KR20010094709A

KR20010094709A - 식품의 잔류 농약 추출 및 발광성 박테리아를 이용한 독성탐지방법

Info

Publication number: KR20010094709A
Application number: KR1020000017987A
Authority: KR
Inventors: 구만복; 민지호; 김은진
Original assignee: 김효근; 광주과학기술원
Priority date: 2000-04-06
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2001-11-01
Also published as: KR100377539B1

Abstract

본 발명은 식품내 잔류하는 농약을 추출한 후, 발광성 박테리아를 이용하여 독성을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 식품내에 잔류하는 농약 성분을 물 및 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜 혼합 용매로 농약을 추출한 후, 이들의 특정한 독성에 대하여 빛을 방출하도록 유전공학적으로 재조합된 발광성 박테리아를 이용하여 독성 정도를 분석하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 종래의 식품에 잔류하는 농약을 검출하기 위해 사용되어 왔던 전처리 방법에 비하여 간단하므로 짧은 시간에 효율적으로 식품내 잔류 농약을 추출할 수 있다. 또한 추출 용매가 독성이 거의 없으므로 인체에 안전할 뿐만 아니라, 발광성 박테리아의 독성 탐지능에 미치는 영향도 거의 없어 추출된 잔류 농약의 독성만을 분석하므로 일반 가정에서도 활용이 가능하다.

본 발명은 무분별한 농약 사용으로 인하여 식품내에 잔류하는 농약 성분의 추출 및 분석방법을 제공함으로써 식품 섭취시 농약의 독성으로 인한 피해를 감소시킬 수 있다.

Description

식품의 잔류 농약 추출 및 발광성 박테리아를 이용한 독성 탐지방법{Method for Extracting Pesticide Residues in Foods and Detection of Toxicity Using Bioluminescent Bacteria}

본 발명은 식품내에 잔류하는 농약 성분을 추출하는 방법으로, 추출된 농약 성분의 독성 정도 및 추출 효율을 유전공학적으로 변형된 발광성 박테리아를 이용하여 측정하는 방법에 관한 것이다.

식품내의 잔류 농약 성분을 분석하기 위한 방법은 GC, GC/MS, LC, LC/MS 등의 분석기기나 실험 동물을 이용한 급성 독성 시험법 및 유전 독성 시험법이 있다. 이러한 방법을 이용하여 잔류 농약의 독성을 분석하기 위해서는 복잡한 추출과 전처리 방법이 요구되어 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라, 숙련된 기술자에 의하여 장시간에 걸쳐 추출한 후, 이를 분석하는데도 많이 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한 추출에 사용되는 용매의 성분자체에 많은 독성을 함유하고 있으므로 추출된 잔류 농약만의 독성 효과를 검증하기가 어려운 단점이 있다.

따라서 본 발명에서는 물과 유기용매로 간단하게 식품내의 잔류농약 성분을 추출한 후, 독성물질의 유입이 생물체의 특정부위를 손상시켰을 때 생물학적 빛을 발생하도록 프로그램 된 유전자 재조합된 발광성 박테리아를 이용하여 추출된 잔류농약의 독성 여부를 확인하는 데 있다.

본 발명은 식품내에 잔류하는 농약성분으로 인한 독성을 신속하게 확인하고 잔류농약을 추출할 수 있는 간편한 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 종래에 잔류 농약을 추출하기 위하여 여러 단계의 복잡한 과정 및 장시간 소요되는 문제점을 해결할 뿐만 아니라, 농약의 물리적ㆍ화학적 성질을 고려하여 두 가지 단계로 구성되어 인체에 무해하면서 최종 추출 농약의 독성에 변화를 주지 않는 추출 용매를 사용하므로 효율적인 독성탐지 방법을 제공한다.

도 1은 식품내 잔류 농약의 추출 방법의 상세도이다.

도 2는 용매 선정을 위한 발광 박테리아의 생물학적 빛과 세포 성장 정도에 영향을 나타낸 것이다.

도 3은 순수한 메틸브로마이드의 여러 농도 범위에 대하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

도 4는 메틸브로마이드를 인위적으로 깻잎에 노출시킨 후, 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

도 5(a)(b)는 DDT(a)와 쥐람(b)을 이용하여 인위적으로 깻잎에 노출하고, 그것을 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

도 6은 식품 중 수분을 다량 함유한 과일류내 잔류 농약을 추출하기 위한 방법에 관한 것이다.

도 7은 메틸브로마이드를 오렌지에 노출시킨 후, 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과로서

(a)는 오렌지 껍질부위만 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

(b)는 오렌지 알맹이 부위를 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

(c)는 오렌지를 증류수 및 추출용매와 완전 파쇄 후 추출하여 발광성 박테리아의 반응성을 확인한 결과이다.

도 1은 본 발명의 잔류농약 추출방법을 나타내는 것으로 식품 샘플로부터 신속하고 간단하게 농약 성분을 추출한후, 발광성 박테리아로 독성 정도를 확인하기 위한 개략도를 보여준다. 식품내 잔류 농약의 추출을 위한 방법은 대략적으로 증류수를 이용한 1차 세척과 추출 용매를 이용한 2차 세척으로 나눌 수 있다. 먼저 적당한 크기로 식품 샘플을 준비한 후에, 증류수 20mL을 이용하여 식품 샘플을 1차 세척하고, 미리 준비된 추출 용매는 20메탄올(Methanol)과15폴리에틸렌글라이콜(Poly Ethylene Glycol)의 혼합 형태의 용매(100메탄올과 60폴리에틸렌글라이콜을 최종 농도가 각각 20와 15가 되도록 혼합)로서 20mL를 보텍서(vortexer)를 이용하여 90초간 2차 세척을 실시한다. 세척시에 이용하는 튜브의 경우, 본 발명에서는 50mL 펠콘튜브 (Falcon tube)를 이용하였지만, 다른 용기를 사용하여도 무관하며, 세척을 위해 요구되는 시간은 60초 내지 120초가 소요되나 보다 바람직하게는 90초 동안하는 것이 좋다. 즉, 세척시간이 90초 이상이 되면 추출 효율은 증가하나 식품으로부터 색소가 함께 추출된다. 예로서 90초간 세척하면 최종 추출 샘플이 깻잎의 경우 녹색을, 오렌지의 경우 오렌지색을 띄게 되었는데, 이들 색소로 인한 부수적인 스트레스를 방지하기 위하여 90초 동안 세척함으로써 세척용기내 잔류 농약이 흡착하는 문제는 발생하지 않게 하였다. 이와 같이 추출된 최종 샘플중 2mL을 취하여 발광성 박테리아를 이용한 추출 효율을 확인하였다.

또한 도 6에 나타나 있는 수분을 다량 함유한 과일류내의 잔류 농약을 추출하기 위한 방법은 추가적으로 식품 샘플을 믹서로 완전히 파쇄하는 과정이 추가된 것으로 원심분리를 통하여 상층액만을 분리하게 된다. 이와 같은 과정을 통해 얻어진 추출 샘플은 모두 유전적으로 재조합된 발광성 박테리아를 이용하여 추출 효율 및 독성 정도를 확인하였다. 특히 독성물질이 생물체의 특정한 부위에 미치는 독성을 탐지하는 여러 가지 재조합 발광성 박테리아 중 특히 독성물질이 세포내 단백질을 손상시켰을 때 빛을 발하도록 유전적으로 재조합된 독성탐지용 박테리아 TV1061(ATCC 69315)을 이용하였다.

유전공학적으로 재조합된 발광성 박테리아(bioluminescent bacteria)는 특정한 부위가 손상되었을 때 이를 회복하는데 관여하는 프로모터와 프로모토의 작동여부를 빛으로서 알려주는 발광유전자(lux유전자)를 인위적으로 결합시킨 플라스미드(plasmid)를 함유하고 있다. 따라서 특정 부위에 미치는 독성은 그에 상응하는 프로모터를 작동시키며, 이는 발광유전자의 발현을 통해 빛으로 나타내게 된다. 따라서 독성 물질의 독성으로 인한 생물체의 특정부분의 손상은 재조합 발광성 박테리아의 빛의 증가로서 나타나게 되는 것이다. 본 발명에서는 특정 손상부위 중 단백질 손상에 민감하게 반응하는 재조합 박테리아 TV1061을 이용하여 개발된 추출 방법을 통해 식품으로부터 추출된 농약 성분의 독성 정도 및 추출 효율을 확인하였다.

이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시 예가 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니며, 실시예에 기재되어 있는 생물학적 빛의 단위는 다음의 두가지로 제한되었다.

,

위의 식에서 SBL(Specific Bioluminescence)은 세포 하나당 발생하는 빛의 양을 의미하는 단위이다.

＜실시예 1＞

본 발명은 식품내 잔류하는 유해 농약 성분을 간단하고 신속하게 추출하여 이들로부터 얻어진 추출 샘플은 유전공학적으로 변형된 발광성 박테리아를 이용하여 추출 효율 및 독성 정도를 그들의 발광 정도로써 비교하는데, 이 단계에서 효율성을 증가시키기 위해서는 추출용으로 사용되는 용매로 인한 박테리아의 스트레스 반응이 최소화시키게 됨으로써, 추출된 농약 성분으로 인한 독성 효과만을 확인하고자 하는 것이다.

적당한 크기로 식품 샘플을 준비한 후에, 정수 20mL을 이용하여 식품 샘플을 1차 세척하고, 미리 준비된 추출 용매는 20메탄올(Methanol)과 15폴리에틸렌글라이콜(Poly Ethylene Glycol)의 혼합 형태의 용매(100메탄올과 60폴리에틸렌글라이콜을 최종 농도가 각각 20와 15가 되도록 혼합)로서 20mL를 보텍서(vortexer)를 이용하여 90초간 2차 세척을 실시하였다.

따라서 종래에 농약성분의 분석을 위한 샘플들의 전처리 과정에서 사용되어 왔던 여러 가지 용매들을 이용하여 발광성 박테리아의 스트레스 반응 정도를 확인하였다. 또한 지용성인 화학물질 용해에 널리 사용되는 메탄올과 소수성 담체(hydrophobic carrier)로 알려져 있는 폴리에틴렌 글라이콜을 혼합하여 이로 인한 스트레스 반응 정도 역시 확인하였다. 도 2에는 8가지 서로 다른 용매로 인한 발광성 박테리아 세포 하나당 발생하는 빛의 최대량(Max. SBL R; Maximum Specific Bioluminescence Ratio)과 세포 성장 속도를 나타내고 있다. 도 2에서 사용한 용매들의 선정 농도는 기존의 샘플 전처리 과정에서 최대 효율을 나타내는 것으로 알려진 것을 참고하였으며, 명시된 농도는 세포 배양용액 내로 삽입되었을 때의 농도를 의미한다. 일반적으로 샘플 처리에 있어 높은 효율을 나타낸 다고 알려진 아세톤과 헥산의 경우는 이로 인한 발광성 박테리아의 성장 저해가 심하여 본 발명에서의 추출방법에 활용하는데는 적합하지 않았다. 따라서 발광성 박테리아로부터 발생되는 생물학적 빛의 양이 최소이면서 세포 성장 저해를 입히지 않는 폴리에틸렌 글라이콜, 에탄올, 메탄올 또는 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜의 혼합형태 등이 적합하였다.

<실시예 2＞

실시예 1에서 사용된 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜의 혼합형태는 표 1(a, b)은 도 2에서 선정된 추출 용매의 최적 추출 효율을 나타내는 농도선정을 위한 것으로 메탄올과 폴리에틸렌글라이콜의 농도 변화에 따른 발광성 박테리아의 생물학적 빛과 세포 성장 정도를 나타낸 것으로 실험을 통하여 선정되었다.

표 1. 선정된 추출 용매의 최적 추출 효율을 나타내는 농도 선정을 위한 메탄올과 폴리에틸렌글라이콜의 농도 변화에 따른 발광성 박테리아의 생물학적 빛과 세포 성장 정도

(a) 발광성 박테리아에 의해 발생되는 생물학적 빛의 양

메탄올 농도 ()	폴리에틸렌 글라이콜 농도 ()
메탄올 농도 ()	0	7.5	15	30	60
0	1	1.13	1.42	1.12	1.3
5	1.38	1.49	1.52	1.39	1.28
10	1.39	1.4	1.42	1.3	2.29
20	1.42	1.38	1.36	1.42	2.8
30	3.36	4.9	4.56	5.0	4.81
40	4.8	5.26	5.23	4.9	5.012
50	6.7	6.84	6.45	6.24	7.12
60	10	10.5	12	14.6	12.4

(b) 발광성 박테리아의 세포 성장 속도 (1/hr)

메탄올 농도 ()	폴리에틸렌 글라이콜 농도 ()
메탄올 농도 ()	0	7.5	15	30	60
0	1.48	1.51	1.51	1.46	1.40
5	1.43	1.54	1.42	1.39	1.32
10	1.39	1.35	1.4	1.38	1.29
20	1.55	1.34	1.38	1.42	1.30
30	1.38	1.29	1.41	1.31	1.39
40	1.38	1.51	1.44	1.38	1.48
50	1.3	1.32	1.25	1.26	1.2
60	1.19	1.16	1.2	1.18	1.18

표 1에는 여러 가지 농도의 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜을 다양하게 혼합하였을 때, 이들로 인한 발광성 박테리아의 생물학적 빛의 양과 세포 성장 속도를 나타내고 있다. 이 경우, 상기와 같이 발생하는 생물학적 빛의 양은 최소이면서 세포 성장 속도에는 거의 영향을 주지 않아야 하므로, 블록을 지정한 부위의 농도 선정이 적합하다. 또한 이들을 추출 용매로 이용하였을 때, 식품내 잔류 농약 성분을 보다 효율적으로 추출할 수 있어야 하므로, 발생하는 빛의 양이 증가하여야 한다. 이를 위하여 깻잎을 인위적으로 메틸브로마이드 성분 10,000 ppm에 노출시켜 추출 효율 실험을 실시하였다.

표 2(a, b)는 메탄올과 폴리에틸렌글라이콜의 농도 변화에 따라 식품내 잔류 농약의 추출후, 발광성 박테리아의 생물학적 빛과 세포 성장 정도를 나타낸 것이다. 표 2의 메탄올 20와 폴리에틸렌 글라이콜 15을 혼합하였을 때, 농약 성분만으로 인한 독성 효과가 최대로 나타나는 것을 확인하였다. 그 이하의 농도에서는 추출 효율이 그에 미치지 못하며, 그 이상의 농도에서는 농약 성분으로 인한 독성 효과 뿐만 아니라, 추출 용매로 인한 효과가 혼합되어 나타는 것을 확인하여, 메탄올 20와 폴리에틸렌글리콜 15의 혼합형태가 잔류 농약성분을 추출하는데 가장 적합함을 확인하였다.

표 2. 메탄올과 폴리에틸렌글라이콜의 농도 변화에 따라 식품내 잔류 농약의 추출후, 발광성 박테리아의 생물학적 빛과 세포 성장 정도

(a) 추출후, 발광성 박테리아에 의해 발생되는 생물학적 빛의 양

메탄올 농도 ()	폴리에틸렌 글라이콜 농도 ()
메탄올 농도 ()	0	7.5	15	30	60
0	1	2.31	3.39	3.81	3.3
5	2.56	2.12	5.12	4.39	4.28
10	3.96	3.41	4.95	9.59	7.96
20	5.61	4.18	10.26	20.16	26.15
30	10.21	12.18	15.12	25	30.8
40	40.12	38.12	44.12	51.16	120.8
50	51.49	55.11	49.51	78.16	207.1
60	100.69	99.1	120.69	146.2	198.1

(b) 추출후, 발광성 박테리아의 세포 성장 속도 (1/hr)

메탄올 농도 ()	폴리에틸렌 글라이콜 농도 ()
메탄올 농도 ()	0	7.5	15	30	60
0	1.48	1.42	1.44	1.52	1.45
5	1.39	1.30	1.302	1.245	1.21
10	1.29	1.201	1.17	1.18	1.46
20	1.18	1.18	1.22	1.24	1.31
30	1.05	1.028	1.12	1.14	1.09
40	1.08	0.95	0.91	0.83	0.84
50	0.75	0.81	0.90	0.83	0.89
60	0.62	0.611	0.72	0.77	0.71

＜실시예 3＞

본 발명의 효과를 확인하기 위하여 최근까지 농가에서 채소류와 과일류에 자주 살포하는 농약 성분으로서 메틸브로마이드를 인위적으로 식품에 노출시켜 추출하는 방법에 대하여 실험하였다. 따라서 도 3에는 단백질 손상에 민감하게 반응하는 발광성 박테리아의 메틸브로마이드에 대한 반응 정도를 나타내었다. 메틸브로마이드의 농도와 발생하는 빛의 양, 세포성장속도가 일정한 상관관계에 있음을 확인하였다.

＜실시예 4＞

실시예 1에서 추출 용매로의 사용이 적합하다고 선정된 용매들을 이용하여 상기의 도 1과 같은 단계로 하여 실제적인 식품 샘플로부터의 잔류 농약 성분의 추출 실험을 실시하였다. 상기한 바와 같이, 메틸브로마이드 10,000 ppm를 깻잎에 인위적으로 노출시킨 후, 추출 실험을 실시하여 도 4과 같은 결과를 얻었다. 도 4의 대조군은 어떠한 스트레스도 가하지 않은 발광성 박테리아의 반응성이며, 깻잎 대조군은 인위적으로 농약성분을 가하지 않은 깻잎을 추출 방법을 이용하여 추출한 것이다. 여러 가지 추출 용매로부터의 추출 정도를 비교했을 때, 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜의 혼합 용매의 경우가 가장 많은 양의 빛이 발생하였고, 이로써 이를 이용한 추출 방법이 가장 추출 효율이 뛰어남을 확인할 수 있었다. 또한 증류수로의 1차 세척후의 추출 샘플과 2차 세척후 샘플의 추출 정도를 최대 SBL율로 비교해 보면, 농약 성분을 추출해 내기 위해서는 추출 용매를 이용한 2차 세척 단계가 까지가 요구됨을 확인할 수 있었다.

＜실시예 5＞

메틸브로마이드 외의 다른 농약 성분인 DDT와 쥐람에 대한 추출실험에서도 역시 상기된 경우와 동일하게 추출 용매를 이용한 2차 처리까지의 단계를 거쳐야만 다량의 농약이 추출되는 것을 확인하였다.

＜실시예 6＞

깻잎의 경우 수분 함유량이 적고, 두께가 거의 없는 식품이였다. 따라서 본 발명에서는 수분 함유량이 많고, 부피가 큰 과일류내의 잔류 농약의 독성을 확인하기 위하여 오렌지를 선정하여 상기된 경우와 동일하게 메틸브로마이드 10,000 ppm을 노출시켜 추출 실험을 실시하였다. 오렌지의 경우, 껍질과 알맹이부위의 구별이 뚜렷하고, 부피가 크기 때문에 농약 노출후, 껍질부위와 알맹이부위를 구별하여 추출을 실시하였으며, 또한 믹서를 이용한 완전 파쇄한 후의 추출 효율 역시 함께 비교하였다. 도 7를 보면, (a)의 경우 껍질만을 이용하여 추출한 결과이고, (b)의 경우는 알맹이를 이용하여 추출하였으며, (c)의 경우 오렌지를 증류수 및 추출 용매와 함께 완전 파쇄하여 추출 효율을 확인한 것이다. 오렌지의 경우는 깻잎의 경우와 달리, 샘플 자체의 성분으로 인한 스트레스 반응이 약간 관찰되었으며, 농약에 노출하여 믹서를 이용하여 완전 파쇄한 경우, 세포 성장 저해 정도로 보아, 다량의 메틸브로마이드 성분이 추출되어짐을 확인하였으며, 특히, 추출 용매와 함께 파쇄한 경우가 증류수와 함께한 경우보다 더 많은 양의 메틸브로마이드가 추출됨을 확인하였다.

본 발명은 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜 혼합용매로 용이하게 식품내 잔류 농약 성분을 추출할 수 있으므로 용매로 인한 독성이 없고 추출방법이 간단하여 손쉽게 측정이 가능하며, 부수적인 장치 및 소모품을 필요로 하지 않게 때문에 매우 경제적인 방법으로서 식품의 종류별로 다른 추출방법을 적용하여 보다 효율적으로 잔류 농약 성분을 추출할 수 있다. 또한 이들 용매는 최종 추출 농약의 화학적·물리적 성질을 고려하여 두 가지 단계로 구성되기 때문에 독성에 변화를 주지 않는 기존에 사용된 다른 방법들에 비해 효율적이라 할 수 있다. 그리고 고도의 숙련자가 아니더라도 일반 가정에서도 손쉽게 식품내의 잔류농약 성분의 추출 및 독성 확인이 가능하다.

Claims

식품내 잔류하는 농약 성분의 추출에 있어서, 절단한 식품류에 순수를 가하여 세척하는 단계와, 세척된 식품류에 혼합 용매를 가하여 60초 내지 120초 동안 추출하는 단계와, 발광성 미생물을 이용하여 추출효율을 분석하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 발광 박테리아를 이용한 식품의 독성 탐지용 잔류 농약 추출방법
제 1항에 있어서, 수분함량과 부피가 작은 식품류의 농약성분은 순수로 세척하는 단계와 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜 혼합용매로 추출하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 발광 박테리아를 이용한 식품의 독성 탐지용 잔류 농약 추출방법
수분 함량이 높은 식품류의 농약성분 추출에 있어서, 절단한 식품류를순수로 세척하는 단계와 메탄올과 폴리에틸렌 글라이콜이 혼합된 용매를 믹서에서 시료를 완전히 파쇄하는 단계와, 분쇄된 시료를 원심분리하여 상등액을 분리하는 단계와, 발광성 미생물을 이용하여 추출 효율을 분석하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 발광 박테리아를 이용한 식품의 독성 탐지용 잔류 농약 추출방법
제 1항에 있어서, 혼합 용매는 20메탄올과 15폴리에틸렌 글라이콜을 사용하는 것을 특징으로 하는 발광 박테리아를 이용한 식품의 독성 탐지용 잔류 농약 추출방법
발광성 박테리아는 독성물질이 세포내 단백질을 손상시켰을 때 빛을 발하도록 유전적으로 재조합된 독성탐지용 박테리아 TV1061(ATCC 69315) 균주를 농약 추출물에 넣어 최대 SBL율을 비교하여 식품으로부터 추출된 잔류 농약 성분의 추출 효율 분석방법