KR20010002140A - A treatment material comprising soluble Fas ligand for autoimmune disease as active ingredient - Google Patents

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KR20010002140A
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Abstract

PURPOSE: A medicine for autoimmune disease containing soluble Fas ligand as effective ingredients is provided, which kills memory T lymphocytes representing Fas that can induce various immune diseases using soluble Fas ligand, so can be used to treat various immune diseases such as diabetes, rheumatoid arthritis. CONSTITUTION: A process for the preparation of soluble Fas ligand comprises: binding CD5 signal sequence to 34th amino acid located on the down side of transmembrane region of human Fas ligand; culturing transformated clones in non-serum medium(CHO-S-SFM II); and collecting supernatant as soluble Fas ligand. The medicine for autoimmune disease containing soluble Fas ligand as effective ingredients can be prepared in the form of injection type, for oral type. In a mouse experiment, the soluble Fas ligand decreases representation of Fas in CD4+ CD45RBlo Fas+ cells.

Description

가용성 파스 리간드를 유효성분으로 하는 자가면역질환의 치료제{A treatment material comprising soluble Fas ligand for autoimmune disease as active ingredient}A treatment material comprising soluble Fas ligand for autoimmune disease as active ingredient

[발명이 속하는 기술분야][TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION]

본 발명은 가용성 파스 리간드(Fas ligand)를 유효성분으로 하는 자가면역질환의 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 파스(CD95 라고도 함)를 발현하는 세포를 살상할 수 있는 가용성 파스 리간드를 이용하여 파스를 발현하는 기억 T 림프구를 죽임으로써 자가면역 당뇨병, 류마티스 관절염, 다경화증 등의 자가면역질환과 기타 각종 면역 질환의 치료 또는 면역에 관한 것이다.The present invention relates to a therapeutic agent for autoimmune diseases using a soluble Fas ligand as an active ingredient, and more specifically, it uses a soluble pars ligand that can kill cells expressing pars (also called CD95). It relates to the treatment or immunity of autoimmune diseases such as autoimmune diabetes, rheumatoid arthritis, polysclerosis and other various immune diseases by killing memory T lymphocytes expressing.

[종래기술][Private Technology]

모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.One of the most important traits of all normal individuals is the ability to recognize and react to and eliminate many non-self antigens, while not harmfully reacting to the antigenic substances that make up self. Is to have. The non-response of the body to autoantigens is called immunologic unresponsiveness or tolerance.

자기관용은 자기항원의 특이적인 수용체를 가지고 있을지 모르는 림프구를 제거함으로써, 또는 자기항원에 접한 후 스스로 반응하는 기능이 불활성화됨으로써 발생한다. 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 초래되는 질환을 자가면역질환(autoimmune disease)이라 한다.Self-tolerance occurs by removing lymphocytes that may have specific receptors for autoantigens, or by inactivating the self-reacting function after contact with autoantigens. When a problem arises in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response occurs to autoantigens, and the resulting disease is called an autoimmune disease.

종래에는 자가면역질환에 대한 치료법으로 CD40 리간드에 항체 투여 등으로 림프구간의 상호작용을 억제하는 방법이 사용되었으나 그다지 성공적이지 못하였으며, 별다른 치료법이 나타나지 않고 있다.Conventionally, a method of inhibiting the interaction between lymphocytes has been used as a treatment for autoimmune diseases by administering an antibody to a CD40 ligand, but it is not very successful, and there is no treatment.

파스는 종양괴사인자(Tumer necrosis factor) 수용체의 일종이고, 파스 리간드는 파스의 리간드로서 종양괴사인자와 구조적으로 일치한다. 파스 리간드는 주로 활성화된 T 림프구에서 발현되며, 파스에 파스의 리간드가 결합되면 일련의 세포 내의 시스테인 단백질분해효소가 활성화되어 핵산단백질이 분절되어 세포고사가 이루어진다고 알려져 있다.PASS is a type of Tumor necrosis factor receptor, and PASS ligand is a ligand of PASS, which is structurally consistent with tumor necrosis factor. PAS ligands are mainly expressed in activated T lymphocytes, and when PAS ligand is bound to PAS, cysteine protease in a series of cells is activated, and nucleic acid proteins are fragmented to cause cell death.

미국특허공보 제 5,759,536호는 파스 리간드를 이용하여 T 림프구가 관여하는 면역반응을 억제하는 발명으로, 파스 리간드를 발현하는 세포를 이식하거나, 또는 세포융합을 통하여 파스 리간드를 발현하도록 처리된 세포를 이식하는 방법이 소개되어 있으나, 상기 발명은 이식 받은 세포가 이식 직후 바로 세포고사가 이루어짐으로써 면역반응을 억제하는데 실패하였다.U.S. Patent No. 5,759,536 is an invention for suppressing an immune response involving T lymphocytes using a pars ligand, in which a cell expressing a pars ligand is expressed or a cell treated to express a pars ligand through cell fusion. However, the present invention has been introduced, but the present invention failed to suppress the immune response by performing the cell death immediately after the transplanted cells.

따라서, 본 발명은 가용성 파스 리간드를 유효성분으로 하는 치료제를 이용하여 자가면역질환을 치료하는 치료제를 제공하는데 있다.Accordingly, the present invention provides a therapeutic agent for treating autoimmune diseases using a therapeutic agent comprising an soluble pars ligand as an active ingredient.

도 1의 A는 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 자연발생적인 당뇨병의 발생률을 나타낸 것이고, B는 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 림프구 입양전달 후의 당뇨병의 발생률을 나타낸 것이며,1A shows the incidence of spontaneous diabetes in NOD-lpr / lpr mice, B shows the incidence of diabetes after lymphocyte adoptive transfer in NOD-lpr / lpr mice,

도 2의 A는 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 파스 리간드가 발현되는 것을 나타낸 것이고, B는 흉선 절제된 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 림프구 입양전달 후에 인슐린염의 발달을 나타낸 것이며,2 shows the expression of the pars ligand in NOD-lpr / lpr mice, B shows the development of insulin salts after lymphocyte adoptive transfer in thymic-resected NOD-lpr / lpr mice,

도 3의 A는 NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터 얻은 림프구를 이용한 당뇨병 전달의 저지를 나타낸 것이고, B는 가용성 파스 리간드를 이용한 당뇨병 전달의 저지를 나타낸 것이며,FIG. 3A shows the inhibition of diabetes mellitus delivery using lymphocytes obtained from NOD-lpr / lpr mice, B is the inhibition of diabetes mellitus delivery using soluble pars ligand,

도 4의 A는 CD4+ CD45RBlo기억세포에서 가용성 파스 리간드의 세포융해를 나타낸 것이고, B는 가용성 파스 리간드 처리 후 죽은 CD4+ CD45RBlo세포를 나타낸 것이고, C 와 D 는 가용성 파스 리간드 처리가 CD4+ CD45RBlo세포에서 Fas를 발현하는 정도를 감소시킴을 나타낸 것이다.4A shows the cell lysis of soluble PAS ligand in CD4 + CD45RB lo memory cells, B shows dead CD4 + CD45RB lo cells after soluble PAS ligand treatment, and C and D are CD4 + CD45RB lo cells treated with soluble PAS ligand. Decreases the expression of Fas.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가용성 파스 리간드를 유효성분으로 하는 자가면역질환 치료제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an agent for treating autoimmune diseases using a soluble pars ligand as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

발명자들은 자가면역질환에서 파스가 관여된 세포고사의 역할에 관하여 연구를 하던 중, 블록킹 타입의 항체 투여 실험 결과, 이미 발표된 바 또는 본인들이 생각하고 있던 것과 같이 파스와 파스 리간드가 결합하여 세포고사를 유도한다는 것과는 반대로 파스와 파스 리간드의 결합이 세포고사에 별다른 영향이 없음을 알게 되었다. 그런데 파스가 없는 NOD(nonobese diabetic) 마우스를 제조하여 본 결과, 그 마우스에서는 당뇨병이 발생하지도 않고, 당뇨병이 전달되지도 않아 파스가 당뇨병의 발생에 필수 불가결한 것 같은 결과를 보였으며, 결과는 도 1에 나타내었다.The inventors studied the role of PAS-induced cell death in autoimmune diseases, and as a result of blocking-type antibody administration experiments, the PAS and PAS ligands were combined and the cell death was performed as previously known or thought. In contrast, the binding of PAS and PAS ligand has no effect on apoptosis. However, as a result of manufacturing NOD (nonobese diabetic) mice without pars, the mice did not develop diabetes and did not transmit diabetes, which showed that pas was indispensable for the development of diabetes. 1 is shown.

상기 도 1의 A는 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 자연발생적인 당뇨병의 발생률을 나타낸 것이고, B는 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서 림프구 입양전달 후의 당뇨병의 발생률을 나타낸 것이다. 상기 도 1의 A와 B에서 NOD- lpr/lpr 실험쥐는 당뇨병이 발생하지 않았으나, 대조군인 NOD- lpr/w 실험쥐는 자연발생적인 당뇨병이 4개월 후부터 나타났으며, 림프구 입양전달의 경우에는 입양전달 후 2주 후부터 당뇨병의 증상이 나타났다. 상기의 결과는 NOD- lpr/lpr 실험쥐가 당뇨병에 대하여 저항성을 갖음을 보여준다.1A shows the incidence of spontaneous diabetes in NOD-lpr / lpr mice, and B shows the incidence of diabetes after lymphocyte adoptive transfer in NOD-lpr / lpr mice. In the A and B of FIG. 1, NOD-lpr / lpr mice did not develop diabetes, but the control NOD-lpr / w mice showed natural diabetes 4 months later, and in the case of lymphocyte adoptive delivery Two weeks later, symptoms of diabetes appeared. The results show that NOD-1pr / lpr mice are resistant to diabetes.

발명자들은 파스와 파스 리간드 결합이 표적세포인 인슐린을 분비하는 체장세포에서의 세포고사에 별다른 영향이 없으며, 파스가 없는 NOD 마우스에서는 당뇨병이 발생하지 않고, 당뇨병이 전달도 되지 않는다는 사실로부터 파스가 없는 NOD 마우스에서 당뇨병이 발생하지 않고, 당뇨병이 전달되지 않는 것은 그 마우스에 파스 리간드를 다량 발현하는 비정상적 림프구가 있고, 이에 의해 전달된 림프구의 살상이 초래되기 때문이라는 것을 착안하였다. 이것은 실험 전에 생각한 것과 같이 파스와 파스 리간드 사이의 상호작용이 표적세포를 죽이는 것이 아니라, 오히려 당뇨병을 일으키는 임파구들을 살상할 것 같다는데서 착안한 것이다.The inventors found that pas and pas ligand binding had no effect on apoptosis in somatic cells secreting insulin, which is a target cell, and that pas-free NOD mice did not develop diabetes and did not transmit diabetes. It was conceived that no diabetes occurred in NOD mice, and that diabetes was not delivered because the mice had abnormal lymphocytes expressing a large amount of pars ligand, resulting in the killing of delivered lymphocytes. It was conceived that the interaction between pars and pars ligand, as thought before the experiment, did not kill target cells, but rather killed lymphocytes causing diabetes.

상기 사실을 이용하여 발명자들은 림프구 전달 전에 전달되는 림프구들을 가용성 파스 리간드로 처리하면 마찬가지 원리로 당뇨병의 전달을 막을 수 있을 것으로 생각하였고, 가용성 파스 리간드를 제작하여 처리한 결과 당뇨병의 발달을 막을 수 있었으며 결과는 도 3과 같다.Using the above facts, the inventors thought that treating lymphocytes delivered before lymphocyte delivery with soluble pars ligand would prevent the delivery of diabetes in the same principle, and that the production and treatment of soluble pars ligand prevented the development of diabetes. The results are shown in FIG.

상기 도 3의 A는 NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터 얻은 림프구를 이용한 당뇨병 전달의 저지를 나타낸 것이고, B는 가용성 파스 리간드를 이용한 당뇨병 전달의 저지를 나타낸 것이다. 상기 도 3의 A에 나타나는 바와 같이 NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터 채취한 림프구를 투여한 실험쥐는 당뇨병이 발생하지 않았으나, 대조군인 NOD- lpr/w 실험쥐로부터 채취한 림프구를 투여한 실험쥐는 림프구 투여 후 2주 후부터 당뇨병이 발생하였으며, NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터 채취한 림프구와 함께 항 파스 리간드 항체인 항-파스 리간드 K10 항체(anti-Fas ligand k10 Ab) 을 투여한 실험쥐는 당뇨병 저지 현상이 깨져서 투여 후 3주 후부터 당뇨병이 발생함을 보여주었다.3A shows the inhibition of diabetes delivery using lymphocytes obtained from NOD-1pr / lpr mice, and B shows the prevention of diabetes delivery using soluble pars ligand. As shown in FIG. 3A, the mice treated with the lymphocytes collected from the NOD-lpr / lpr mice did not develop diabetes. However, the mice treated with the lymphocytes collected from the control group NOD-lpr / w mice were lymphocytes. Diabetes developed 2 weeks after administration. Anti-Fas Ligand K10 Antibody (anti-Fas Ligand K10 Ab) with lymphocytes from NOD-lpr / lpr mice was used to prevent diabetes. The cracks showed that diabetes occurred three weeks after administration.

상기 도 3의 B는 가용성 파스 리간드를 처리한 실험쥐는 당뇨병의 발생이 가용성 파스 리간드 처리 후 4주 후부터 나타나며, 그 발생의 정도도 25 %에 불과하나, 대조군인 가용성 파스 리간드로 처리하지 않은 실험쥐는 상기 가용성 파스 리간드로 처리한 시점과 같은 시점을 기준으로 할 때, 3주 후부터 당뇨병이 발생하였으며, 그 발생의 정도는 75 %나 되었다. 상기 결과는 가용성 파스 리간드가 당뇨병의 치료효과가 있음을 보여준다.3B shows that in mice treated with soluble pars ligand, the incidence of diabetes appears after 4 weeks after treatment with soluble pars ligand, and the incidence is only 25%. Based on the same time point as when treated with the soluble pars ligand, diabetes occurred after 3 weeks, and the incidence was 75%. The results show that soluble pars ligand has a therapeutic effect on diabetes.

가용성 파스 리간드의 제조는 CD5 인식서열(signal sequence)을 인간 파스 리간드의 세포막통과 영역(transmembrane region)의 아래쪽에 위치하는 34번째 아미노산에 결합시키고, 상기 형질 전환된 클론들(clones)을 혈청이 없는 배양액에 배양하고, 상기 배양액의 상등액을 취하여 제조된다. 본 발명에서는 배양액으로 CHO-S-SFM Ⅱ (GibcoBRL, Gaithersburg, MD)를 사용하였다.Preparation of the soluble pars ligand binds the CD5 signal sequence to the 34th amino acid located below the transmembrane region of the human pars ligand, and the transformed clones are serum-free. It is cultured in a culture solution, and prepared by taking the supernatant of the culture solution. In the present invention, CHO-S-SFM II (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) was used as a culture medium.

본 발명의 자가면역질환 치료제는 상기 가용성 파스 리간드를 유효성분으로 하며, 주사제형 또는 경구복용형 등 어떠한 제형으로도 제조가 가능하다.The therapeutic agent for autoimmune diseases of the present invention may be prepared in any formulation such as an injection or oral dosage form using the soluble pars ligand as an active ingredient.

한편 상기 가용성 파스 리간드를 이용한 자가면역질환의 원리는 가용성 파스 리간드가 파스를 발현하는 기억 T 림프구를 살상하여 파스를 발현하지 못하도록 함으로써 자가면역질환이 더 이상 발달하지 못하게 하는 것이다.On the other hand, the principle of autoimmune diseases using the soluble pars ligand is to prevent the development of autoimmune diseases by killing the memory T lymphocytes expressing pars to express the pars.

이하 본 발명의 실시예을 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명을 한정하는 것은 아니다.Hereinafter, examples of the present invention will be described. However, the following examples are intended to illustrate the invention and not to limit the invention.

[실시예 1]Example 1

초기 역치 가능 요소(early transposable element)를 지닌 쥐들을 DNA 말단의 PCR 분석을 통하여 선택하여 9세대 역교배(backcrossing)를 반복하여 NOD- lpr/lpr 실험쥐를 얻었다. 암컷 NOD- lpr/lpr 실험쥐(0/12)의 어느 것도 당뇨병 또는 인슐린염(insulitis)이 8 개월 동안 발현되지 않았고, 반면에 대조군 암컷 NOD- lpr/wild litermates(한 어미에게서 한 배에 난 새끼들)의 60 % (6/10) 가 24 주전에 당뇨병이 생겼다. 도 1의 A는 상기 결과를 나타낸 것이다.Mice with early transposable elements were selected by PCR analysis at the ends of the DNA and repeated 9 generation backcrossing to obtain NOD-1pr / lpr mice. None of the female NOD-lpr / lpr mice (0/12) developed diabetes or insulitis for eight months, whereas control female NOD-lpr / wild litermates (folded from one mother) 60% (6/10) had diabetes 24 weeks ago. 1A shows the result.

상기 결과는 NOD- lpr/lpr 실험쥐가 당뇨병 전달에 저항함을 알 수 있다.The results show that NOD-1pr / lpr mice are resistant to diabetes delivery.

[실시예 2]Example 2

상기 실시예 1과 같은 방법으로 NOD- lpr/lpr 실험쥐를 얻은 후 상기 실험쥐에 림프구 입양전달을 하였다. NOD- lpr/lpr 실험쥐의 어느 것도 입양전달 후 8 주 내에는 당뇨병이 발현되지 않은 반면, 대조군 NOD- lpr/wild littermates의 73 % (8/11)는 8 주 내에 당뇨병이 발현되었다. 도 1의 B는 상기 결과를 나타낸 것이다.After obtaining NOD-1pr / lpr mice in the same manner as in Example 1, lymphocytes were transferred to the mice. None of the NODlpr / lpr mice developed diabetes within 8 weeks after adoption, whereas 73% (8/11) of control NODlpr / wild littermates developed diabetes within 8 weeks. 1B shows the result.

[실시예 3]Example 3

NOD- lpr/lpr 실험쥐의 림프구들이 다른 종래의 lpr 실험쥐에서와 같이 파스 리간드를 발현하는지를 실험하였다. RNase 방어분석(protection assays) 한 결과 도 2의 A에서 나타나는 바와 같이 높은 수준의 파스 리간드 mRNA를 발현함을 보여주었다.Lymphocytes of NOD-1pr / lpr mice were tested to express the pars ligand as in other conventional lpr mice. RNase protection assays showed high levels of pars ligand mRNA as shown in FIG.

[실시예 4]Example 4

당뇨병 전달에서 파스 리간드를 발현하는 림프구 세포들의 효과를 제거하기 위하여 흉선 절제(neonatal thymectomy)를 수행하였다. 흉선 절제된 NOD- lpr/lpr 실험쥐는 입양전달 후 당뇨병을 발달시키지 못했다(n = 6). 그러나 조직학적 분석을 통하여 본 결과 상기 쥐들에게 입양전달 후 인슐린염이 생겼다. 인슐린 염의 평균 크기는 입양전달 후 6 내지 8주에서 0.74 ± 0.39 이었다(평균 ± 표준편차, n = 6). 흉선 절제되지 않은 NOD- lpr/lpr 실험쥐에서는 입양전달 후 인슐린염이 생성되지 않았다. 도 2의 B는 상기 결과를 나타낸 것이다.Neonatal thymectomy was performed to eliminate the effect of lymphocyte expressing PAS ligand on diabetes delivery. Thymic resected NODlpr / lpr mice did not develop diabetes after adoptive delivery (n = 6). However, as a result of histological analysis, the mice developed insulin salt after delivery. The mean size of the insulin salt was 0.74 ± 0.39 at 6-8 weeks after adoption delivery (mean ± standard deviation, n = 6). Insulin salts were not produced after adoptive delivery in NOD-lpr / lpr mice without thymic resection. 2B shows the result.

상기 결과는 파스 리간드 숫자의 감소는 인슐린염의 발달을 촉진함을 보여주었고, 파스-파스 리간드 결합이 인슐린염에서는 필수적이 아님을 보여주었다.The results showed that a decrease in the number of pars ligands promotes the development of insulin salts, and that pas-pars ligand binding is not essential for insulin salts.

[실시예 5]Example 5

NOD- lpr/lpr 실험쥐의 비정상적인 림프구들이 자가면역 당뇨병의 전달을 방해하는 것을 더욱 증명하기 위하여, NOD- lpr/lpr 실험쥐의 림프구들을 방사선 조사된 NOD 실험쥐로부터의 비장세포(splentocytes)와 함께 투입했다.To further demonstrate that abnormal lymphocytes in NOD-lpr / lpr mice interfere with the transmission of autoimmune diabetes, lymphocytes in NOD-lpr / lpr mice were combined with splenocytes from irradiated NOD mice. Committed.

비장세포가 투입된 NOD 실험쥐(n = 9)의 어느 것도 입양전달 후 8주 내에는 당뇨병이 발현되지 않았으며, 반면 NOD- lpr/wild 실험쥐로부터 림프구들을 투입한 NOD 실험쥐는 75 %(6/8)가 당뇨병에 걸렸다. 상기 결과는 파스 리간드를 발현하는 림프구들이 당뇨병의 전달을 방해함을 나타낸다.None of the NOD mice injected with splenocytes (n = 9) developed diabetes within 8 weeks after adoption, whereas 75% (6/6) of NOD mice injected with lymphocytes from NODlpr / wild mice. 8) has diabetes. The results indicate that lymphocytes expressing pars ligand interfere with the delivery of diabetes.

[실시예 6]Example 6

항 파스 리간드 항체인 항-파스 리간드 k10 항체를 일주일에 3 번, 1 회에 1 mg씩 주사하였다. NOD- lpr/lpr 실험쥐의 림프구들을 집어넣어 발생하였던 당뇨병의 저지 현상이 파괴되어 당뇨병이 재발하였다. 실험의 결과를 도 3의 A에 나타내었다.The anti-parse ligand k10 antibody, an anti-parse ligand antibody, was injected 1 mg 3 times a week. Diabetes recurred due to the disruption of diabetic depression caused by the insertion of lymphocytes from NOD-1pr / lpr mice. The results of the experiment are shown in A of FIG. 3.

상기 실험 결과는 NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터의 비정상적인 파스를 발현하는 림프구 세포들이 당뇨병에 걸린 NOD 실험쥐로부터 유래한 자동 반응적인 림프구들에서 세포고사를 수행함으로써 당뇨병 전달을 저지함을 나타낸다.The experimental results indicate that lymphocyte cells expressing abnormal pars from NOD-1pr / lpr mice inhibited diabetes delivery by performing apoptosis on autoreactive lymphocytes derived from NOD mice with diabetes.

[실시예 7]Example 7

NOD- lpr/lpr 실험쥐로부터 얻은 파스 리간드를 직접 실험쥐에 투입하였다. 투입된 NOD 수용 실험쥐는 골수이식 수용자의 이식편대 숙주병(GVHD)의 징후인 비성 백색 비수(splenic white pulp)의 세포 상실(cellar depletion)과 간 문맥삼분기(portal triad of the liver) 주위의 림프구 축적(lymphoid infiltration)을 보였다. 상기 결과로서 생체에 직접적인 파스 리간드를 투입하는 것은 부작용을 일으키게 됨을 알 수 있다.The pars ligand obtained from NOD-1pr / lpr mice was directly injected into the mice. Injected NOD mice received cell depletion of lymphoid white pulp, a sign of graft-versus-host disease (GVHD), and lymphocyte accumulation around the portal triad of the liver. (lymphoid infiltration). As a result, it can be seen that injecting the pars ligand directly into the living body causes side effects.

[실시예 8]Example 8

부작용 없이 자동 반응적인 림프구들에서 파스 리간드의 자가면역질환 치료 효과를 이용하기 위하여, 가용성 파스 리간드로 처리하여도 당뇨병 전달에서의 유사한 저지효과가 나타나는지 조사하였다.In order to take advantage of the autoimmune disease treatment effect of PAS ligand in autoreactive lymphocytes without side effects, it was investigated whether treatment with soluble PAS ligand showed a similar inhibitory effect on diabetes delivery.

가용성 파스 리간드는 인간 파스 리간드의 세포막 통과 영역의 아래쪽에 위치하는 34 번째 아미노산에 CD5 인식 서열을 결합시켜 제조하였으며, CHO-S-SFM Ⅱ 배지(GibcoBRL, Gaithers, MD)에서 배양하였다. 상기 배양한 상등액을 식염수 100중량부에 대하여 10 중량부를 혼합하여 실험쥐의 비장세포를 전처리한 후 결과를 관찰하였으며 결과를 도 3에 나타내었다.Soluble parse ligand was prepared by binding the CD5 recognition sequence to the 34th amino acid located below the cell membrane transit region of the human parse ligand, and was cultured in CHO-S-SFM II medium (GibcoBRL, Gaithers, MD). 10 parts by weight of the cultured supernatant was mixed with 100 parts by weight of saline to pretreat the mice's splenocytes, and the results were observed. The results are shown in FIG.

상기 가용성 파스 리간드의 처리는 당뇨병의 범위를 75 %(6/8)에서 22 %(2/9)로 줄였다. 상기 결과는 가용성 파스 리간드가 당뇨병에 치료제 또는 예방제가 될 수 있음을 알 수 있다.Treatment of the soluble pars ligand reduced the range of diabetes from 75% (6/8) to 22% (2/9). The results show that the soluble pars ligand can be a therapeutic or prophylactic agent for diabetes.

[실시예 9]Example 9

당뇨병에 걸린 NOD 실험쥐(n = 3)와 당뇨병에 걸리지 않은 NOD 실험쥐(n = 4)로부터 얻은 림프구들을 가용성 파스 리간드로 16 시간 처리를 하여 CD4+ T 세포 사이의 CD45RBlo부분을 관찰하였다. 도 4의 A에 상기의 결과를 나타내었으며, CD4+ T 세포 사이의 CD45RBlo부분은 16.4 ± 2.7 %에서 10.2 ± 3.0 %로 줄어들었다.Lymphocytes obtained from diabetic NOD mice (n = 3) and nondiabetic NOD mice (n = 4) were treated with soluble pars ligand for 16 hours to observe the CD45RB lo region between CD4 + T cells. 4A shows the above result, and the CD45RB lo portion between CD4 + T cells was reduced from 16.4 ± 2.7% to 10.2 ± 3.0%.

상기와 같은 방법으로 당뇨병에 걸린 NOD 실험쥐(n = 3)과 당뇨병에 걸리지 않은 NOD 실험쥐(n = 4)로부터 얻은 림프구들을 가용성 파스 리간드로 16 시간 처리를 하여 CD4+ CD45RBlo세포 사이의 죽은 세포들을 PI로 염색하여 관찰하였다. 도 4의 B에 상기의 결과를 나타내었으며, 죽은 세포 부분들은 12.7 ± 5.5 %에서 32.2 ± 12.1 %로 증가하였다.Lymphocytes from NOD mice with diabetes (n = 3) and non-diabetic NOD mice (n = 4) were treated with soluble PAS ligands for 16 hours in the same manner as the dead cells between CD4 + CD45RB lo cells. Were stained with PI and observed. The results of the above are shown in B of FIG. 4, and the dead cell portions increased from 12.7 ± 5.5% to 32.2 ± 12.1%.

상기 결과에서 가용성 파스 리간드 처리 후 CD4+ CD45RBlo의 숫자가 감소한 것은 CD4+ CD45RBloFas+ 세포의 죽음 때문이다. 도 4의 C와 D는 가용성 파스 라간드의 처리가 CD4+ CD45RBlo세포에서 파스를 발현하는 정도를 감소시킨다는 것을 나타낸 것이며, 상기 도에 나타난 것과 같이 파스의 발현 양은 7.3 %에서 3.6 %로 줄어들었다.In this result, the decrease in the number of CD4 + CD45RB lo after soluble PAS ligand treatment is due to the death of CD4 + CD45RB lo Fas + cells. 4C and D show that treatment of soluble pars lagand reduces the expression of pars in CD4 + CD45RB lo cells, and the amount of pars expression decreased from 7.3% to 3.6% as shown in the figure.

상기한 바와 같이, 가용성 파스 리간드는 당뇨병을 비롯한 자가면역질환을 치료하는 작용을 하며, 파스 리간드를 유효성분으로 하는 자가면역질환의 치료제는 자가면역질환에 대하여 유용한 치료제임을 알 수 있다.As described above, the soluble pars ligand acts to treat autoimmune diseases including diabetes, and it can be seen that the therapeutic agent for autoimmune diseases using the pars ligand as an active ingredient is a useful therapeutic agent for autoimmune diseases.

Claims (1)

가용성 파스 리간드를 유효성분으로 하는 자가면역질환 치료제.An autoimmune disease therapeutic agent comprising a soluble pars ligand as an active ingredient.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2003022299A1 (en) * 2001-08-01 2003-03-20 Genset S.A. Genobix agonists and antagonists for use in the treatment of metabolic disorders

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