측정하여 자일라나제 생산성을 조사하는 단계; 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제 효소를 소맥 부산물인 밀기울에 처리한 후 자일라나제의 활성에 의해 생성된 환원당의 증가량을 조사하여 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제가 사료첨가용으로서의 유용성을 확인하고 가축용사료를 제조하는 단계로 구성된다.The present invention inoculates the actinomycetes colonies formed by smearing the soil sample on the actinomycetes separation medium in a complex medium and incubated at 28 ° C. for 4 days, and then, by using the culture supernatant as a coenzyme solution, strains having excellent resolution of oat xylan are selected by using xyl Selecting microorganisms producing lanase; Identifying and identifying the morphological, cultural, and biochemical properties of the selected strains; Irradiating the enzyme xylanase produced by Streptomyces sp. WL-2 strain of Streptomyces at different reaction temperatures and pHs to investigate the optimum activity temperature and optimum activity pH; Investigating xylanase activity while culturing Streptomyces WL-2 strain in a medium containing high molecular carbon sources alpha amylose and oat xylan to investigate the effect of carbon source on xylanase productivity; Xylanase productivity was measured by measuring the activity of xylanase at certain times while culturing Streptomyces sp. WL-2 strain by adding another carbon source instead of glucose in the medium. Investigating; After treating xylanase enzyme produced by Streptomyces spp. WL-2 to wheat bran, a byproduct of wheat, the amount of reducing sugar produced by the activity of xylanase was investigated and WL-2 strains produced by Streptomyces spp. Xylanase consists of confirming its usefulness as a feed additive and preparing livestock feed.

상기 단계에서 토양시료로부터 방선균을 분리하는 배지로 휴믹산 1g/L, Na2HPO40.5g/L, KCl 1.7g/L, MgSO4·7H2O 0.05g/L, FeSO4·7H2O 0.01g/L, CaCO30.02g/L, 티아민 0.5mg/L, 리보플라빈 0.5mg/L, 니아신 0.5mg/L, 피리독신 0.5mg/L, 이노시톨 0.5mg/L, 칼슘 판토테닉산 0.5mg/L, 파라-아미노벤조익산 0.5mg/L, 바이오틴 0.25mg/L, 사이클로헥사미드 50mg/L, 날리딕식산 50mg/L, 한천 18g/L로 구성되어있고 pH를 7.2로 조절한 휴믹산-비타민(HV)한천 배지를 사용하였다. 방선균 배양용 배지로는 수용성 전분 10g/L, 포도당 20g/L, 대두박 25g/L, 소고기 추출물 1g/L, 효모 추출물 4g/L, NaCl 2g/L, K2HPO40.25g/L, CaCO32g/L로 구성되어 있고 pH를 7.2로 조절한 지.에스.에스(G.S.S)복합 액체배지를 사용하였다.Humic acid 1g / L, Na 2 HPO 4 0.5g / L, KCl 1.7g / L, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05g / L, FeSO 4 · 7H 2 O 0.01 g / L, CaCO 3 0.02 g / L, thiamine 0.5 mg / L, riboflavin 0.5 mg / L, niacin 0.5 mg / L, pyridoxine 0.5 mg / L, inositol 0.5 mg / L, calcium pantothenic acid 0.5 mg / L, Humic Acid-Vitamin (HV), consisting of para-aminobenzoic acid 0.5mg / L, biotin 0.25mg / L, cyclohexamide 50mg / L, nalidic acid 50mg / L, agar 18g / L and pH adjusted to 7.2 Agar medium was used. Actinomycetes culture media include water-soluble starch 10g / L, glucose 20g / L, soybean meal 25g / L, beef extract 1g / L, yeast extract 4g / L, NaCl 2g / L, K 2 HPO 4 0.25g / L, CaCO 3 A GSS composite liquid medium consisting of 2 g / L and adjusted to pH 7.2 was used.

스트렙토마이세스 속 균의 동정은 버기의 매뉴얼(Bergey's mamual of determinative bacteriology)과 ISP (International Streptomyces Project) 방법에준하여 실시하였다.Identification of Streptomyces spp. Was carried out according to the Buggy's mamual of determinative bacteriology and the International Streptomyces Project (ISP) method.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만,본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these Examples.

실시예 1 : 토양으로부터 자일라나제 생산균의 분리 및 선발Example 1 Isolation and Selection of Xylanase Producing Bacteria from Soil

본 발명 자일라나제(xylanase)를 생산하는 방선균의 분리를 위해 토양시료 1 g을 생리식염수 10 ml에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 방선균 분리용 휴믹산-비타민 (HV) 한천 배지에 도말한 후 28℃에서 7일간 배양하였다. 고체 한천배지에서 형성된 콜로니 중에서 서로 다른 형태를 갖는 콜로니를 방선균 배양용 지.에스.에스 (G.S.S) 복합 액체배지에 접종하여 28℃에서 4일간 배양하였다. 방선균 배양액을 원심분리하여 얻은 배양상등액을 사용하여 자일라나제 활성을 조사하여 자일라나제 활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선발하였다.In order to isolate the actinomycetes producing xylanase of the present invention, 1 g of a soil sample is suspended in 10 ml of physiological saline, and an appropriate amount of the suspension is plated on a humic acid-vitamin (HV) agar medium for actinomycetes separation. Incubated for 7 days at ℃. Colonies having different forms among the colonies formed in the solid agar medium were inoculated in the G.S.S composite liquid medium for culturing actinomycetes and incubated at 28 ° C. for 4 days. The culture supernatant obtained by centrifugation of actinomycetes cultures was used to examine xylanase activity, and finally, strains having the best xylanase activity were selected.

실시예 2 :스트렙토마이세스 속 WL-2 균주의 동정 및 특성조사Example 2 Identification and Characterization of Streptomyces spp. WL-2 Strain

상기 실시예 1에서 토양으로부터 분리하여 선발된 균주를 형태적, 배양학적, 생리학적 특성을 조사하고 동정하였다. 또한 상기 균주를 다양한 온도에서 배양하면서 배양가능한 온도범위를 조사하였다.In Example 1, the strains isolated from the soil were selected and examined for morphological, culture, and physiological characteristics. In addition, the strain was incubated at various temperatures while cultivating the temperature range was investigated.

실험 결과, 선발된 균주의 형태적, 배양학적, 생리학적 특성은 표 1, 표2 및 표 3에 나타낸바와 같으며, 고체배지 상에서 21일 간 배양한 후 균의 포자사슬 모습 및 포자형태는 도 1에 나타난 바와 같다. 특히, 본 발명 방선균주는 LL-디아미노피멜릭산 (LL-diaminopimelic acid)을 생성하는 특성으로 미루어 볼 때 방선균 중에서 스트렙토마이세스 속 균으로 동정할 수 있었다. 또한 동정된 본 발명 스트렙토마이세스 속 균주는 35℃ 이상의 온도에서는 자라지 못하였으나 10℃에서 30℃ 까지는 정상적인 성장이 일어나 저온에서 잘 성장하는 특성을 나타내었다. 따라서, 상기 선발된 본 발명 균주를 스트렙토마이세스 속 WL-2 (Streptomycessp. WL-2) 균주로 명명하였고, 이를 한국 생명공학연구소내 유전자 은행에 2000년 6월 7일자로 기탁번호 KCTC 0801BP로 기탁하였다.As a result of the experiment, the morphological, physiological and physiological characteristics of the selected strains are as shown in Table 1, Table 2 and Table 3, and after 21 days of incubation on a solid medium, the spores and spores of the bacteria were As shown in 1. In particular, the actinomycetes of the present invention could be identified as Streptomyces spp. Among the actinomycetes in view of the characteristics of producing LL-diaminopimelic acid. In addition, the identified Streptomyces spp. Strain of the present invention did not grow at temperatures above 35 ° C, but normal growth occurred from 10 ° C to 30 ° C, showing good growth at low temperatures. Therefore, the selected strain of the present invention was named as Streptomyces sp. WL-2 strain, which was assigned to the gene bank in the Korea Biotechnology Research Institute on June 7, 2000, with the accession number KCTC 0801BP. Deposited.

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주의 형태적 특성Morphological Characteristics of WL-2 Strains of the Streptomyces spp. 구 분division 성 질Property 포자모양 (Spore shape)Spore shape 실린더 형(Cylindrial)Cylindrial 포자크기 (Spore size)Spore size 0.7∼0.8 ×0.8∼1.0 ㎛0.7 to 0.8 x 0.8 to 1.0 μm 포자표면 (Spore surface)Spore surface 매끄러움 (smooth)Smooth 포자사슬모양 (Spore chain morphology)Spore chain morphology 직파형 (rectiflexibilis)Straight wave (rectiflexibilis) 포자사슬의 포자수 (Spore number per chain)Spore number per chain 10∼20 개 이상10-20 or more

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주의 배양적 특성Culture Characteristics of Streptomyces sp. WL-2 Strains of the Invention 구 분division 성장정도Growth 기균사의양Specifications of Bacillus 콜로니색깔Colony color 기중균사색깔Aerial mycelium color 수용성색소Water-soluble pigment 효모추출물-맥아추출물 한천배지(Yeast extract-malt extract agar)Yeast extract-malt extract agar 우수Great 풍부abundance 회색grey 진한 갈색Dark brown 없음none 오트밀 한천배지(Oatmeal agar)Oatmeal agar 우수Great 풍부abundance 회색grey 진한 갈색Dark brown 없음none 무기염-전분 한천배지(Inorganic salts-starch agar)Inorganic salts-starch agar 우수Great 풍부abundance 분홍성회색Pinkish gray 진한 갈색Dark brown 없음none 글리세롤-아스파라긴 한천배지(Glycerol-asparagine agar)Glycerol-asparagine agar 부진Sluggish 드뭄Rare 없음none 펩톤-효모추출물-철 한천배지(Peptone-yeast extract-iron agar)Peptone-yeast extract-iron agar 우수Great 보통usually 회색grey 엷은 노란색Pale yellow 없음none 티로신 한천배지(Tyrosine agar)Tyrosine agar 부진Sluggish 드뭄Rare 없음none 포도당-아스파라긴 한천배지(Glucose-asparagine agar)Glucose-asparagine agar 우수Great 풍부abundance 회색grey 갈색Brown 없음none 벤넷 한천배지(Bennett's agar)Bennett's agar 우수Great 풍부abundance 회색grey 갈색Brown 없음none 영양 한천배지(Nutrient agar)Nutrient agar 보통usually 보통usually 회색grey 엷은 노란색Pale yellow 없음none

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주의 생리적 특성Physiological Characteristics of Streptomyces spp. WL-2 구 분division 성 질Property 구 분division 성 질Property 흑색소Black pigment 없음none D-자일로스 이용능D-Xylose Capability 있음has exist 우유 응고능Milk coagulation 있음has exist 이노시톨 이용능Inositol ability 없음none 우유의 펩톤화능Peptonation of Milk 없음none D-만니톨 이용능D-mannitol ability 없음none 질산염 환원능Nitrate Reducing Ability 없음none D-과당 이용능D-fructose availability 있음has exist 전분 가수분해능Starch hydrolysis 있음has exist L-람노스 이용능L-Rhamnose ability 있음has exist 탈지유 가수분해능Skim milk hydrolysis capacity 있음has exist 설탕 이용능Sugar utilization 있음has exist 디아미노피멜릭산의 형태Form of Diaminopimelic Acid LL형LL type 라피노스 이용능Raffinose 있음has exist D-포도당 이용능D-glucose availability 있음has exist L-아라비노스 이용능L-Arabinose 있음has exist

실시예 3 :본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제의 특성 조사Example 3 Characterization of Xylanase Produced by Streptomyces Strain WL-2

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2) 균주가 생산하는자일라나제를 이용하여 귀리 자일란을 가수분해 하는데 있어서 반응온도와 pH에 따른 활성을 조사하기 위하여 배양 상등액을 농축하고 황산 암모니움염으로 분획하여 침전물을 얻은 다음 20 mM Na·phosphate 완충용액 (pH 7.0)에 현탁한 후 동일한 완충용액으로 투석하였다. 분획된 단백질 중 자일라나제 활성을 갖는 부분을 모아 조효소액으로 사용하고 반응온도와 pH를 달리하여 자일라나제 활성을 측정하였다.In the hydrolysis of oat xylan using xylanase produced by Streptomyces sp. WL-2 strain of the present invention, the culture supernatant was concentrated to investigate the activity according to reaction temperature and pH. The precipitate was obtained by fractionation with ammonium sulfate, and then suspended in 20 mM Na · phosphate buffer (pH 7.0) and dialyzed with the same buffer solution. The xylanase activity of the fractionated protein was collected and used as a coenzyme solution, and the xylanase activity was measured by varying the reaction temperature and pH.

실험결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 60℃와 pH 6.0 부근에서 최고의 효소 활성을 보였으며, pH 4.5에서 pH 6.5 까지의 범위에서 90% 이상의 활성을 보였고 특히 pH 6.5에서 95% 이상의 활성을 나타내 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제는 본 발명 균주 배양에 적합한 중성부근의 pH에서 우수한 활성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한, 반응에 사용하였던 효소 시료에서는 자일로시다제(xylosidase) 활성이 나타나지 않아 효소시료의 자일라나제 활성은 모두 자일라나제 활성에 의한 것임을 알 수 있었다.As a result, as shown in Figure 2 showed the highest enzyme activity in the vicinity of 60 ℃ and pH 6.0, showed more than 90% activity in the range of pH 4.5 to pH 6.5, especially showed at least 95% activity at pH 6.5 Xylanase produced by the strain WL-2 of Streptomyces genus was found to have good activity at a pH near the neutral suitable for culturing the strain of the present invention. In addition, it was found that the xylanase activity of the enzyme sample was all due to xylanase activity because no xylosidase activity was observed in the enzyme sample used for the reaction.

실시예 4: 고분자 탄수화물의 첨가에 의한 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 이용한 자일라나제 생산Example 4 Production of Xylanase Using WL-2 Strain of Genus Streptomyces by Addition of Polymer Carbohydrate

여러 종류의 고분자 탄수화물을 배지에 각각 첨가하여 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 이용하여 자일라나제의 생산성을 조사하였다. 그 결과, 알파-셀룰로즈와 귀리 자일란을 배지에 첨가하였을 때 자일라나제 생산성이 증가한다는 사실을 확인하고, 배지내 알파-셀룰로즈와 귀리 자일란의 첨가량이 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2) 균주의 자일라나제 생산성에 미치는 영향을 조사하였다. 지.에스.에스 배지를 대조구로 하여 지.에스.에스 배지에서 가용성 전분 대신 알파셀룰로즈 또는 귀리 자일란의 농도를 각각 달리하여 첨가한 액체배지에 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 접종하여 28℃에서 4 일간 각각 배양한 후 배양상등액의 자일라나제 활성을 조사하였다.Several kinds of polymer carbohydrates were added to the medium, respectively, and the productivity of xylanase was investigated using the strain WL-2 of the present invention Streptomyces. As a result, it was confirmed that the productivity of xylanase increased when alpha-cellulose and oat xylan were added to the medium, and the amount of alpha-cellulose and oat xylan in the medium was added to Streptomyces sp. -2) The effect on the xylanase productivity of the strain was investigated. Inoculated with WL-2 strain of the present invention Streptomyces into a liquid medium in which G.S medium was used as a control, and added with different concentrations of alpha cellulose or oat xylan instead of soluble starch in G.S medium. After incubation at 4 ° C. for 4 days, the xylanase activity of the culture supernatant was investigated.

실험 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 알파-셀룰로즈의 경우 첨가량이 1.0%인 배지에서 효소 생산성이 가장 높았으며 효소 생산 증가는 대조구의 8배에 달하였다. 귀리 자일란의 경우에는 1.5%를 첨가하였을 때 대조구의 9배에 달하는 효소가 생산되었다.As a result, as shown in Table 4, in the case of alpha-cellulose, the enzyme productivity was the highest in the medium containing 1.0% and the increase in enzyme production was 8 times higher than that of the control. In the case of oat xylan, 9 times more enzymes were produced when 1.5% was added.

알파-셀룰로즈와 귀리 자일란의 첨가량이 효소 생산성에 미치는 영향Effect of Addition of Alpha-Cellulose and Oat Xylan on Enzyme Productivity 지.에스.에스 배지변화성분S. S medium change component 첨가량 (%)Addition amount (%) 자일라나제 활성(unit/mL)Xylanase activity (unit / mL) 상대활성 (%)Relative activity (%) 무 변 화(지.에스.에스)No change (G.S.S) 8.58.5 100100 가용성 전분 대신 알파셀룰로스Alphacellulose instead of soluble starch 0.51.01.52.03.00.51.01.52.03.0 39.967.763.750.136.239.967.763.750.136.2 469796749589426469796749589426 가용성 전분 대신 귀리 자일란Oat xylan instead of soluble starch 0.51.01.52.03.00.51.01.52.03.0 26.658.077.340.429.726.658.077.340.429.7 313682909475206313682909475206

실시예 5 : 당 첨가에 의한 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 이용한 자일라나제 생산Example 5 Production of Xylanase Using WL-2 Strain of the Present Streptomyces by Sugar Addition

상기 실시예 4에서 얻어진 결과를 활용하여, 가용성 전분을 제거한 지.에스.에스 배지에 가용성 전분을 대신하여 알파-셀룰로즈 (1%) 또는 귀리 자일란 (1.5%)를 첨가한 배지를 대조구로 하고 지.에스.에스 배지성분인 포도당 대신 과당, 엿당, 아라비노스, 갈락토스를 각각 1% 첨가한 배지에 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 접종하여 28℃에서 4일간 배양하여 자일라나제 생산성을 조사하고, 엿당을 배지에 첨가하였을 때 자일라나제 생산성이 가장 증가한다는 사실을 확인하였다. 따라서 엿당의 첨가량을 달리하여 제조한 배지에 본 발명 균주를 접종하여 배양하고 배양상등액에 자일라나제 활성을 측정하였다.Using the results obtained in Example 4, the soluble starch was removed, and the medium containing alpha-cellulose (1%) or oat xylan (1.5%) was added as a control to the S. medium. Inoculate WL-2 strain of Streptomyces genus of the present invention to medium containing 1% of fructose, maltose, arabinose, and galactose instead of glucose, which is an S.S medium component, and incubate at 28 ° C. for 4 days to increase productivity of xylanase. Investigations confirmed that xylanase productivity increased the most when the maltose was added to the medium. Therefore, the strain of the present invention was inoculated into the medium prepared by varying the amount of maltose added, and the xylanase activity was measured in the culture supernatant.

실험 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이 엿당이 1%가 첨가된 배지에서 가장 효소 생산성이 높으며 포도당을 함유한 대조구보다 자일라나제 활성이 모두 증가하였다. 특히, 알파-셀룰로즈를 함유한 배지에서는 엿당 (1%) 첨가에 의한 효소 생산의 증가가 귀리 자일란을 함유한 배지에서 보다 높았으며 대조구에 비해 약 14배 증가하였다.As a result, as shown in Table 5, the highest enzyme productivity in the medium containing 1% maltose was increased, and all of the xylanase activity was increased compared to the control containing glucose. In particular, in the medium containing alpha-cellulose, the increase in enzyme production by addition of maltose (1%) was higher in the medium containing oat xylan and increased about 14 times compared to the control.

엿당의 첨가량이 효소 생산성에 미치는 영향Effect of Dried Sugar on Enzyme Productivity 배지구분Badge 엿당 첨가량 (%)Sugar content (%) 자일라나제 활성(unit/mL)Xylanase activity (unit / mL) 상대활성 (%)Relative activity (%) 지.에스.에스S.S.S 8.58.5 100100 지.에스.에스알파S.S alpha 0.51.02.03.00.51.02.03.0 11.9117.347.917.911.9117.347.917.9 1401,3805642111401,380564211 지.에스.에스자일란S.S.Xyllan 0.51.02.03.00.51.02.03.0 99.4105.445.019.699.4105.445.019.6 1,1691,2405292311,1691,240529231 [주] 지.에스.에스알파 : 지.에스.에스배지 성분중 가용성 전분대신 알파-셀룰로즈1%를 함유한 배지지.에스.에스자일란 : 지.에스.에스배지 성분중 가용성 전분대신 귀리 자일란1.5%를 함유한배지G.S Alpha: G.S.E.B.S. medium containing 1% of alpha-cellulose instead of soluble starch in G.S.B.E.Sylan: Oat xylan instead of soluble starch. Medium containing 1.5%

실시예 6 : 배양시간에 따른 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주의 자일라나제 생산Example 6 Production of Xylanase from Streptomyces sp. WL-2 Strains According to Incubation Time

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균을 스트렙토마이세스 속 균주의 대표적인 배양배지인 지.에스.에스 배지와 실시예 5에서 얻어진 엿당 1%를 각각 함유한 지.에스.에스알파 배지 및 지.에스.에스자일란 배지에 각각 접종하여 28℃에서 5일간 진탕배양하면서 배양시간에 따른 자일라나제 활성을 조사하였다.Streptomyces genus WL-2 of the present invention is G.S.alpha medium and J.S. alpha medium and G.S. medium containing 1% per malt obtained in Example 5, respectively. Inoculation was carried out in S. xylan medium and shaken culture at 28 ℃ for 5 days to examine the xylanase activity according to the culture time.

실험결과, 도 3에서 보는 바와 같이 배양시간이 4.5 일이 되었을 때까지 배양액의 자일라나제 활성이 증가하였으며 그 이후에는 약간 감소하는 것으로 나타났고, 엿당 1%를 첨가한 지.에스.에스알파 배지에서 가장 자일라나제 활성이 높은 것으로 나타났다. 따라서 지.에스.에스알파 배지에서 본 발명 균주를 4.5 일간 배양하여 약 120 unit/mL의 자일라나제를 생산할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 3, the xylanase activity of the culture medium was increased until the culture time was 4.5 days, and thereafter, it was slightly decreased, and 1% per maltose was added. Was found to have the highest xylanase activity. Therefore, the strain of the present invention was cultured in G.S.alpha. Medium for 4.5 days to produce about 120 unit / mL xylanase.

실시예 7 : 본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제의 사료첨가시 유용성 조사Example 7 Investigation of the Usefulness of Xylanase Produced by Streptomyces Strain WL-2

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomycessp. WL-2) 균주가 생산하는 자일라나제(xylanase)가 사료첨가용 목적에 적합한지를 조사하기 위해서 소맥부산물인 밀기울을 대상으로 본 발명 균주 유래의 자일라나제를 처리한 후 효소활성에 의해 생성된 환원당의 양을 분석하였다. 먼저, 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주를 지.에스.에스알파 배지에서 배양한 후 배양 상등액을 황산 암모니움염으로 침전시켜 조효소액을 제조하였다. 그리고 밀기울 1 그램에 자일라나제 100 unit/mL이 되도록 첨가하여 가축용 사료를 제조하고 단위동물의 소장의 생리적 조건인 pH 6.5, 온도 37℃으로 하여 반응시켰다.In order to investigate whether xylanase produced by Streptomyces sp. WL-2 strain of the present invention is suitable for feed addition purposes, wheat bran product is derived from the strain of the present invention. After treatment with xylanase, the amount of reducing sugar produced by enzymatic activity was analyzed. First, the WL-2 strain of Streptomyces was incubated in G.S.alpha. Medium, and the culture supernatant was precipitated with ammonium sulfate to prepare a crude enzyme solution. In addition, 1 gram of bran was added to 100 units / mL of xylanase to prepare a feed for livestock, and the reaction was performed at pH 6.5 and a temperature of 37 ° C., which is the physiological condition of the small animal's small intestine.

실험결과, 표 6에 나타낸 바와 같이 반응시간에 따라 밀기울이 분해되어 반응액에 환원당 값은 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명 균주 유래의 자일라나제는 사료첨가 목적에 적합함을 알 수 있었다.As a result, as shown in Table 6, the bran was decomposed with the reaction time, and the reducing sugar value was increased in the reaction solution. Looking at these results, it was found that the xylanase derived from the strain of the present invention is suitable for feed addition purposes.

본 발명 스트렙토마이세스 속 WL-2 균주가 생산하는 자일라나제의 밀기울 분해능Bran Resolution of Xylanase Produced by Streptomyces Strain WL-2 반응시간(시간)Response time (hours) 반응후 생성된 환원당의 양 (μmole)Amount of reducing sugar produced after the reaction (μmole) 00 00 0.50.5 142142 1One 216216 22 266266 33 308308 44 353353 55 415415 66 432432

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 토양으로부터 자일란 분해능이 있는 스트렙토마이세스 속 균주를 분리, 동정하여 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptomyces sp. WL-2) 균주로 명명하고, 이 균주를 알파-셀룰로즈와 엿당 또는 귀리 자일란과 엿당이 함유된 배지에서 배양하여 얻은 중성 자일라나제는 사료첨가용으로 적합하고 산성 자일라나제 대체 용도에 유용하며, 제지 및 폐지 재생, 퇴비부숙에도 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 사료산업, 비료산업 및 제지산업상 매우 유용한 발명인 것이다.As described above, the present invention isolates and identifies a strain of genus Streptomyces with degradable xylan from the soil and names it as Streptomyces sp. WL-2 strain of Streptomyces. Neutral xylanase obtained by culturing the strain in a medium containing alpha-cellulose and maltose or oat xylan and maltose is suitable for feed addition, and it is useful for acid xylanase replacement, and for paper and waste paper regeneration and composting. It is a very useful invention in the feed industry, fertilizer industry and paper industry because it has an excellent effect.

Claims (4)

중성 자일라나제(xylanase)를 생산하는 스트렙토마이세스 속 WL-2(Streptom- Neutral xylene My process in Streptomyces to produce the Lana (xylanase) WL-2 (Streptom- ycessp. WL-2) 균주 (KCTC 0801BP). yces sp. WL-2) strain (KCTC 0801BP). 방선균 배양용 배지인 지.에스.에스(G.S.S)복합 액체배지에 있어서, 가용성 전분 대신 알파-셀룰로즈 또는 귀리 자일란을 각각 0.1∼10% 첨가하고 포도당 대신 엿당을 0.1∼10% 첨가한 배지에 상기 제 1항의 균주를 접종하고 28℃에서 4∼5일간 배양함을 특징으로 하는 중성 자일라나제 제조방법.In G.S. (GSS) complex liquid medium which is a culture medium for actinomycetes, 0.1 to 10% of alpha-cellulose or oat xylan is added instead of soluble starch, and 0.1 to 10% of sugar is used instead of glucose. Inoculating the strain of claim 1 and the neutral xylanase production method characterized in that the culture for 4 to 5 days at 28 ℃. 상기 제 2항의 방법에 의해 제조되고, 온도 50∼70℃, pH 4∼8에서 효소 활성을 나타내며, 헤미셀룰로즈를 분해능을 가지는 스트렙토마이세스 속 WL-2균주(KCTC 0801BP) 유래의 중성 자일라나제.Neutral xylanase derived from Streptomyces sp. WL-2 (KCTC 0801BP), prepared by the method of claim 2, exhibiting enzymatic activity at a temperature of 50-70 ° C., pH 4-8, and having a resolution of hemicellulose. . 상기 제 3항 기재의 중성 자일라나제가 첨가된 단위가축용 사료.The unit livestock feed to which the neutral xylanase of Claim 3 is added.
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