KR20010027418A - 말토오스 생성 아밀레이즈 또는 그것의 단편의 결정 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정화 방법; 말토오스 생성 아밀레이즈 결정 및 그 결정의 3차원 구조, 이러한 구조를 이용하여 올리고당 생산 활성이 개선된 말토오스 생성 아밀레이즈를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

말토오스 생성 아밀레이즈 또는 그것의 단편의 결정{Crystals of maltogenic amylase comprising and structure thereof}

본 발명은 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정화 방법, 말토오스 생성 아밀레이즈 결정 및 3차원 구조에 관한 것이다. 또한 당전이(transglycosylation) 활성이 개선된 아밀레이즈의 제조방법에 관한 것이다.

아밀레이즈는 전분을 가수분해하며 탄수화물의 대사에 중요한 역활을 한다. 다양한 형태의 아밀레이즈가 보고된 바 있는데, 대부분의 아밀레이즈가 알파-D-(1,4)-글리코시드 결합만 가수분해할 수 있는데 비하여 말토오스 생성 아밀레이즈 (Maltogenic amylase; EC 3.2.1.133)는 α-D-(1,4)-글리코시드 결합과 α-D-(1,6)-글리코시드 결합을 가수분해할 뿐 아니라, α-D-(1,4)-글리코시드 결합을 α-D-(1,3)-글리코시드 결합, α-D-(1,4)-글리코시드 결합, α-D-(1,6)-글리코시드 결합을 생성하도록 당 수용체(acceptor)에 전이시킬 수 있다. 또, 전분을 말토오스 단위로 분해하고, 풀루란 및 사이클로덱스트린을 분해할 수 있다.

말토오스 생성 아밀레이즈는 Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase; BSMA, GeneBank accession No. X67133) Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis maltogenic amylase; BLMA, GeneBank accession No. U50744), Bacillus subtilis 등으로부터 분리 되었으며(Kim 등, (1992) J. Biol. Chem. vol 267, 22108-22114), 최적온도가 60 ℃인 고온성 균주인 Thermus 중 유래의 효소가 한국특허출원 1998-63956에 보고되었다.

말토오스 생성 아밀레이즈는 특유의 당전이(transglycosylation) 활성은 다양한 유효성이 있는데, 그 중 하나가 분지올리고당(isomaltooligosaccharides)을 생산할 수 있다는 것이다. 분지올리고당은 포도당이 α-D-(1,4)-글리코시드 결합과 적어도 1개 이상의 α-D-(1,6)-글리코시드 결합으로 연결된 포도당 올리고머를 말하는데, 이러한 분지올리고당은 수분활성도가 낮아 식품의 저장성을 높일 수 있으며 식품 부패균이 대사할 수 없어 식품 부패균의 생육을 저해할 수 있고 흡습성이 커서 타 당류의 결정화 방지 효과가 있고, 전분질 식품의 노화를 방지할 수 있다. 또 장내에서 소화되지 않고, 충치 원인균이 대사할 수 없어 충치 발생을 저해할 수 있고, 장내 유용균인 Bifidus의 생육을 촉진하는 Bifiuds 인자로 알려져 있다.

또한 말토오스 생성 아밀레이즈는 아카보오스를 종래의 아밀라제에 의해 가수분해되지 않는 아카보오스를 분해하고, 올리고당을 단당류 또는 이당류의 수용체에 전이시켜 다양한 당전이물을 생산할 수 있다. 이러한 당전이물은 아밀레이즈 저해제로 작용할 수 있어 당뇨병 치료제 등으로 이용될 수 있다는 것이 보고되었다(한국특허출원 1998-63965).

당전이 효소 활성이 증대된 말토오스 생성 아밀레이즈를 얻기 위해서는 말토오스 생성 아밀레이즈의 아미노산 서열을 분석하고, 이들 각각에 대한 무작위적인 돌연변이를 통하여 보다 활성이 개선된 돌연변이체를 얻을 수 있다. 그러나 이러한 시도는 방대한 인력과 자원 및 시간을 필요로 할 뿐 아니라, 성공가능성이 극히 희박하다.

효소와 같은 생체 고분자들은 작은 기질을 인식하거나 다른 고분자를 인식하여 화학작용 또는 물리적 작용을 통하여 생화학적, 생물학적 기능을 발휘한다. 생체 고분자들은 기질 또는 다른 분자의 인식 부위를 가지고 있으며 이 부위의 3차원구조를 알면 그 생체 고분자의 기능의 저해, 활성화 또는 변환이 가능하다. 이와 같이 생체 고분자들의 3차원 구조를 밝히면 활성저해물질, 원하는 기능을 갖는 돌연변이체 창출 등에 유용한 정보를 얻을 수 있다.

표적 단백질의 분자 3차원 구조를 얻기 위해서는 엑스선 결정법과 핵자기공명(NMR) 분광학적 방법이 주로 사용되고 있으며, 이와 더불어 기존의 구조를 알고 있는 단백질과의 염기서열 상의 상동성을 비교한 결과를 이용하는 모델링 방법을 이용할 수 있다.

알파-아밀레이즈의 결정 구조는 Kadziloa, A 등 (1998) J. Mol. Biol. 278, 205∼217; Fujimoto, A. 등 (1998) J. Mol. Biol. 277, 393-407에 보고되었는데 이들 단백질은 공통의 폴딩 스케폴더인 (α/β)₈원통(barrel)을 가지며, 이 원통의 위쪽에 효소 활성 부위(active site)가 위치한다고 보고되었다.

그러나 말토오스 생성 아밀레이즈의 구조에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명의 목적은 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 당전이 활성이 향상된 아밀레이즈를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 X-선 회절로부터 유래된, ThMA의 원자 구조 코오디네이트 리스트이다. "원자형태"는 코오디네이트가 측정된 원소를 나타낸다. 컬럼의 첫번째 글자가 원소를 나타낸다.

"X", "Y", "Z"는 각 원소의, 결정학적으로 정의된 원자 위치이다.

"B"는 원자중심 둘레의 원자 운동을 측정하는 열인자(thermal factor)이다.

"0CC"는 분자에서 각 원자가 해당되는 코오디네이트에 의해 특정되는 위치를 차지하는 부분을 의미하는 점유 인자(occupancy factor)이다. "1"은 결정의 모든 분자에서 각 원자가 동일한 컨포메이션 즉, 동일한 위치를 가진다는 것을 의미한다.

도 2는 ThMA, BSMA, B. stearothermophilus NPase, Bacillus sp. CDase, A. oryzae TAKA-아밀레이즈의 아미노산 서열을 비교한 것이다. 아미노산 서열 위의 숫자는 ThMA을 기초로 한 것이고, Nβ1, Bβ1, Cβ1은 각각 N-도메인, (α/β)₈-원통, C-도메인의 첫번째 β-스트랜드를 나타낸다. ThMA와 비교하여 보존되지 않은 아미노산은 밝은 색의 그림자로 표시하였고, 검은색 박스는 촉매 잔기를 나타낸다.

도 3은 ThMA 단량체의 Cα트래이싱의 입체 모델이다. 번호는 아미노산 번호를 나타낸다.

도 4는 ThMA 단량체의 리본 다이아그램이다. N-도메인은 초록색, (α/β)₈-원통은 파란색, C-도메인은 연두색으로 표시하였다.

도 5는 β-CD가 결합된 ThMA 이량체의 리본 다이아그램이다. 180°회전된 형태로 위치하는 두 서브유니트를 다른 색으로 표시하였다.

도 6은 크기 배제 컬럼으로 ThMA 분자량을 측정한 결과이다.

도 7는 평형 원심분리 분석에 의해 ThMA 분자량을 측정한 결과이다.

도 8은 ThMA 분자의, 말토오스 결합 당-결합 포켓과 표면을 나타낸 모델이다.

도 9는 β-CD와 말토오스가 결합된 ThMA 이량체의 입체 모델이다. β-CD와 말토오스의 위치는 각각 도 5 및 도 8에서와 동일하다. 모든 산소 원자는 붉은색으로 표시하였다. 활성 부위를 구성하는 (α/β)₈-원통형과 N-도메인을 각각 초록색 및 짙은 분홍색으로 표시하였다.

도 10은 아카보오스를 ThMA와 반응시켰을 때의 반응 개략도이다.

본 발명은 말토오스 생성 아밀레이즈를 결정화(crystallization)하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정화 방법은

1) 말토오스 생성 아밀레이즈를 제조하는 단계; 및

2) 상기 말토오스 생성 아밀레이즈를 포함하는 용액으로부터, 0.3-0.7M 리튬 설페이트, 0.1-0.5M 암모니움 설페이트, pH 5.6인 0.05-0.3M 소디움 사이트레이트와 1-10에탄올(v/v)이 포함된 침전용액을 이용한 증기분산법에 의해 단백질을 결정화시키는 단계로 이루어진다.

본 발명의 결정화 방법에서, 2) 단계에서 아밀레이즈의 농도는 10-20 mg/ml인 것이 바람직하다.

말토오스 생성 아밀레이즈는 공지된 방법, 예를 들어 한국특허출원 1989-7818, 1998-63956 등에 기재된 방법으로 분리, 정제할 수 있다.

본 발명은 말토오스 생성 아밀레이즈 결정 및 그것의 3차원 구조에 관한 것이다.

본 발명에서 말토오스 생성 아밀레이즈는 어떤 미생물로부터 분리된 말토오스 생성 아밀레이즈 또는 그것의 컨센서스 서열, 말토오스 생성 아밀레이즈 기능을 가지는 도메인을 포함하는 말토오스 생성 아밀레이즈의 단편 또는 그것의 컨센서스 서열, 또는 이들과 기능적으로 동일한 아미노산 변이체를 모두 포함한다. 또 본 발명의 결정의 말토오스 생성 아밀레이즈는 정제에 도움이 되도록 N-말단 또는 C-말단에 아미노산이 부가된 것일 수 있다.

본 발명에 따른 아밀레이즈 결정은 기질 가수분해 활성 포켓을 가진다. 본 명세서에서 "가수분해 활성 포켓"은 도 1의 구조 코오디네이트에서 Asp-328, Glu-357, Asp-424로 표시된 아미노산 잔기로 이루어지는 활성 부위뿐 아니라 이러한 구조와 충분히 유사하여 전분, 사이클로덱스트린과 같은 말토오스 생성 아밀레이즈의 기질이 결합할 수 있는 구조를 의미한다. 이와 같은 구조의 유사함은 어떤 분자 또는 그것의 일부를 도 1에 기재된 구조 코오디네이트에 기재된 상응하는 골격 원자들과 겹쳐놓았을 때, 그 가수분해 활성 포켓의 아미노산의 골격 원자들의 구조 코오디네이트의 제곱-평균-제곱근의 편차(root mean square deviation)가 약 1.5Å이하로 표시되는 경우를 의미한다.

또다른 예로, 본 발명의 아밀레이즈 결정은 당전이에 필요한 당 수용체가 위치하는 당-결합 포켓을 가지는 구조를 가진다. 본 명세서에서 "당-결합 포켓"은 말토오스 생성 아밀레이즈의 당전이를 위해 필요한 당 수용체가 알맞게 위치할 수 있는 구조와 충분히 유사한 구조를 의미한다. 이와 같은 구조의 유사함은 어떤 분자 또는 그것의 일부를 도 1에 기재된 구조 코오디네이트에 기재된 상응하는 골격 원자들과 겹쳐놓았을 때, 그 당-결합 포켓의 아미노산의 골격 원자들의 구조 코오디네이트의 제곱-평균-제곱근의 편차가 약 1.5Å 이하로 표시되는 경우를 의미한다. 본 발명에서 당-결합 포켓은 예를 들어, 도 1의 코오디네이트에서 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116, Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 표시된 아미노산 잔기로 이루어지는 것과 같은 구조이다.

"제곱-평균-제곱근의 편차(root mean square deviation)"는 도 1에 기재된 구조 코오디네이트에 의해 결정되는 말토오스 생성 아밀레이즈 또는 그것의 활성 부위 또는 당-결합 포켓의 골격으로부터 비교 대상인 분자의 골격의 편차를 의미한다.

한 예로, 본 발명에 따른 말토오스 생성 아밀레이즈 결정은 한국특허출원 1995-63956에 기재된 Thermus sp. 에서 유래된 말토오스 생성 아밀레이즈(ThMA, GeneBank accession No. XF060204)의 결정이며, 이것은 공간 그룹이 P6₁이고, 유니트 셀 디멘션(unit cell dimension)이 a=b=118.04Å, c=266.88Å이며, 비대칭 유니트 안에 말토오스 생성 아밀레이즈 단량체 2분자가 포함되어 있는 이량체이다.

본 발명에서 말토오스 생성 아밀레이즈의 한 예로, ThMA의 3차원 X-선 결정 구조를 밝혔으며, 그 구조 코오디네이트 데이터를 도 1에 나타낸다. "구조 코오디네이트"는 단백질 결정의 원자들에 의한 X-선 모노크롬 빔의 회절 패턴을 기초로 얻은 Cartesian 코오디네이트를 의미한다. 이 회절 데이터로부터 결정의 반복단위의 전자 밀도 지도를 계산할 수 있으며, 이 전자 밀도 지도로부터 단백질의 각 원자의 위치를 결정할 수 있다.

본 발명에 의해, 말토오스 생성 아밀레이즈 결정이 비대칭 유니트 안에 말토오스 생성 아밀레이즈 단량체 2분자가 포함되어 있는 이량체 구조임을 밝혔다. 이와 같은 이량체 구조는 크기 배제 컬럼 크로마토그래피(size exclusion column chromatography) 및 평형 원심분리(equilibrium centrifugation)를 통하여 ThMA 및 BSMA(Gene Bank code 0069007)의 분자량을 측정한 결과에 의해서도 확인되었다. BSMA는 ThMA와 매우 유사한 3차 및 4차 구조를 가지며 두 효소 모두 용액 내에서도 이량체로 존재한다. 이로부터 말토오스 생산 아밀레이즈는 용액상에서 이량체로 존재한다는 것을 추측할 수 있다.

또한 본 발명은 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조를 제공한다.

본 발명에서 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조는 아래와 같은 방법으로 결정된다.

1) 말토오스 생성 아밀레이즈 결정의 냉각체 또는 중금속 유도체 결정을 사용하여 결정으로부터 엑스선 데이터를 얻는 단계,

2) 상기 단계에서 얻은 엑스선 데이터로부터 전자밀도를 계산하고 컴퓨터 프로그램을 이용하여 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조를 결정하는 단계.

상기 단계 2)에서 컴퓨터 프로그램은 엑스선 회절 데이터를 토대로 단백질의 3차원 구조를 결정하는 공지의 프로그램을 포함하는데, 상기 프로그램은 분자 대치법(molecular replacement, MR)과 다중 이질동상 대치법(multiple isomorphous replacement, MIR) 등을 그 원리로 이용한다. 상기 프로그램의 예로는, CCP4 패키지, 프로그램 O, 프로그램 CHAIN, 프로그램 X-PLOR 등이 있다.

본 발명에서 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조는 아래 방법으로 결정한다.

1) β-아밀레이즈의 3차원 구조 중 (α/β)₈원통을 검침(probe)로 사용하여 말토오스 생성 아밀레이즈 분자의 결정내 위치를 알아내어 전자 밀도 계산에 필요한 상(phases) 정보를 얻는 단계;

2) (HoCl₃, PtCl₂(NH₃)₂, Se-Met를 사용하여 각각의 중금속 원자가 들어간 결정으로부터 X-선 회절 데이터를 얻고 전자 밀도 계산에 필요한 상(phases) 정보를 얻는 단계;

3) 1) 단계 및 2) 단계로부터 얻은 상 정보를 기초로 정확한 상 정보를 얻고 이를 기초로 전자 밀도 지도를 계산하여 단백질 분자를 여기에 끼워 넣는 모델링 단계; 및

4) 컴퓨터 프로그램으로 분자 모델의 에너지 최소화(energy minimization)를 수행하는 단계로 이루어진다.

상기 단계 1)에서 β-아밀레이즈의 3차원 구조는 공지의 것(Protein Data Bank code 1BYA)을 이용할 수 있다.

상기 단계 1)과 3)에서 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 QUANTA 등이 있으며, 상기 단계 2)에서 이용할 수 있는 프로그램은 CCP4 팩키지 등이 있으며, 상기단계 4)에서 이용할 수 있는 컴퓨터 프로그램으로는 X-PLOR 등이 있다.

상기 3차원 구조는 일반적인 컴퓨터 장치에 저장되고 표시될 수 있다. 상기컴퓨터 장치에 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조를 표시하기 위해서 다양한 소프트웨어가 사용될 수 있는데, 예를 들어 프로그램 O, 프로그램 CHAIN, 프로그램 QUANTA 등이 사용될 수 있다.

다른 아밀레이즈들과 아미노산 서열을 비교한 결과, 말토오스 생성 아밀레이즈(ThMA, BSMA)는 네오플루라네이즈(NPase; EC 3.2.1.135), 사이클로말토덱스트리네이즈(CDase; EC 3.2.1.54)와 비교적 서열 호몰로지가 높으며, 3개의 촉매 잔기인 Asp-328, Glu-357, Asp-424(ThMA에서의 아미노산 번호)에서는 서로 완전히 일치하였다(도 2). 또, 말토오스 생성 아밀레이즈는 TAKA-아밀레이즈(TAA)와 같은 전형적인 α-아밀레이즈에는 없는 약 130 여개의 N-말단 아미노산 잔기를 가지고 있다.

ThMA는 도 1의 구조 코오디네이트에서 Asp-328, Glu-357, Asp-424로 표시된아미노산 잔기로 이루어지는 활성 부위를 가진다.

본 발명에 의해, ThMA의 활성 부위의 구조가 α-아밀레이즈 또는 β-아밀레이즈의 활성부위와는 상당히 다른 구조임을 밝혔다. ThMA 결정에서 비대칭 유니트를 이루는 이량체 중 한 서브유니트의 N-말단 부분이 다른 서브유니트의 (α/β)₈원통의 윗부분(α-아밀레이즈 또는 β-아밀레이즈의 활성부위)을 덮고 있다. 이로 인해 이 원통의 윗부분에서 이량체의 인터페이스는 길이 약 17Å, 넓이 약 8Å, 깊이 약 18Å인 좁고 깊은 홈(groove)을 형성한다. 홈의 바닥에 3개의 촉매 잔기, Asp-328, Glu-357, Asp-424가 존재하는 것으로 보아 이 홈이 활성 부위임을 확인하였다. 이와 같이 좁고 깊은 홈 모양의 활성 부위 구조는 말토오스 생성 아밀레이즈와 비교할 때 N-말단에 약 130개가 부족한 α-아밀레이즈와 같이 보다 적은 아밀레이즈의 넓고 얕은 활성 부위와 구조적으로 확연히 구분된다.

이 활성 부위의 형태를 기초로, 말토오스 생성 아밀레이즈가 사이클로덱스트린에 비해 전분이나 풀루란을 느리게 가수분해한다는 것을 설명할 수 있다. 사이클로덱스트린의 환형 구조는 용매 내에서 6-8개의 포도당 잔기로 이루어지는 헬릭스구조인 전분에 비해 좁은 형태로, QUANTA( Molecular Simulation, Inc)의 "solid docking" 모듈을 사용한 β-CD의 가상적인 결합 모드에서 보여지는 것과 유사하게 이 활성부위 홈에 알맞게 들어가며(도 5), 이 때 β-CD는 (α/β)₈원통과 N-말단의 많은 아미노산 잔기와 상호작용하면서 홈의 바닥에서 β-CD의 글루코시드 결합 중하나가 촉매 잔기들 가까이에 위치한다(도 9). 이에 비해 전분의 경우는 전분의 무질서한 부분만 ThMA의 촉매잔기에 가까이 접근할 수 있을 것으로 예상된다. 기질의 구조를 고려할 때 풀루란 역시 사이클로덱스트린 만큼 용이하게 말토오스 생성 아밀레이즈의 촉매 잔기에 도달하지 못할 것으로 예상된다.

또한, 본 발명에서는 ThMA의 촉매 부위의 바닥 깊숙한 부분에 (α/β)₈원통와 N-말단과 나란히 위치하며, 말토오즈와 같은 이당류가 들어가기에 적당한 크기인 당-결합 포켓을 가진다는 것을 밝혔다. 본 발명에서 당-결합 포켓은 예를 들어, 도 1의 코오디네이트에서 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116, Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 표시된 아미노산 잔기로 이루어지는 구조이다.

본 발명에서, 이러한 당-결합 포켓이 말토오스 생성 아밀레이즈의 당전이 활성에 특히 중요함을 밝혔다.

도 9에서 볼 수 있듯이 당-결합 포켓에서 말토오스의 C4-OH는 Glu-357로부터 3.6Å 떨어져 있는데 이러한 구조에서는 회전이 가능하며 구조적인 충돌없이 모델을 분자이동시킬 수 있다. 이러한 당-결합 포켓은 α-아밀레이즈와 같이 보다 적은 아밀레이즈에는 존재하지 않는다.

ThMA로 아카보오스를 가수분해하여 얻은 유사-3탄당(pseudo-trisaccharide; PTS), 분지 PTS를 얻는데, PTS와 포도당 모두를 고농도로 ThMA와 반응시키면 당전이물이 생성되지 않는다. 이로부터 당전이 반응은 가수분해반응과 동시에 진행된다는 것을 알 수 있다(도 10). 이러한 반응기작과, 수용체 농도가 높을 때에 당전이 반응이 일어난다는 것을 고려할 때, 수용체 분자가 물 분자와 경쟁적으로 글라이코실-효소 중간체(기질-효소 중간체)를 공격할 것이라는 것을 추론할 수 있다.

이를 위해서는 당 수용체가 효소의 기질 결합 위치 가까이에 존재할 필요가 있다. 따라서 말토오스 생성 아밀레이즈의 당-결합 포켓이 ThMA의 당전이 활성에 중요한 역활을 하며, 이 공간에 들어가는 단당류 또는 이당류가 효소-기질 중간체를 물 분자와 경쟁적으로 공격하게 된다. 당-결합 포켓에서 수용체인 당 분자는 C3, C4 또는 C6-OH가 기질-효소의 중간체를 친핵성(nucleophilic) 공격에 적당한 방향이 되도록 놓여질 수 있다.

이러한 당-결합 포켓의 중요성은 Glu-332 돌연변이의 효과에 의해서도 증명된다. ThMA의 Glu-332를 히스티딘으로 치환하면, 가수분해 활성에는 영향이 없으나α-D-(1,6)-당전이 생성물의 양은 급격히 감소한다. Glu-332는 α-아밀레이즈와 같이 보다 적은 아밀레이즈에서는 히스티딘으로 잘 보존되어 있다. 이러한 보다 적은 아밀레이즈에서는 이 위치의 히스티딘이 기질과의 결합에 중요한 역활을 한다고 알려져 있는데 비해, ThMA의 Glu-332는 당-결합 포켓에 위치하며, 당-결합 포켓에 적절하게 위치한 말토오스 분자와는 수소 결합이 가능한 거리에 있으나, 도 5 및 도 9에서 제시된 결합된 β-CD 모델과는 상호작용하지 않는다.

또한 본 발명은 당전이 특성이 향상된 말토오스 생성 아밀레이즈를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 구조 분석 결과 규명된 상기 3차원 구조 및 공지의 아밀레이즈 구조를 참고하여, 공지의 돌연변이법을 이용함에 의해 천연형보다 당전이 활성이 높은 재조합 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.

구체적으로 본 발명의 방법은 물 분자에 대해 당 수용체가 더욱 경쟁적으로 반응할 수 있도록 하기 위하여, 당 수용체가 위치하기에 더욱 적합한 "당-결합 포켓" 구조를 형성하도록 아미노산을 돌연변이시키는 것으로 이루어진다. "당-결합 포켓" 구조는 말토오스 생성 아밀레이즈의 종류에 따라 달라질 수 있을 것이다. 각 말토오스 생성 아밀레이즈의 "당-결합 포켓" 구조는 아미노산 서열 또는 3차원 구조를 통해 확인할 수 있을 것이다. 한 예로, 말토오스 생성 아밀레이즈, 특히 ThMA에서 도 1의 코오디네이트에서 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116, Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 표시된 아미노산 잔기로 이루어지는 구조 또는 이와 유사한 구조를, 당 수용체가 위치하기에 더욱 적합한 구조로 변형시키는 것으로 이루어진다.

본 발명에서 상기 아미노산 잔기들의 돌연변이는 종래에 잘 알려진 방법에 따라 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입 또는 결실시키는 것에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 ThMA의 생산, 분리 및 정제는 한국특허출원 1998-63956에 기재된 방법으로 수행하였다.

본 명세서에서 언급된 참고문헌들은 모두 본 명세서의 일부로 포함된다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 설명하나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1. 말토오스 생성 아밀레이즈의 생산 및 정제

Thermus sp. IM6501(KCTC 5027BP)에서 분리한 말토오스 생성 아밀라제 생성유전자를 플라즈미드 pUC119에 삽입시켜 얻은 재조합 DNA(pThMA119)을 E. coli MC1061에 도입시켜 얻은 형질전환체(E. coli MC1061/pThMA119; KCTC 5028BP)를 pH 7.0 LBA배지(박토-트립톤 10g/l, 효모추출물 5g/l, NaCl 5g/l를 포함하는 LB 배지에 100 g/ml의 엠피실린 첨가)에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하고 원심분리하여 균체를 얻었다. 회수한 균체를 pH 7.5의 50 mM Tris-HCl 완충용액으로 현탁시킨 다음 초음파로 파괴한 뒤 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 20-60(w/v)의범위에서 황산암모니움으로 분획하고 컬럼크로마토그래피로 DEAE-TOYOPEARL 및 Mono-Q 컬럼을 통과시켜 효소 역가를 측정하여 정제된 ThMA를 얻었다.

효소 역가는 효소액 0.05 ml에 pH 6.0의 50mM 소디움 아세테이트 완충용액 0.2 ml와 1(w/v)의 β-사이클로덱스트린 용액 0.25 ml를 넣은 후 60℃에서 30분간 반응시키고 DNS 용액을 넣어 반응을 중단시킨 뒤 5분간 끓여 발색시켜 575 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.

실시예 2. ThMA의 결정화

ThMA 결정은 섭씨 4℃에서 24웰 린브로 플레이트 (24-well Linbro plate)를 사용한 행잉드롭 증기분산법 (hanging-drop vapour-diffusion method)에 의하여 얻었다. 초기 결정화 스크리닝은 스파즈 매트릭스 스크리닝 키트 (sparse-matrix screening kit, Hampton Research, USA)인 Crystal Screen 2TM으로 이행하였다. 작은 육각형 평면형 결정 (hexagonal plate crystal)이 침전 용액(0.5M 리튬 설페이트, 0.3M 암모니움 설페이트, pH 5.6인 0.1M 소디움 사이트레이트와 4에탄올(v/v)을 포함)에서 하루만에 생성되었다.

2㎕ 단백질 시료(pH 6.8 20mM 말리에이트 용액 내의 10 mg/ml)과 0.5㎕의 침전용액(0.5M 리튬 설페이트, 0.3M 암모니움 설페이트, pH 5.6인 0.1M 소디움 사이트레이트와 4에탄올(v/v)을 포함)을 혼합한 혼합물 방울을, 동일한 조성의 침전용액 1 ml에 대해 22℃에서 평형화시켜 단백질 결정을 얻었다.

실시예 3. 데이터 수집 및 3차원 구조 모델링

0.5M 리튬 설페이트, 0.3M 암모니움 설페이트, pH 6.5인 0.1M BES(N,N-[비스(2-하이드록시에틸)아미노]에탄설포닌산), 4에탄올(v/v)과 포화 에리스리톨을 포함하는 냉동보호제 용액에 말토오스 생성 아밀레이즈 결정을 잠시 담근 후 냉각기(cryostream cooler, Oxford Cryosystems UK)를 이용하여 100。K의 질소 가스로 순간 냉각시켰다. 이렇게 냉각된 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정 및 말토오스 생성 아밀레이즈의 중금속 유도체 결정(HoCl₃, PtCl₂(NH₃)₂, Se-Met 사용)을 사용하여 냉각된 상태에서 TARA 및 BL18B 빔라인(BL18B beamline, 일본 Photon Factory)에서 나오는 엑스선(파장 1.00 Å)을 사용하여 데이터를 수집하였다. 시판되는 프로그램인 DENZO와 SCALEPACK을 사용하여 데이터를 reduction, merging, 스케일링하였다(Otwinowski, A. 등 (1997) Methods in Enzynology Vol. 276, pp.307-326, Acadamic Press).

이와 같이 수집된 자료를 토대로 분자 대치법(MR)과 다중 이질동상 대치법(MIR)을 조합하여 말토오스 생성 아밀레이즈의 3차원 구조를 규명하였다. MR방법에는 β-아밀레이즈의 (α/β)₈구조를 검침 분자로 사용하였다. MIR 방법에서는 HoCl₃, PtCl₂(NH₃)₂, Se-Met를 사용한 중금속 유도체 결정으로부터 얻은 엑스선 회절 데이터를 수집하여 전자밀도 지도를 만들기 위한 초기 위상차 정보 계산에 사용하였다. 소프트웨어로는 CCP4 패키지(CCP4 Collaborative Computational Project Number 4., Acta Cryst. D50, 70-763, 1994)를 사용하였고 프로그램 O(Jones, T. A., Kjeldgaard, M. O., version 5.9, Uppsala, Sweden, Uppsala University, 1993) 및 프로그램 CHAIN을 이용하여 전자밀도에 맞게 단백질의 모델을 만들었고, 프로그램 X-PLOR (Brunger, A. T., X-PLOR Version 3.0, New Haven, CT.: Yale University Press, 1992)를 이용하여 구조를 세밀화하였다.

MR 방법에서, 놀랍게도 의미있는 아미노산 서열 호몰로지가 거의 없는 β-아밀레이즈의 (α/β)₈구조의 3차원 구조를 모델로 사용하였을 때, 이량체인 비대잉 유니트에서의 두 분자의 바른 위치를 얻을 수 있었다. 이 때 1차 솔루션을 위해서는 AMoRe CCP4를 사용하였고 2차 솔루션을 위해서는 X-PLOR 을 사용하였다.

MR 방법으로 얻은 상을 이용하여 Fourier 차이 분석(difference analysis)에의해 중금속 결합 위치를 결정하였고, 이 중금속 결합 위치를 이용하여 MIR 상을 결정하였다. 3 종류의 중금속(HoCl₃, PtCl₂(NH₃)₂, Se-Met)이 각각 결합한 결정을 이용하였다.

이 결과 얻은 MIR 상은 해상도(resolution) 3.1Å에서 mean figure of merit가 0.47이었다. 180°회전의 NCS(noncrystallographic symmetry) 밀도 평균화(density averaging)와 solvent flattening에 의해 MIR 상은 보다 개선되었다. 부분 모델과 MIR 상 및 8∼3.1Å에서의 180°회전의 NCS의 평균값을 조합하여 개선된 전자 밀도 지도를 얻었다. CCP4 수트를 이용하여 MIR 패이징(phasing) 및 밀도 변형(density modification)을 수행하였다(CCP4 (1994), Acta Crystallogr. Sec. D 50, 760-763).

X-PLOR, CCP4 수트를 사용하여 결정학적 세밀화(crystalllographic refinements), 반복적인 맵 계산(iterative map calculations), 모델 빌딩(model building)을 수행하였다.

해상도 2.8Å 에서의 최종적으로 확립된 구조는 574 아미노산으로 이루어지고, 결정학적 R 인자가 20.9, R_free가 27.0였다. 이 모델에는 전자밀도가 보이지 않는 아미노산 잔기 160-163, 259-264, 277-280은 생략되었다(도 3).

ThMA의 구조는 β-스트랜드로 구성된 N-부위(아미노산 잔기 1-124), 중간의(α/β)₈원통 부위, 8개의 β-스트랜드로 구성된 C-부위(아미노산 잔기 505-588)의 3 부분으로 구분되며, ThMA 결정은 두 개의 동일한 서브유니트로 이루어지는 비대칭 유니트인 이량체 구조이다(도 4, 도 5). ThMA와 TAKA-아밀레이즈의 구조를 비교한 결과, 아미노산 배열 비교의 결과와는 달리, (α/β)₈원통 부위 뿐 아니라 C-도메인 역시 구조적으로 보존되어 있음을 알게되었다. 그러나 12개의 반 평형(anti- parallel) β-스트랜드로 구성된 β-샌드위치와 유사한 구조로 된 ThMA의 N-도메인은 TAKA-아밀레이즈에는 존재하지 않았다. N-도메인 ThMA의 중심부와는 뚜렷하게 구분되어 있으나 비대칭 유니트에서의 인접 분자의 (α/β)₈원통 부위와 강하게 상호작용(interaction)한다. 용매가 접근가능한 표면의 1390Å이 이러한 상호작용에서 배제되어 있음을 고려할 때, ThMA가 용액상태에서 이량체로 존재한다는 것을 추측할 수 있다. 배제된 표면의 2/3 이상이 소수성 표면이다.

분자량 측정

Superdex 200 HR 10/30 컬럼(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하고 용출액으로는 150 mM NaCl을 함유하는 pH 7.0 50mM 인산완충액을 사용하여 용출속도 0.4 ml/분으로 크기 배제 컬럼(size exclusion column) 크로마토그래피를 수행하여 ThMA의 분자량을 측정하였다. 분자량은 약 130,000이었으며(도 8), 이것은 이 효소의 이량체의 계산값이 136,414와 비슷하였다.

평형 원심분리 분석에 의해 말토오스 생성 아밀레이즈의 이량체 구조는 다시 확인되었다(도 9). ThMA의 농도는 50mM 소디움 아세테이트 완충액(pH6.0)에 0.87mg/ml로 녹였으며 40시간에 평형에 도달하였다.

활성 부위 및 당-결합 포켓의 구조

ThMA 결정에서 비대칭 유니트를 이루는 이량체 중 한 서브유니트의 N-말단 부분이 다른 서브유니트의 (α/β)₈원통의 윗부분을 덮고 있으며, 이로 인해 이 원통의 윗부분에서 이량체의 인터페이스는 길이 약 17Å, 넓이 약 8Å, 깊이 약 18Å인 좁고 깊은 홈을 형성함을 확인하였다. 이 홈의 바닥에 3개의 촉매 잔기, Asp-328, Glu-357, Asp-424가 존재하는 것으로 보아 이 홈이 활성 부위임을 알 수 있었다.

또, ThMA의 촉매 부위의 바닥 깊숙한 부분에 (α/β)₈원통와 N-말단과 나란 한, 당-결합 포켓이 존재함을 알 수 있었다. 이러한 당-결합 포켓의 구조에는 이량체를 이루는 한분자의 ThMA의 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116와 다른한 분자의 ThMA의 Asn331', Glu332', Val329', His360'(도 1의 구조 코오디네이트에는 각각 Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 표시됨)가 관여한다.

상기와 같이 밝혀진 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정 및 그것의 3차원 구조를 이용하여, 당전이 활성이 향상된 말토오스 생성 아밀레이즈를 제조할 수 있다.

Claims (9)

1. 말토오스 생성 아밀레이즈의 결정.
2. 제1항에 있어서, 상기 말토오스 생성 아밀레이즈가 ThMA인 결정.
3. 제1항에 있어서, 상기 말토오스 생성 아밀레이즈가 두 분자의 말토오스 생성아밀레이즈로 이루어지는 이량체인 결정.
4. 제3항에 있어서, 상기 아밀레이즈가 도 1의 코오디네이트에서 Asp-328, Glu-357, Asp-424로 표시되는 아미노산 잔기로 이루어지는 활성 부위를 가지는 구조 및 이와 유사한 구조를 가지는 결정.
5. 제3항에 있어서, 상기 아밀레이즈가 도 1의 코오디네이트에서 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116, Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 이루어지는 아미노산 잔기로 이루어지는 당-결합 포켓을 가지는 구조 및 이와 유사한 구조를 가지는 결정.
6. 공간 그룹이P6 ₁이고, 유니트 셀 디멘션(unit cell dimension)이 a=b=118.04Å, c=266.88Å이며, 비대칭 유니트 안에 말토오스 생성 아밀레이즈 단량체 2분자가 포함되어 있는 이량체 구조인 말토오스 생성 아밀레이즈 결정.
7. 말토오스 생성 아밀레이즈를 제조하는 단계; 및

   상기 말토오스 생성 아밀레이즈를 포함하는 용액으로부터, 0.3-0.7M 리튬 설페이트, 0.1-0.5M 암모니움 설페이트, pH 5.6인 0.05-0.3M 소디움 사이트레이트와 1-10에탄올(v/v)이 포함된 침전용액을 이용한 증기분산법에 의해 단백질을 결정화시키는 단계로 이루어지는, 말토오스 생성 아밀레이즈 결정을 제조하는 방법.
8. 말토오스 생성 아밀레이즈의 "당-결합 포켓" 구조를 당 수용체가 보다 잘 위치하도록 변형시키는 것으로 이루어지는, 당 전이능이 향상된 말토오스 생성 아밀레이즈의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 당-결합 포켓이 도 1의 코오디네이트에서 Pro44, Tyr45, Arg81, Arg83, Pro118, Cys116, Asn1331, Glu1332, Val1329, His1360로 표시된 아미노산 잔기로 이루어지는 구조 또는 이와 유사한 구조인 방법.