KR20010043127A - 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질을 선택적으로분해시킬 수 있는 세린 프로테아제 - Google Patents

인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질을 선택적으로분해시킬 수 있는 세린 프로테아제 Download PDF

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KR20010043127A
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액시스 파마슈티컬스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 ASP05 프로테아제와 서열 동일성을 갖는 핵산 및 단백질, 및 검정에 사용될 뿐만 아니라 질병의 진단과 치료에 사용되는 본 발명의 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질을 선택적으로 분해시킬 수 있는 세린 프로테아제 {NOVEL SERINE PROTEASE CAPABLE OF SELECTIVE CLEAVAGE OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR BINDING PROTEIN}
발명의 분야
본 발명은 핵산, 단백질 및 항체를 포함하는, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질을 선택적으로 분해시킬 수 있는, "ASP05"로 명명되는 신규한 세린 프로테아제의 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 IGFBP의 선택적 분해에 대한 검정에 사용되는 이러한 신규한 ASP05 프로테아제의 용도 및 효소의 조절물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 질병의 진단에 사용되는, 신규한 ASP05 단백질에 대해 유도된 항체의 용도에 관한 것이다.
발명의 배경
인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP)는 IGF 생물학에서 중요한 역할을 한다. IGFBP를 선택적으로 분해시키는 세포성 프로테아제는 이러한 활성을 매개시킨다. 이러한 단백질가수분해는 IGF에 대한 IGFBP의 친화성을 변화시키는 것으로 공지되어 있고, 다양한 시스템에서 IGF 기능을 아고나이징(agonizing)시키거나 안타고나이징(antagonizing)시키는 것으로 보고되어 왔다.
인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-I)과 IGF-II는 다수의 세포에 의해 합성되고 분비되어, 오토크린(autocrine) 및 파라크린으로서 작용함으로써, 뇌, 혈액, 뼈, 간, 근육, 신장 및 신경계로부터 유도된 세포를 포함하는 다수의 타입의 세포의 분화, 증식 및 기능을 조절한다 [참조: Jones, J. I et al. Endocrine Reviews 16 3-34 (1995)].
IGF 결합 단백질(IGFBP)은 IGF 시스템의 필요불가결한 성분이며; IGF 분자와 단단히 결합함으로써, 이들은 표적 세포에 대한 이들의 생체이용성을 변화시킨다 [참조: Jones et al supra, Cohen et al., Horm. Metab. Res. 26 81-84 (1994)]. IGFBP 패밀리는 IGFBP-1 내지 -6로 일컬어지는 6개의 별개의 단백질로 구성되며, 각각은 IGF-1과 IGF-2에 대해 높은 결합 친화성을 갖는다 [참조: Cohen et al. supra, Oh et al. J. Biol. Chem. 271 30322-30325 (1996), Kim et al. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 94 12981-12986 (1997)]. IGFBP의 아미노산 서열은 40 내지 60%의 유사성을 디스플레이하고, 11개 내지 18개의 고도로 보존된 시스테인 잔기를 코드화한다. IGFBP 패밀리의 일원 중에서, 가장 최근에 확인된 IGFBP7는 최저 아미노산 서열 유사성 및 최소 보존된 시스테인 잔기를 갖는다 [참조: Oh et al. supra, Kim et al. supra].
IGFBP의 대사작용은 IGF와의 이들의 상호작용에 영향을 미치므로, IGF의 작용을 변화시킨다. IGFBP를 분해시키는 프로테아솜의 확인을 기술하는 다수의 보고서가 존재한다. IGFBP-1이 매트릭스 메탈로프로테아제 스트로멜리신-3의 잠재적인 생리학적 기질인 것으로 보고되었고[참조:Manes et al. J. Biol. Chem., 272 25706-25712 (1997)]; IGFBP-3에 대한 프로테아제 활성이 사람 유방암 세포인 MCF-7에서 입증되었고[참조: Salahifar et al., Endocrinology 138 1683-1690 (1997)]; IGFBP-4가 정상 및 형질전환된 사람 섬유아세포에서 분해되는 것으로 발견되었으며[참조: Conover et al., J. Clin. Invest. 91 1129-1137 (1993)]; IGFBP-3와 IGFBP-4에 대한 특이적 프로테아제 활성이 심장 대수술 받은 후의 환자로부터의 혈청에서 발견되었다[참조: Hughes et al., J. Endocrinology 135 135-145 (1992)]. 사람 섬유아세포는 IGFBP-5를 분해시키는 프로테아제의 공급원으로서 확인되었다 [참조: Nam et al., Endocrinology 135 1385-1391 (1994) Nam et al., Endocrinology 137 5530-5536 (1996)]. 프로테아제가 임신 도중에 150kD 복합체 중의 IGFBP를 분해시키고, 플라스민 시스템이 IGFBP 복합체의 해리에 관여한다는 것이 또한 입증되었다 [참조: Giudice et al., J. Clin. Endocrinology and Metabolism 71 806-816 (1990), Campbell et al., Am. J. Physiol. 273 E996-E1004 (1997)]. 이러한 모든 보고서는 IGFBP의 단백질가수분해가 IGFBP의 이용성을 조절하여 IGF 시스템의 기능을 조절하는데 필수적인 작용임을 나타낸다.
지난 수 년에 걸쳐 진행된 많은 실험에도 불구하고, 이러한 분해를 수행하는 프로테아제(들)의 실체는 불분명한 상태이다. 또한, ASP05 프로테아제의 서열은 다른 연구가들에 의해 최근 공표되었다 [참조: JP Application Serial No.: 9-1007980].
그러나, 천연 핵산으로부터 ASP05 단백질을 발현시키려는 시도는 성공적이지 못했다. [참조: Zumbrunn, J. ＆ Trueb, B. FEBS Letters 398:)1996)pp.187-192]
본 발명은 세린 프로테아제 패밀리의 일원이며 IGFBP를 특이적으로 분해시키는 IGFBP 특이적 세린 프로테아제인 "ASP05"의 확인 및 특징화에 관한 것이다. 실시예는 본원에 "ASP05"로 표시된, 생물학적으로 활성이며 IGFBP을 특이적으로 분해시킬 수 있는 단백질을 발현시키는 핵산 서열을 생성시키는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 목적은 ASP05, 효소적으로 활성인 ASP05 및 관련된 분자를 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 ASP05를 코드화하는 재조합 핵산, 및 이러한 ASP05 프로테아제를 코드화하는 핵산이 함유된 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 이러한 ASP05 프로테아제 및 이의 안타고니스트를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.
발명의 요약
상기 약술된 본 발명의 목적에 따르면, 본 발명은 IGFBP 특이적 세린 프로테아제를 코드화하는 핵산을 제조하는 방법을 제공하며, 폴리펩티드는 본원에서 "ASP05"로서 표시된다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 ASP05를 코드화하는 DNA를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 ASP05 단백질 및 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 ASP05 프로테아제를 IGFBP에 첨가시키는 것을 포함하여 IGFBP를 분해시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 ASP05, ASP05 유사 단백질을 억제시킬 수 있는 생체작용성 제제를 스크리닝하는 방법 및 IGFBP를 분해시키는 방법을 제공한다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 IGFBP를 선택적으로 분해시킬 수 있는 세린 프로테아제에 결합하는 외인성 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하여, 세포에서의 IGFBP의 분해를 조절하는 방법으로서, 결합이 상기 세린 프로테아제의 생물학적 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 하나의 개체에서 ASP05 프로테아제의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 첫 번째 개체로부터의 조직 중의 이러한 ASP05의 활성이 측정되어, 두 번째의 온전한 개체로부터의 조직 또는 첫 번째 개체의 제 2 조직 중의 이러한 ASP05의 활성과 비교될 수 있다. 상기 첫 번째 개체로부터의 이러한 ASP05의 활성이 두 번째 개체 또는 제 2 조직 중의 ASP05의 활성과 비교하여 변화되거나 상이한 경우, 첫 번째 개체는 인슐린 대사와 관련된 질병 상태일 위험이 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 "ASP05"로 표시되는 IGFBP를 선택적으로 분해시킬 수 있는 세린 프로테아제의 누클레오티드 서열 cDNA인 누클레오티드 1-1443 (서열 1), 및 아미노산 서열 1-480 (서열 2)을 도시한다. ASP05의 발현을 위해 변경된 누클레오티드는 밑줄그어져 있다. 화살표는 시그널 분해 부위를 나타낸다. IGFBP 유사 도메인은 밑줄그어져 있고, PSTI-도메인은 두 줄로 밑줄그어져 있다. 촉매 도메인은 박스로 표시되어 있으며, 여기서, 촉매적으로 필수적인 히스티딘(H), 아스파테이트(D) 및 세린(S) 잔기는 동그라미쳐져 있다.
도 2a 내지 2b는 천연 단백질을 코드화하는 핵산 서열(상부; 서열 3)과 합성 ASP05 프로테아제를 코드화하는 핵산 서열(하부)의 정렬을 도시한다. 합성 ASP05 프로테아제 중의 변경된 누클레오티드는 밑줄그어져 있다. 둘 모두의 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열이 또한 도시되어 있다.
도 3은 SDS-PAGE를 수행하여, 화학발광에 의해 가시화된 HRP-컨쥬게이팅된 토끼 IgG 항체와 결합된 형태의 안티-ASP05 펩티드 항체에 의해 검출시킨, 정제된 ASP05의 웨스턴 블롯 분석에 의한 ASP05의 자가분해 활성의 평가의 결과를 도시한다. 레인 1의 경우, 플래그(flag) 항체 친화성 크로마토그래피로 정제시킨 단백질(0.5㎍)을 4-20% SDS-PAGE를 걸고, 쿠마시에 블루로 염색시켰고; 레인 2와 3의 경우, 레인 1에서와 동량의 샘플을 4-20% SDS-PAGE를 걸고, 안티-ASP05 펩티드 항체로 블롯팅시켰다. 레인 2의 샘플은 37℃에서 인큐베이션되지 않았지만, 레인 3의 샘플은 37℃에서 15시간 동안 인큐베이션된 후 겔 상으로 로딩되었다. ST: 분자량 표준 단백질 마커.
도 4a는 IGFBP-5의 선택적 분해를 도시한다. IGFBP-1 내지 6을 ASP05와 인큐베이션시키고, 각각의 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. "-"는 ASP05이 없는 대조표준을 나타내고, "+"는 ASP05이 존재함을 나타낸다.
도 4b는 IGFBP-5의 선택적 분해를 도시한다. IGFBP-1 내지 6을 ASP05와 인큐베이션시키고,125l-IGF-I를 사용하여 웨스턴 리간드 블롯에 의해 분석하였는데, BP 1-6은 각각 IGFBP 1-6을 나타내고, "-"는 ASP05가 없는 IGFBP 1-6을 나타내며, "+"는 ASP05의 존재하의 각각의 IGFBP 1-6을 나타낸다.
도 5는 ASP05에 의한 IGFBP-5의 분해에 대한 프로테아제 억제제의 효과를 도시한다. ASP05를 프로테아제 억제제와 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, IGFBP-5를 첨가시키고, 생성물을 IGFBP-5 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 레인 1, ASP05 없음; 레인 2, ASP05 존재, 레인 3, 아프로티닌, 1.5μM; 레인 4, 안티파인(antipain), 370μM; 레인 5, 3,4-DCI, 1mM; 레인 6, E64, 140μM; 레인 7, 루펩틴(leupeptin), 5μM; 레인 8, 펩스타틴(pepstatin) A, 5μM; 레인 9, PMSF, 5mM; 레인 10, TLCK, 675μM; 레인 11, TPCK, 1.4mM 및 레인 12, EDTA, 10mM.
도 6은 실시예에 나타난 바와 같이, ASP05의 C-말단 도메인의 누클레오티드 서열 및 정제용으로 유용한 히스티딘 태그를 도시한다.
도 7은 ASP05의 C-말단 도메인의 아미노산 서열과 히스티딘 태그를 도시한다.
도 8은 ASP05의 C-말단 단편에 의한 IGFBP-5의 선택적 분해를 도시한다. IGFBP-1 내지 6을 단편과 37℃에서 2시간 동안 각각 인큐베이션시킨 후, 각각의 블롯의 상단에 지시된 항체를 사용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. "-"은 단편으로 처리하지 않은 샘플을 나타내고, "+"는 단편으로 처리한 샘플을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 IGFBP를 특이적으로 분해시킬 수 있는, ASP05로서 일컬어지는 신규한 IGFBP 특이적 세린 프로테아제를 제공한다. 본 발명의 ASP05 프로테아제는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있거나, 다양한 공급원으로부터 단리될 수 있다. 특히, 야생형 ASP05 누클레오티드 서열은 G-C 풍부한 N-말단을 함유하여, ASP05 단백질을 발현시키는 것을 어렵게 한다. 따라서, 본 발명은 작용성(즉, 효소적으로 활성인) ASP05의 발현이 달성될 수 있도록, 감소된 G-C 함량, 특히, 핵산 코딩 서열의 N-말단 부분내의 감소된 G-C 영역을 갖는 ASP05 핵산을 제공한다.
따라서, 본 발명은 ASP05 단백질 및 핵산을 제공한다.
본 발명의 ASP05 단백질은 다수의 방법으로 확인될 수 있다. 이러한 관계에 있어서 "단백질"이라 함은 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 포함한다. ASP05 핵산 또는 ASP05 단백질은 도 1에 도시된 서열과 상당한 핵산/아미노산 서열 상동성에 의해 먼저 확인된다. 이러한 상동성은 전체 핵산 또는 아미노산 서열을 기준으로 할 수 있다.
이러한 관계에 있어서 상동성은 서열 유사성 또는 동일성을 의미하며, 동일성이 바람직하다. 이러한 상동성은 당 분야에 공지된 표준 기법, 예를 들어 베스트 핏(Best Fit) 서열 프로그램[참조: Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12:387-395 (1984)], 바람직하게는 디폴트 지정, 또는 BLASTX 프로그램[참조: Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410]을 사용하여 결정될 것이다. 정렬은 정렬시키려는 서열로의 갭의 도입을 포함할 수 있다. 또한, 도 1, 2 및 7에 도시된 단백질 보다 많거나 적은 아미노산을 함유하는 서열의 경우, 상동성의 퍼센트가 전체 아미노산 갯수에 대한 상동 아미노산의 갯수를 기초로 하여 결정되는 것으로 이해된다. 따라서, 예를 들어, 하기 설명되는 바와 같이, 도면에 도시된 서열 보다 짧은 서열의 상동성은 짧은 서열의 아미노산의 갯수를 사용하여 결정될 것이다.
유사성은 하기 당 분야에 공지된 표준 기법을 사용하여 결정되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다: 스미쓰와 워터맨(Smith ＆ Waterman)의 알고리듬[참조: Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)], 니들맨과 운쉬(Needleman ＆ Wunsch)의 알고리듬[참조: J. Mol. Biol. 1970. 48:443], 피어슨과 립맨(Pearson ＆ Lipman)의 유사성 방법에 대한 검색[참조: 1988. PNAS USA 85:2444], 이들 알고리듬의 컴퓨터화된 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA; Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI), 또는 베스트 핏 서열 프로그램[참조: Devereux et al. Nucl. Acid Res. 1984. 12:387-395].
바람직한 구체예에 있어서, 퍼센트 동일성 또는 유사성은 하기 파라미터를 기초로 하여 FastDB에 의해 계산된다: 1.0의 미스매치 패널티(mismatch penalty); 1.0의 갭 패널티; 0.33의 갭 크기 패널티, 30.0의 조이닝(joining) 패널티. [참조: "Current Methods in Comparison and Analysis", Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998. Alan R. Liss, Inc.].
유용한 알고리듬의 또 다른 예는 PILEUP 이다. PILEUP은 점진적인 쌍 형태의 정렬을 사용하여 관련된 서열의 군으로부터 다중 서열 정렬을 생성시킨다. 또한, 이것은 정렬을 생성시키는데 사용되는 클러스터링(clustering) 관계를 나타내는 트리(tree)를 플롯팅할 수 있다. PILEUP은 펭(Feng)과 둘리틀(Doolittle)의 점진적 정렬 방법[참조: J. Mol. Evol. 1987. 35:351-360]을 단순화시킨 방법이며; 이 방법은 히긴스(Higgins)와 샤프(Sharp)에 의해 기술된 방법[참조: 1989. CABIOS 5:151-153]과 유사하다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 중량, 0.10의 디폴트 갭 길이 및 칭량된 말단 갭을 포함한다.
유용한 알고리듬의 또 다른 예는 BLAST 알고리듬이다 [참조: Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990. 215:403-410 and Karlin et al., PNAS USA 1993. 90:5873-5787]. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 알츠슐(Altschul) 등의 문헌[Methods in Enzymology. 1996. 266:460-480; [http://blast.wust/edu/blast/README.html]]으로부터 입수되는 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 대부분이 디폴트 값으로 설정된 다수의 검색 파라미터를 사용한다. 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정되어 있다: 오버랩 스팬(overlap span) = 1, 오버랩 프랙션(fraction) = 0.125, 워드(word) 한계값 (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적인 값이고, 특정 서열의 조성과 목적 서열이 대항 검색되고 있는 특정 데이터베이스의 조성에 좌우되어 프로그램 그 자체에 의해 확정되지만; 값은 감도를 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 퍼센트 아미노산 서열 동일성은 수동적으로 결정된다. 퍼센트 동일성 계산에 있어서, 상대적 중량은 삽입, 결실, 치환 등과 같은 서열 변화의 다양한 징후의 탓이 아니다. 동일성만이 포지티브하게(+1) 기록되고, 모든 형태의 서열 변화는 "0"의 값으로 주어지며, 이는 서열 유사성 계산에 대해 상기 기술된 칭량된 스케일 또는 파라미터를 제거시킨다. 따라서, 퍼센트 동일성은 서열을 비교하는 고도로 정밀한 방법을 나타낸다.
퍼센트 서열 동일성은 예를 들어, 매칭하는 동일한 잔기의 갯수를 정렬된 영역내의 "짧은(shorter)" 서열의 잔기의 전체 갯수로 나누고, 100을 곱함으로서 계산될 있다. "긴(longer)" 서열은 정렬된 영역내에서 가장 현실적인 잔기를 갖는 서열이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단백질은, 바람직하게는 (i) 이것의 IGFBP 결합 도메인이 도 1에 도시된 서열(서열 2)의 아미노산 30 내지 104와 65% 보다 크고, 일반적으로 80% 보다 크고, 바람직하게는 90% 보다 큰 전체 서열 동일성을 갖고/거나 (ii) 이것의 촉매 도메인이 도 1에 도시된 서열(서열 2)의 아미노산 161 내지 371과 65% 보다 크고, 일반적으로 80% 보다 크고, 바람직하게는 90% 보다 큰 전체 서열 동일성을 갖는 경우에 "ASP05 단백질"이다. 몇몇 구체예에 있어서, 서열 동일성은 약 90 내지 95% 이거나 98%로 높을 것이다.
ASP05 단백질은 촉매 도메인, IGFBP 도메인, PSTI 유사 도메인 및 PDZ 유사 도메인을 포함하는 하나 이상의 도메인의 존재에 의해 확인될 수 있으며, 최종 3개의 도메인은 공지된 단백질에 대한 상동성을 기초로 하여 확인될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 프로테아제는 세린 프로테아제 촉매 도메인을 포함한다. 이러한 촉매 도메인이 발현되면 작용성 ASP05 프로테아제를 생성시킨다. 도 1에 도시된 서열의 아미노산 161 내지 371에 상응하는 이러한 도메인은 위치 220에 히스티딘을, 위치 250에 아스파르트산을, 위치 328에 세린을 추정적으로 포함하는 활성 부위를 갖는다. 따라서, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 도 1 서열의 아미노산 161 내지 371과 약 65% 이상의 동일성에 의해 확인될 수 있으며, 약 80% 이상이 바람직하고, 약 90% 이상이 특히 바람직하다. 몇몇 구체예에 있어서, 동일성은 90% 내지 95% 또는 98%로 높을 것이다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 이러한 촉매 도메인과 관련된 효소적 활성에 의해 확인될 수 있다. 따라서, 본 발명은 효소적으로 활성인 ASP05를 제공한다. 본원에 사용된 "효소적으로 활성"이란 IGFBP-5를 선택적으로 분해시키는 것을 의미한다. 본원에 사용된 "선택적으로 분해"란 IGFBP-5가 일반적으로 다른 IGFBP를 실질적으로 분해시키지 않는 조건하에서 분해되는 것을 의미한다. IGFBP-5 분해에 대한 대표적인 검정은 실시예에 나타나 있다.
한 가지 바람직한 구체에에 있어서, ASP05 단백질은 IGFBP와 관련된 N-말단 도메인을 포함하는 것으로서 확인될 수 있다. 이러한 도메인은 도 1에 도시된 서열의 아미노산 30 내지 104에 상응한다. 따라서, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 도 1 서열의 아미노산 30 내지 104와 약 65% 이상의 동일성에 의해 확인될 수 있으며, 약 80% 이상인 것이 바람직하고, 약 90% 이상인 것이 특히 바람직하다. 몇몇 구체예에 있어서, 동일성은 90% 내지 95% 또는 98%로 높을 것이다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 췌장 분비성 트립신 억제제(PSTI) 유사 도메인을 포함한다. 이러한 PSTI 유사 도메인은 도 2에 도시된 서열의 아미노산 105 내지 160에 상응한다. 따라서, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 도 2 서열의 아미노산 105 내지 160과 약 65% 동일성을 갖는 PSTI 유사 도메인을 또한 포함하며, 약 80% 이상이 바람직하고, 약 90% 이상이 특히 바람직하다. 몇몇 구체예에 있어서, 상동성은 93% 내지 955 또는 98%로 높을 것이다.
본 발명의 ASP05 단백질은 도면에 도시된 아미노산 서열 보다 짧거나 길 수 있다. 따라서, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질의 정의에는, 도면에 도시된 서열의 일부 또는 단편이 포함된다. 본원에 약술된 바와 같이, ASP05 결실 돌연변이체는 아미노산 106-480 및 1-105의 결실을 포함하여 생성될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 한 가지 바람직한 ASP05 단편은 본원에 도시된 바와 같이 IGFBP를 선택적으로 분해시키는 ASP05의 촉매 도메인이다. 또 다른 바람직한 ASP05 단편은 ASP05 활성의 조절에 필요할 수 있는 ASP05의 결합 도메인이다. 또 다른 바람직한 ASP05 단편은 ASP05의 촉매 도메인과 결합된 형태의 ASP05의 결합 도메인이다. 또 다른 바람직한 ASP05 단편은 ASP05의 단백질가수분해 활성의 조절에 필요할 수 있는, ASP05의 PSTI 유사 프로테아제 억제제 도메인이다. 또 다른 바람직한 ASP05 단편은 ASP05의 C-말단 PDZ 유사 도메인이다. 단편은 임의의 도메인의 조합물을 포함할 수 있으며, 바람직한 구체예는 적어도 촉매 도메인, 및 촉매 도메인과 결합 도메인을 포함한다.
본원에 추가로 약술된 바와 같이, ASP05 융합 단백질은 시그널 서열, 정제 태그 및 다른 단백질과 같은 이종성 서열에 대한 아미노산 160 내지 480의 융합을 포함하여 생성될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 추가의 바람직한 융합 단백질은 이종성 서열 도메인에 융합된 ASP05의 촉매 도메인을 포함한다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 유도체 또는 변이체 ASP05 단백질이다. 즉, 하기 더욱 상세히 약술된 바와 같이, 유도체 ASP05 펩티드는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 것이며, 아미노산 치환이 특히 바람직하다. 아미노산 치환, 삽입 또는 결실은 ASP05 펩티드내에서 임의의 잔기에서 일어날 수 있다. 하기 약술된 바와 같이, 특히 바람직한 치환은 ASP05 단백질의 촉매 도메인 또는 결합 도메인내에서 이루어 진다.
또한, 하기 더욱 상세히 약술된 바와 같이, ASP05 단백질은 예를 들어, 에피토프 또는 정제 태그의 첨가, 다른 융합 서열의 첨가 등에 의해 도면에 도시된 단백질 보다 길게 생성될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 하기 규정되는 ASP05 핵산에 의해 코드화되는 것으로서 또한 확인될 수 있다. 따라서, ASP05 단백질은 도 1에 도시된 서열에 하이브리드화하는 핵산, 또는 본원에 약술된 이것의 상보체에 의해 코드화된다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질을 항체를 생성시키는데 사용하려는 경우, ASP05 단백질은 도 1에 도시된 온길이 단백질과 하나 이상의 에피토프 또는 결정기를 공유해야 한다. 본원에 사용된 "에피토프" 또는 "결정기"란 항체를 생성시키고/거나 항체와 결합하는 단백질의 일부를 의미한다. 따라서, 대부분의 경우, 작은 ASP05 단백질로 제조된 항체는 온길이 단백질에 결합할 수 있을 것이다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 에피토프는 독특하며; 즉, 독특한 에피토프로 생성된 항체는 교차반응성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 ASP05 분자의 촉매 부분, 즉, 아미노산 번호 106 내지 480으로부터의 영역의 일부 또는 전부에 대해 생성된다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05에 대한 항체는 하기 기술된 바와 같이 ASP05의 생물학적 기능을 감소시키가나 제거시킬 수 있다. 즉, ASP05 단백질을 포함하는 세포 또는 체액에 안티-ASP05 항체(폴리클로날, 바람직하게는 모노클로날)를 첨가하면 ASP05 활성을 감소시키거나 제거시킬 수 있다. 예를 들어, IGFBP의 분해가 감소되거나 제거될 수 있는데; 즉, ASP05 촉매 기능이 감소되거나 제거되는 경우, IGFBP의 일부 또는 전부가 온전하게 남아 있는다. 일반적으로, 활성의 20% 이상의 감소가 바람직하고, 약 50% 이상이 특히 바람직하고, 약 75% 이상이 더 바람직하고, 약 95 내지 100% 감소가 특히 바람직하다.
본 발명의 ASP05 항체는 ASP05 단백질에 특이적으로 결합한다. 본원에 사용된 "특이적으로 결합"이란 항체가 10-6내지 10-8M, 바람직하게는 10-7내지 10-9M의 결합 상수를 가지면서 단백질에 결합함을 의미한다.
핵산의 경우, 핵산 서열의 전체 상동성은 아미노산 상동성과 동일한 정도이지만, 유전 코드의 축중 및 다양한 생물체의 코돈 바이어스(bias)가 고려된다. 따라서, 핵산 서열 상동성은 단백질 서열의 상동성 보다 낮거나 높을 수 있다.
핵산 유사성은 예를 들어 BLASTIN[참조: Altschul et al. 1990. J. Mol. Biol. 147:195-197]을 사용하여 결정될 수 있다. BLASTIN은 매칭이 +5를 카운팅하고 미스매칭이 -4를 카운팅하는 간단한 스코어링 시스템을 이용한다. 계산 효율을 달성하기 위해, 디폴트 파라미터는 소스 코드(source code)내로 직접 편입되었다.
따라서, 핵산은, (i) IGFBP 결합 도메인을 코드화하는 핵산 서열이 도 1(서열 1)에 도시된 폴리누클레오티드 서열의 누클레오티드 90 내지 314와 75% 보다 크고, 전형적으로 85% 보다 크고, 바람직하게는 95% 보다 큰 전체 서열 동일성을 갖고/거나 (ii) 촉매 도메인을 코드화하는 누클레오티드 서열이 도 1(서열 2)에 도시된 누클레오티드 서열의 누클레오티드 481 내지 1113과 75% 보다 크고, 전형적으로 85% 보다 크고, 바람직하게는 95% 보다 큰 전체 서열 동일성을 갖는 경우, "ASP05 핵산" 이다. 몇몇 구체예에 있어서, 동일성은 약 90 내지 95% 또는 98%로 높을 것이다.
따라서, 한 가지 바람직한 구체예는 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP) 분해 프로테아제를 코드화하는 재조합 핵산으로서, (i) 핵산이 도 1(서열 2)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 161 내지 371과 65%가 넘는 서열 동일성을 갖는 IGFBP 분해 프로테아제의 촉매 도메인을 코드화하고/거나 (ii) 핵산이 도 1(서열 2)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 30 내지 104와 65%가 넘는 서열 동일성을 갖는 IGFBP 분해 프로테아제의 IGFBP 결합 도메인을 코드화하고 (iii) 핵산의 누클레오티드 서열의 최초 약 500개 누클레오티드가 75% 미만의 전체 GC 함량을 갖는 핵산을 제공한다.
본원에 약술된 바와 같이, 야생형 또는 천연 핵산 서열은 N-말단 G-C 풍부 영역을 갖는다. 이것은 발현을 어렵게 하는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 줌부룬(Zumbrunn) 등(상기 참조)은 ASP05 단백질을 발현시킬 수 없었으므로 이것의 생물학적 활성을 확인할 수 없었다고 보고하였다. 본 발명은 유전자의 G-C 함량을 감소시킴으로써 ASP05 단백질, 특히 효소적으로 활성인 단백질의 생성을 가능하게 한다.
따라서, 핵산에 대한 한 가지 구체예에 있어서, ASP05에 대한 누클레오티드 서열을 도 2의 천연 핵산 서열과 비교하는 경우, 전체 코딩 서열에 걸쳐 GC 함량이 10%가 넘게 감소하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 20%가 넘게 감소하며, 특히 바람직하게는 30%가 넘게 감소한다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 감소는 유전자의 N-말단 영역에서 일어난다. 또한, 핵산은 ASP05 핵산으로서, 누클레오티드 서열의 최초 약 500개 누클레오티드는 75% 미만, 전형적으로 60% 미만, 바람직하게는 50% 미만의 전체 GC 함량을 갖는다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 핵산은 ASP05 단백질을 코드화한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 유전 코드의 축중으로 인해, 모두 본 발명의 ASP05 단백질을 코드화하는 매우 많은 수의 핵산이 생성될 수 있다. 따라서, 특정한 아미노산 서열을 확인한 경우, 당업자는 ASP05의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 방식으로 하나 이상의 코돈의 서열을 단순 개질시킴으로써 임의의 갯수의 다수의 핵산을 생성시킬 수 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 핵산 동일성은 하이브리드화 실험을 통해 결정된다. 따라서, 예를 들어, 고도의 스트린전시(stringency)하에서 도 1에 도시된 핵산 서열 또는 이것의 상보체에 하이브리드화하고 ASP05 활성(특히, 촉매 생물학적 활성이 바람직하다)을 갖는 핵산은 ASP05 유전자로서 간주된다.
고도의 스트린전시 조건은 당 분야에 공지되어 있다 [본원에 참고문헌으로 명백히 인용되어 있는 하기 문헌 참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, 1989, and Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al., Hames and Higgins, eds. Nucleic Acid Hibridization, A Practical Approach, IL press, Washinton, D.C., 1985; Berger and Kimmel eds. Methods in Enzymology, Vol. 52, Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic press Inc., New York, N.Y., 1987; and Bothwell, Yancopoulos and Alt, eds, Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Gene, Jones and Bartlett Publishers, Boston, Mass. 1990]
하이브리드화 조건의 선택은 당업자에게 명백할 것이며, 하이브리드화의 목적, 하이브리드화의 타입(DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, 올리고누클레오티드-DNA 등), 및 서열 사이의 원하는 관련성의 수준에 의해 일반적으로 안내될 것이다. 하이브리드화 방법은 문헌에 잘 정립되어 있다. 예를 들어, 당업자는 핵산 이중체의 안정성이 매스매칭된 염기의 수가 증가하고 가까이 인접할 수록 감소할 것이므로; 하이브리드화의 스트린전시가 이러한 이중체의 안정성을 최대화시키거나 최소화시키는데 사용될 수 있음을 인식한다. 하이브리드화 스트린전시는 예를 들어, 하이브리드화 용액의 온도를 조정하고; 하이브리드화 용액 중의 나선 불안정화 제제, 예를 들어 포름아미드의 퍼센트를 조정하고; 세척 용액의 온도와 염 농도를 조정함으로써 변화될 수 있다. 일반적으로, 하이브리드화의 스트린전시는 염 농도 및/또는 온도를 변화시킴으로써 하이브리드화후 세척 도중에 조정된다. 하이브리드화의 스트린전시는 예를 들어, i) 하이브리드화 용액 중의 포름아미드의 퍼센트를 증가시키거나; ii) 세척 용액의 온도를 증가시키거나; iii) 세척 용액의 이온 강도를 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 고도의 스트린전시 조건은 고온(예를 들어, Tm 미만의 5℃ 내지 25℃)과 조합된 고온 하이브리드화(예를 들어, 4-6X SSC가 함유된 수용액 중의 65℃ 내지 68℃, 또는 50% 포름아미드 중의 42℃) 및 낮은 염 농도(예를 들어, 0.1X SSC) 세척을 포함할 수 있다. 완화된 스트린전시 조건은 낮은 하이브리드화 온도(예를 들어, 20-50% 포름아미드 중의 35℃ 내지 42℃)와 높은 염 농도(예를 들어, 2-6X SSC)에서의 중간 온도(예를 들어, 40℃ 내지 60℃) 세척을 포함할 수 있다. 50℃ 내지 55℃의 온도에서의 하이브리드화 및 50℃ 내지 55℃에서의 0.1X SSC, 0.1% SDS에서의 세척을 포함할 수 있는 적당한 스트린전시 조건이 사용될 수 있다 [참조: Maniatis and Ausubel, supra]. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산에 하이브리드화하는 핵산은 본원에 기술된 생물학적 활성을 갖는다.
본 발명의 ASP05 단백질과 핵산은 바람직하게는 재조합물이다. 본원에 사용된 "핵산"이란 DNA 또는 RNA, 또는 데옥시- 및 리보누클레오티드를 함유하는 분자를 의미할 수 있다. 핵산으로는 게놈 DNA, cDNA 및 센스와 안티-센스 핵산을 포함하는 올리고누클레오티드가 있다. 이러한 핵산은 생리학적 환경에서의 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 리보오스-포스페이트 주쇄의 개질을 또한 함유할 수 있다.
핵산은 이중 가닥이거나, 단일 가닥이거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 하나의 가닥("Watson")의 서술은 또한 나머지 가닥("Crick")의 서열을 규정하므로; 도 1에 도시된 서열은 서열의 상보체를 또한 포함한다. 본원에 사용된 용어 "재조합 핵산"이란 일반적으로 엔도누클레아제에 의한 핵산의 조작에 의해 자연계에서 보통 발견되지 않는 형태로 시험관내에서 처음 형성된 핵산을 의미한다. 따라서, 선형의 단리된 ASP05 핵산 또는 보통 결합되지 않는 DNA 분자를 연결시킴으로써 시험관내에서 형성된 발현 벡터는 둘 모두 본 발명의 목적을 위한 재조합물로서 간주된다. 유사하게는, 조절 서열에 임의적으로 부착된 온길이 서열의 단편은 재조합물로서 간주된다. 또한, 누클레오티드 서열이 변경된(예를 들어, 낮은 G-C 함량) 본원에 기술된 서열과 같은 변경된 핵산 서열도 재조합물이다. 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 생물체내로 재도입된 경우, 이것은 비재조합적으로, 즉, 시험관내 조작이라기 보다는 숙주 세포의 생체내 세포 기구를 사용하여 복제되는 것으로 이해되지만; 이러한 핵산은, 재조합적으로 생성된 경우, 비재조합적으로 후속 복제된다고 하더라도 본 발명의 목적을 위해 여전히 재조합물로서 간주된다.
유사하게는, "재조합 단백질'은 재조합 기법을 사용하여, 즉, 상기 기술된 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다. 재조합 단백질은 하나 이상의 특징에 의해 천연 단백질과 구별된다. 예를 들어, 이러한 단백질은 이것의 야생형 숙주에서 보통 결합하고 있는 단백질 및 화합물의 일부 또는 전부로부터 단리되거나 정제될 수 있으므로, 실질적으로 순수할 수 있다. 예를 들어, 단리된 단백질은 이것의 천연 상태에서 보통 결합하고 있는, 바람직하게는 주어진 샘플에서 전체 단백질의 약 0.5 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 약 5 중량% 이상을 구성하는 물질의 일부 또는 전부를 수반하지 않는다. 실질적으로 순수한 단백질은 전체 단백질의 약 75 중량% 이상을 포함하며, 약 80% 이상이 바람직하고, 약 90% 이상이 특히 바람직하다. 정의는 하나의 생물체로부터의 ASP05 단백질을 또 다른 생물체 또는 숙주 세포에서 생성시키는 것을 포함한다. 또한, 단백질은 단백질이 증가된 농도 수준에서 생성되도록 유도성 프로모터 또는 고발현 프로모터를 사용함으로써 보통 나타나는 농도 보다 훨씬 높은 농도로 생성될 수 있다. 또한, 단백질은 하기 설명되는 에피토프 태그의 첨가 또는 아미노산 치환, 삽입 및 결실에서와 같이, 자연계에서 보통 발견되지 않는 형태일 수 있다. 또한, 재조합 단백질은 효소적으로 활성일 수 있다.
확인되기만 하면, 생물학적으로 활성인 서열을 포함하는 폴리펩티드가 합성(예를 들어, 벡크만 모델(Beckman Model) 990 펩티드 합성기 또는 그 밖의 시판되는 합성기를 사용한다)과 같은 통상의 기법에 따라 제조될 수 있다.
아미노산 서열 변이체가 본 발명의 ASP05 단백질의 정의에 또한 포함된다. 이들 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체와 같은 세 가지 종류 중 하나 이상에 속한다. 이들 변이체는 카세트 또는 PCR 돌연변이유발 또는 당 분야에 널리 공지된 그 밖의 기법을 사용하여 ASP05 단백질을 코드화하는 DNA의 누클레오티드를 특정부 돌연변이유발시킨 후, DNA를 상기 약술된 재조합 세포 배양물에서 발현시킴으로써 보통 제조된다. 그러나, 약 100개 내지 150개 잔기를 갖는 변이체 ASP05 단백질 단편은 정립된 기법을 사용하여 시험관내 합성시킴으로써 제조될 수 있다. 아미노산 서열 변이체는 ASP05 단백질 아미노산 서열의 천연적 대립형질 또는 종간(interspecies) 변화와는 다른 특징인 변이의 소정의 특성을 특징으로 한다. 변이체는 전형적으로 천연 유사체와 동일한 정량적 생물학적 활성을 나타내지만, 하기 상세하게 약술되는 개질된 특성을 갖는 변이체가 또한 선택될 수 있다.
아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 부위 또는 영역이 예정되지만, 돌연변이 자체는 예정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 성능을 최적화시키기 위해, 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈 또는 영역에서 수행될 수 있고, 발현된 ASP05 변이체가 원하는 활성의 최적 조합에 대해 스크리닝될 수 있다. 공지된 서열을 갖는 DNA내의 소정 부위에 치환 돌연변이를 생성시키는 기법은 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, M13 프라이머 돌연변이유발 및 PCR 돌연변이유발이 있다. 돌연변이체의 스크리닝은 ASP05 단백질 활성의 검정법을 이용하여 수행되며; 예를 들어, 결합 도메인 돌연변이의 경우, 실시예에 약술된 경합 결합 실험이 수행될 수 있다.
아미노산 치환은 전형적으로 단일 잔기를 가지며; 삽입은 약 1 내지 20개 아미노산 정도일 것이지만, 현저하게 많은 삽입이 허용될 수 있다. 삽입은 약 1개 내지 약 20개 잔기이지만, 몇몇 경우, 삽입은 훨씬 많을 수 있다. 예를 들어, 바람직한 변이체는 촉매 도메인의 결실을 포함하여, ASP05의 결합 도메인만을 남긴다. 또 다른 바람직한 변이체는 촉매 도메인만을 포함하거나 가용성 수용체(즉, 결합 도메인)를 포함한다.
치환, 결실, 삽입 또는 이들의 임의의 조합이 최종 유도체에 도달하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 이들 변화는 분자의 변화를 최소화시키기 위해 수 개의 아미노산에 대해 이루어진다. 그러나, 더 큰 변화가 특정한 경우에 허용될 수 있다. ASP05 단백질의 특성의 작은 변화가 바람직하다고 하더라도, 치환은 하기 차트에 따라 일어나는 것이 일반적이다:
차트 I
최초 잔기 전형적인 치환기
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln, His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn, Gln
Ile Leu, Val
Leu Ile, Val
Lys Arg, Gln, Glu
Met Leu, Ile
Phe Met, Leu, Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp, Phe
Val Ile, Leu
기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변화는 차트 I에 도시된 치환기 보다 덜 보존적인 치환기를 선택함으로서 이루어진다. 예를 들어, 변화를 갖는 영역에서의 폴리펩티드 주쇄의 구조, 예를 들어 알파-나선 또는 베타-시트 구조; 표적 부위에 있는 분자의 하전 또는 소수성; 또는 측쇄의 크기에 더욱 현저하게 영향을 주는 치환이 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 특성의 최대 변화를 생성시키는 것으로 일반적으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐가 소수성 잔기, 예를 들어 루실, 이소루실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐로 치환되가; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기로 치환되거나; (c) 양전성 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 리실, 아르기닐, 또는 히스티딜이 음전성 잔기, 예를 들어 글루타밀 또는 아스파르틸로 치환되거나; (d) 거대한 측쇄를 갖는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어 글리신으로 치환되는 것들이다.
변이체는 전형적으로 동일한 정량적 생물학적 활성을 나타내며, 천연 유사체와 동일한 면역 반응을 유도시킬 것이지만, 변이체는 필요에 따라 ASP05 단백질의 특성을 개질시키도록 또한 선택된다. 대안적으로, 변이체는 ASP05 단백질의 생물학적 활성이 변경되도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 글리코실화 부위, 더욱 상세하게는 하나 이상의 O-결합된 또는 N-결합된 글리코실화 부위가 도입되거나, 변경되거나, 제거될 수 있다.
예를 들어, 기질 또는 억제제와 결합하지만 이들을 분해시키지 않는 ASP05 단백질을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이러한 목적 및 그 밖의 목적을 위해 활성 부위 서열의 치환이 이루어질 수 있다.
한 가지 대안적인 구체예에 있어서, 변이체의 라이브러리는 완전 비특이적인 무작위 돌연변이유발법에 의해 생성된다. 이들 기법은 당 분야에 공지되어 있고, 변경시키려는 특정 부위 또는 영역의 선택을 필요로 하지 않는다. 예를 들어, DNA 셔플링(shuffling)[참조: Stemmer. Nature 370:389-391 (1994) and Stemmer. PNAS USA 91:10747-10751 (1994)]이 클로닝되고, 발현되고, 원하는 특성에 대해 스크리닝되는, 변이체를 생성시키는데 이용될 수 있다. 예를 들어, ASP05 단백질의 생물학적 활성은 필요에 따라 증가되거나 감소될 수 있다.
ASP05 폴리펩티드의 공유적 개질은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유적 개질의 한 가지 타입으로는 ASP05 폴리펩티드의 표적화된 아미노산 잔기를, ASP05 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 제제와 반응시키는 것이 있다. 2작용성 제제에 의한 유도체화는, 예를 들어 하기 더욱 상세히 설명되는 안티-ASP05-항체의 정제 방법 또는 스크리닝 검정에 사용하기 위해 ASP05를 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시키는데 유용하다. 일반적으로 사용되는 가교제로는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 동종2작용성 이미도에스테르가 있으며, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 2작용성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함한다.
그 밖의 개질로는 글루타밀과 아스파라기닐 잔기의 각각 상응하는 글루타밀과 아스파틸 잔기로의 아미드분해, 프롤린과 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 아미노기의 메틸화[참조: T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co. San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 C-말단 카르복실기의 아미드화가 있다.
본 발명의 범위에 속하는 ASP05 폴리펩티드의 공유적 개질의 또 다른 타입은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴을 변경"이란 천연 서열 ASP05 폴리펩티드에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분을 결실시키고/거나 천연 서열 ASP05 폴리펩티드에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가시키는 것을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다.
글리코실화 부위를 ASP05 폴리펩티드에 첨가시키는 것은 이것의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 ASP05 폴리펩티드에 첨가시키거나 치환시킴으로써(O-결합된 글리코실화 부위에 대해) 이루어질 수 있다. ASP05 아미노산 서열은 DAN 수준에서의 변화에 의해, 특히, 원하는 아미노산으로 번역되지 않을 코돈이 생성되도록 ASP05 폴리펩티드를 코드화하는 DNA를 소정의 염기에서 돌연변이시킴으로써 임의로 변경될 수 있다.
ASP05 폴리펩티드의 탄수화물 부분의 갯수를 증가시키는 또 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적 또는 효소적 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 애플린(Aplin)과 리스톤(Wriston)의 문헌[CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
ASP05 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화에 대한 표적으로서 작용하는 아미노산 잔기를 코드화하는 코돈의 돌연변이적 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 하키무딘(Hakimuddin) 등의 문헌[Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)]과 에지(Edge) 등의 문헌[Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드상의 탄수화물 부분의 효소적 분해는 토타쿠라(Thotakura) 등의 문헌[Meth. Enzymol., 138:350 (1987]에 기술된 다수의 엔도- 및 엑소-글리코시다아제를 사용하여 달성될 수 있다.
ASP05의 공유적 개질의 또 다른 타입은 ASP05 폴리펩티드를, 미국 특허 제 4,640,835호; 4,496,689호; 4,301,144호; 4,670,417호; 4,791,192호; 또는 4,179,337호에 기술된 방식으로, 다수의 비단백질성 중합체 중의 하나, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 ASP05 폴리펩티드는 또 다른 이종성(합성을 포함한다) 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 형태의 ASP05 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 형성하도록 하는 방식으로 또한 개질될 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 이러한 키메라 분자는 ASP05 폴리펩티드와 안티-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 ASP05 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치하는 것이 일반적이다. 대안적으로, 에피토프는 ASP05 폴리펩티드의 표면에 있게 되도록 내부에, 바람직하게는 친수성 영역에 위치하여, 항체에 접근가능할 수 있다. 이러한 에피토그 태깅된 형태의 ASP05 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은, ASP05 폴리펩티드가, 안티-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 친화성 매트릭스의 또 다른 타입을 사용하여 친화성 정제에 의해 용이하게 정제될 수 있게 한다. 대안적인 구체예에 있어서, 키메라 분자는 ASP05 폴리펩티드와 또 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정한 영역의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자의 경우, 이러한 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역 또는 GST 융합체에 대한 것일 수 있다. 유사하게는, 키메라 단백질을 코드화하는 키메라 핵산 분자는 본원에 약술된 바와 같이 제조될 수 있다.
다수의 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(poly-his-gly) 태그가 있으며; flu HA 태그 폴리펩티드와 이것의 항체[Field, et al., Mol. Cell Biol., 8:2159-2165 (1988)]; 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D(gD) 태그와 이것의 항체[Paborsky, et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. 그 밖의 태그 폴리펩티드로는 플래그-펩티드[Hopp, et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1998)]; KT3 에피토프 펩티드[Martin, et al., Science, 255:192-194 (1992)]; 투불린 에피토프 펩티드[Skinner, et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그[Lutz-Freyermuth, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]가 있다.
ASP05 단백질의 정의에는 ASP05 과의 그 밖의 ASP05 단백질 및 다른 생물체로부터의 ASP05 단백질이 또한 포함되며, 이들은 하기 약술된 바와 같이 클로닝되고 발현된다. 따라서, 프로브 또는 축중 폴리머라제 사슬 반응(PCR) 프라이머 서열은 사람 또는 그 밖의 생물체로부터 다른 관련된 ASP05 단백질을 발견하기 위해 사용될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 특히 유용한 프로브 및/또는 PCR 프라이머 서열은 ASP05 핵산 서열의 독특한 영역을 포함한다. 따라서, 유용한 프로브 또는 프라이머 서열은 촉매 도메인의 서열의 일부 또는 전부, 또는 독특한 결합 도메인의 일부 또는 전부, 또는 이들의 조합물에 대해 설계될 수 있다. 당 분야에 일반적으로 공지된 바와 같이, 바람직한 PCR 프라이머는 길이가 약 15개 내지 약 35개, 바람직하게는 약 20개 내지 30개의 누클레오티드이며, 필요에 따라 개질된 누클레오티드, 예를 들어 이노신을 함유할 수 있다. PCR 반응에 대한 조건은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
ASP05 핵산이 확인되면, 이것은 클로닝되고, 필요에 따라, 이것의 구성 부분을 재조합하여 전체 ASP05 핵산을 형성시킬 수 있다. 이것의 천연 공급원으로부터 단리된 경우, 예를 들어 플라스미드 또는 다른 벡터내에 함유되거나 선형의 핵산 세그먼트로서 이로부터 절제된 경우, 재조합 ASP05 핵산은 다른 ASP05 핵산을 확인하고 단리시키기 위한 프로브로서 추가로 사용될 수 있다. 또한, 이것은 개질된 또는 변이체 ASP05 핵산 및 단백질을 생성시키기 위해 "전구체" 핵산으로서 사용될 수 있다.
ASP05 단백질을 코드화하는 본 발명의 핵산을 사용하는 경우, 다수의 발현 벡터가 생성된다. 발현 벡터는 자체복제성 염색체외 벡터이거나 숙주 게놈내로 삽입되는 벡터일 수 있다. 일반적으로, 이들 발현 벡터는 ASP05 단백질을 코드화하는 핵산에 작동적으로 결합된 전사 및 번역 조절 핵산을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는 특정한 숙주 생물체에서 작동적으로 결합된 코딩 서열을 발현시키는데 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵 생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 부위 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 이것이 또 다른 핵산 서열과 작용성 관계로 위치하는 경우에 "작동적으로 결합"되어 있다. 예를 들어, pre서열 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 이것이 폴리펩티드의 분비에 관여하는 pre단백질로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 결합되어 있거나; 프로모터 또는 인핸서는 이것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우에 작동적으로 결합되어 있거나; 리보솜 결합 부위는 이것이 번역을 용이하게 하도록 위치하는 경우에 작동적으로 결합되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 결합된"이란 결합되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 리더의 경우, 연속적이고 리딩 페이스(reading phase)에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서는 연속적일 필요는 없다. 결합은 편리한 제한 부위에서의 연결에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고누클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 실시에 따라 사용된다. 전사 및 번역 조절 핵산은 ASP05 단백질을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포에 대해 일반적으로 적합할 것이며; 예를 들어, 바실루스(Bacillus)로부터의 전사 및 번역 조절 핵산 서열이 바실루스에서 ASP05 단백질을 발현시키는데 사용되는 것이 바람직하다. 다수의 타입의 적합한 발현 벡터, 및 적합한 조절 서열이 다수의 숙주 세포에 대해 당 분야에 공지되어 있다.
일반적으로, 전사 및 번역 조절 서열로는, 프로모터 서열, 리보솜 결합 부위, 전사 개시 및 정지 서열, 번역 개시 및 정지 서열, 및 인핸서 또는 액티베이터 서열이 있을 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 조절 서열로는 프로모터 및 전사 개시 및 정지 서열이 있다.
프로모터 서열은 구성 또는 유도성 프로모터를 코드화시킨다. 프로모터는 천연 프로모터 또는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 하나 이상의 엘리먼트가 조합된 하이브리드 프로모터가 당 분야에 또한 공지되어 있으며, 본 발명에 유용하다.
또한, 발현 벡터는 추가의 엘리먼트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 하나 이상의 복제 시스템을 가질 수 있어서, 예를 들어, 포유동물 또는 곤충 세포에서의 발현을 위해 및 원핵 숙주에서의 클로닝과 증폭을 위해 하나 이상의 생물체에서 유지될 수 있게 된다. 또한, 삽입 발현 벡터의 경우, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈과 상동인 하나 이상의 서열, 바람직하게는 발현 구성물을 플랭킹(flanking)하는 두 개의 상동 서열을 함유한다. 삽입 벡터는 벡터에 함유되는 적합한 상동 서열을 선택함으로써 숙주 세포의 특정 유전자좌로 유도될 수 있다. 삽입 벡터를 위한 구성물은 당 분야에 공지되어 있다.
또한, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 발현 벡터는 선택성 마커 유전자를 함유하여 형질전환된 숙주 세포가 선택되도록 할 수 있다. 선택 유전자는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
바람직한 발현 벡터 시스템은 둘 모두 본원에 참고문헌으로 명확히 인용되어 있는 PCT/US97/01019 및 PCT/US97/01048에 일반적으로 기술되어 있는 레트로바이러스 벡터 시스템이다.
본 발명의 ASP05 단백질은 ASP05 단백질을 코드화시키는 핵산이 함유된 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를, ASP05 단백질을 발현시키기에 적당한 조건하에서 배양함으로써 생성된다. ASP05 단백질을 발현시키기에 적당한 조건은 발현 벡터와 숙주 세포의 선택에 따라 달라질 것이며, 당업자에 의해 일상적인 실험을 통해 쉽게 확인될 것이다. 예를 들어, 발현 벡터에 구성 프로모터를 사용하는 경우에는 숙주 세포의 성장 및 증식을 최적화시키는 것을 필요로 하며, 유도성 프로모터를 사용하는 경우에는 유도에 적합한 성장 조건을 필요로 한다. 또한, 몇몇 구체예에 있어서, 수거 시간이 중요하다. 예를 들어, 곤충 세포 발현에 사용되는 바쿨로바이러스 시스템은 용해성 바이러스이므로, 수거 시간 선택은 생성물 수율에 있어서 중요할 수 있다.
본 발명의 ASP05 단백질은 적합한 숙주 세포에서 "발현될 수" 있어서, 생물학적 활성 단백질이 된다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 바쿨로바이러스 감염된 곤충 세포에서 발현된다. 박-대-박(Bac-to-Bac) 바쿨로바이러스 발현 시스템(GibcoBRL, Gaithersburg, MD)이 단백질을 발현시키는데 사용된다. 플래그 에피토프(flag epitope)(Eastman Kodak, New Haven. CT)로 태깅(tagging)된 ASP05 cDNA는 pFASBac1 벡터내로 연결된 후, DH1 OBac 컴피턴트 세포내로 형질전환되어 재조합 박미드(bacmid)를 생성시킨다. 박미드 DNA는 스포도프테라 프루기퍼다(Spodoptera frugiperda)("Sf9") 곤충 세포(ATCC CRL 1711)내로 트랜스펙션되어 재조합 바쿨로바이러스를 생성시킨다. 고역가 스톡(stock)이 sf9 곤충 세포를 감염시키는데 사용되며, 발현된 단백질은 발현된 ASP05의 C-말단부내로 공학처리된 플래그 에피토프에 대해 특이적인 아가로오스-결합된 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 용리되고 태깅된 ASP05 폴리펩티드가 함유된 분획은 풀링(pooling)되고, MES 또는 HEPES 완충액과 같은 완충액에 대해 투석된다.
적합한 숙주 세포로는 효모, 박테리아, 아키박테리아, 균류, 및 곤충 및 동물 세포가 있으며, 동물 세포로는 포유동물 세포, 예를 들어 골수 간세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 간세포를 포함하는 1차 세포가 있다. 특히 관심있는 세포는 SF9 세포, 드로소필라 멜랑개스터(Drosophila melangaster) 세포, 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 및 그 밖의 효모, 이.콜라이(E. coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), C129 세포, 293 세포, 뉴로스포라(Neurospora), BHK, CHO, COS, 및 HeLa 세포, 섬유아세포, 쉬완노마(Schwanoma) 세포계, 불멸화된 포유동물 골수구 및 림프구 세포계, 쥬카트(Jukat) 세포, 사람 세포 및 그 밖의 1차 세포가 있다.
대안적으로, IgG 태깅된(또는 Fc 태깅된) ASP05 폴리펩티드의 정제는, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 포함하는 공지된 크로마토그래피 기법을 사용하여 수행될 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 포유동물 세포에서 발현된다. 포유동물 발현 시스템은 당 분야에 또한 공지되어 있으며, 레트로바이러스 시스템이 있다. 포유동물 프로모터는 포유동물 RNA 폴리머라제와 결합하여 ASP05 단백질에 대한 코딩 서열의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시킬 수 있는 임의의 DNA 서열이다. 프로모터는 코딩 서열의 5' 말단 근처에 일반적으로 위치하는 전사 개시 영역, 및 전사 개시 부위의 업스트림에 위치한 25 내지 30개 염기쌍을 사용하는 TATA 박스를 가질 것이다. TATA 박스는 RNA 폴리머라제 II를 유도시켜서 정확한 부위에서 RNA 합성을 개시시키는 것으로 생각된다. 포유동물 프로모터는 전형적으로 TATA 박스의 100 내지 200개 염기쌍 업스트림내에 위치하는 업스트림 프로모터 엘리먼트(인핸서 엘리먼트)를 또한 함유할 것이다. 업스트림 프로모터 엘리먼트는 전사가 개시되는 속도를 결정하며, 양방향으로 작용할 수 있다. 포유동물 프로모터로서 특히 사용되는 것은 포유동물 바이러스 유전자로부터의 프로모터인데, 이는 바이러스 유전자가 종종 고도로 발현되며 광범위한 숙주 범위를 갖기 때문이다. 예로는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 메이저(major) 후기 프로모터, 단순 포진 바이러스 프로모터, CMV 프로모터, 레트로바이러스 LTR 프로모터, 마우스 말로니(malony) 백혈병 바이러스 LTR, 또는 pBabeMN이 있다.
전형적으로, 포유동물 세포에 의해 인식되는 전사 종결 및 폴리아데닐화 서열은 번역 정지 코돈에 대해 3'에 위치하는 조절 영역이므로, 프로모터 엘리먼트와 함께, 코딩 서열을 플랭킹한다. 성숙한 mRNA의 3' 말단은 특정부 번역후 분해 및 폴리아데닐화에 의해 형성된다. 전사 터미네이터 및 폴리아데닐화 시그날의 예로는 SV40으로부터 유도된 것들이 있다.
포유동물 숙주 뿐만 아니라 그 밖의 숙주내로 외인성 핵산을 도입시키는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다. 기법으로는 덱스트란-매개된 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개된 트랜스펙션, 프로토플라스트 융합, 일렉트로포레이션, 바이러스 감염, 리포솜내로의 폴리누클레오티드(들)의 캡슐화, 및 DNA의 핵내로의 직접 미세주입이 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 박테리아 시스템에서 발현된다. 박테리아 발현 시스템은 당 분야에 널리 공지되어 있다.
적합한 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 폴리머라제와 결합하여, ASP05 단백질의 코딩 서열의 mRNA로의 다운스트림(3') 전사를 개시시킬 수 있는 임의의 핵산 서열이다. 박테리아 프로모터는 코딩 서열의 5' 말단 근처에 일반적으로 위치하는 전사 개시 영역을 갖는다. 이러한 전사 개시 영역은 전형적으로 RNA 폴리머라제 결합 부위 및 전사 개시 부위를 포함한다. 대사 경로 효소를 코드화시키는 서열은 특히 유용한 프로모터 서열을 제공한다. 예로는 갈락토오스, 락토오스 및 말토오스와 같은 당 대사 효소로부터 유도된 프로모터 서열, 및 트립토판과 같은 생합성 효소로부터 유도된 서열이 있다. 박테리오파지로부터의 프로모터가 또한 사용될 수 있으며, 당 분야에 공지되어 있다. 또한, 합성 프로모터 및 하이브리드 프로모터가 또한 유용하며; 예를 들어, tac 프로모터는 trp 및 lac 프로모터 서열의 하이브리드이다. 또한, 박테리아 프로모터는 박테리아 RNA 폴리머라제와 결합하여 전사를 개시킬 수 있는 능력을 갖는 박테리아 이외의 기원을 갖는 천연 프로모터일 수 있다.
작용성 프로모터 서열 이외에, 효율적인 리보솜 결합 부위가 바람직하다. 이.콜라이의 경우, 리보솜 결합 부위는 샤인-델가르노(Shine-Delgarno)(SD) 서열로 명명되며, 개시 코돈과 개시 코돈의 3 내지 11개 누클레오티드 업스트림에 있는 길이가 3 내지 9개 누클레오티드인 서열을 포함한다.
또한, 발현 벡터는 박테라아에서 ASP05 단백질을 분비시키는 시그널 펩티드 서열을 포함한다. 시그널 서열은 전형적으로 세포로부터의 단백질의 분비를 유도시키는 소수성 아미노산으로 구성된 시그널 펩티드를 코드화시키며, 당 분야에 널리 공지되어 있다. 단백질은 성장 배지(그람-포지티브 박테리아)내로 분비되거나 세포의 내막과 외막 사이에 위치한 세포질 공간(그람-네거티브 박테리아)내로 분비된다.
박테리아 발현 벡터는 형질전환된 박테리아 균주가 선택될 수 있도록 하는 선택성 마커 유전자를 또한 포함할 수 있다. 적당한 선택 유전자로는 박테리아를 암피시린, 클로로암페니콜, 에리트로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 테트라사이클린과 같은 약물에 대해 내성이 되게 하는 유전자가 있다. 또한, 선택성 마커로는 히스티딘, 트립토판 및 루신 생합성 경로에 존재하는 유전자와 같은 생합성 유전자가 있다.
이들 성분은 발현 벡터내로 어셈블링된다. 박테리아에 대한 발현 벡터는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 특히, 바실루스 서브틸리스, 이.콜라이, 스트렙토코쿠스 크레모리스(Streptococcus cremoris), 및 스트렙토코쿠스 리비단스(Streptococcus lividans)에 대한 벡터가 있다.
박테리아 발현 벡터는 염화칼슘 처리, 일렉트로포레이션 등과 같은 당 분야에 공지된 기법을 사용하여 박테리아 숙주 세포내로 형질전환된다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 효모 세포에서 생성된다. 효모 발현 시스템은 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 사카로마이시스 세레비시애, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 씨. 말토사(C. maltosa), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이시스 프래길리스(Kluyveromyces fragilis) 및 케이.락티스(K. lactis), 피치아 길러리몬디(Pichia guillerimondii) 및 피. 파스토리스(P. pastoris), 쉬조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)에 대한 발현 벡터가 있다. 효모에서의 발현을 위한 바람직한 프로모터 서열로는 유도성 GAL1,10 프로모터, 알코올 탈수소효소, 에놀라아제, 글루코키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라아제, 글리세르알데히드-3-포스페이트-탈수소효소, 헥소키나아제, 포스포프룩토키나아제, 3-포스포글리세레이트 뮤타아제, 피루베이트 키나아제, 및 산 포스파타아제 유전자로부터의 프로모터가 있다. 효모 선택성 마커로는 튜니카마이신에 대한 내성을 부여하는 ALG7, ADE2, HIS4, LEU2 및 TRP1; G418에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자; 및 구리 이온의 존재하에서 효모를 성장시킬 수 있는 CUP1 유전자가 있다.
ASP05 단백질은 당 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 융합 단백질로서 또한 제조될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 모노클로날 항체의 생성의 경우, 원하는 에피토프가 작다면, ASP05 단백질은 캐리어 단백질에 융합되어 면역원을 형성시킬 수 있다. 대안적으로, ASP05 단백질은 용이한 정제 또는 그 밖의 이유로 인해 융합 단백질로서 제조되어, 발현을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, ASP05 단백질이 ASP05 펩티드인 경우, 펩티드를 코드화시키는 핵산은 발현을 위해 다른 핵산에 결합될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 프로테아제 분해 부위를 코드화시키는 핵산은 핵산 캐리어 단백질과 ASP05 폴리펩티드 사이에서 이들에 대해 프레임적으로 위치한다. 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 발현된 ASP05 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하거나 그 밖의 목적을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 분해 부위는 ASP05 폴리펩티드에서 발견되지 않거나, ASP05 폴리펩티드는 이것에 결합하여 분해 부위에서 분해시키는 프로테아제에 의해 실질적으로 분해되지 않는다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 ASP05 핵산, 단백질 및 항체는 표지화된다. 본원에서 "표지화"란 용어는 화합물이 이것을 검출할 수 있도록 부착된 하나 이상의 엘리먼트, 이소토프 또는 화학적 화합물을 가짐을 의미한다. 일반적으로, 표지는 세 종류로 나뉜다: a) 방사성 또는 무거운 이소토프일 수 있는 이소토프 표지; b) 항체 또는 항원일 수 있는 면역 표지; 및 c) 착색된 염료 또는 형광 염료. 표지는 임의의 위치에서 화합물내로 혼입될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질은 발현 후에 정제되거나 단리된다. ASP05 단백질은 샘플에 존재하는 기타 성분에 따라 당업자에게 공지된 다수의 방법으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법으로는 전기영동 기법, 분자적 기법, 면역학적 기법, 및 이온 교환, 소수성, 친화성 및 역상 HPLC 크로마토그래피 및 크로마토포커싱을 포함하는 크로마토그래피 기법이 있다. 예를 들어, ASP05 단백질은 표준 안티ASP05-항체 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 단백질 농도와 관련된 한외여과 및 투석여과 기법이 또한 유용하다. 적당한 정제 기법의 일반적 안내에 대해서는, 스콥스, 알.(Scopes, R.)의 문헌[Protein Purification, Springer-Verlag, NY (1982)]를 참조하라. 필요한 정제의 정도는 ASP05 단백질의 용도에 좌우되어 달라질 것이다. 몇몇 경우, 정제는 불필요할 것이다.
발현되고, 필요에 따라 정제된 경우, ASP05 단백질 및 핵산은 다수의 분야에서 유용하다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 개질된 ASP05, 및 개질된 단백질을 함유하는 세포가 제조된다. 한 가지 구체예에 있어서, 개질된 ASP05를 함유하는 사람 이외의 동물(바람직하게는 형질전환된 동물)이 생성되며; 유사하게는, 유도성 프로모터가 함유된 ASP05 형질전환된 동물 및 "녹-아웃(knock-out)" 동물 모델이 제조될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질, 핵산, 개질된 ASP05 단백질 및 천연 또는 개질된 ASP05 단백질이 함유된 세포가 스크리닝 검정에서 사용된다. 이러한 중요한 세린 프로테아제이 확인되면 단백질분해 활성, 결합 등을 포함하는 ASP05 생물학적 활성을 조절하는 화합물에 대한 약물 스크리닝이 설계될 수 있다.
스크린은 ASP05에 결합할 수 있는 후보(candidate) 제제를 먼저 발견하도록 설계될 수 있고, 그 후, 이들 제제가 ASP05 활성을 조절할 수 있는 후보 제제의 능력을 평가하는 검정에 사용될 수 있다. 따라서, 당업자에게 인식되는 바와 같이, 결합 검정과 활성 검정을 포함하는 수행가능한 다수의 상이한 검정이 존재한다. 이들 구체예에서 특히 중요한 것은 ASP05의 촉매 부분이 IGFBP의 선택적 분해를 일으키는 주원인이라는 데에 있다. 또한, IGFBP는 체액 뿐만 아니라 생체내 조직에도 존재할 수 있다. 따라서, 후보 제제는, 분해에 대해 검정하는 경우, 제제를 세포에 표적화시킬 필요 없이 세포에 직접 첨가될 수 있다. 따라서, ASP05의 촉매 도메인은 생물학적 검정에 대한 기준으로서 독립적으로 사용될 수 있다.
따라서, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 ASP05 단백질과 후보 생체활성 제제를 혼합시키고, 후보 제제가 ASP05 단백질에 결합하는 것을 측정하는 것을 포함한다. 바람직한 구체예는 사람 ASP05(또는 본원에 약술된 촉매 또는 결합 도메인과 같은 일부)을 사용하지만, 그 밖의 포유동물 ASP05 단백질이 설치동물(마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등), 가축(소, 양, 돼지, 말 등) 및 영장류를 포함하는 각각의 경우에 또한 사용될 수 있다. 이들 후자 구체예는 사람 질병의 동물 모델의 개발에 있어서 바람직할 수 있다. 몇몇 경우, 본원에 약술된 바와 같이, 상기 약술된 결실 ASP05 단백질을 포함하는, 변이체 또는 유도체 ASP05 단백질이 사용될 수 있다.
또한, ASP05 단백질의 정의에는 ASP05 단백질의 일부가 포함되는데; 즉, 온길이 단백질 또는 이것의 작용성 일부가 사용될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05의 촉매 도메인은 촉매 영역과 함께 또는 촉매 영역 없이 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 검정은, 특정한 검정에 필요한 경우, 단리된 ASP05 단백질 또는 ASP05 단백질을 포함하는 세포를 사용할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 방법의 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 및 후보 제제는 샘플 수용 영역에서 함께 위치되거나, 이들 중 하나가 불용성 지지체(예를 들어, 미량역가 플레이트, 어레이 등)에 결합될 수 있다. 불용성 지지체는 ASP05 또는 후보 제제가 결합할 수 있는 임의의 조성물로 구성될 수 있고, 전체 스크리닝 방법과 양립가능하다. 이러한 지지체의 표면은 솔리드(solid) 또는 다공성일 수 있고, 임의의 편리한 형태를 가질 수 있다. 적합한 불용성 지지체의 예로는 미량역가 플레이트, 어레이, 막 및 비드가 있다. 이들은 전형적으로 유리, 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 니트로셀룰로오스, 테플론TM등으로 구성된다. 소량의 시약 및 샘플을 사용하여 다수의 검정이 동시에 수행될 수 있기 때문에, 미량역가 플레이트 및 어레이가 특히 편리하다. 조성물의 결합의 특정한 방식은, 이것이 시약 및 본 발명의 방법과 양립가능하고, 조성물의 활성을 유지시키고, 비확산성인 한은 중요하지 않다. 결합의 바람직한 방법은 항체(ASP05 단백질이 지지체에 결합되는 경우에 프로테아제 서열을 입체적으로 블록킹하지 않는다)의 사용, "점착성(sticky)" 또는 이온성 지지체 대한 직접적 결합, 화학적 가교, 표면상에서의 ASP05 프로테아제의 합성 등을 포함한다. ASP05 단백질의 결합을 수행한 후, 과량의 결합되지 않은 물질이 세척에 의해 제거된다. 그 후, 샘플 수용 영역은 우혈청알부민(BSA), 카제인 또는 그 밖의 무독성 단백질 또는 기타 부분과의 인큐베이션을 통해 블록킹될 수 있다.
하기 규정된 후보 생체활성 제제가 검정에 첨가된다. 신규한 결합제로는 특정 항체, 화학적 라이브러리의 스크린에서 확인된 합성 결합제, 펩티드 유사체 등이 있다. 특히 관심있는 것은 사람 세포에 대해 저독성을 갖는 제제에 대한 스크리닝 검정이다. 표지화된 시험관내 단백질-단백질 결합 검정, 전기영동적 이동 시프트 검정, 단백질 결합에 대한 면역검정, 작용성 검정(인산화 검정 등) 등을 포함하는, 광범위한 검정이 이를 위해 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "후보 생물학적 제제" 또는 "외인성 화합물"은 ASP05 단백질의 생물학적 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있는 능력을 갖는 임의의 분자, 예를 들어 단백질, 올리고펩티드, 작은 유기 분자, 폴리사카라이드, 폴리누클레오티드 등을 의미한다. 일반적으로, 다수의 검정 혼합물이 다양한 농도에 대한 상이한 반응을 수득하기 위해 다양한 제제 농도를 사용하여 병렬적으로 실험된다. 전형적으로, 이들 농도 중의 하나는 네거티브 대조표준, 즉, 농도 0 또는 검출 수준 미만으로서의 기능을 한다.
후보 제제는 다수의 화학물질 종류를 포함하지만, 전형적으로 이들은 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 100 보다 크고 2,500 달톤 미만의 작은 유기 화합물이다. 후보 제제는 단백질과의 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 작용기를 포함하며, 전형적으로, 적어도 아민, 카르보닐, 히드록실 또는 카르복시기, 바람직하게는 둘 이상의 작용성 화학물질 기를 포함한다. 후보 제제는 고리 탄소 또는 헤테로고리 구조 및/또는 하나 이상의 상기 작용기로 치환된 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함한다. 후보 제제는 펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 푸린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합물을 포함하는 생체분자 중에서 또한 발견된다.
후보 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위한 공급원으로부터 수득된다. 예를 들어, 다수의 수단이 무작위화된 올리누클레오티드의 발현을 포함하는 광범위한 유기 화합물 및 생체분자의 무작위 및 유도된 합성을 위해 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 균류, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 입수가능하거나 용이하게 생성된다. 또한, 천연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 개질된다. 공지된 약리학적 제제가 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화와 같은 유도된 또는 무작위 화학적 변형에 사용되어 구조적 유사체를 생성시킬 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 단백질이다. 본원에 사용된 "단백질"은 둘 이상의 공유결합된 아미노산을 의미하는 것으로서, 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드가 있다. 단백질은 천연 아미노산과 펩티드 결합 또는 합성 펩티도미메틱(peptidomimetic) 구조물로 구성될 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 "아미노산" 또는 "펩티드 잔기"는 천연 아미노산 및 합성 아미노산 둘 모두를 의미한다. 예를 들어, 호모-페닐알라닌, 시트룰린 및 노레루신(noreleucine)은 본 발명의 목적에 적합한 아미노산으로서 간주된다. "아미노산"은 프롤린 및 히드록시프롤린과 같은 이미노(imino) 아미노산 잔기를 또한 포함한다. 측쇄는 (R) 또는 (S) 형태일 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 아미노산은 (S) 또는 L-형태이다. 합성 측쇄가 사용되는 경우, 예를 들어 생체내 분해를 방지하거나 지연시키기 위해 아미노산 이외의 치환기가 사용될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 천연 단백질 또는 천연 단백질의 단편이다. 따라서, 예를 들어, 단백질이 함유된 세포 추출물 또는 단백질성 세포 추출물의 무작위 또는 유도된 분해물이 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, 원핵 및 진핵 단백질의 라이브러리가 ASP05에 대한 스크리닝을 위해 생성될 수 있다. 이러한 구체예에서 특히 바람직한 것은 박테리아, 균류, 바이러스 및 포유동물 단백질의 라이브러리이며, 이 중에서, 포유동물 단백질이 바람직하고, 사람 단백질이 특히 바람직하다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 약 5 내지 약 30개의 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 약 20개의 아미노산, 특히 바람직하게는 약 7 내지 약 15개의 아미노산을 갖는 펩티드이다. 펩티드는 상기 약술된 바와 같은 천연 단백질의 분해물, 무작위 펩티드, 또는 "바이어싱(biasing)된" 무작위 펩티드일 수 있다. 본원에 사용된 "무작위화된" 또는 문법적 동의어는 각각의 핵산 및 펩티드가 각각 무작위 누클레오티드 및 아미노산으로 본질적으로 구성됨을 의미한다. 일반적으로 이들 무작위 펩티드(또는 하기 논의되는 핵산)이 화학 합성되기 때문에, 이들은 임의의 누클레오티드 또는 아미노산을 임의의 위치에 포함할 수 있다. 합성 방법은 무작위화된 단백질 또는 핵산을 생성시키도록 설계되어, 서열의 길이에 걸친 모든 또는 대부분의 가능한 조합을 형성시킴으로써, 무작위화된 후부 생물학적 단백질성 제제의 라이브러리를 형성시킬 수 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 라이브러리는 완전 무작위화되며, 임의의 위치에서의 서열 선택성 및 불변성은 없다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 라이브러리는 바이어싱된다. 즉, 서열내에서의 일부 위치가 일정하게 유지되거나, 제한된 갯수의 가능성으로부터 선택된다. 예를 들어, 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 누클레오티드 또는 아미노산 잔기는 한정된 종류, 예를 들어 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체적으로 바이어싱된(작거나 크게) 잔기내에서, 시스테인의 생성쪽으로, 가교, SH-3 도메인에 대한 프롤린, 인산화 부위에 대한 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히스티딘, 등, 또는 푸린 등으로 무작위화된다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 핵산이다. 본원에 사용된 "핵산" 또는 "올리고누클레오티드" 또는 문법적 동의어는 함께 결합된 둘 이상의 누클레오티드를 의미한다. 본 발명의 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 몇몇 경우, 하기 약술되는 바와 같이, 예를 들어 포스포르아미드(Beaucage, et al., Tetrahedron, 49(10):1925 (1993) 및 여기에 인용된 참고문헌; Letsinger, J. Org. Chem., 35:3800 (1970); Sprinzl, et al., Eur. J. Biochem., 81:579(1977); Letsinger, et al., Nucl. Acids Res., 14:3487(1986); Sawai, et al., Chem. Lett., 805 (1984), Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); and Pauwels, et al., Chemica Scripta, 26:141 (1986)), 포스포로티오에이트(Mag, et al., Nucleic Acids Res., 19:1437 (1991); and U.S. Patent No. 5,644,048), 포스포로디티오에이트(Briu, et al., J. Am. Chem. Soc., 111:2321 (1989)), O-메틸포스포로아미디트 결합(참조: Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press), 및 펩티드 핵산 주쇄와 결합(참조: Egholm, J. Am. Chem. Soc., 114:1895 (1992); Meier, et al., Chem. Int. Ed. Engl., 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson, et al., Nature, 380:207 (1996), 모두 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다)을 포함하는 대안적 주쇄를 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 다른 핵산 유사체로는 포지티브 주쇄(Denpcy, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6097 (1995)); 비이온성 주쇄(U.S. Patent Nos. 5,386,023; 5,637,684; 5,602,240; 5,216,141; and 4,469,863; Kiedrowishi, et al., Angrew. Chem. Intl. Ed. English, 30:423 (1991); Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc., 110:4470 (1988); Letsinger, et al., Nucleoside ＆ Nucleotide, 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker, et al., Bioorganic ＆ Medicinal Chem. Lett., 4:395 (1994); Jeffs, et al., J. Biomolecular NMR, 34:17 (1994); Tetrahedron Lett., 37:743 (1996)) 및 리보오스 이외의 주쇄(참조: U.S. Patent Nos. 5,235,033 and 5,034,506, and Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook)를 갖는 핵산이 있다. 하나 이상의 카보사이클릭 당이 함유된 핵산이 또한 핵산의 정의에 포함된다 (참조: Jenkins, et al., Chem. Soc. Rev., (1995) pp.169-176). 수 개의 핵산 유사체가 로울스(Rawls)의 문헌[C ＆ E News, June 2, 1997, page 35]에 기술되어 있다. 이러한 모든 문헌은 본원에 참고문헌으로 명확히 인용된다. 리보오스-포스페이트 주쇄의 이들 변형은 표지와 같은 추가의 부분의 첨가를 용이하게 하거나, 생리적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 또한, 천연 핵산 및 유사체의 혼합물이 생성될 수 있다. 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물, 및 천연 핵산와 유사체의 혼합물이 생성될 수 있다. 핵산은 단일 가닥 또는 명시된 경우, 이중 가닥이거나, 이중 가닥 또는 단일 가닥 서열 둘 모두의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 게놈 DNA 및 cDNA 둘 모두인 DNA, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 핵산은 데옥시리보- 및 리보-누클레오티드의 임의의 조합물, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 히포크산틴, 이소시토신, 이소구아닌 등을 포함하는 염기의 임의의 조합물을 함유한다.
단백질에 대해 상기 일반적으로 기술된 바와 같이, 핵산 후보 생물학적 제제는 천연 핵산, 무작위 핵산 또는 "바이어싱된" 무작위 핵산일 수 있다. 예를 들어, 원핵 또는 진핵 게놈의 분해물이 단백질에 대해 상기 약술된 바와 같이 사용될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 문헌에서 입수가능한 광범위한 종류의 유기 화학물질 부분이다.
후보 생물학적 제제가 ASP05에 결합하는 것의 측정은 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제는 표지화되고, 결합이 직접 측정된다. 예를 들어, 이것은 ASP05의 일부 또는 전부를 고체 지지체에 부착시키고, 표지화된 후보 제제(예를 들어 형광 표지)를 첨가하고, 과량의 시약을 세척하고, 표지가 고체 지지체에 존재하는 지를 측정함으로써 수행될 수 있다. 당 분야에 공지된 다수의 블록킹 및 세척 단계가 이용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "표지화된"이란 화합물이 검출성 시그널, 예를 들어 방사성동위원소, 형광물질, 효소, 항체, 자기 입자와 같은 입자, 화학발광물질, 또는 특이적 결합 분자 등을 제공하는 표지로 직접 또는 간접 표지화된 것을 의미한다. 특이적 결합 분자로는 쌍, 예를 들어 비오틴과 스트렙타비딘, 디곡신 및 안티디곡신 등이 있다. 특정 결합 멤버의 경우, 상보적 멤버는 보통 상기 약술된 공지된 과정에 따라 검출을 제공하는 분자로 표지화될 것이다. 표지는 검출성 시그널을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있다.
몇몇 구체예에 있어서, 성분의 하나만이 표지화된다. 예를 들어,125I 또는 형광단에 의해 티로신 위치에서 표지화될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 성분이 상이한 표지로 표지화될 수 있는데; 예를 들어 ASP05 단백질에 대해서는125I가, 후보 제제에 대해서는 형광단이 사용될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 생체활성 제제의 결합은 경합 결합 검정을 사용하여 측정된다. 이러한 구체예에 있어서, 경합물질은 항체, 펩티드, 결합 파트너, 리간드 등과 같은 표적 분자에 결합하는 것으로 공지된 결합 부분이다. 특정한 환경하에서, 생물학적 제제와 결합 부분 사이에 경합 결합이 존재할 수 있으며, 여기서, 결합 부분은 생물학적 제제를 치환한다.
한 가지 구체예에 있어서, 후보 생체활성 제제는 표지화된다. 후보 생체활성 제제, 경합물질, 또는 둘 모두는, 존재하는 경우, 결합이 이루어지기에 충분한 시간 동안 ASP05 단백질에 먼저 첨가된다. 인큐베이션은 최적 활성을 촉진시키는 임의의 온도, 전형적으로 4 내지 40℃에서 수행될 수 있다. 인큐베이션 기간은 최적 활성에 대해 선택되지만, 신속한 고처리량 스크리닝을 촉진시키도록 또한 최적화될 수 있다. 전형적으로 0.1 내지 1시간이면 충분할 것이다. 과량의 시약은 일반적으로 제거되거나 세척된다. 그 후, 제 2 성분이 첨가되고, 표지화된 성분의 존재 또는 부재가 결정되어 결합을 나타낸다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 경합물질이 먼저 첨가된 후, 후보 생체활성 제제가 첨가된다. 경합물질의 치환은 후보 생물학적 제제가 ASP05 단백질에 결합하고, 이로써, ASP05 단백질에 결합하여 이것의 활성을 잠재적으로 조절할 수 있음을 나타낸다. 이러한 구체예에 있어서, 성분이 표지화될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 경합물질이 표지화된 경우, 세척 용액에서의 표지의 존재는 제제에 의한 치환을 나타낸다. 대안적으로, 후보 생체활성 제제가 표지화된 경우, 지지체상의 표지의 존재는 치환을 나타낸다.
한 가지 대안적인 구체예에 있어서, 후보 생물학적 제제가 인큐베이션 및 세척되면서 먼저 첨가된 후, 경합물질이 첨가된다. 경합물질에 의한 결합의 부재는 생체활성 제제가 높은 친화성으로 ASP05 단백질에 결합됨을 나타낼 수 있다. 따라서, 후보 생체활성 제제가 표지화된 경우, 경합물질 결합 없이 커플링된 지지체상의 표지의 존재는 후보 제제가 ASP05 단백질에 결합할 수 있음을 나타낼 수 있다.
대안적으로, 한 가지 바람직한 구체예는 천연 ASP05 프로테아제에는 결합하지만 개질된 ASP05 프로테아제에는 결합할 수 없는 약물 후보체를 확인하기 위해 차동 스크리닝(differential screening)을 이용한다. ASP05 프로테아제의 구조는 모델링될 수 있고, 그 부위와 상호작용하는 제제를 합성하기 위해 합리적 약물 설계에 사용될 수 있다. 분해를 조절하는 약물 후보체는 약물을 ASP05 프로테아제에 의한 특이적 분해를 향상시키거나 감소시킬 수 있는 능력에 대해 스크리닝함으로써 또한 확인된다.
포지티브 대조표준 및 네거티브 대조표준이 검정에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 모든 대조표준 및 시험 샘플이 통계적으로 의미있는 결과를 수득하기 위해 적어도 3중으로 수행된다. 모든 샘플의 인큐베이션은 제제가 ASP05 프로테아제에 결합하기에 충분한 시간 동안 이루어진다. 인큐베이션 후, 모든 샘플은 비특이적으로 결합된 물질이 유리되도록 세척되고, 결합된, 일반적으로 표지화된 제제의 양이 측정된다. 예를 들어, 방사성표지가 사용되는 경우, 샘플은 결합된 화합물의 양을 측정하기 위해 섬광 카운터로 카운팅될 수 있다.
ASP05의 활성을 조절하는 제제에 대한 스크리닝이 또한 수행될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질의 활성을 조절할 수 있는 생물학적 제제에 대해 스크리닝 방법은 상기한 바와 같이 후보 생체활성 제제를 ASP05의 샘플에 첨가하고, ASP05 단백질의 생물학적 활성의 변화를 측정하는 단계를 포함한다. "ASP05의 활성을 조절하는"이란 활성의 증가, 활성의 감소, 또는 존재하는 활성의 타입 또는 종류의 변화를 포함한다. 따라서, 이러한 구체예에 있어서, 후보 제제는 ASP05에 결합하고(그러나, 이것은 필수적이 아닐 수 도 있다), 본원에 규정된 이것의 생물학적 또는 생화학적 활성을 변화시켜야 한다. 본 발명의 방법은 ASP05 단백질의 존재, 분포, 활성 또는 양의 변화에 대한 상기 일반적으로 약술된 시험관내 스크리닝 방법 및 생체내 스크리닝 둘 모두를 포함한다.
따라서, 이러한 구체예에 있어서, 본 발명의 방법은 ASP05 단백질과 후보 생체활성 제제를 혼합하고, 당 분야에 공지된 ASP05 단백질의 생물학적 활성을 시험하여 ASP05의 활성에 대한 제제의 효과를 평가하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 "ASP05 활성" 또는 문법적 동의어는 IGFBP를 선택적으로 분해시킬 수 있는 ASP05의 능력, IGFBP에 결합할 수 있는 ASP05의 능력 및 IGF-매개된 세포 기능을 변화시킬 수 있는 ASP05의 능력을 포함하는 ASP05의 추정적으로 확인된 기능 중의 하나를 의미하지만 이들에 제한되지 않는다.
한 가지 구체예에 있어서, 이러한 조절은 ASP05의 촉매 도메인에 반응하여 생성될 수 있고, 선택적 분해의 감소 또는 증가에 상응할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05의 촉매 도메인의 활성이 증가되며; 또 다른 바람직한 구체예의 경우, ASP05의 촉매 도메인의 활성은 감소된다. 따라서, 안타고니스트(즉, ASP05 단백질의 활성을 감소시킨다)인 생체활성 제제가 몇몇 구체예에서 바람직하며, 아고니스트(즉, ASP05 단백질의 활성을 증가시킨다)인 생체활성 제제가 다른 구체예에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, ASP05 단백질에 결합하는 제제는 안타고니스트일 수 있다. 또한, ASP05 단백질에 결합하는 제제는 ASP05 단백질에 의한 특이적 분해를 증가시키므로, 아고니스트로서 작용할 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 이러한 조절은 ASP05의 결합 도메인에 대해 반응하여 생성될 수 있고, 결합의 감소 또는 증가에 상응할 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05의 결합 도메인의 활성이 증가되고; 또 다른 바람직한 구체예의 경우, ASP05의 결합 도메인의 활성이 증가된다. 따라서, 안타고니스트(즉, ASP05 단백질의 활성을 감소시킨다)인 생체활성 제제가 몇몇 구체예에서 바람직하며, 아고니스트(즉, ASP05 단백질의 활성을 증가시킨다)인 생체활성 제제가 다른 구체예에서 바람직할 수 있다. 예를 들어, ASP05 단백질에 의한 결합을 감소시키는 제제는 안타고니스트일 수 있다. 또한, 제제는 ASP05 단백질에 대한 결합을 증가시킬 수 있으므로, 아고니스트로서 작용할 수 있다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 ASP05 프로테아제의 세린 프로테아제 활성을 조절할 수 있는 생체활성 제제에 대해 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 규정된 후보 생체활성 제제를 ASP05 단백질 또는 ASP05 촉매 도메인을 포함하는 세포에 첨가시키는 것을 포함한다. 바람직한 세포 타입으로는, SF9 및 이.콜라이 세포 및 포유동물 세포가 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 세포는 ASP05 프로테아제를 코드화시키는 재조합 핵산을 함유하며; 즉, 세포는 ASP05를 발현시킨다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 후보 제제의 라이브러리는 다양한 IGFBP에 대한 다수의 검정에서 시험된다. 그 후, 예를 들어, 선택적 분해에 대한 후보 제제가 평가된다. ASP05가 작용성인 경우, 즉, 안타고니스트 제제가 존재하지 않는 경우, IGFBP는 항체 또는 리간드 검출을 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 바와 같이 선택적으로 분해되지 않을 것이다. 그러나, 안타고니스트 제제가 존재하는 경우, 분해는 일어나지 않을 것이다.
분해의 검출은 당업자에게 인식되는 바와 같이 수행될 것이다. 한 가지 구체예에 있어서, 정제된 ASP05는 IGFBP-1 내지 IGFBP-6을 포함하는 다양한 IGFBP와 인큐베이션되지만, 이들에 제한되지 않는다. 분석하려는 반응 생성물은 SDS-PAGE 겔상에서 조작된 후, 폴리비닐리딘 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮겨진다. 한 가지 또 다른 구체예에 있어서, 막은 IGFBP-특이적 항체와 인큐베이션된 후, HRP-컨쥬게이팅된 마우스 IgG 항체에 의해 예증된 2차 항체와 인큐베이션된 후, 화학발광에 의해 후속 가시화된다. 한 가지 대안적인 구체예에 있어서, 검출은125IGF-I(또는125IGF-II)와 인큐베이션된 후 자동방사선사진법에 노출됨으로써 달성된다.
또한, 형광 합성 펩티드를 기질로서 사용하는 검정은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 또한 수행될 수 있으며, 경합-타입 검정을 포함할 수 있다.
다수의 그 밖의 시약이 스크리닝 검정에 포함될 수 있다. 이들로는 최적 단백질-단백질 결합을 촉진시키고/거나 비특이적 또는 백그라운드 상호작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있는, 염과 같은 시약, 알부민과 같은 중성 단백질, 세정제 등이 있다. 또한, 프로테아제 억제제, 누클레아제 억제제, 항미생물 제제 등과 같은 검정의 효율을 개선시키는 시약이 사용될 수 있다. 성분의 혼합물은 필요한 결합을 제공하는 임의의 순서로 첨가될 수 있다.
이러한 방식으로, 생체활성 제제가 확인된다. 약리학적 활성을 갖는 화합물은 ASP05 단백질의 활성을 향상시키거나 간섭할 수 있다. 원하는 약리학적 활성을 갖는 화합물은 공지된 바와 같이 생리학적으로 허용되는 캐리어에 함유된 형태로 숙주에 투여될 수 있다. 제제는 경구적, 비경구적, 예를 들어 피하, 복강내, 정맥내 등의 광범위한 방식으로 투여될 수 있다. 도입 방식에 의존하여, 화합물은 광범위한 방식으로 제형화될 수 있다. 제형 중의 치료적으로 활성인 화합물의 농도는 약 0.1 내지 100 중량%일 수 있다.
약제 조성물은 과립, 정제, 알약, 좌약, 캡슐, 현탁액, 연고, 로션 등과 같은 다양한 형태로 제조될 수 있다. 경구용 및 국소용으로 적합한 약제 등급의 유기 또는 무기 캐리어 및/또는 희석제가 치료적 활성 화합물이 함유된 조성물을 구성하는 데에 사용될 수 있다. 당 분야에 공지된 희석로는 수성 매질, 식물성 및 동물성 오일 및 지방이 있다. 안정화제, 습윤 및 에멀션화제, 삼투압을 변화시키는 염 또는 적당한 pH 값을 고정시키는 완충제, 및 경피 인핸서가 보조제로서 사용될 수 있다.
이론에 국한시키고자 하는 것은 아니지만, ASP05가 뇌, 혈액, 뼈, 간, 근육, 신장 및 신경계로부터 유도된 세포를 포함하는 다수의 타입의 세포의 조절, 분화, 증식 및 기능에 관여하는 중요한 효소인 것으로 여겨진다. 따라서, 다양한 체액에서의 돌연변이체 또는 변이체 ASP05 형태 또는 농도에 입각한 질환이 측정될 수 있다. 한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 체액 및 조직내의 내인성 ASP05의 타입 및 농도를 측정하는 것을 포함하여 ASP05의 변이체 형태 또는 농도가 함유된 세포를 확인하는 방법을 제공한다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 이것은 당 분야에 일상적으로 사용되는 임의의 수의 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방법은 ASP05의 형태 또는 농도를 ASP05의 공지된 형태 또는 농도와 비교(즉, 상이한 생물학적 샘플 중의)하는 것을 포함한다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 환자의 ASP05의 형태 또는 농도와 ASP05의 공지된 형태 또는 농도의 차이의 존재는 본원에 약술된 바와 같이 질병 상태를 나타내거나 질병 상태의 경향을 나타낼 수 있다.
따라서, IGFBP의 선택적 분해에서의 ASP05의 역할에 관한 본 발명의 발견은 이러한 분해의 억제제에 대한 스크리닝 방법을 제공한다.
한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05 단백질, 특히 ASP05 단편은 IGF에 의해 매개되는 질환의 실험 또는 치료, 즉, IGF-매개된 질환을 진단하거나, 치료하거나 방지하는 데에 유용하다. 따라서, "IGF 매개된 질환" 또는 "질병 상태"로는 IGF에 의해 매개되는 질환 또는 세포 프로세스 뿐만 아니라 부적절한 IGF 대사를 갖는 질환을 포함하는 질환이 있다. 따라서, IGF 매개된 질환으로는 암(다양한 종류) 및 재발협착증과 관련된 네오인티멀(neointimal) 과형성, 종양 성장과 관련된 혈관형성과 같은 증식성 질환 및 가속된 황반 변성(AMD), 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증(ROP), 허혈성 망막증 및 혈관신생성 녹내장을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 눈의 혈관신생 질병이 있지만, 이들에 제한되지 않는다. 그 밖의 IGF 매개된 질환으로는 뼈 대사 질환, 예를 들어 골다공증, 및 골관절염, 근육, 뇌, 난소, 자궁 및 태반 질환이 있지만, 이들에 제한되지 않는다.
따라서, 한 가지 구체예에 있어서, IGFBP를 억제시키는 방법은 사람 질병의 치료를 위한 이러한 억제제의 사용과 일관된 방식으로 IGF 기능의 선택적 길항작용을 포함할 것이다. 한 가지 구체예에 있어서, 이러한 방법은 내인성 ASP05의 생물학적 활성을 감소시키거나 제거시키는 안티-ASP05-항체를 세포에 투여하는 것을 포함한다. 대안적으로, 이러한 방법은 ASP05를 코드화시키는 재조합 핵산을 세포 또는 생물체에 투여하는 것을 포함한다. 당업자에게 인식되는 바와 같이, 이것은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, ASP05의 활성은, 예를 들어 공지된 유전자-치료 기법을 이용하여 내인성 ASP05의 발현을 간섭하거나 개질된 ASP05를 코드화시키는 유전자를 투여하여, 세포내의 ASP05의 양을 감소시킴으로써 감소된다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 유전자 치료 기법으로는 외인성 유전자의 혼입이 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명은 개체의 IGF 매개된 질환을 진단하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 개체 또는 환자로부터의 조직의 ASP05의 활성 및 발현을 측정하는 것을 포함하며, ASP05의 양 또는 비활성의 측정을 포함할 수 있다. 이러한 활성은 정량되어, 온전한 제 2 개체로부터의 ASP05의 활성 또는 제 1 개체로부터의 온전한 조직으로부터의 ASP05의 활성을 비교된다. 이들 활성이 상이한 경우, 제 1 개체는 IGF 매개된 질환에 걸릴 위험이 있을 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 다양한 질병 상태의 모니터링이 ASP05의 수준을 모니터함으로써 수행될 수 있다. 유사하게는, ASP05 수준은 상기 열거된 질병 및 질환과 상호 관련될 수 있다.
한 가지 구체예에 있어서, 본 발명의 ASP05 단백질은 본원에 기술된 바와 같이 유용한, ASP05 단백질의 촉매 또는 결합 도메인에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 유사하게는, ASP05 단백질은 표준 기술을 사용하여 친화성 크로마토그래피 컬럼에 커플링될 수 있다. 그 후, 이들 컬럼은 ASP05 항체를 정제시키는 데에 사용될 수 있다. 한 가지 바람직한 구체예에 있어서, 항체는 ASP05 단백질에 독특한 에피토프에 대해 생성되며; 즉, 항체는 그 밖의 단백질에 대한 교차-반응성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 이들 항체는 다수의 분야에 사용된다. 예를 들어, ASP05 항체는 표준 친화성 크로마토그래피 컬럼에 커플링되어, ASP05 단백질을 정제시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 항체는 상기 약술된 바와 같이 블록킹 폴리펩티드로서 사용될 수 있는데, 이는 이들이 ASP05 단백질에 특이적으로 결합할 것이기 때문이다.
한 가지 구체예에 있어서, ASP05 또는 이의 억제제의 치료적 유효 용량이 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 "치료적 유효 용량"이란 투여에 따른 효과를 생성시키는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료의 목적에 좌우될 것이며, 공지된 기법을 사용하여 당업자에 의해 확인될 것이다. 당 분야에 공지된 바와 같이, ASP05 분해, 전신적 대 국소화된 전달, 및 새로운 프로테아제 합성율 뿐만 아니라 연령, 체중, 종합적 건강 상태, 성별, 규정식, 투여 시간, 약물 상호작용 및 질환의 심각도에 대한 조정이 필요할 수 있으며, 당업자에 의해 일상적인 실험으로 확인될 것이다.
본 발명의 목적을 위한 "환자"로는 사람 및 그 밖의 동물 모두가 있으며, 특히, 포유동물 및 생물체이다. 따라서, 본 발명의 방법은 사람 치료 및 수의학적 용도 둘 모두에 대해 적용가능하다. 바람직한 구체예에 있어서, 환자는 포유동물이고, 가장 바람직한 구체예에 있어서, 환자는 사람이다.
본 발명의 ASP05 또는 이의 억제제의 투여는 경구, 피하, 정맥, 비내, 경피, 복강내, 근내, 폐내, 경질, 직장 또는 안내 투여를 포함하지만 이들에 제한되지 않는 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 몇몇 경우, 예를 들어, 창상 및 염증의 치료에 있어서, ASP05 또는 이의 억제제는 용액 또는 스프레이로서 직접 도포될 수 있다.
본 발명의 약제 조성물은 ASP05 또는 이의 억제제를 환자에게 투여하기에 적당한 형태로 포함한다. 바람직한 구체예에 있어서, 약제 조성물은 수용성 형태, 예를 들어 산 부가염 및 염기 부가염 둘 모두를 포함함을 의미하는 약제학적으로 허용되는 염으로서 존재한다. "약제학적으로 허용되는 산 부가염"이란 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말레산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등으로 형성되는, 유리 염기의 생물학적 효과를 보유하며 생물학적으로 그 밖의 목적으로 바람직한 염을 의미한다.
"약제학적으로 허용되는 염기 부가염"으로는 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염 등으로부터 유도된 염이 있다. 특히 바람직하게는, 암모늄, 칼륨, 나트륨, 칼슘, 및 마그네슘 염이 있다. 약제학적으로 허용되는 유기 비독성 염기로부터 유도된 염으로는 1차, 2차 및 3차 아민, 천연 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민, 및 염기성 이온 교환 수지, 예를 들어 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민 및 에탄올아민의 염이 있다.
또한, 약제 조성물은 하기 성분 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 캐리어 단백질, 예를 들어 혈청 알부민; 완충제; 필러, 예를 들어 미세결정성 셀룰로오스, 락토오스, 옥수수 및 그 밖의 전분; 결합제; 감미제 및 기타 풍미제; 착색제; 및 폴리에틸렌 글리콜. 첨가제는 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 다수의 제형으로 사용된다.
하기 실시예는 상기 기술된 본 발명을 사용하는 방식을 더욱 상세히 설명할 뿐만 아니라, 본 발명의 다양한 일면을 수행하기 위해 고려되는 최상의 모드를 나타내는 기능을 한다. 이들 실시예는 어떤 방식으로 본 발명의 진정한 범위를 제한하는 것이 아니라 예시를 목적으로 제공된다. 본원에 인용된 모든 참고문헌은 이들 전체가 본원의 참고문헌으로서 포함된다.
실시예 1
온길이 ASP05 cDNA의 클로닝
어닐링, 연결, 및 폴리머라제 사슬 반응(PCR)을 조합시키는 방법을 사용하여 ASP05 cDNA의 합성 5' 말단을 생성시켰다. 합성 서열은 코딩 영역의 최초 156개 누클레오티드를 포함하였지만, 코드화된 아미노산 중 어느 하나도 변화시키지 않았다. 온길이 cDNA는 1443개 누클레오티드(정지 코돈을 포함함)를 함유한다. 완전한 천연 cDNA 서열, 및 활성 단백질을 발현시키는데 사용되는 서열을 도 2에 도시하였다. 어닐링에 사용된 12개의 올리고누클레오티드는 다음과 같았다:
상보적 올리고누클레오티드(각각 50 pmol)을 10mM Tris-CI(pH 7.4), 150mM NaCl 중에서 혼합시킨 후, 95℃에서 3분간 가열시키고 서서히 실온으로 냉각시켰다. 그 후, 모든 6개의 어닐링된 DNA 단편쌍을 혼합시키고, 급속 DNA 연결 시약(Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN)과 연결시켰다. 이러한 연결된 cDNA를, PCR 반응에서 프라이머 5'-ACT ATG CAG ATT CCA AGA GCT G-3'(서열 16) 및 5'-GTC TAA AGC TTG CGA AAC AAT TCG-3' (서열 17)과 함께 주형으로서 사용하여, 완전한 단편을 증폭시켰다. PCR을, cDNA 단편 및 프라이머(각각 100pmol), 각각의 dNTP 0.2mM, 0.1 U의 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer, Branchburg, NJ), 50mM KCI, 1.75mM MgCl 및 10mM Tris-HCl(pH 8.4)가 함유된 100㎕ 용액 중에서 수행하였다. PCR을 다음과 같은 증폭 프로파일로 25 사이클 동안 수행하였다: 1분간의 95℃ 변성, 1분간의 55℃ 어닐링, 그 후, 1분간의 72℃ 연장(extension). PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)내로 클로닝시켰다.
ASP05의 3'-870 bp 말단을 주형으로서의 사람 태반 cDNA(Clontech, Palo Alto, CA) 및 서열 5'-AAT TGT TTC GCA AGC TTC CGT TTT CTA AAC G-3' (서열 18)의 5' 말단 프라이머와 서열 5-AGT CTA GAA TTC CAT GAA GTC CAG CTC ATG CCT CTGCCT ATG G-3' (서열 19)의 3' 말단 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 클로닝시켰다. 이러한 단편을 증폭시키고, 상기한 바와 동일한 방식으로 클로닝시켰다.
5' 말단 단편을 제한 효소인 BamHI와 HindIII로 벡터로부터 절제시키고, 1% 아가로오스 겔로 벡터로부터 분리시켰다. 예상된 크기를 갖는 DNA 밴드를 퀵 겔 익스트랙션 리전츠(Quick Gel Extraction Reagents; Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)로 추출시켰다. 정제된 DNA 단편을 급속 연결 시약으로 HindIII 부위에서 3' 말단 단편에 연결시켰다. 온길이 ASP05 cDNA를 ABI 377 DNA 시퀀서(ABI Division, Perkin Elmer, Foster City, CA)를 사용하여 양 방향에서 완전 서열화시켰다.
실시예 2
바쿨로바이러스에서의 ASP05의 발현 및 단백질의 정제
박-대-박(Bac-to-Bac) 바쿨로바이러스 발현 시스템(GibcoBRL, Gaithersburg, MD)를 단백질을 발현시키는 데에 사용하였다. 간단하게, 플래그 에피토프(Eastman Kodak, New Haven. CT)로 태깅된 ASP05 cDNA를 pFASTBac1 벡터내로 연결시킨 후, DH1 OBac 컴피턴트(competent) 세포내로 형질전환시켜서, 재조합 박미드(bacmid)를 생성시켰다. 박미드 DNA를 sf9 곤충 세포내로 트랜스펙션시켜서, 재조합 바쿨로바이러스를 생성시켰다. 고역가 스톡(stock)를 Sf-900 II SFM에서 배양시킨 sf9 곤충 세포(감염의 다양성은 5 보다 크다)를 감염시키기 위해 사용하였다. 배지를 감염시킨 지 48시간 후에 수거하였다. 발현된 단백질을 발현된 ASP05의 C-말단부내로 공학처리된 플래그 에피토프 태그에 특이적인 아가로오스-연결된 항체를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 간단하게, 플래그 아가로오스 4㎖를 4℃에서 2시간 동안 배지 900㎖와 인큐베이션시킨 후, 아가로오스 배지 슬러리를 10㎖ 컬럼내로 부었다. 겔을 20 겔 부피의 포스페이트-완충된-염수(PBS, pH 7.2)로 세척시키고, 결합된 ASP05을 4 겔 부피의 Tris-글리신 용액(pH 2.5)으로 용리시켰다. 용리액을 10x PBS로 즉시 중화시키고, 마이크로셉(microsep) 10K(Filtron, Northborough, MA)로 20배 농축시켰다. 농축된 단백질을 4℃에서 PBS에 대해 밤새 투석시켰다. 친화성 정제된 ASP05를 BCA 단백질 정량 시약(Pierce, Rockford, IL)로 정량하였다.
실시예 3
ASP05의 N-말단 아미노산의 결정
정제된 ASP05(2㎍)을 4 내지 20% 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)상에서 조작한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막으로 옮겼다. 막을 50% 메탄올 중의 쿠마시에 블루로 5분간 염색시키고, 10% 아세트산 및 10% 메탄올로 탈염색시켰다. 정확한 분자량을 갖는 단백질 밴드를 잘라내어, 서열 분석을 위해 프로테인 스트럭처 라보라토리스(Protein Structure Laboratories; University of California, Davis)에 보냈다.
곤충 세포 발현된 성숙한 ASP05의 N-말단 서열은 다음과 같았다:
실시예 4
ASP05의 단백질분해 활성의 분석
정제된 ASP05(200nM)을 25mM Hepes(pH 7.4), 25mM CHES, 50mM NaCl 및 0.025% Tween 20 (검정 완충액) 중에서 125nM IGFBP-5와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 분석하려는 반응 생성물을 4 내지 20% 구배 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)에서 조작한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막으로 옮긴 후, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl 및 0.05% Tween 20(TBST) 중의 1% 우혈청알부민(BSA)로 1시간 동안 블록킹시켰다. 그 후, 막을 IGFBP-5 항체(Autral Biologicals)와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TBST로 3회(각각 15분) 세척한 후, 막을 HRP-컨쥬게이팅된 마우스 IgG 항체와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PVDF 막을 각각 15분간 3회 재세척하고, 단백질을 ECL 화학발광(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의해 가시화시켰다. 시험시에, ASP05가 IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4 또는 IGFBP-6을 분해시키는 경우, 각각의 125nM을 IGFBP-5 대신에 반응에 첨가시키고, 분석을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다 (도 4A 참조).
실시예 5
IGFBP의 ASP05 분해 활성의 리간드 블롯 분석
정제된 ASP05(200nM)을 25mM Hepes(pH 7.4), 25mM CHES, 50mM NaCl 및 0.025% Tween 20(검정 완충액)의 20㎖ 중에서 각각 125nM의 IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5 및 IGFBP-6과 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응 생성물을 비환원성 4 내지 20% 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)상에서 조작하고, 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 0.15M NaCl, 0.01M Tris-HCl(pH 7.4)(TS) 및 3% NP40 중에서 4℃(이하, 모든 단계는 4℃에서 수행된다)에서 30분간 인큐베이션시킨 후, TS, 1% BSA에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 막을 TS+Tween 20 중에서 10분간 린싱시켰다. 그 후, 막을 TS, 1% BSA 및 0.1% Tween 20의 3㎖ 중에서 400,000 cpm의125IGF-I(또는125IGF-II)와 인큐베이션시켰다. TS, 0.1% Tween 20 중에서 매회 15분씩 2회 세척하고, TS 중에서 15분간 1회 세척한 후, 막을 공기 건조시키고, X-레이 필름에 밤새 노출시켰다. 필름을 자동 필름 현상기 코니카 QX-130A로 현상하였다 (도 4B).
실시예 6
ASP05의 단백질분해 활성에 대한 프로테아제 억제제의 억제 효과
ASP05의 단백질분해 활성에 대한 프로테아제 억제제의 억제 효과를 분석하기 위해, 개개의 억제제를 검정 완충액에서 ASP05와 각각 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, IGFBP-5를 상기한 바와 같이 첨가시켰다. 반응물을 37℃에서 2시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 분석된 프로테아제 억제제(및 사용된 농도)는 다음과 같았다: 아프로티닌(1.5μM); 안티파인(antipain)(370μM); 3,4-DCI(1mM); E64(140μM); 루펩틴(5μM); 펩스타틴 A(5μM); PMSF(5mM); L-1-클로로-3-(4-토실아미도)-7-아미노-2-헵타논-HCl(TLCK)(675μM); L-1-클로로-3-(4-토실아미도)-4-페닐-2-부타논(TPCK)(1.4mM) 및 EDTA(10mM). 결과를 도 5에 나타내었고, 이는 ASP05가 시험된 억제제 중에서 세린 프로테아제 억제제인 3,4-디클로로이소쿠마린(레인 5) 및 PMSF(레인 9)에 의해서만 억제됨을 나타낸다.
실시예 7
ASP05의 자체분해 활성의 평가
정제된 ASP05(200nM)을 25mM Hepes(pH 7.4), 25mM CHES, 50mM NaCl 및 0.025% Tween 20(검정 완충액) 20㎕ 중에서 37℃에서 15시간 동안 인큐베이션시켰다. 반응물 10㎕를 4 내지 20% 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE)상에서 조작한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF)막으로 옮긴 후, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl 및 0.05% Tween 20(TBST) 중의 1% 우혈청알부민(BSA)로 1시간 동안 블록킹시켰다. 그 다음, 막을 ASP05 펩티드 항체(Zymed, Inc.)와 인큐베이션시켰다. TBST로 매회 15분씩 3회 세척한 후, 막을 HRP 컨쥬게이팅된 토끼 IgG 항체와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PVDF 막을 매회 15분씩 3회 세척시키고, 단백질을 ECL 화학발광(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의해 가시화시켰다 (도 3).
실시예 8
ASP05의 C-말단 단편의 발현 벡터의 구성
폴리머라제 사슬 반응(PCR)을 사용하여 ASP05의 C-말단 단편을 코드화시키는 cDNA를 생성시켰다. PCR에 사용된 2개의 올리고누클레오티드는 다음과 같았다: 올리고 1: 5'-GAT CTA CGG ATC CCA AGC TGG TTT ATG TGT ATG C-3' (서열 21) 및 올리고 2: 5'-GAT CTA CCT GCA GAG GGT CAA TTT CGG CGG GAA TC-3' (서열 22). 이러한 2개의 올리고누클레오티드를 프라이머로서 사용하였고, 온길이 합성 ASP05 cDNA를 PCR 반응에서 주형으로서 사용하여 단편을 증폭시켰다. PCR을 주형과 프라이머(각가 100pmol), 각각의 dNTP 0.2mM, 1U의 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer, Branchburg, NJ), 50mM KCI, 1.75mM MgCl2및 10mM Tris-HCl(pH 8.4)가 함유된 100㎕ 용액에서 수행하였다. PCR을 다음과 같은 증폭 프로파일로 25 사이클 동안 수행하였다: 1분간의 95℃ 변성, 1분간의 55℃ 어닐링, 그 후, 1분간의 72℃ 연장. PCR 생성물을 페놀-클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시켰다. DNA 펠레트를 10mM Tris-HCl(pH 7.6), 1mM EDTA(TE) 중에서 재현탁시켰다.
증폭된 cDNA 단편을 제한 효소인 BamHI와 PstI로 37℃에서 1시간 동안 처리하고, 1% 아가로오스 겔로 정제시켰다. 예상된 크기를 갖는 DNA 밴드를 겔로부터 절제시키고, 퀵 겔 익스트랙션 시약(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)로 추출하였다. 정제된 DNA 단편을 BamHI와 PstI로 처리시킨 pQE-30 벡터(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)에 연결시키고, 증폭된 cDNA 단편과 동일한 방식으로 아가로오스 겔에 의해 정제시켰다. 제한 분해를 사용하여 cDNA가 정확한 배향으로 벡터내로 삽입됨을 입증하였다.
플라스미드(0.2㎍)를 SG13009 컴피턴트 세포(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA) 100㎕와 혼합시키고, 혼합물을 얼음상에서 20분간 유지시킨 후, 혼합물을 42℃에서 90분간 가열시켰다. 얼음상에서 2분간 냉각시킨 후, 10mM MgCl2가 함유된 SOC 배지 500㎕를 혼합물에 첨가시키고, 세포를 37℃에서 1시간 동안 격렬하게 진탕시켰다. 세포를 100㎎/㎖의 암피실린과 10㎎/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 아가 플레이트상에 스프레딩시키고, 37℃에서 밤새 성장시켰다.
실시예 9
이.콜라이에서의 ASP5의 C-말단 단편의 발현
하나의 형질전환된 이.콜라이 콜로니를 플레이트로부터 피킹(picking)하여, 100㎎/㎖의 암피실린과 10㎎/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 브로쓰 중에서 37℃에서 밤새 성장시키면서 격렬하게 진탕시켰다. 다음날 아침, 배양물을 LB-브로쓰로 1:50으로 희석시키고, 37℃에서 OD600이 0.5 이하가 되도록 성장시켰다. 이소프로필(3-D티오갈락토-피로노시드(IPTG)를 2mM의 최종 농도로 첨가시키고, 배양물을 3시간 더 계속 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고, 세포 펠레트를 탈이온수 200㎕ 중에 재현탁시켰다. 세포를 100㎕의 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드겔(SDS-PAGE) 샘플 완충액을 첨가시키고, 95℃에서 2분간 가열시킴으로써 용해시켰다. 각각 샘플 5㎕를 환원성 SDS-PAGE상에서 분리시키고, ASP05의 발현된 C-말단 단편을 쿠마시에 블루 염색에 의해 가시화시켰다.
실시예 10
ASP05의 C-말단 단편의 대규모 발현 및 정제
형질전환된 이.콜라이 콜로니를 100㎎/㎖의 암피실린과 10㎎/㎖의 카나마이신이 함유된 LB 3㎖ 중에서 37℃에서 밤새 성장시키면서 격렬하게 진탕시켰다. 15시간 후, 배양물을 미리 가온시킨 동일한 배지 150㎖로 옮기고, OD600이 0.6 이하가 되도록 성장시켰다. IPTG를 2mM의 최종 농도로 첨가시키고, 배양물을 5시간 더 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고, -80℃에서 동결시켰다. 다음날 아침, 세포를 6M 구아니딘-HCl, 0.1M Na-포스페이트, 및 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)(GuHCl) 20㎖ 중에서 해동시켰다. 세포를 실온에서 1시간 동안 교반시키고, 10,000g로 4℃에서 15분간 스피닝시켰다. 상층액을 10 컬럼 부피의 GuHCl로 미리 평형시킨 Ni-NTA 컬럼(Qiagen, Inc., Chatsworth, CA)상으로 로딩시켰다. 그 후, 컬럼을 10 컬럼 부피의 GuHCl 완충액으로 세척한 후, 8M 우레아, 0.1m Na-포스페이트 및 0.01M Tris-HCl(pH 8.0)으로 세척한 후, 10 컬럼 부피의 8M 우레아, 0.1m Na-포스페이트 및 0.01M Tris-HCl(pH 6.3)으로 세척시켰다. 결합된 단백질을 5 컬럼 부피의 8M 우레아, 0.1m Na-포스페이트 및 0.01M Tris-HCl(pH 4.5)로 용리시켰다. 단백질을 10mM Mes 완충액(pH 5.5)에 대해 투석시켰다. 투석 후, 우레아의 최종 농도는 10-7M 미만이었다.
실시예 11
ASP05의 C-말단 단편의 단백질분해 활성의 분석
ASP05의 정제된 C-말단 단편을 25mM Hepes(pH 7.4), 25mM CHES, 50mM NaCl 및 0.025% Tween 20(검정 완충액) 20㎕ 중의 125nM의 IGFBP-5와 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 반응 생성물을 4 내지 20% SDS-PAGE 상에서 조작한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막으로 옮긴 후, 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 150mM NaCl 및 0.05% Tween 20(TBST) 중의 1% 우혈청알부민(BSA)로 1시간 동안 블록킹시켰다. 그 다음, 막을 IGFBP-5 항체(Autral Biologicals, San Ramon, CA)와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. TBST로 매회 15분씩 3회 세척한 후, 막을 HRP-컨쥬게이팅된 마우스 IgG 항체와 1시간 동안 인큐베이션시켰다. PVDF 막을 매회 15분씩 3회 재세척하고, 단백질을 ECL 화학발광(Amersham, Arlington Heights, IL)에 의해 가시화시켰다.
단편을 다른 IGFBP, 즉, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4 또는 IGFBP-6을 분해시킬 수 있는 능력에 대해 시험하였다. 이들 반응의 경우, 각각의 IGFBP 125nM을 상기 기술된 바와 같이 IGFBP-5 대신 반응에 첨가시켰다.
SEQUENCE LISTING
＜110＞ Axys Pharmaceuticals, Inc.
＜120＞ Novel Serine Protease Capable of Selective Cleavage of
Insulin-like Growth Factor Binding Protein
＜130＞ FP66065-1/RMS/DSS
＜140＞ PCT/US99/09224
＜141＞ 1999-04-28
＜150＞ 60/083,321
＜151＞ 1998-04-28
＜160＞ 24
＜170＞ PatentIn Ver. 2.0
＜210＞ 1
＜211＞ 1443
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜221＞ CDS
＜222＞ (1)..(1443)
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 1
atg cag att cca aga gct gca ttg tta cct ctt ctg tta tta ctg ctc 48
Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
gca gct cct gca tct gca caa ctt tct cga gct gga aga tct gct cca 96
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
tta gct gct gga tgt cct gat aga tgt gag cca gct aga tgt cct cca 144
Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro
35 40 45
caa cct gaa cat tgc gaa ggt ggt aga gct aga gat gca tgc gga tgt 192
Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys
50 55 60
tgc gaa gtt tgc gga gct cct gaa gga gct gct tgt gga tta caa gag 240
Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu
65 70 75 80
ggt cct tgt gga gaa ggt cta caa tgc gta gtt cca ttc gga gta cca 288
Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro
85 90 95
gct tca gca aca gta aga cga agg gcc caa gct ggt tta tgt gta tgc 336
Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys
100 105 110
gcg agt tca gaa cca gta tgt ggc tct gat gca aat aca tac gca aac 384
Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn
115 120 125
tta tgc caa ttg aga gct gct tct aga cgt agt gaa aga cta cat aga 432
Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg
130 135 140
ccg cct gtt ata gtc ctg caa cgg gga gcc tgc ggc caa ggg cag gaa 480
Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu
145 150 155 160
gat ccc aac agt ttg cgc cat aaa tat aac ttt atc gcg gac gtg gtg 528
Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val
165 170 175
gag aag atc gcc cct gcc gtg gtt cat atc gaa ttg ttt cgc aag ctt 576
Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu
180 185 190
ccg ttt tct aaa cga gag gtg ccc gtg gct agt ggg tct ggg ttt att 624
Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile
195 200 205
gtg tcg gaa gat gga ctg atc gtg aca aat gcc cac gtg gtg acc aac 672
Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn
210 215 220
aag cac cgg gtc aaa gtt gag ctg aag aac ggt gcc act tac gaa gcc 720
Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
aaa atc aag gat gtg gat gag aaa gca gac atc gca ctc atc aaa att 768
Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile
245 250 255
gac cac cag ggc aag ctg cct gtc ctg ctg ctt ggc cgc tcc tca gag 816
Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu
260 265 270
ctg cgg ccg gga gag ttc gtg gtc gcc atc gga agc ccg ttt tcc ctt 864
Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu
275 280 285
caa aac aca gtc acc acc ggg atc gtg agc acc acc cag cga ggc ggc 912
Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly
290 295 300
aaa gag ctg ggg ctc cgc aac tca gac atg gac tac atc cag acc gac 960
Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp
305 310 315 320
gcc atc atc aac tat gga aac tcg gga ggc ccg tta gta aac ctg gac 1008
Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp
325 330 335
ggt gaa gtg att gga att aac act ttg aaa gtg aca gct gga atc tcc 1056
Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser
340 345 350
ttt gca atc cca tct gat aag att aaa aag ttc ctc acg gag tcc cat 1104
Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His
355 360 365
gac cga cag gcc aaa gga aaa gcc atc acc aag aag aag tat att ggt 1152
Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly
370 375 380
atc cga atg atg tca ctc acg tcc agc aaa gcc aaa gag ctg aag gac 1200
Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp
385 390 395 400
cgg cac cgg gac ttc cca gac gtg atc tca gga gcg tat ata att gaa 1248
Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu
405 410 415
gta att cct gat acc cca gca gaa gct ggt ggt ctc aag gaa aac gac 1296
Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp
420 425 430
gtc ata atc agc atc aat gga cag tcc gtg gtc tcc gcc aat gat gtc 1344
Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val
435 440 445
agc gac gtc att aaa agg gaa agc acc ctg aac atg gtg gtc cgc agg 1392
Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg
450 455 460
ggt aat gaa gat atc atg atc aca gtg att ccc gaa gaa att gac cca 1440
Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
465 470 475 480
tag 1443
＜210＞ 2
＜211＞ 480
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜400＞ 2
Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro
35 40 45
Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Arg Ala Arg Asp Ala Cys Gly Cys
50 55 60
Cys Glu Val Cys Gly Ala Pro Glu Gly Ala Ala Cys Gly Leu Gln Glu
65 70 75 80
Gly Pro Cys Gly Glu Gly Leu Gln Cys Val Val Pro Phe Gly Val Pro
85 90 95
Ala Ser Ala Thr Val Arg Arg Arg Ala Gln Ala Gly Leu Cys Val Cys
100 105 110
Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr Tyr Ala Asn
115 120 125
Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg Leu His Arg
130 135 140
Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln Gly Gln Glu
145 150 155 160
Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala Asp Val Val
165 170 175
Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe Arg Lys Leu
180 185 190
Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ile
195 200 205
Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val Val Thr Asn
210 215 220
Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr Tyr Glu Ala
225 230 235 240
Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu Ile Lys Ile
245 250 255
Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg Ser Ser Glu
260 265 270
Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro Phe Ser Leu
275 280 285
Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln Arg Gly Gly
290 295 300
Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile Gln Thr Asp
305 310 315 320
Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val Asn Leu Asp
325 330 335
Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala Gly Ile Ser
340 345 350
Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr Glu Ser His
355 360 365
Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys Tyr Ile Gly
370 375 380
Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu Leu Lys Asp
385 390 395 400
Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr Ile Ile Glu
405 410 415
Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys Glu Asn Asp
420 425 430
Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala Asn Asp Val
435 440 445
Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val Val Arg Arg
450 455 460
Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu Ile Asp Pro
465 470 475 480
＜210＞ 3
＜211＞ 1443
＜212＞ DNA
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 3
atgcagatcc cgcgcgccgc tcttctcccg ctgctgctgc tgctgctggc ggcgcccgcc 60
tcggcgcagc tgtcccgggc cggccgctcg gcgcctttgg ccgccgggtg cccagaccgc 120
tgcgagccgg cgcgctgccc gccgcagccg gagcactgcg agggcggccg ggcccgggac 180
gcgtgcggct gctgcgaggt gtgcggcgcg cccgagggcg ccgcgtgcgg cctgcaggag 240
ggcccgtgcg gcgaggggct gcagtgcgtg gtgcccttcg gggtgccagc ctcggccacg 300
gtgcggcggc gcgcgcaggc cggcctctgt gtgtgcgcca gcagcgagcc ggtgtgcggc 360
agcgacgcca acacctacgc caacctgtgc cagctgcgcg ccgccagccg ccgctccgag 420
aggctgcacc ggccgccggt catcgtcctg cagcgcggag cctgcggcca agggcaggaa 480
gatcccaaca gtttgcgcca taaatataac tttatcgcgg acgtggtgga gaagatcgcc 540
cctgccgtgg ttcatatcga attgtttcgc aagcttccgt tttctaaacg agaggtgccg 600
gtggctagtg ggtctgggtt tattgtgtcg gaagatggac tgatcgtgac aaatgcccac 660
gtggtgacca acaagcaccg ggtcaaagtt gagctgaaga acggtgccac ttacgaagcc 720
aaaatcaagg atgtggatga gaaagcagac atcgcactca tcaaaattga ccaccagggc 780
aagctgcctg tcctgctgct tggccgctcc tcagagctgc ggccgggaga gttcgtggtc 840
gccatcggaa gcccgttttc ccttcaaaac acagtcacca ccgggatcgt gagcaccacc 900
cagcgaggcg gcaaagagct ggggctccgc aactcagaca tggactacat ccagaccgac 960
gccatcatca actatggaaa ctcgggaggc ccgttagtaa acctggacgg tgaagtgatt 1020
ggaattaaca ctttgaaagt gacagctgga atctcctttg caatcccatc tgataagatt 1080
aaaaagttcc tcacggagtc ccatgaccga caggccaaag gaaaagccat caccaagaag 1140
aagtatattg gtatccgaat gatgtcactc acgtccagca aagccaaaga gctgaaggac 1200
cggcaccggg acttcccaga cgtgatctca ggagcgtata taattgaagt aattcctgat 1260
accccagcag aagctggtgg tctcaaggaa aacgacgtca taatcagcat caatggacag 1320
tccgtggtct ccgccaatga tgtcagcgac gtcattaaaa gggaaagcac cctgaacatg 1380
gtggtccgca ggggtaatga agatatcatg atcacagtga ttcccgaaga aattgaccca 1440
tag 1443
＜210＞ 4
＜211＞ 85
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 4
atgcagattc caagagctgc attgttacct cttctgttat tactgctcgc agctcctgca 60
tctgcacaac tttctcgagc tggaa 85
＜210＞ 5
＜211＞ 93
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 5
agcagatctt ccagctcgag aaagttgtgc agatgcagga gctgcgagca gtaataacag 60
aagaggtaac aatgcagctc ttggaatctg cat 93
＜210＞ 6
＜211＞ 103
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 6
gatctgctcc attagctgct ggatgtcctg atagatgtga gccagctaga tgtcctccac 60
aacctgaaca ttgcgaaggt ggtagagcta gagatgcatg cgg 103
＜210＞ 7
＜211＞ 103
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 7
cgcaacatcc gcatgcatct ctagctctac caccttcgca atgttcaggt tgtggaggac 60
atctagctgg ctcacatcta tcaggacatc cagcagctaa tgg 103
＜210＞ 8
＜211＞ 90
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 8
atgttgcgaa gtttgcggag ctcctgaagg agctgcttgt ggattacaag agggtccttg 60
tggagaaggt ctacaatgcg tagttccatt 90
＜210＞ 9
＜211＞ 91
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 9
ggtactccga atggaactac gcattgtaga ccttctccac aaggaccctc ttgtaatcca 60
caagcagctc cttcaggagc tccgcaaact t 91
＜210＞ 10
＜211＞ 99
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 10
cggagtacca gcttcagcaa cagtaagacg aagggcccaa gctggtttat gtgtatgcgc 60
gagttcagaa ccagtatgtg gctctgatgc aaatacata 99
＜210＞ 11
＜211＞ 98
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 11
agtttgcgta tgtatttgca tcagagccac atactggttc tgaactcgcg catacacata 60
aaccagcttg ggcccttcgt cttactgttg ctgaagct 98
＜210＞ 12
＜211＞ 96
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 12
cgcaaactta tgccaattga gagctgcttc tagacgtagt gaaagactac atagaccgcc 60
tgttatagtc ctgcaacggg gagcctgcgg ccaagg 96
＜210＞ 13
＜211＞ 97
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 13
tcttcctgcc cttggccgca ggctccccgt tgcaggacta taacaggcgg tctatgtagt 60
ctttcactac gtctagaagc agctctcaat tggcata 97
＜210＞ 14
＜211＞ 103
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 14
gcaggaagat cccaacagtt tgcgccataa atataacttt atcgcggacg tggtggagaa 60
gatcgcccct gccctggttc atatcgaatt gtttcgcaag ctt 103
＜210＞ 15
＜211＞ 94
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 15
aagcttgcga aacaattcga tatgaaccac ggcaggggcg atcttctcca ccacgtccgc 60
gataaagtta tatttatggc gcaaactgtt ggga 94
＜210＞ 16
＜211＞ 22
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 16
actatgcaga ttccaagagc tg 22
＜210＞ 17
＜211＞ 24
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 17
gtctaaagct tgcgaaacaa ttcg 24
＜210＞ 18
＜211＞ 31
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 18
aattgtttcg caagcttccg ttttctaaac g 31
＜210＞ 19
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 19
agtctagaat tccatgaagt ccagctcatg cctctgccta tgg 43
＜210＞ 20
＜211＞ 63
＜212＞ PRT
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 20
Met Gln Ile Pro Arg Ala Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ser Ala Gln Leu Ser Arg Ala Gly Arg Ser Ala Pro
20 25 30
Leu Ala Ala Gly Cys Pro Asp Arg Cys Glu Pro Ala Arg Cys Pro Pro
35 40 45
Gln Pro Glu His Cys Glu Gly Gly Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly
50 55 60
＜210＞ 21
＜211＞ 34
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 21
gatctacgga tcccaagctg gtttatgtgt atgc 34
＜210＞ 22
＜211＞ 35
＜212＞ DNA
＜213＞ Artificial Sequence
＜220＞
＜223＞ Description of Artificial Sequence: synthetic
＜400＞ 22
gatctacctg cagtgggtca atttcggcgg gaatc 35
＜210＞ 23
＜211＞ 1185
＜212＞ DNA
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 23
atgagaggat cgcatcatca tcatcatcat ggatcccaag ctggtttatg tgtatgcgcg 60
agttcagaac cagtatgtgg ctctgatgca aatacatacg caaacttatg ccaattgaga 120
gctgcttcta gacgtagtga aagactacat agaccgcctg ttatagtcct gcaacgggga 180
gcctgcggcc aagggcagga agatcccaac agtttgcgcc ataaatataa ctttatcgcg 240
gacgtggtgg agaagatcgc ccctgccgtg gttcatatcg aattgtttcg caagcttccg 300
ttttctaaac gagaggtgcc ggtggctagt gggtctgggt ttattgtgtc ggaagatgga 360
ctgatcgtga caaatgccca cgtggtgacc aacaagcacc gggtcaaagt tgagctgaag 420
aacggtgcca cttacgaagc caaaatcaag gatgtggatg agaaagcaga catcgcactc 480
atcaaaattg accaccaggg caagctgcct gtcctgctgc ttggccgctc ctcagagctg 540
cggccgggag agttcgtggt cgccatcgga agcccgtttt cccttcaaaa cacagtcacc 600
accgggatcg tgagcaccac ccagcgaggc ggcaaagagc tggggctccg caactcagac 660
atggactaca tccagaccga cgccatcatc aactatggaa actcgggagg cccgttagta 720
aacctggacg gtgaagtgat tggaattaac actttgaaag tgacagctgg aatctccttt 780
gcaatcccat ctgataagat taaaaagttc ctcacggagt cccatgaccg acaggccaaa 840
ggaaaagcca tcaccaagaa gaagtatatt ggtatccgaa tgatgtcact cacgtccagc 900
aaagccaaag agctgaagga ccggcaccgg gacttcccag acgtgatctc aggagcgtat 960
ataattgaag taattcctga taccccagca gaagctggtg gtctcaagga aaacgacgtc 1020
ataatcagca tcaatggaca gtccgtggtc tccgccaatg atgtcagcga cgtcattaaa 1080
agggaaagca ccctgaacat ggtggtccgc aggggtaatg aagatatcat gatcacagtg 1140
attcccgaag aaattgaccc actgcagcca agcttaatta gctga 1185
＜210＞ 24
＜211＞ 394
＜212＞ PRT
＜213＞ Homo sapiens
＜400＞ 24
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Gln Ala Gly Leu
1 5 10 15
Cys Val Cys Ala Ser Ser Glu Pro Val Cys Gly Ser Asp Ala Asn Thr
20 25 30
Tyr Ala Asn Leu Cys Gln Leu Arg Ala Ala Ser Arg Arg Ser Glu Arg
35 40 45
Leu His Arg Pro Pro Val Ile Val Leu Gln Arg Gly Ala Cys Gly Gln
50 55 60
Gly Gln Glu Asp Pro Asn Ser Leu Arg His Lys Tyr Asn Phe Ile Ala
65 70 75 80
Asp Val Val Glu Lys Ile Ala Pro Ala Val Val His Ile Glu Leu Phe
85 90 95
Arg Lys Leu Pro Phe Ser Lys Arg Glu Val Pro Val Ala Ser Gly Ser
100 105 110
Gly Phe Ile Val Ser Glu Asp Gly Leu Ile Val Thr Asn Ala His Val
115 120 125
Val Thr Asn Lys His Arg Val Lys Val Glu Leu Lys Asn Gly Ala Thr
130 135 140
Tyr Glu Ala Lys Ile Lys Asp Val Asp Glu Lys Ala Asp Ile Ala Leu
145 150 155 160
Ile Lys Ile Asp His Gln Gly Lys Leu Pro Val Leu Leu Leu Gly Arg
165 170 175
Ser Ser Glu Leu Arg Pro Gly Glu Phe Val Val Ala Ile Gly Ser Pro
180 185 190
Phe Ser Leu Gln Asn Thr Val Thr Thr Gly Ile Val Ser Thr Thr Gln
195 200 205
Arg Gly Gly Lys Glu Leu Gly Leu Arg Asn Ser Asp Met Asp Tyr Ile
210 215 220
Gln Thr Asp Ala Ile Ile Asn Tyr Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu Val
225 230 235 240
Asn Leu Asp Gly Glu Val Ile Gly Ile Asn Thr Leu Lys Val Thr Ala
245 250 255
Gly Ile Ser Phe Ala Ile Pro Ser Asp Lys Ile Lys Lys Phe Leu Thr
260 265 270
Glu Ser His Asp Arg Gln Ala Lys Gly Lys Ala Ile Thr Lys Lys Lys
275 280 285
Tyr Ile Gly Ile Arg Met Met Ser Leu Thr Ser Ser Lys Ala Lys Glu
290 295 300
Leu Lys Asp Arg His Arg Asp Phe Pro Asp Val Ile Ser Gly Ala Tyr
305 310 315 320
Ile Ile Glu Val Ile Pro Asp Thr Pro Ala Glu Ala Gly Gly Leu Lys
325 330 335
Glu Asn Asp Val Ile Ile Ser Ile Asn Gly Gln Ser Val Val Ser Ala
340 345 350
Asn Asp Val Ser Asp Val Ile Lys Arg Glu Ser Thr Leu Asn Met Val
355 360 365
Val Arg Arg Gly Asn Glu Asp Ile Met Ile Thr Val Ile Pro Glu Glu
370 375 380
Ile Asp Pro Leu Gln Pro Ser Leu Ile Ser
385 390

Claims (33)

  1. 고도의 스트린전시(stringency) 조건하에서 도 1(서열 1)에 도시된 핵산 서열 또는 이의 상보적 서열의 누클레오티드 481 내지 1113에 하이브리드화하고, 도 2(서열 3)의 야생형 ASP05 핵산의 핵산 서열과 비교하여 10% 이상 감소된 GC 함량을 갖는 핵산을 포함하는 재조합 핵산.
  2. 제 1항에 있어서, 고도의 스트린전시 조건하에서 도 1(서열 3)에 도시된 핵산 서열에 하이브리드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  3. 도 1(서열 2)의 아미노산 서열의 아미노산 161 내지 371을 코드화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산으로서, 핵산 서열이 도 3의 천연 핵산 서열과 비교하여 10% 이상 감소된 GC 함량을 갖는 재조합 핵산.
  4. 제 3항에 있어서, 도 1(서열 2)의 ASP05 단백질을 코드화함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  5. 제 1항에 있어서, 서열 1의 누클레오티드 서열 또는 이의 상보적 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  6. 제 1항에 있어서, 서열 1의 누클레오티드 서열 또는 이의 상보적 서열의 누클레오티드 481 내지 1113을 포함함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  7. 제 1항에 있어서, 고도의 스트린전시 조건하에서 도 1(서열 1)의 누클레오티드 481 내지 1113에 하이브리드화하는 핵산을 필수 성분으로 함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  8. 제 1항에 있어서, 도 1(서열 2)의 아미노산 서열의 아미노산 잔기 161 내지 371을 코드화하는 핵산을 필수 성분으로 함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  9. 도 1(서열 2)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 30 내지 104를 코드화하는 핵산을 필수 성분으로 함을 특징으로 하는 재조합 핵산.
  10. 제 1항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  11. 제 3항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제 1항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  13. 제 3항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  14. 제 10항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  15. 제 11항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  16. (a) 제 12항의 숙주 세포를 ASP05 단백질을 발현시키기에 적합한 조건하에서 배양하고;
    (b) 세포 배양물로부터 ASP05 단백질을 회수하는 것을 포함하여, ASP05 단백질을 생성시키는 방법.
  17. 도 1(서열 2)의 아미노산 서열의 아미노산 161 내지 371을 포함하는 효소적으로 활성인 ASP05 단백질.
  18. 제 17항에 있어서, 도 1(서열 2)의 아미노산 1 내지 481을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  19. 고도의 스트린전시 조건하에서 도 1(서열 1)에 도시된 핵산 서열 또는 이의 상보적 서열의 누클레오티드 481 내지 1113에 하이브리드화하고, 도 3(서열 3)의 야생형 ASP05 핵산의 핵산 서열과 비교하여 10% 이상 감소된 GC 함량을 갖는 핵산에 의해 코드화된 재조합 ASP05 단백질.
  20. 제 19항에 있어서, 고도의 스트린전시 조건하에서 도 1(서열 3)에 도시된 핵산 서열에 하이브리드화하는 핵산에 의해 코드화됨을 특징으로 하는 단백질.
  21. 제 19항에 있어서, 서열 2의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
  22. 제 19항에 있어서, 도 1(서열 2)에 도시된 아미노산 서열의 아미노산 161 내지 371을 필수 성분으로 함을 특징으로 하는 단백질.
  23. 이종성 아미노산 서열에 융합된 ASP05 단백질의 촉매 도메인을 포함하는 키메라 분자.
  24. ASP05 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
  25. 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP)을, 도 1(서열 2)의 아미노산 서열의 아미노산 약 161 내지 371을 포함하는 효소적으로 활성인 ASP05 단백질과 혼합시키는 것을 포함하여, IGFBP를 선택적으로 분해시키는 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질이 분해되었음을 결정하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) 후보(candidate) 생체활성 제제와 ASP05 단백질의 촉매 도메인을 포함하는 단백질을 혼합시키고;
    (b) 제제가 ASP05 단백질의 활성을 조절하는 지를 결정하는 것을 포함하여, ASP05 단백질의 활성을 조절할 수 있는 생체활성 제제를 스크리닝하는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, ASP05 단백질이 온길이 ASP05 단백질을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  29. (a) 후보 생체활성 제제를 ASP05 단백질을 코드화하는 재조합 핵산을 포함하는 세포에 첨가시키는 단계(여기서, ASP05 단백질은 발현된다); 및
    (b) 제제가 발현된 ASP05 단백질이 없는 세포와 비교하여 ASP05 단백질의 활성을 조절하는 지를 결정하는 단계를 포함하여, IGFBP를 선택적으로 분해시킬 수 있는 세린 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 생체활성 제제를 스크리닝하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 후보 생체활성 제제의 라이브러리가 다수의 세포에 첨가됨을 특징으로 하는 방법.
  31. ASP05 단백질의 생물학적 활성을 조절하는 외인성 화합물을 세포에 투여하는 것을 포함하여, 세포에서의 IGFBP의 분해를 조절하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 조절이 ASP05 단백질의 생물학적 활성의 감소 또는 제거임을 특징으로 하는 방법.
  33. a) 제 1 개체의 제 1 조직의 ASP05 단백질의 활성을 측정하고;
    b) 첫 번째 ASP05 단백질 활성을, 제 2의 온전한 개체의 ASP05 단백질의 활성 또는 제 1 개체의 제 2의 온전한 조직으로부터의 ASP05 단백질의 활성과 비교하는 것을 포함하여, 제 1 개체의 IGF 관련된 질환을 진단하는 방법으로서,
    제 1 개체로부터의 ASP05 단백질의 활성이 제 2 개체 또는 제 2 조직의 ASP05 단백질의 활성과 비교하여 변경되어 있는 경우, 제 1 개체가 IGF 관련된 질환에 걸릴 위험이 있음을 나타내는 방법.
KR1020007012020A 1998-04-28 1999-04-28 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질을 선택적으로분해시킬 수 있는 세린 프로테아제 KR20010043127A (ko)

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US60/083,321 1998-04-28
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US09/300,621 1999-04-27
PCT/US1999/009224 WO1999055885A2 (en) 1998-04-28 1999-04-28 Novel serine protease capable of selective cleavage of insulin-like growth factor binding protein

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210047828A (ko) * 2019-10-22 2021-04-30 주식회사 지니스 '혈관내 혈전' 용해제
KR20210047690A (ko) * 2019-10-22 2021-04-30 주식회사 지니스 '혈관내 혈전' 용해제

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20210047828A (ko) * 2019-10-22 2021-04-30 주식회사 지니스 '혈관내 혈전' 용해제
KR20210047690A (ko) * 2019-10-22 2021-04-30 주식회사 지니스 '혈관내 혈전' 용해제

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