KR20010011334A - CYTROBACTER sp. Y19 AND METHOD OF PREPARING HYDROGEN BY USING THE SAME - Google Patents

CYTROBACTER sp. Y19 AND METHOD OF PREPARING HYDROGEN BY USING THE SAME Download PDF

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Abstract

PURPOSE: A microorganism, Citrobacter sp. Y19(KFCC-11087) and a method for producing hydrogen by using the same are provided. Thereby, carbon monoxide can be converted into hydrogen, then the hydrogen is used as a source of energy, so that the environmental pollution can be inhibited. CONSTITUTION: A microorganism, Citrobacter sp. Y19(KFCC-11087) is capable to rapidly convert carbon monoxide into hydrogen and its growth rate is fast. The microorganism, Citrobacter sp. Y19(KFCC-11087) is isolated from the sludge in an anaerobic fire extinguishing vessel by incubating and screening procedures and is identified by 16S rDNA analysis. The hydrogen is produced by incubating the microorganism, Citrobacter sp. Y19(KFCC-11087) in an appropriate medium in the presence of oxygen, then providing carbon monoxide in the absence of oxygen.

Description

사이트로박터속 균주 Ｙ１９ 및 이에 의한 수소 생산{CYTROBACTER sp. Y19 AND METHOD OF PREPARING HYDROGEN BY USING THE SAME}Scytobacterium strain Ｙ１Ｙ and its hydrogen production {CYTROBACTER sp. Y19 AND METHOD OF PREPARING HYDROGEN BY USING THE SAME}

본 발명은 일산화탄소를 이용하여 높은 전환속도로 수소를 다량 생산하는 신규 미생물, 이의 분리, 배양 및 이에 의한 수소 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel microorganism that produces a large amount of hydrogen at a high conversion rate using carbon monoxide, separation and cultivation thereof, and a method for producing hydrogen by the same.

산업 공정에서 발생하는 폐가스는 일산화탄소, 이산화탄소, 수소, 황, 질소 산화물들을 다량 포함하고 있다. 이들 중 일산화탄소 등은 유용한 에너지원임에도 그냥 버려지고 있어 경제적인 손실이 될 뿐만 아니라 대기 환경에도 악영향을 미치고 있다. 특히 제철소에서 발생하는 COG(코오크스로 가스), BFG(고로가스), LDG(전로가스), 또는 카본블랙 제조시 발생하는 폐가스 등은 일산화탄소와 이산화탄소를 다량 함유하는데 이렇게 발생하는 폐가스의 양은 포항, 광양제철소에서만 1년에 3 X 1010㎥에 이르며, 이들의 일산화탄소 비율은 최고 70 % 에 이른다. 이들 국가 기간산업인 제철소 부생가스의 경우 재활용 실적이 부진하여 극히 일부만 회수되고 나머지는 모두 폐기되고 있는 실정이다. 특히 일산화탄소는 에너지원으로 활용될 수 있는 귀중한 자원임에도 불구하고 회수나 재활용이 거의 되지 않고 버려지는 실정이다. 뿐만 아니라 일산화탄소의 전환으로 생성된 수소는 청정에너지로서 직접 연료로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 연료전지, 화학공업의 원료, 환원제 등으로 사용될 수 있어 그 이용범위가 매우 넓다. 따라서, 부존자원이 부족한 우리 나라의 경우, 자원의 효율적인 활용이라는 측면에서 본 기술의 개발은 시급하고 유용하다 할 것이다.Waste gases from industrial processes contain large amounts of carbon monoxide, carbon dioxide, hydrogen, sulfur and nitrogen oxides. Among them, carbon monoxide is simply thrown away as a useful energy source, which is not only economically damaging but also adversely affecting the atmospheric environment. In particular, COG (coke oven gas), BFG (blast furnace gas), LDG (converter gas), or waste gas generated in carbon black production in steel mills contain large amounts of carbon monoxide and carbon dioxide. Only Gwangyang Works reaches 3 X 10 10 ㎥ per year, and their carbon monoxide ratio is up to 70%. In the case of these by-products, iron and steel by-products of the national infrastructure industry, only a part of them are recovered and all of them are discarded due to poor recycling performance. In particular, although carbon monoxide is a valuable resource that can be used as an energy source, it is rarely recovered or recycled and is discarded. In addition, the hydrogen generated by the conversion of carbon monoxide can be used as a direct fuel as a clean energy, as well as a fuel cell, a raw material of the chemical industry, a reducing agent and the like, and its use is very wide. Therefore, in Korea, where there is a lack of existing resources, the development of this technology is urgent and useful in terms of efficient use of resources.

일산화탄소와 물로부터 수소를 생산하는 공정은 크게 화학적 공정과 생물학적 공정으로 나눌 수 있다. 화학적 공정의 경우, 수율이 낮고 반응조건이 가혹하다는 단점이 있다. 반면에 생물학적 공정은 일산화탄소를 수소로 전환하는 미생물을 이용한 것으로 여타의 생물학적 공정과 마찬가지로 온화한 조건에서 높은 전환 속도를 얻을 수 있다는 장점이 있다.The process of producing hydrogen from carbon monoxide and water can be divided into chemical and biological processes. In the case of chemical processes, there are disadvantages in that the yield is low and the reaction conditions are severe. On the other hand, the biological process uses a microorganism that converts carbon monoxide to hydrogen, and like other biological processes, it has an advantage of obtaining a high conversion rate under mild conditions.

지금까지 알려진 일산화탄소 전환 균주로는 광합성 세균, 혐기성 세균 등으로 나눌 수 있는데, 이에 포함되는 것들로는 로도슈도모나스 젤라티노사 (Rhodopseudomonas gelatinosa), 로도스피릴룸 루브룸 (Rhodospirillum rubrum) 등의 광합성 세균과, 메타노사르시나 바커리 (Methanosarcina barkeri) (O'Brien, J.N., Wolkin, R. H., Moench, T. T. , Morgan, J. B., and Zeikus, J. G. (1984) J. Bacteriol. 158, 373-375) 등의 절대 혐기성 미생물들이 알려져 있다. 이 중 광합성 세균인 로도스피릴룸 루브룸이 가장 높은 전환속도를 가지고 있는 미생물로 알려져 있으나 (Klasson, K. T., Lundack, K. M. O., Clausen, E. C., and Gaddy, J. L. (1993) J. Biotechnol., 29, 177-188), 0.2 기압 이상의 일산화탄소 분압에서 수소생성이 저해되고 매우 낮은 성장속도와 낮은 세포 농도로 인해 그 상업적 적용에 한계를 가지고 있다 (Cowger, J. P., Klasson, K. T., Ackerson, M. D., Clausen, E. E., and Gaddy, J. L. (1992) Appl. Biochem. Biotechnol., 34/35, 613-624). 따라서, 일산화탄소로부터 수소를 효율적으로 생산하는 생물학적 공정개발에 있어서, 높은 전환속도와 성장속도를 가진 새로운 미생물의 개발은 필수적이다.Carbon monoxide conversion strains known to date can be divided into photosynthetic bacteria, anaerobic bacteria, and the like, including photosynthetic bacteria such as Rhodopseudomonas gelatinosa, Rhodospirillum rubrum, Absolute anaerobic, such as Methanosarcina barkeri (O'Brien, JN, Wolkin, RH, Moench, TT, Morgan, JB, and Zeikus, JG (1984) J. Bacteriol. 158, 373-375) Microbes are known. Among them, photosynthetic bacteria, Rhodospirilum rubrum, are known to have the highest conversion rate (Klasson, KT, Lundack, KMO, Clausen, EC, and Gaddy, JL (1993) J. Biotechnol., 29, 177 (188), hydrogen production is inhibited at carbon monoxide partial pressures above 0.2 atm and its commercial application is limited due to very low growth rates and low cell concentrations (Cowger, JP, Klasson, KT, Ackerson, MD, Clausen, EE, and Gaddy, JL (1992) Appl. Biochem. Biotechnol., 34/35, 613-624). Thus, in the development of biological processes that efficiently produce hydrogen from carbon monoxide, the development of new microorganisms with high conversion and growth rates is essential.

종래의 이러한 광합성 세균들은 성장속도 및 전환속도가 느리며, 높은 분압의 기질이 있을 경우에 기질저해가 심하다. 또한 빛이 안정성에 중요한 인자로 작용하여 빛이 존재하는 경우에만 수소 생성능이 오랫동안 지속될 수 있다는 문제점이 있다. 특히, 빛을 에너지원으로 사용하는 광합성 세균의 고농도 배양 기술은 충분히 개발되어 있지 못하여, 유기탄소를 이용하여 호기적으로 성장할 수 있는 미생물의 이용이 절실하다. 그러나, 앞서 언급한 바와 같이, 종래에 일산화탄소로부터 수소를 생산하는 것으로 알려져 있는 미생물들은 광합성 미생물과 절대 혐기성 미생물들로 이러한 미생물들의 현실적 적용이 문제가 되고 있다.Conventional photosynthetic bacteria have slow growth and conversion rates, and severe substrate inhibition in the presence of high partial pressure substrates. In addition, since light acts as an important factor for stability, there is a problem that hydrogen generation ability can be maintained for a long time only when light exists. In particular, the high concentration culture technology of photosynthetic bacteria using light as an energy source has not been sufficiently developed, and the use of microorganisms capable of aerobic growth using organic carbon is urgently needed. However, as mentioned above, microorganisms conventionally known to produce hydrogen from carbon monoxide are problematic due to the practical application of these microorganisms to photosynthetic microorganisms and absolute anaerobic microorganisms.

본 발명은 일산화탄소로부터 수소로의 전환속도가 매우 높고, 성장속도가 빠른 새로운 균주 사이트로박터속 Y19를 제공하는 것이다.The present invention provides a bacterium Y19 to a new strain site having a very high conversion rate from carbon monoxide to hydrogen and a fast growth rate.

또한, 본 발명은 일산화탄소로부터 수소로의 전환속도가 매우 높고, 성장속도가 매우 빠른 신규한 미생물을 산소 존재하에서 배양한 후에, 산소의 차단에 의해서 일산화탄소를 전환기질로하여 수소를 높은 전환속도로 생성하는 방법을 제공하고자 한다.In addition, the present invention, after culturing a new microorganism having a very high conversion rate from carbon monoxide to hydrogen, very fast growth rate in the presence of oxygen, by generating a high conversion rate of hydrogen by the carbon monoxide as a conversion substrate by the blocking of oxygen. To provide a method.

도 1은 사이트로박터속 균주 Y19의 투과전자현미경 사진(X50,000)을 나타낸다.Figure 1 shows a transmission electron micrograph (X50,000) of Cyclobacter strain Y19.

도 2는 호기적 조건에서의 세포 성장과 수소생산을 나타냈다. 도면의 ● 기호는 일산화탄소의 기상에서의 분압을, ○ 기호는 수소의 기상에서의 분압을 각각 나타낸다.2 shows cell growth and hydrogen production in aerobic conditions. Symbols in the drawings denote partial pressures in the gas phase of carbon monoxide, and symbols denote partial pressures in the gas phase of hydrogen, respectively.

도 3은 혐기적 조건에서의 세포 성장과 수소생산을 비교한 것이다. 도면의 ● 기호는 일산화탄소의 기상에서의 분압을, ○ 기호는 수소의 기상에서의 분압을 각각 나타낸다.Figure 3 compares cell growth and hydrogen production in anaerobic conditions. Symbols in the drawings denote partial pressures in the gas phase of carbon monoxide, and symbols denote partial pressures in the gas phase of hydrogen, respectively.

도 4은 호기적 조건에서 배양한 세포를 박토트립톤이 함유되지 않은 배지에서 혐기적 조건에서 배양한 경우의 일산화탄소의 소비와 수소의 생산에 관한 그림이다. ● 기호는 기상에서의 일산화탄소의 분압을 나타내며, ○ 기호는 기상에서의 수소의 분압을 나타낸다.FIG. 4 is a diagram illustrating carbon monoxide consumption and hydrogen production when cells cultured in aerobic conditions were cultured under anaerobic conditions in a medium containing no bactotrypton. The symbol represents the partial pressure of carbon monoxide in the gas phase, and the symbol ○ represents the partial pressure of hydrogen in the gas phase.

본 발명은 일산화탄소를 이용하여 유용한 물질인 수소를 다량 생산하는 신규 미생물 및 수소전환을 위한 배양 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 통성혐기성인 화학종속영양균, 특히 사이트로박터속 균주 Y19를 유기탄소원이 포함된 배지에서 성장시키고 일산화탄소를 전환기질로 사용하여 수소를 높은 전환속도로 생성하는 균주 Y19 및 수소 생성방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel microorganism that produces a large amount of hydrogen, a useful substance using carbon monoxide, and a culture method for hydrogen conversion. Specifically, the present invention is the strain Y19 and hydrogen for growing the anaerobic chemical heterotrophs, in particular, Scytopbacter strain Y19 in a medium containing an organic carbon source and using a carbon monoxide as a conversion substrate to produce hydrogen at a high conversion rate It relates to a production method.

본 발명의 사이트로박터속 균주 Y19는 부산에 소재하는 혐기성 소화조의 슬러지에서 분리한 것으로서, 형태학적 분석의 결과 막대모양의 통성혐기성 화학종속영양균이며, 퀴논분석결과, 8개의 이소프렌을 함유한 유비퀴논과 8개의 이소프렌을 함유한 메나퀴논으로 결정되었다. 이러한 종류의 퀴논조성은 엔테로박테리아세 목에 속하는 미생물에서 발견되는 특성이다. 16S rDNA의 Ribosomal Database Project (RDP) 와 GenBank database 에 대해서 Sequence_Match 와 BLAST 프로그램을 사용하여 얻어진 서열을 분석하였다. BLAST 분석 결과, 사이트로박터 라프메리 (GenBank accession no. AF025371) 와 사이트로박터 아말로나티쿠스 (GenBank accession no. AF025370) 의 16S rDNA에 대해 99 %로 유사성을 나타냈다. 따라서, 16S rDNA 서열의 비교분석결과, 본 발명의 균주 Y19는 프로테오박테리아의 γ-서브그룹에 속하는 것이므로, 이를 사이트로박터 속 균주 Y19라고 확인하였다.Cyclobacter strain Y19 of the present invention was isolated from sludge of an anaerobic digester located in Busan, and is a rod-like anaerobic chemically-dependent nutrient as a result of morphological analysis. As a result of quinone analysis, ubicon containing 8 isoprene. It was determined as menaquinone containing quinone and eight isoprenes. This kind of quinone composition is a property found in microorganisms belonging to the genus Enterobacteriaceae. Ribosomal Database Project (RDP) and GenBank database of 16S rDNA were analyzed using Sequence_Match and BLAST programs. BLAST analysis showed a similarity of 99% to 16S rDNA of CiBrobacter rafmeri (GenBank accession no. AF025371) and CiBrobacter amalonaticus (GenBank accession no. AF025370). Therefore, as a result of the comparative analysis of the 16S rDNA sequence, strain Y19 of the present invention belonged to the γ-subgroup of the proteobacteria, so it was confirmed that the strain Y19 genus SYB.

본 발명의 Y19은 유기탄소를 탄소원으로하여 호기적 및 혐기적으로 성장할 수 있는 화학종속영양균이지만, 호기적 조건에서 보다 더 높은 성장속도를 보여준다. 또한 일산화탄소를 탄소원으로 사용할 수 없으며, 단지 수소생산을 위한 전환기질로서만 사용된다. 따라서 호기적으로 배양한 후에 산소를 차단하여 혐기적 조건에서 일산화탄소를 전환기질로 사용하여 수소를 생성하는 균이다. 이러한 특성은 기존의 알려진 수소 생산균과는 명백히 구분되는 성질로서, 기존의 수소 전환 미생물은 대부분 광합성 미생물 또는 절대 혐기성 미생물들이며, 이들 미생물들은 산소에 의해 수소 전환 활성이 비가역적으로 저해된다고 알려져 있다. 반면, 본 발명의 사이트로박터속 균주 Y19는 호기적 조건에서 성장하고 혐기적 조건에서 일산화탄소를 기질로 하여 수소를 생산하여, 높은 세포 농도에 높은 전환활성을 얻을 수 있는 장점이 있다.Y19 of the present invention is a chemically dependent nutrient which can grow aerobic and anaerobic with organic carbon as a carbon source, but shows a higher growth rate than under aerobic conditions. In addition, carbon monoxide cannot be used as a carbon source, but only as a conversion substrate for hydrogen production. Therefore, it is a bacterium that generates hydrogen using carbon monoxide as a conversion substrate under anaerobic conditions by blocking oxygen after aerobic culture. This property is clearly distinguished from known hydrogen producing bacteria, and the existing hydrogen converting microorganisms are mostly photosynthetic microorganisms or absolute anaerobic microorganisms, and these microorganisms are known to irreversibly inhibit hydrogen conversion activity by oxygen. On the other hand, Shittobacter strain Y19 of the present invention has the advantage of growing under aerobic conditions and producing hydrogen with carbon monoxide as a substrate under anaerobic conditions, thereby obtaining high conversion activity at high cell concentrations.

또한 본 발명의 한예에서, 호기적 조건 및 혐기적 조건하에서의 성장속도와 수소생성을 비교한 결과를 도 2 및 3에서 나타내고 있다. 구체적으로, 호기적 조건하에서는 0.7 h-1의 높은 비성장속도로 성장하여, 최종 세포농도가 2 g/l 에 이른다. 반면, 혐기적 조건에서는 0.12 h-1의 낮은 성장속도로 성장하며, 24 시간 배양 후에는 세포농도가 0.4 g/l 에 불과하였다. 그러나, 하단 도면에서 보는 바와 같이, 호기적 조건에서는 일산화탄소의 소비와 수소의 생산이 이루어지지 않았으며, 반면, 혐기적 조건에서 일산화탄소의 소비와 수소의 생산이 이루어진다.In addition, in one embodiment of the present invention, the results of comparing the growth rate and hydrogen production under aerobic and anaerobic conditions are shown in Figures 2 and 3. Specifically, under aerobic conditions, they grow at a high specific growth rate of 0.7 h −1 , resulting in a final cell concentration of 2 g / l. On the other hand, in anaerobic conditions, the growth rate was low at 0.12 h −1 , and after 24 hours of incubation, the cell concentration was only 0.4 g / l. However, as shown in the lower figure, consumption of carbon monoxide and production of hydrogen were not made under aerobic conditions, whereas consumption of carbon monoxide and production of hydrogen were made under anaerobic conditions.

Y19를 다음과 같은 배지조성에서 유기탄소를 탄소원으로 하여 호기적으로 또는 혐기적 조건하에서 배양시킨다.Y19 is cultured under aerobic or anaerobic conditions using organic carbon as a carbon source in the following medium composition.

성장배지조성Growth Medium 배지조성Badge composition 함유량content 박토트립톤Bactotripton 10 g/l10 g / l 박토이스트추출물Bakto yeast extract 5 g/l5 g / l 소량광물Trace minerals 50 ml/l50 ml / l 미량금속Trace metal 1 ml/l1 ml / l 복합비타민Complex vitamins 5 ml/l5 ml / l

여기서 소량광물은 KH2PO4, MgCl2, NaCl, NH4Cl, CaCl2·2H2O 이고, 미량금속은 ZnSO4·7H2O, MnCl2·4H2O, H3BO3, CoCl2·5H2O, Na2MO2·2H2O, NiCl2·6H2O, FeSO4·7H2O이며, 복합비타민으로는 바이오틴, 엽산, 피리독살염산, 리포산, 리보플라빈, 티아민염산, D-판토텐산 칼슘, 시아노코발아민, p-아미노벤조산, 니코틴산으로 이루어진다.The trace minerals are KH 2 PO 4 , MgCl 2 , NaCl, NH 4 Cl, CaCl 2 · 2H 2 O, and the trace metals are ZnSO 4 · 7H 2 O, MnCl 2 · 4H 2 O, H 3 BO 3 , CoCl 2 5H 2 O, Na 2 MO 2 · 2H 2 O, NiCl 2 · 6H 2 O, FeSO 4 · 7H 2 O, with complex vitamins: biotin, folic acid, pyridoxalic acid, lipoic acid, riboflavin, thiamine hydrochloride, D- It consists of calcium pantothenate, cyanocobalamin, p-aminobenzoic acid and nicotinic acid.

또한 본 발명은 호기적 조건하에서 사이트로박터속 균주 Y19을 고농도 배양하고, 산소를 차단함으로써 고효율로 일산화탄소에서 수소로의 전환반응을 일으키는, 사이트로박터속 균주 Y19에 의한 수소생성방법을 제공하는 것이다. 균주의 성장단계에서 수소생산단계로의 전환을 위해서는 전환기질로서 일산화탄소를 공급하고, 산소를 차단하고, 박토트립톤이 포함되지 않은 배지로 이동시킬 필요성이 있다. 왜냐하면, 일산화탄소는 탄소원이나 에너지원으로 균주의 성장에 사용될 수 없고 수소전환의 기질로 사용되면 수소전환효소의 활성의 유도를 위해서 기상에 필요한 것 같다. 또한 박토트립톤이 포함된 배지는 아마도 수소전환효소의 생성을 억제하며, 산소는 수소전환효소를 가역적으로 저해하는 것으로 추정된다.In another aspect, the present invention is to provide a method for producing hydrogen by the cystobacter strain Y19 to incubate a high concentration of Scytobacterium strain Y19 under aerobic conditions, and to block the oxygen to convert carbon monoxide to hydrogen with high efficiency. . In order to switch from the growth stage of the strain to the hydrogen production stage, it is necessary to supply carbon monoxide as a conversion substrate, to block oxygen, and to move to a medium that does not contain bactotryptone. Because carbon monoxide cannot be used as a carbon source or energy source for growth of strains, and used as a substrate for hydrogen conversion, carbon monoxide seems to be necessary for gas phase to induce the activity of hydrogen converting enzyme. In addition, medium containing bactotrypton probably inhibits the production of hydrogen convertase, and oxygen is reversibly inhibited.

수소생성용 배지조성Hydrogen production medium composition 배지성분Medium 함유량content 박토이스트추출물Bakto yeast extract 1 g/l1 g / l 소량광물Trace minerals 50 ml/l50 ml / l 미량금속Trace metal 1 ml/l1 ml / l 복합비타민Complex vitamins 5 ml/l5 ml / l

균주의 성장을 위한 배양에서는 박토트립톤과 효모추출물 (yeast extract) 이 필요하나, 수소전환을 위해서는 박토트립톤이 포함되지 않고, 효모 추출물이 소량으로 포함된 배지로 배양한 균주를 이동시킬 필요성이 있다. 사이트로박터속 균주는 엔테로박테리아세목에 속하며 엔테로박테리아세목의 미생물은 통성혐기성 화학종속영양균이므로, 박토트립톤과 효모추출물이 포함된 배지에서 호기적 조건 또는 혐기적 조건하에서 배양하였으며, 그 결과는 도 2 및 도 3에 나타냈다. 이 결과로부터 사이트로박터속 균주는 혐기적 조건보다 호기적 조건하에서 더 빨리 성장함을 알수 있다. 한편, 도 2 및 도 3에서는 또한 호기적 조건하에서는 일산화탄소의 소비와 수소의 생산이 관찰되지 않았고, 혐기적 조건에서만 비록 낮은 수준이지만 수소의 생산이 관찰되었다. 따라서, 높은 수소 생산성을 얻기 위해서는 호기적 조건에서 배양한 후, 혐기적 조건에서 수소를 생산하는 2단계 배양이 필요하다는 것을 알 수 있었다.In the culture for the growth of strains, bactotriptone and yeast extract are required, but for the hydrogen conversion, it is necessary to transfer the strain cultured to a medium that does not contain bactotrypton and contains a small amount of yeast extract. have. The Scytobacterium strain belongs to the Enterobacter spp., And the Enterobacter spp. Microorganism is an anaerobic chemical heterotrophic bacterium. Therefore, the strain was cultured under aerobic or anaerobic conditions in a medium containing bactotripton and yeast extract. 2 and 3 are shown. From this result, it can be seen that the strain of Scytobacterium grows faster under aerobic conditions than anaerobic conditions. On the other hand, in Figs. 2 and 3 also the consumption of carbon monoxide and the production of hydrogen were not observed under aerobic conditions, and the production of hydrogen, although at a low level only in anaerobic conditions, was observed. Therefore, in order to obtain high hydrogen productivity, it was found that after culturing in aerobic conditions, two-step culturing to produce hydrogen in anaerobic conditions is required.

2단계 배양을 수행함에 있어서, 수소 생산 단계에서의 배지 조성의 영향을 살펴보았다. 호기적으로 성장시킨 세포를 박토트립톤이 함유된 배지에서 수소를 생산한 경우, 수소의 뚜렷한 생산증가는 관찰되지 않았으나, 박토트립톤이 함유되지 않은 배지에서는 높은 수소 생산성을 보였다. 이는 수소 생산 활성에 있어서 탄소원이 중요한 영향을 미친다는 사실을 말해준다. 따라서, 높은 세포농도에서 높은 수소 생산활성을 얻기 위해서는 박토트립톤이 함유되어 있는 배지에서 호기적으로 성장시킨 후, 박토트립톤이 결핍되어 있는 배지에서 혐기적 조건으로 수소를 생산하는 2단계 배양을 필요로 함을 알 수 있다. 구체적으로 도 4에서는 약 48 시간동안 0.25 기압 - 0.45 기압 사이의 일산화탄소를 계속 주입하였을 경우, 1 기압의 높은 분압의 일산화탄소를 높은 속도로 소비할 수 있었으며, 이 때, 최대 수소 비생산속도는 33.7 mmol/g cell·h 까지 얻을 수 있었으며, 배양 200 시간 후, 수소 생산 활성이 점차 감소되는 경향을 보였다.In performing the two-stage culture, the influence of the medium composition on the hydrogen production step was examined. When hydrogen was produced in aerobic-grown cells in medium containing bactotrypton, no significant increase in hydrogen production was observed, but high hydrogen productivity was observed in medium without bactotrypton. This indicates that the carbon source has an important effect on the hydrogen production activity. Therefore, in order to obtain high hydrogen production activity at high cell concentration, aerobic growth in a medium containing bactotrypton is performed, followed by a two-step culture in which hydrogen is produced under anaerobic conditions in a medium containing bactotrypton. It can be seen that it is necessary. Specifically, in the case of continuously injecting carbon monoxide between 0.25 atm and 0.45 atm for about 48 hours, it was possible to consume a high partial pressure of carbon monoxide at a high rate, and at this time, the maximum hydrogen specific production rate was 33.7 mmol. / g cell · h was obtained, and after 200 hours of culture, hydrogen production activity showed a tendency to decrease gradually.

이러한 2단 배양법을 이용하여, 호기적으로 성장시킨 세포를 0.2 기압에서 0.5 기압 사이의 적절한 일산화탄소 분압 하에서 48시간동안 적응시킨 후, 33.7 mmol/g cell·h 에 이르는 매우 높은 속도의 수소 생성능을 보였으며, 1기압의 높은 분압의 일산화탄소도 분해할 수 있었다.Using this two-stage culture method, the aerobic grown cells were acclimated for 48 hours under an appropriate carbon monoxide partial pressure between 0.2 atm and 0.5 atm, and then showed very high hydrogen production capacity of 33.7 mmol / g cell · h. The high partial pressure of carbon monoxide at 1 atm could be decomposed.

한편, 박토트립톤을 탄소원으로 사용하여 배양할 경우, 배지를 교체하는 과정을 포함한 이단계 배양법을 사용하여야 한다. 그러나, 실제 공정에의 적용에 있어서, 배지의 교체는 중요한 제한 요소로 작용하고 있다. 따라서, 수소 활성에 영향을 주지 않는 새로운 탄소원을 찾아낼 필요가 있다. 박토트립톤을 다른 탄소원인 포도당, 락토오스, 수크로오스 등으로 바꾸어, 미생물의 성장과 수소 생산 활성을 표 3에 나타내었다. 이 때, 락토오스와 수크로오스가 세포성장을 유지하면서, 수소생산활성을 저해하지 않는 탄소원임을 알 수 있었고, 락토오스와 수크로오스를 탄소원으로 사용하여 배양할 경우, 배지의 교체 없이 높은 수소 생산 활성을 가진 미생물을 다량 배양할 수 있었다.On the other hand, in the case of culturing using the bacto tryptone as a carbon source, a two-step culture including the process of replacing the medium should be used. However, in practical applications, replacement of the medium is an important limiting factor. Thus, there is a need to find new carbon sources that do not affect hydrogen activity. Table 3 shows the growth and hydrogen production activity of microorganisms by replacing bactotrypton with other carbon sources such as glucose, lactose and sucrose. At this time, it was found that lactose and sucrose are carbon sources that do not inhibit hydrogen production activity while maintaining cell growth, and when cultured using lactose and sucrose as carbon sources, microorganisms having high hydrogen production activity without replacement of medium were obtained. It could be cultured in large quantities.

탄소원이 세포성장과 수소생산활성에 미치는 영향Effect of Carbon Sources on Cell Growth and Hydrogen Production Activity 세포농도 (g/l)Cell concentration (g / l) 수소생산활성(mmol/g cell·h)Hydrogen Production Activity (mmol / g cell · h) 시간(h)Hours (h) 박토트립톤Bactotripton 포도당glucose 락토오스Lactose 수크로오스Sucrose 박토트립톤Bactotripton 포도당glucose 락토오스Lactose 수크로오스Sucrose 00 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 00 00 00 00 22 0.40.4 0.40.4 0.40.4 0.40.4 0.20.2 00 5.25.2 8.28.2 44 0.60.6 0.60.6 0.60.6 0.60.6 0.30.3 00 8.08.0 11.511.5 66 0.80.8 0.90.9 0.80.8 0.80.8 0.50.5 00 10.210.2 12.512.5 88 1.21.2 1.31.3 1.11.1 1.11.1 0.60.6 00 15.615.6 15.915.9 1010 1.61.6 1.61.6 1.51.5 1.41.4 1.01.0 00 18.418.4 19.419.4 1212 2.02.0 2.02.0 1.81.8 1.51.5 0.80.8 00 22.622.6 22.822.8 1414 2.22.2 2.32.3 2.12.1 1.81.8 0.90.9 00 23.723.7 26.426.4 1616 2.32.3 2.32.3 2.22.2 2.02.0 0.40.4 00 28.428.4 29.429.4 1818 2.32.3 2.42.4 2.32.3 2.02.0 0.60.6 00 30.230.2 32.732.7 2020 2.42.4 2.42.4 2.32.3 2.22.2 0.80.8 00 31.231.2 33.733.7 2222 2.42.4 2.42.4 2.32.3 2.22.2 1.01.0 00 30.230.2 32.732.7 2424 2.42.4 2.52.5 2.42.4 2.32.3 0.70.7 00 29.729.7 33.433.4

따라서, 락토오스와 수크로오스 농도에 따른 세포 성장과 수소생산활성을 살펴보았으며 이를 표 4와 표5에 각각 나타내었다.Therefore, cell growth and hydrogen production activities were examined according to lactose and sucrose concentrations, which are shown in Table 4 and Table 5, respectively.

락토오스 농도에 따른 세포 성장과 수소생산활성의 영향Effects of Lactose Concentration on Cell Growth and Hydrogen Production 락토오스농도 (g/l)Lactose Concentration (g / l) 세포농도 (g/l)Cell concentration (g / l) 수소생산활성 (mmol/g cell·h)Hydrogen Production Activity (mmol / g cell · h) 시간(h)Hours (h) 00 2.52.5 55 1010 00 2.52.5 55 1010 00 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 00 00 00 00 22 0.10.1 0.20.2 0.40.4 0.40.4 2.12.1 3.53.5 5.25.2 4.34.3 44 0.20.2 0.30.3 0.60.6 0.60.6 3.43.4 7.07.0 8.08.0 6.56.5 66 0.20.2 0.40.4 0.80.8 0.80.8 6.26.2 9.59.5 10.210.2 9.69.6 88 0.30.3 0.50.5 1.11.1 1.21.2 7.27.2 11.511.5 15.615.6 12.312.3 1010 0.40.4 0.60.6 1.51.5 1.61.6 8.28.2 12.512.5 18.418.4 16.216.2 1212 0.40.4 0.80.8 1.81.8 1.91.9 9.69.6 14.614.6 22.622.6 20.620.6 1414 0.50.5 0.90.9 2.12.1 2.42.4 10.510.5 18.018.0 23.723.7 22.622.6 1616 0.50.5 1.01.0 2.22.2 2.62.6 11.011.0 20.120.1 28.428.4 27.527.5 1818 0.60.6 1.11.1 2.32.3 2.82.8 10.510.5 22.022.0 30.230.2 28.628.6 2020 0.60.6 1.21.2 2.32.3 3.03.0 9.49.4 18.318.3 31.231.2 30.530.5 2222 0.60.6 1.21.2 2.32.3 3.13.1 10.810.8 19.619.6 30.230.2 27.327.3 2424 0.60.6 1.31.3 2.42.4 3.03.0 11.011.0 20.320.3 29.729.7 28.528.5

수크로스 농도에 따른 세포 성장과 수소생산활성의 영향Influence of Sucrose Concentration on Cell Growth and Hydrogen Production Activity 수크로스 농도(g/l)Sucrose concentration (g / l) 세포농도 (g/l)Cell concentration (g / l) 수소생산활성 (mmol/g cell·h)Hydrogen Production Activity (mmol / g cell · h) 시간(h)Hours (h) 00 2.52.5 55 1010 00 2.52.5 55 1010 00 0.10.1 0.10.1 0.10.1 0.10.1 00 00 00 00 22 0.10.1 0.20.2 0.40.4 0.40.4 2.12.1 4.54.5 8.28.2 7.17.1 44 0.10.1 0.30.3 0.60.6 0.60.6 3.43.4 8.38.3 11.511.5 10.910.9 66 0.20.2 0.40.4 0.80.8 0.80.8 6.26.2 9.59.5 12.512.5 10.710.7 88 0.20.2 0.50.5 1.11.1 1.21.2 7.27.2 11.511.5 15.915.9 14.314.3 1010 0.30.3 0.60.6 1.41.4 1.51.5 8.28.2 13.813.8 19.419.4 17.617.6 1212 0.40.4 0.70.7 1.51.5 1.81.8 9.69.6 15.915.9 22.822.8 20.620.6 1414 0.40.4 0.80.8 1.81.8 2.22.2 10.510.5 18.018.0 26.426.4 24.724.7 1616 0.50.5 0.90.9 2.02.0 2.42.4 11.011.0 22.122.1 29.429.4 27.527.5 1818 0.50.5 1.01.0 2.02.0 2.72.7 10.510.5 24.024.0 32.732.7 28.628.6 2020 0.50.5 1.01.0 2.22.2 2.92.9 9.49.4 23.323.3 33.733.7 32.532.5 2222 0.60.6 1.01.0 2.22.2 3.03.0 10.810.8 21.621.6 32.732.7 30.330.3 2424 0.60.6 1.11.1 2.32.3 3.03.0 11.011.0 22.322.3 33.433.4 31.731.7

실시예Example

실시예 1 사이트로박터 속 균주 Y19의 분리Example 1 Isolation of Sightrophyllium Strain Y19

부산시에 소재하는 혐기성 폐수조에서 과립슬러지 5 ml 를 표 1 의 배지 45 ml 에 접종하여 CO-공기 혼합기체 (20:80, v/v) 하에서 2일간 배양한다. 충분한 농도의 현탁배양이 이루어지면, 배양액 5 ml을 위의 배지에서 위와 같은 방법으로 배양한다. 이러한 배양을 수회 반복하여 집적배양을 한 다음, 표 1의 배지와 같은 조성의 고체 배지에 도말하여 CO-공기 혼합기체 (20:80, v/v) 하에서 배양하고, 빨리 성장하는 콜로니를 분리하였다. 이러한 방법으로 얻은 균주를 사이트로박터속 Y19로 명명하고, 한국종균협회에 1999년 4월 30일에 기탁하였다 (기탁번호: 제 KFCC-11087 호). 본 발명의 사이트로박터속 균주 Y19의 투과전자현미경 사진을 도 1에 나타내었다 (X 50,000)5 ml of granular sludge was inoculated into 45 ml of medium in Table 1 in an anaerobic wastewater tanker located in Busan, and incubated under CO-air mixed gas (20:80, v / v) for 2 days. If sufficient concentration of suspension culture is made, 5 ml of the culture is incubated in the same manner as above. This culture was repeated several times to accumulate culture, and then plated in a solid medium having the same composition as in Table 1, incubated under a CO-air mixed gas (20:80, v / v), and fast growing colonies were separated. . The strain obtained in this way was named Syrobacter Y19, and was deposited with the Korean spawn association on April 30, 1999 (Accession No .: KFCC-11087). A transmission electron micrograph of the cystobacter strain Y19 of the present invention is shown in FIG. 1 (X 50,000).

실시예 2 사이트로박터속 균주 Y19의 성장 및 수소생산에 미치는 산소의 영향Example 2 Influence of Oxygen on Growth and Hydrogen Production of Cyclobacter Strain Y19

표 1의 배지에서 150 ml의 혈청병에 50 ml의 부피로 CO-공기 (20:80, v/v) 와 CO-Ar (20:80, v/v) 혼합기체 하에서 각각 배양하였다. 기체의 분석은 열전도도 측정장치와 Molecular Sieve 5A로 충진된 컬럼이 장착된 가스크로마토그래피를 사용하여 분석하였다. 호기적 조건 하에서는 0.7 h-1의 높은 비성장속도로 성장하였으며, 최종 세포농도는 2 g/l 에 이르렀다. 그러나, 일산화탄소의 소비나 수소의 생산은 관찰되지 않았다. 반면, 혐기적 조건 하에서는 세포 성장이 매우 느렸으나, 일산화탄소의 소비와 수소의 생산이 관찰되었다. 따라서, 높은 수소 생산성을 얻기 위해서는 호기적으로 세포를 성장시키고, 혐기적 조건에서 수소를 생산하는 2단계 배양법이 필요하다. 이러한 결과를 도 2 및 도 3 에 나타내었다.In the medium of Table 1, 150 ml serum bottles were cultured in a volume of 50 ml under CO-air (20:80, v / v) and CO-Ar (20:80, v / v) mixed gas, respectively. The gas was analyzed using gas chromatography with a thermal conductivity measuring device and a column filled with Molecular Sieve 5A. Under aerobic conditions, it grew at a high specific growth rate of 0.7 h −1 and the final cell concentration reached 2 g / l. However, no carbon monoxide consumption or hydrogen production was observed. On the other hand, cell growth was very slow under anaerobic conditions, but carbon monoxide consumption and hydrogen production were observed. Therefore, in order to obtain high hydrogen productivity, a two-stage culture method for growing cells aerobicly and producing hydrogen under anaerobic conditions is required. These results are shown in FIGS. 2 and 3.

실시예 3 호기적 조건에서 배양한 세포를 이용한 혐기적 수소 생산Example 3 Anaerobic Hydrogen Production Using Cells Cultured in Aerobic Conditions

실시예 2에서와 같이 호기적으로 배양한 세포를 표2의 배지에서 CO-Ar 혼합기체 하에서 배양하였다. 0.2 - 1.0 기압에 이르는 다양한 일산화탄소 분압에서 높은 속도로 수소 생산을 하였으며, 수소 생산 활성이 200 시간동안 높게 유지되었다. 이 때, 최대 수소생산속도는 35.47 mmol/g cell·h 에 이르렀다. 또한, 일산화탄소에 대한 수소의 수율은 100 % 이었으며, 250 시간까지 수소 생산이 관찰되었다. 이러한 결과를 도 3에 나타내었으며, 이 때, 일산화탄소 분압과 수소생산활성과의 상관관계를 표 6에 나타내었다.The cells cultured aerobicly as in Example 2 were cultured under a CO-Ar mixed gas in the media of Table 2. Hydrogen production was carried out at high rates at various carbon monoxide partial pressures ranging from 0.2-1.0 atm, and the hydrogen production activity remained high for 200 hours. At this time, the maximum hydrogen production rate reached 35.47 mmol / g cell · h. In addition, the yield of hydrogen to carbon monoxide was 100% and hydrogen production was observed up to 250 hours. These results are shown in FIG. 3, where the correlation between the partial pressure of carbon monoxide and hydrogen production activity is shown in Table 6.

일산화탄소 분압과 수소 생산 활성Carbon monoxide partial pressure and hydrogen production activity 일산화탄소 분압 (기압)Carbon monoxide partial pressure (atmospheric pressure) 수소비생산속도 (mmol/g cell·h)Hydrogen specific production rate (mmol / g cell · h) 0.010.01 7.197.19 0.020.02 11.1311.13 0.030.03 12.2812.28 0.040.04 16.6116.61 0.060.06 17.1217.12 0.070.07 19.5219.52 0.080.08 26.2526.25 0.090.09 33.8933.89 0.100.10 29.9329.93 0.130.13 31.8131.81 0.150.15 31.8731.87 0.190.19 35.4735.47 0.270.27 31.3731.37 0.300.30 31.2931.29 0.430.43 29.5329.53 0.520.52 24.1024.10 0.570.57 16.8716.87 0.680.68 12.8512.85 0.790.79 16.4016.40 0.890.89 14.8014.80 1.01.0 10.6910.69

실시예 4: 수소 생산 활성에 미치는 탄소원의 영향.Example 4 Influence of Carbon Sources on Hydrogen Production Activity.

수소생산활성에 미치는 탄소원의 영향을 살펴보기 위하여, 표2의 배지에 박토트립톤, 포도당, 락토오스, 수크로오스를 각각 5 g/l로 첨가하여 150 ml의 혈청병에 50 ml의 부피로 배양하였으며, 상기 실시예 2에서 나타낸 바와 같이 배양하여, 세포농도를 측정하였다. 또한, 수소생산활성은 배양 중에 0.5 ml의 배양액을 취하여, 6 ml 의 혈청병에 든 50 mM의 인산 완충용액 9.5 ml 에 현탁한 후, 기상에 CO-Ar (20:80, v/v) 혼합기체를 공급하여 배양하고, 1 시간 후 생성된 수소 생성량을 실시예 2에서 나타낸 바와 같이 가스크로마토그래피로 분석하였다. 이 때의 결과를 표 3에 나타내었다.In order to examine the effect of the carbon source on the hydrogen production activity, 5 g / l of bactotrypton, glucose, lactose and sucrose were added to the medium of Table 2, and cultured in a volume of 50 ml in a 150 ml serum bottle. Cultured as shown in Example 2, the cell concentration was measured. In addition, hydrogen production activity was obtained by taking 0.5 ml of the culture medium during the cultivation, suspending it in 9.5 ml of 50 mM phosphate buffer solution in 6 ml serum bottle, and then mixing CO-Ar (20:80, v / v) gas in the gas phase. Was fed and cultured, and the amount of hydrogen produced after 1 hour was analyzed by gas chromatography as shown in Example 2. The results at this time are shown in Table 3.

실시예 5: 세포성장 및 수소생산활성에 미치는 락토오스의 영향Example 5 Effect of Lactose on Cell Growth and Hydrogen Production Activity

세포성장 및 수소생산활성에 미치는 락토오스의 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 4에서 나타낸 바와 같이, 표 2의 배지에 락토오스를 각각 0, 2.5, 5, 10 g/l의 농도로 첨가하여, 세포농도와 수소생산활성을 측정하였으며, 결과를 표 4에 나타내었다.In order to examine the effect of lactose on cell growth and hydrogen production activity, as shown in Example 4, lactose was added to the medium of Table 2 at concentrations of 0, 2.5, 5, and 10 g / l, respectively, Concentration and hydrogen production activity were measured, and the results are shown in Table 4.

실시예 6: 세포성장 및 수소생산활성에 미치는 수크로오스의 영향Example 6 Effect of Sucrose on Cell Growth and Hydrogen Production Activity

세포성장 및 수소생산활성에 미치는 수크오스의 영향을 알아보기 위하여, 상기 실시예 4에서 나타낸 바와 같이, 표 2의 배지에 수크오스를 각각 0, 2.5, 5, 10 g/l의 농도로 첨가하여, 세포농도와 수소생산활성을 측정하였으며, 결과를 표 5에 나타내었다.In order to examine the effect of sucrose on cell growth and hydrogen production activity, as shown in Example 4, sucrose was added to the medium of Table 2 at concentrations of 0, 2.5, 5, and 10 g / l, respectively. , Cell concentration and hydrogen production activity were measured, and the results are shown in Table 5.

본 발명은 높은 성장속도 및 수소생산속도를 갖는 신규한 미생물 및 이에 의한 수소생산방법을 제공하여, 고수율로 수소를 생산할 수 있으며, 또한 배지에 유기탄소원을 첨가함으로써 성장 및 전환효율을 증가시키고, 동일한 배지에서 성장 및 전환이 가능하므로 경제적인 수소생산공정 개발에 용이하다.The present invention provides a novel microorganism having a high growth rate and hydrogen production rate and a method for producing hydrogen by this, can produce hydrogen in high yield, and also increase the growth and conversion efficiency by adding an organic carbon source to the medium, Growth and conversion in the same medium facilitate the development of economic hydrogen production processes.

현재 버려지고 있는 일산화탄소를 유용한 수소로 전환함으로써 폐기물의 재활용으로 경제적 이익이 증대되고 환경오염을 방지할 수 있으며 생성된 수소는 청정에너지원으로 직접 사용될 수 있을 뿐만 아니라 연료전지, 화학공업의 원료, 환원제 등으로 사용될 수 있으므로, 그 이용범위가 매우 넓다.By converting carbon monoxide, which is now thrown away, into useful hydrogen, economic benefits can be increased through recycling of waste, and pollution can be prevented. The generated hydrogen can be directly used as a clean energy source, as well as raw materials and reducing agents in fuel cells and chemical industries. It can be used as such, the use range is very wide.

Claims (2)

기탁번호 제 KFCC-11087 호의 일산화탄소에서 수소로 전환하는 사이트로박터속 균주 Y19.Cyrobacter strain Y19 converting carbon monoxide to hydrogen of Accession No. KFCC-11087. 제 1항의 균주를 호기적으로 배양한 후, 산소를 차단한 혐기적 상태에서 일산화탄소를 공급하여 고효율로 일산화탄소에서 수소로의 전환반응을 일으키는 제 1항의 미생물에 의한 수소생성방법.The method for producing hydrogen by the microorganism of claim 1, wherein the strain of claim 1 is cultivated aerobicly, and the carbon monoxide is supplied in an anaerobic state in which oxygen is blocked to cause the carbon monoxide-to-hydrogen conversion reaction with high efficiency.
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