KR20000068161A - Method of attenuating viruses - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 뇌막 수용체 제제를 제조하는 단계; (b) 목적하는 바이러스의 일정량을 과량의 막 수용체를 함유하는 상기 막 수용체 제제의 일정량과 혼합하여 바이러스-막 수용체 제제 현탁액을 형성시키는 단계; (c) 이러한 현탁액을 원심분리시켜 상등액을 형성시키는 단계; (d) 상기 상등액에서의 잔류 바이러스 감염도를 결정하는 단계; 및 (e) 바이러스 백신 후보로서 유용한 개개의 막 수용체 제제 결합-내성 바이러스 변이체를 분리시키는 단계를 포함하는, 뇌막 수용체 제제와 결합되지 않는 바이러스 변이체를 선별함으로써 바이러스 백신 후보를 선별하는 방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of (a) preparing a meninges receptor preparation; (b) mixing an amount of the desired virus with an amount of said membrane receptor formulation containing excess membrane receptor to form a virus-membrane receptor formulation suspension; (c) centrifuging this suspension to form a supernatant; (d) determining the residual viral infectivity in the supernatant; And (e) isolating individual membrane receptor agent binding-tolerant viral variants useful as viral vaccine candidates.
Description
종두법(vaccination)이 전염병으로 인한 사람의 사망률과 질병율을 감소시키는데 가장 좋은 방법이다. 백신이 두창, 황열, 회백수염 및 마진과 같이 전세계적으로 창궐하는 몇가지 주요 전염병을 근절시키거나 억제시키는데 상당한 기여를 하고 있다. 특히, 약독화된 생 백신(live attenuated vaccine)은 숙주 면역 반응의 상이한 방어 능력을 자극하기 때문에 성공적이었다. 이들 생 백신은 비정상적인 숙주에서 바이러스, 예를 들면, 치킨 조직에서 황열 17D 바이러스를 계대접종시킴으로써 유도된 천연의 바이러스 변이체이다(Monath, 1990). 그러나, 이러한 방법은 실험적일 뿐이며 비용면에서 효율적이지 못하고 사람에게 투여할 수 있을 정도로 유용한 백신을 개발하는데는 장시간이 소요된다.Vaccination is the best way to reduce mortality and morbidity in humans from infectious diseases. Vaccines have made a significant contribution to eradicating or suppressing some of the major epidemics that are outbreaks worldwide, such as cramps, yellow fever, whiskers and margins. In particular, live attenuated vaccines have been successful because they stimulate different protective abilities of the host immune response. These live vaccines are natural viral variants derived by passage of viruses in abnormal hosts, such as yellow fever 17D virus in chicken tissue (Monath, 1990). However, this method is experimental and not cost effective and it takes a long time to develop a vaccine that is useful enough for human administration.
바이러스는 감수성 세포의 바이러스 흡착성 단백질이 특정한 바이러스에 대한 수용체로서 작용하는 세포 표면 상의 특정 분자에 결합될 수 없는 한은 이러한 감수성 세포를 감염시킬 수 없다. 특이적 세포 또는 조직 상의 수용체를 완전한 숙주에서 발현시키는 것은 숙주 내로의 바이러스 유입 경로, 숙주에서의 바이러스 유포 양상 및 이에 따른 발병학을 결정하는 주요 방법이다[참조: Marsh and Helinius, 1989; Lentz, 1989; Dimmock and Primrose, 1995]. 다가성일 수 있고 몇몇 수용체 단위로 이루어진 숙주 세포 수용체 부위의 성질, 수 및 분포 위치를 포함한, 숙주 범위와 바이러스의 조직 친화성(tissue tropism)을 결정하는 수많은 요소들이 있다[참조: Paulson, 1985; Mims, 1986].Viruses cannot infect such susceptible cells unless the viral adsorbent proteins of the susceptible cells can bind to specific molecules on the cell surface that act as receptors for that particular virus. Expression of receptors on specific cells or tissues in a complete host is a major method of determining viral pathways into the host, patterns of viral spread in the host, and thus pathogenesis. Marsh and Helinius, 1989; Lentz, 1989; Dimmock and Primrose, 1995]. There are a number of factors that determine host range and tissue tropism of the virus, including the nature, number and location of host cell receptor sites, which may be multivalent and consist of several receptor units (Paulson, 1985; Mims, 1986].
일본 뇌염(JE)은 일본 뇌염 바이러스, 즉 모기-기원의 플라비바이러스(flavivirus)에 의해 유발된 질병으로서, 아시아 전지역에서 유행하고 있고(Huang, 1982) 전 세계적으로 가장 자주 발생하는 유행성 바이러스 뇌염이다. 이러한 바이러스는 뇌, 특히 신경단위(neuron)에 대해 조직 친화성을 지니고 있다. 일본 뇌염 바이러스는 플라비비리대(Flaviviridae) 과의 플라비바이러스 속에 속한다(Westaway et al., 1985). 이러한 바이러스의 게놈은 5' 말단에 3개의 구조적 단백질[캡시드(C), 막(M) 및 외막(E) 단백질] 및 3' 말단에 7개의 비-구조적 단백질(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5)을 암호화하는 1개의 긴 개방 판독 프레임을 함유하고 10,986개 뉴클레오티드 길이로 된, 1개의 일본쇄, 포지티브 센스 RNA로 구성된다. 상기 바이러스는 사망률이 50% 정도인 신경학적 질환을 유발시키는데, 생존자의 70% 정도도 신경학적 속발증세를 나타낼 수 있다.Japanese encephalitis (JE) is a disease caused by the Japanese encephalitis virus, or mosquito-derived flavivirus, which is prevalent throughout Asia (Huang, 1982) and is the most frequent pandemic encephalitis worldwide. . Such viruses have tissue affinity for the brain, particularly neurons. Japanese encephalitis virus belongs to the genus Flaviviridae of the family Flaviviridae (Westaway et al., 1985). The genome of this virus consists of three structural proteins (capsid (C), membrane (M) and outer membrane (E) proteins) at the 5 'end and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, 3) at the 3' end. It consists of one single-chain, positive sense RNA, containing one long open reading frame encoding NS4A, NS4B and NS5) and 10,986 nucleotides in length. The virus causes neurological diseases with a mortality rate of about 50%, and about 70% of survivors may also exhibit neurological secondary symptoms.
이러한 질병을 예방할 만한 치료법이 없다. 따라서, 이러한 질병을 방제하기 위해 백신을 사용하고 있다(1). 약독화된 생 백신 개발은 바이러스의 향신경성과 병원성에 대한 반전 잠재성으로 인해 어려운 것으로 입증되었다. 현재, 일본 뇌염 바이러스의 약독화와 병원성에 대한 분자상 기본 원리에 관해서는 전혀 공지된 바가 없다.There is no cure for these diseases. Therefore, vaccines are used to control these diseases (1). The development of attenuated live vaccines has proved difficult due to the reversible potential for viral neuropathy and pathogenicity. At present, there is no known molecular basis for attenuation and pathogenicity of Japanese encephalitis virus.
플라비바이러스 속의 원형 원(prototype member)인 야생형 황열(YF) 바이러스가 사람 및 원숭이에게서 간염 및 유행성 출혈열(즉, 내장 친화성 질병)과 향신경성이 아닌 질병을 유발시키는 것으로 확인되었다. YF는 사람과 원숭이에게서 다양한 정도의 향신경성을 나타내지만 내장 친화성을 나타내지는 않는, 17D 및 FNV(프렌치 향신경성 백신)으로서 공지된 약독화된 생 백신을 사용함으로써 억제된다.Wild type yellow fever (YF) virus, a prototype member of the flavivirus genus, has been shown to cause hepatitis and epidemic hemorrhagic fever (ie visceral affinity disease) and non-neurotropic diseases in humans and monkeys. YF is inhibited by using attenuated live vaccines known as 17D and FNV (French Neuropathic Vaccine), which show varying degrees of neuropathy in humans and monkeys but not visceral affinity.
이와 같이 약독화된 FNV 바이러스는 마우스 뇌에서 야생형 균주 프렌치 내장 친화성 바이러스(FVV)를 계대접종함으로써 유도하였다[참조: Mathis et al., 1928]. 이러한 FNV 바이러스가 내장 친화성에 대해서는 약독화되긴 하였지만, 이를 뇌내 접종시킨 원숭이에 대한 치사율이 높고 11세 정도의 소아에게서 백신 접종 후의 합병증이 자주 발생되는 등의 향신경성적 성질은 증가된 것으로 밝혀졌다. 이를 17D 바이러스와 비교해보면, 17D 백신은 17D 바이러스를 뇌내 접종시킨 원숭이에게서는 치사율이 거의 없을 정도로 내장 친화성과 향신경성 모두에 대해서 약독화된 것이며 백신 접종 후의 합병증의 발생율도 극히 낮아서 이러한 17D 백신을 1세 영아에게도 안전하게 투여할 수 있다. 이와 같이 보다 더 약독화된 17D의 표현형으로 인해, 17D 바이러스가 황열을 제어하기 위한 백신으로서 FNV 바이러스를 대체하게 되었다.This attenuated FNV virus was induced by passage of wild type strain French visceral affinity virus (FVV) in the mouse brain (Mathis et al., 1928). Although the FNV virus was attenuated for visceral affinity, neurological properties such as high mortality in monkeys vaccinated and high incidence of post-vaccination complications in children about 11 years old were found to be increased. Compared with the 17D virus, the 17D vaccine was attenuated for both visceral affinity and neuropathy, with little mortality in monkeys vaccinated with the 17D virus. It can also be safely administered to infants. This more attenuated phenotype of 17D led to 17D virus replacing FNV virus as a vaccine to control yellow fever.
선행 기술에서는 바이러스를 약독화시키는데 효과적인 방법이 결여되어 있다. 본 발명은 당해 분야에서 이러한 지속적으로 대두되는 요망을 충족시켜 준다.Prior art lacks effective methods for attenuating viruses. The present invention satisfies this constantly emerging need in the art.
〈발명의 요약〉<Summary of invention>
현재, 일본 뇌염(JE) 바이러스의 약독화 및 병원성에 관한 분자상 기본 원리가 완전하게 밝혀지지는 않았다. 두 시스템을 사용하여 약독화와 병원성을 검사하였다: 첫 번째 시스템은 야생형 균주 SV14를 1차적인 햄스터 신장 세포 배양물에서 계대접종시킴으로써 약독화시켜 약독화된 생 백신을 생성시키는 것을 포함한다. SA14의 게놈은 공통의 7개 아미노산(E-138, E-176, E-315, E-439, NS2B-63, NS3-105 및 NS4B-106)에 있어서만 이의 4가지 백신 유도체와 상이하다. 두 번째 시스템은 지금까지 가장 병원성인 균주로 동정된 야생형 균주 P3을 분석하는 것을 포함한다. 균주 P3의 게놈을 다른 야생형 균주의 것과 비교해 본 결과, 균주 P3의 병원성 표현형과 연관이 있는 16개의 독특한 아미노산(외막(E) 단백질에서의 9개 아미노산을 포함함)을 동정할 수 있었다. 마우스 뇌막 수용체 제제 결합-내성 변이체는 E-306과 E-408이 수용체 결합과 연관이 있다는 것을 지시해준다. 전반적으로, 지금까지의 연구는 E 단백질이 일본 뇌염 바이러스의 마우스 약독화된 또는 병원성 표현형의 주요 결정 요인이 된다는 것을 지시하고 있다.At present, the molecular basic principles regarding the attenuation and pathogenicity of the Japanese encephalitis (JE) virus are not fully understood. Two systems were used to test for attenuation and pathogenicity: The first system involved attenuating wild type strain SV14 in primary hamster kidney cell culture to generate attenuated live vaccines. The genome of SA14 differs from its four vaccine derivatives only in common seven amino acids (E-138, E-176, E-315, E-439, NS2B-63, NS3-105 and NS4B-106). The second system involves analyzing wild type strain P3, which has been identified as the most pathogenic strain to date. Comparing the genome of strain P3 with that of other wild type strains, 16 unique amino acids (including 9 amino acids in the outer membrane (E) protein) associated with the pathogenic phenotype of strain P3 could be identified. Mouse meninges receptor agent binding-resistant variants indicate that E-306 and E-408 are associated with receptor binding. Overall, studies to date indicate that E protein is a major determinant of the mouse attenuated or pathogenic phenotype of Japanese encephalitis virus.
마우스 뇌막 수용체 제제(MRP)에 대한 결합 내성을 알아보기 위하여 일본 뇌염 바이러스 균주 P3의 3가지 변이체를 선별하였다. 이들 MRPR변이체는 이들의 모 바이러스와 비교해서 신경침입력(200배 초과)과 신경병원성(1000배 초과) 모두에 대해서 마우스에서 상당히 약독화시킨 것이다. 약독화된 모든 마우스 뇌 MRPR변이체는 뇌내(i.c.) 또는 복강내(i.p.) 접종시킨 마우스의 혈청에서 복제된 반면, 복제는 i.c. 접종시킨 마우스의 뇌에서 탐지되었다. 모기 C6-36 세포에성 성장되거나 원숭이 신장 베로 세포에서 정제되고 증폭된 P3 바이러스와 비교해서, 모든 마우스 뇌 MRPR변이체의 외막(E) 단백질 유전자에서 이러한 E 단백질의 E-306과 E-408 잔기에서 2개의 통상의 아미노산 돌연변이가 발견되었다. 이들 아미노산은 마우스 뇌에서 일본 뇌염 바이러스가 이의 세포 수용체에 대한 결합을 변형시키기 때문에 약독화와 관련이 있는 것으로 추정된다. 일본 뇌염 사람 뇌 MRPR변이체의 발생으로 인해, 마우스 신경병원성에 대해 5,000,000배 약독화시킨 바이러스가 생성되었다. 유사하게, 황열 원숭이 뇌 MRPR변이체는 마우스에서 신경병원성에 대해 8,000배 약독화시켰고 랑가트(Langat) 바이러스 마우스 뇌 MRPR변이체는 마우스 신경병원성에 대해 16,000배 약독화시켰다. 본원에서 개발된 방법은 일반적으로, 바이러스의 병원성을 약독화시키고 세포 수용체와 상호작용하는 바이러스 흡착성 단백질(들) 중의 아미노산을 차단시키는 제제를 동정하는데 응용할 수 있다.Three variants of Japanese encephalitis virus strain P3 were screened for binding resistance to mouse meninges receptor preparations (MRP). These MRP R variants are significantly attenuated in mice for both neuroinvasiveness (more than 200-fold) and neuropathogenicity (more than 1000-fold) compared to their parental virus. All attenuated mouse brain MRP R variants were replicated in the serum of mice inoculated (ic) or intraperitoneally (ip), whereas replication was detected in the brains of ic inoculated mice. E-306 and E-408 residues of these E proteins in the outer membrane (E) protein genes of all mouse brain MRP R variants, compared to P3 viruses grown on mosquito C6-36 cells or purified and amplified in monkey kidney Vero cells. Two common amino acid mutations were found in. These amino acids are believed to be associated with attenuation because Japanese encephalitis virus in the mouse brain modifies its binding to cellular receptors. The development of Japanese encephalitis human brain MRP R variants resulted in a virus that attenuated 5,000,000-fold attenuation for mouse neuropathogenicity. Similarly, yellow fever monkey brain MRP R variants attenuated 8,000-fold for neuropathogenicity in mice and Langat virus mouse brain MRP R variants attenuated 16,000-fold for mouse neuropathogenicity. The methods developed herein are generally applicable to identifying agents that attenuate the pathogenicity of a virus and block amino acids in viral adsorbent protein (s) that interact with cellular receptors.
본 발명의 한 양태에서는, (a) 뇌막 수용체 제제를 제조하는 단계; (b) 목적하는 바이러스의 일정량을 과량의 막 수용체를 함유하는 상기 막 수용체 제제의 일정량과 혼합하여 바이러스-막 수용체 제제 현탁액을 형성시키는 단계; (c) 상기 현탁액을 원심분리시켜 상등액을 형성시키는 단계; (d) 이러한 상등액에서의 잔류성 바이러스 감염도를 측정하는 단계; 및 (e) 바이러스 백신 후보로서 유용한 개개의 막 수용체 제제 결합-내성 바이러스 변이체를 분리시키는 단계를 포함하는, 뇌막 수용체 제제와 결합되지 않는 바이러스 변이체를 선별함으로써 바이러스 백신 후보를 선별하는 방법이 제공된다.In one aspect of the present invention, there is provided a method for preparing a cerebral membrane receptor formulation; (b) mixing an amount of the desired virus with an amount of said membrane receptor formulation containing excess membrane receptor to form a virus-membrane receptor formulation suspension; (c) centrifuging the suspension to form a supernatant; (d) measuring the residual viral infection in such supernatant; And (e) isolating individual membrane receptor preparation binding-tolerant viral variants useful as viral vaccine candidates.
본 발명의 기타 및 추가의 국면, 양태 및 이점은 예시 목적으로 제시된 본 발명의 바람직한 양태에 관한 다음 기재내용으로부터 명백할 것이다.Other and further aspects, aspects, and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments of the invention presented for purposes of illustration.
본 발명은 일반적으로 바이러스학, 면역학 및 단백질 화학 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 바이러스를 약독화시키는 신규 방법에 관한 것이다.The present invention generally relates to the field of virology, immunology and protein chemistry. More specifically, the present invention relates to novel methods of attenuating viruses.
상기 언급된 본 발명의 양태, 이점 및 목적 뿐 아니라 명백해질 기타 양태가 얻어지고 이를 상세히 이해시키기 위하여, 앞서 간단하게 요약된 본 발명의 보다 특정한 명세가 첨부된 도면에 예시되는 이의 특정 양태를 참조로 하여 이루어질 수 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부된 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 예시할 뿐이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것을 인지해야 한다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS In order to obtain and understand in detail the above-described aspects, advantages and objects of the present invention as well as other aspects that will become apparent, reference is made to the specific embodiments thereof, more briefly summarized above in brief, illustrated in the accompanying drawings. It can be done by. These drawings form part of this specification. It should be appreciated, however, that the appended drawings illustrate only preferred embodiments of the invention and thus do not limit the scope of the invention.
도 1은 SA14-유도된 백신 바이러스의 계대접종 내력을 도시한 것이다.1 shows the passage history of SA14-induced vaccine virus.
도 2는 E 단백질의 영역외(17로부터 변형됨) 구조에 대한 모델을 도시한 것이다. 패널 A: 평면도, 패널 B: 측면도.2 shows a model for the out-of-region (modified from 17) structure of the E protein. Panel A: Top view, Panel B: Side view.
도 3은 가장 중요한 적당한 아미노산을 갖는 E 단백질의 가용성 부분 모델[문헌(Rey et al., 1995)로부터 변형됨]을 도시한 것이다. 패널 A: 평면도, 패널 B: 측면도.3 depicts a soluble partial model of E protein with the most important suitable amino acid (modified from Rey et al., 1995). Panel A: Top view, Panel B: Side view.
도 4는 가장 중요한 적당한 아미노산을 갖는 E 단백질의 가용성 부분 모델[문헌(Rey et al., 1995)로부터 변형됨]을 도시한 것이다. 패널 A: 평면도, 패널 B: 측면도.4 depicts a soluble partial model of E protein with the most important suitable amino acid (modified from Rey et al., 1995). Panel A: Top view, Panel B: Side view.
본 발명에서는, 바이러스 흡착성 단백질-세포 수용체 상호작용을 연구하기 위한 모델 시스템으로서 고도로 신경병원성인 플라비바이러스, 즉 일본 뇌염 바이러스가 사용되었다. 잠재적인 바이러스 백신 후보를 선별하기 위한 신규의 방법이 정립되었다. 본 발명은 마우스에서 사람 뇌 MRPR 변이체의 신경 병원성 및 신경 침입력의 약독화에 대해 평가하고, 사람 뇌와 마우스 뇌에서 JE 바이러스의 병원성 약독화와 관련이 있을 수 있는 유전적 돌연변이(들)와 비교한다.In the present invention, a highly neuropathogenic flavivirus, ie, Japanese encephalitis virus, was used as a model system for studying virus adsorptive protein-cell receptor interactions. New methods for screening potential viral vaccine candidates have been established. The present invention evaluates the neuropathic and neuroinvasive attenuation of human brain MRPR variants in mice and compares with genetic mutation (s) that may be associated with pathogenic attenuation of JE virus in human brain and mouse brain. do.
본 발명의 한 가지 목적은 마우스 뇌막 수용체 제제(MRPR)와 결합되지 않는 일본 뇌염 바이러스 변이체를 선별하는 것이다.One object of the present invention is to select Japanese encephalitis virus variants that do not bind to the mouse meninges receptor preparation (MRPR).
본 발명의 또 다른 목적은 마우스에서 MRPR의 신경 병원성과 신경 침입력의 약독화를 평가하는 것이다.Another object of the present invention is to evaluate the attenuation of neuropathic and neuronal invasiveness of MRPR in mice.
본 발명의 추가의 목적은 MRPR 변이체의 병원성 약독화와 관련이 있는 유전적 돌연변이(들)를 분석하는 것이다. 세포 수용체와 결합되는 바이러스 흡착성 단백질 중의 아미노산을 동정하는 것이 약독화된 생 백신을 개발하고 바이러스의 세포/조직 친화성의 분자상 기본 원리를 이해하는데 있어서 바람직한 방법이다.A further object of the present invention is to analyze the genetic mutation (s) associated with pathogenic attenuation of MRPR variants. Identifying amino acids in viral adsorbent proteins that bind to cellular receptors is a preferred method for developing attenuated live vaccines and for understanding the molecular basic principles of the cell / tissue affinity of the virus.
본 발명은 (a) 뇌막 수용체 제제를 제조하는 단계; (b) 목적하는 바이러스의 일정량을 과량의 막 수용체를 함유하는 상기 막 수용체 제제의 일정량과 혼합하여 바이러스-막 수용체 제제 현탁액을 형성시키는 단계; (c) 상기 현탁액을 원심분리시켜 상등액을 형성시키는 단계; (d) 이러한 상등액에서 잔류 바이러스 감염도를 측정하는 단계; 및 (e) 바이러스 백신 후보로서 유용한 개개의 막 수용체 제제 결합-내성 바이러스 변이체를 분리시키는 단계를 포함하는, 뇌막 수용체 제제와 결합되지 않는 바이러스 변이체를 선별함으로써 바이러스 백신 후보를 선별하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 뇌막은 마우스 뇌막 및 사람 뇌막으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 본원에 기재된 방법에 따라서 제조하는 경우, 뇌막 수용체 제제는 단백질 농도가 습윤된 뇌 약 20 내지 40mg/ml이다. 바람직하게는, 일본 뇌염의 경우에는, 베로 세포 단층을 감염시킨 다음 이로써 생성된 플라크를 계수함으로써 상기 상등액에서의 잔류 바이러스 감염도를 측정한다. 바람직하게는, 개개의 막 수용체 제제 결합-내성 변이체 플라크를 분리시킨 후, 상기 바이러스를 증폭시킨다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 변이체를 신선한 뇌막 수용체 제제와 함께 배양하여 상기 변이체가 신선한 뇌막 수용체 제제에 결합되지 못한다는 사실로부터 상기 변이체가 진정한 변이체라는 것을 확인한다. 가장 바람직하게는, 상기 변이체를 신경 침입력과 신경 병원성에 대해 약독화시킨다. 실제적으로 본 발명의 방법을 사용하여 어떠한 바이러스도 약독화시킬 수 있긴 하지만, 대표적인 바이러스로는 황열, 뎅그열-4 및 랑가트 바이러스가 있다.The present invention comprises the steps of (a) preparing a meninges receptor preparation; (b) mixing an amount of the desired virus with an amount of said membrane receptor formulation containing excess membrane receptor to form a virus-membrane receptor formulation suspension; (c) centrifuging the suspension to form a supernatant; (d) measuring the residual viral infection in this supernatant; And (e) isolating individual membrane receptor preparation binding-tolerant viral variants useful as viral vaccine candidates. Preferably, the meninges are selected from the group consisting of mouse meninges and human meninges. When prepared according to the methods described herein, the meninges receptor formulation is about 20-40 mg / ml of brain with wet protein concentration. Preferably, in the case of Japanese encephalitis, residual viral infection in the supernatant is measured by infecting Vero cell monolayers and then counting the resulting plaques. Preferably, the individual membrane receptor agent binding-resistant variant plaques are isolated and then the virus is amplified. Variants generated by the methods described herein are incubated with fresh meninges receptor preparations to confirm that the variants are true variants from the fact that the variants do not bind to fresh meninges receptor preparations. Most preferably, the variant is attenuated for nerve invasion and neuropathogenicity. While practically any virus can be attenuated using the method of the present invention, representative viruses include yellow fever, dengue-4 and langat virus.
본 명세서에 기재된 기술을 사용하게 되면, 당해 분야의 숙련인은 수용체에 결합되는 바이러스 흡착성 단백질의 3차원적 구조 상의 세포 수용체 부위에 반응될 수 있는 아미노산을 동정하는 것을 기초로 하여 항바이러스성 화합물을 고안할 수 있을 것이다.Using the techniques described herein, one of ordinary skill in the art can identify antiviral compounds based on the identification of amino acids capable of reacting to cellular receptor sites on the three-dimensional structure of viral adsorbent proteins that bind to receptors. You can devise it.
본 명세서에 기재된 기술을 사용하게 되면, 당해 분야의 숙련인은 하나의 조직을 사용하여 MRPR 돌연변이체를 발생시킴으로써 순차적 돌연변이체를 고안한 다음, 두 번째 조직으로부터의 MRPR 돌연변이체를 사용하여 순차적인 선별을 고안할 수 있을 것이다. 이러한 방식으로, 다중 조직에 대해 약독화시킨 변이체를 고안할 수 있는데, 몇몇 바이러스는 상이한 조직에서 질병 잠재성인 것으로 증명되었기 때문에 상기 변이체가 바람직하다.Using the techniques described herein, one skilled in the art devises sequential mutants by generating MRPR mutants using one tissue, and then sequentially selects using MRPR mutants from a second tissue. Could be devised. In this way, attenuated variants can be devised for multiple tissues, which are preferred because some viruses have proven to be disease potential in different tissues.
다음 실시예는 본 발명의 각종 양태를 예시하고자 제시된 것이며 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하지 않는다.The following examples are presented to illustrate various aspects of the invention and do not limit the invention in any way.
실시예 1Example 1
JE 바이러스의 병원성에 대한 분자상 결정 요소Molecular Determinants of Pathogenicity of JE Virus
대부분의 바이러스와 같이, 일본 뇌염 바이러스도 균주마다 다른 양상을 띤다. 균주 P3은 고도의 병원성 균주인 것으로 인식되는 반면, 균주 JaOArS982 및 나카야마(Nakayama)는 중간 정도의 병원성 균주이고 SA14는 낮은 병원성을 지니는 균주이다(표 Ⅰ).Like most viruses, Japanese encephalitis virus has different patterns. Strain P3 is recognized to be a highly pathogenic strain, whereas strains JaOArS982 and Nakayama are medium pathogenic strains and SA14 is a low pathogenic strain (Table I).
실시예 2Example 2
외막 단백질Outer membrane protein
E 단백질은 바이러스의 중요한 구조적 단백질이고 바이러스 흡착성 단백질, 즉 세포 수용체와 상호작용하는 바이러스 단백질을 암호화하는 것으로 여겨진다. 7개의 SA14 백신 아미노산 치환체중 4개가 E 단백질내에 있기 때문에, 약독화가 부분적으로는 상기 백신 균주의 변형된 세포 친화성에 기인된 것일 수 있다. 이러한 사실은 SA14-14-2 바이러스성 항원을 함유하는 마우스 뇌에서 극히 소수의 신경단위를 나타내는 면역조직화학적 연구에 의해 뒷받침되며, 야생형 모 균주 SA14(9)으로 감염시킨 것에서는 세포병리학적 양상이 전혀 관찰되지 않았다.E proteins are important structural proteins of viruses and are believed to encode viral adsorbent proteins, ie viral proteins that interact with cellular receptors. Since four of the seven SA14 vaccine amino acid substituents are in the E protein, the attenuation may be due in part to the modified cell affinity of the vaccine strain. This is supported by immunohistochemical studies showing very few neurons in mouse brains containing SA14-14-2 viral antigens, and cytopathological aspects of infection with wild-type parental strain SA14 (9). Not observed at all.
항-일본 뇌염 바이러스 모노클로날 항체 중화-내성(MAbR) 변이체를 사용하여 연구한 결과, E-52+E-364+E-367에서의 돌연변이(10) 또는 E-270 또는 E-330에서의 돌연변이(11)는 모두 마우스 신경 침입력은 약독화시키지만, 신경 병원성은 약독화시키지 못하는 것으로 밝혀졌다. 다른 플라비바이러스에 대한 모노클로날 항체 중화-내성 변이체에 관한 연구 결과, 약독화된 신경 침입력(신경 병원성은 아님)이 머레이 계곡(Murray Valley) 뇌염 바이러스에 대한 E-277(12), 도약병 바이러스에 대한 E-308(일본 뇌염 바이러스에 대한 E-305와 등가물임)(13) 및 중앙 유럽산 침진드기-유래의 뇌염(CE TBE) 바이러스에 대한 E-384(일본 뇌염 바이러스에 대한 E-384와 등가물임)(14)에 사상(map)된 것으로 밝혀졌다. 일본 뇌염 바이러스의 돌연변이성과 연관된 두가지 다른 연구는 E-138이 마우스 신경 병원성을 약독화시키고 SA14 백신 시리즈에서 E-138을 이용한 경우에 관찰되는 바와 같이 동일하게 Lys를 Glu로 치환시키는 것과 연관이 있는 것으로 나타났다(15,16).Studies using anti-Japanese encephalitis virus monoclonal antibody neutralizing-tolerant (MAbR) variants have shown that mutations in E-52 + E-364 + E-367 (10) or in E-270 or E-330 Mutations 11 have all been found to attenuate mouse nerve invasion but not attenuate neuropathicity. Studies on monoclonal antibody neutralizing-tolerant variants against other flaviviruses revealed that attenuated neuroinvasiveness (but not neuropathicity) jumped E-277 (12), against Murray Valley encephalitis virus E-308 for diseased viruses (equivalent to E-305 for Japanese encephalitis virus) (13) and E-384 for central European sting-derived encephalitis (CE TBE) virus (E- for Japanese encephalitis virus) And equivalent to 384). Two other studies associated with the mutation of the Japanese encephalitis virus have linked E-138 to attenuating mouse neuropathicity and replacing Lys with Glu in the same way as observed with E-138 in the SA14 vaccine series. (15,16).
일본 뇌염 바이러스와 마우스 뇌와의 상호작용을 보다 상세히 예시하기 위하여, 표준 약리학적 기술을 사용하여 마우스 뇌로부터 막 수용체 제제를 만들었다. 이러한 마우스 뇌막 수용체 제제를 사용하여 마우스 뇌막 수용체 제제 결합-내성(MRPR) 변이체를 발생시킨다. 3개의 마우스 뇌막 수용체 제제 결합-내성 변이체를 신선한 마우스 뇌 MRP에 결합되지 않은 것으로 밝혀진 균주 P3으로부터 발생시키고 이들을 모두 마우스에서 신경 침입력과 신경 병원성에 대해 약독화시킨다(표 Ⅱ). 3개의 변이체 모두는 E-306 및 E-408에서 동일한 2개의 아미노산 치환을 나타낸다. 양 잔기는 균주 P3에 대해 독특하고 MRPR 돌연변이는 일본 뇌염 바이러스의 다른 균주에서 발견된 잔기에 대한 반전을 유도시킨다.To illustrate the interaction of the Japanese encephalitis virus with the mouse brain in more detail, membrane receptor preparations were made from the mouse brain using standard pharmacological techniques. Such mouse meninges receptor preparations are used to generate mouse meninges receptor preparations binding-tolerant (MRPR) variants. Three mouse meninges receptor preparation binding-resistant variants arise from strain P3 found not to bind to fresh mouse brain MRP and all are attenuated for nerve invasion and neuropathogenicity in mice (Table II). All three variants show the same two amino acid substitutions in E-306 and E-408. Both residues are unique for strain P3 and MRPR mutations lead to reversal of residues found in other strains of Japanese encephalitis virus.
실시예 3Example 3
바이러스 및 세포Viruses and cells
야생형 일본 뇌염 바이러스 균주 P3이 다음 기관(Dr. Robert Shope of Yale Arbovirus Research Unit)에 의해 제공된다. 원숭이 신장(베로) 세포와 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus) 모기 C6-36 세포를 10% 열 불활성화된 태아 송아지 혈청(Sigma), 2mM L-글루타민(Sigma) 및 항생제가 보충된 이글즈 최소 필수 배지(EMEM: Sigma)에서 각각 37℃ 및 28℃에서 성장시킨다.Wild type Japanese encephalitis virus strain P3 is provided by Dr. Robert Shope of Yale Arbovirus Research Unit. Eagles supplemented with 10% heat inactivated fetal calf serum (Sigma), 2 mM L-glutamine (Sigma) and antibiotics to monkey kidney (Vero) cells and Aedes albopictus mosquito C6-36 cells Grow at 37 ° C. and 28 ° C. in minimum essential medium (EMEM: Sigma), respectively.
실시예 4Example 4
마우스 뇌막 수용체 제제Mouse Meninges Receptor Formulations
마우스 뇌를 3 내지 4주생의 암컷 balb/C 마우스로부터 수집한다. 신경전달자 수용체 결합 검정에 대해 기재된 방법[참조: Meddlemiss and Frozard, 1983]을 근거로 하여 뇌막 수용체 제제(MRP)를 제조한다. 간략하게 언급하면, 상기 뇌를 신속하게 해부하고, 칭량한 다음, 트리스 완충액(50mM, pH 7.6)에서 균질화시킨다. 이러한 균질물을 원심분리시키고(35,600g으로 10분 동안), 펠릿을 동일한 용적의 트리스 완충액에 재현탁시키고 이러한 공정을 2회 반복한다. 두 번째와 세 번째 원심분리 사이의 단계에서, 상기 균질물을 37℃에서 10분 동안 배양한다. 최종 펠릿을 일정 용적의 트리스 완충액(50mM pH 7.6)에서 재현탁시켜 약 20 내지 40mg 습윤 뇌/ml의 단백질 농도를 수득하고 이를 -70℃에서 저장한다.Mouse brains are collected from 3 to 4 week old female balb / C mice. Meninges receptor preparations (MRPs) are prepared based on the methods described for neurotransmitter receptor binding assays (Meddlemiss and Frozard, 1983). Briefly, the brain is dissected quickly, weighed and homogenized in Tris buffer (50 mM, pH 7.6). This homogenate is centrifuged (10 min at 35,600 g) and the pellet is resuspended in the same volume of Tris buffer and this process is repeated twice. In a step between the second and third centrifugation, the homogenate is incubated at 37 ° C. for 10 minutes. The final pellet is resuspended in a volume of Tris buffer (50 mM pH 7.6) to yield a protein concentration of about 20-40 mg wet brain / ml and stored at −70 ° C.
실시예 5Example 5
바이러스 마우스 뇌 MRP 일탈(MRPR) 변이체의 발생Development of Viral Mouse Brain MRP Deviation (MRP R ) Variants
사용하기에 앞서, 분취량의 동결된 막 수용체 제제와 바이러스를 -70℃ 저장실로부터 꺼내고, 37℃에서 해동시킨 다음 4℃ 얼음 상에서 유지시킨다. 100㎕ 분취량의 바이러스를 과량의 막 수용체(들)를 함유하는 마우스 뇌막 수용체 제제 900㎕에 가한 다음 와동시킨다. 동일한 방식으로 대조군 바이러스 샘플을 제조하는데, 단 막수용체 제제 대신 트리스 완충액(500mM 트리스, pH 7.6) 900㎕와 혼합한다. 샘플을 회전 스탠드 상에서 30분 동안 37℃에서 배양한다. 배양 후, 상기 바이러스-막 수용체 제제 현탁액과 대조군 바이러스-트리스 완충액 샘플을 13,000rpm으로 10분 동안 원심분리시켜 막 물질 및 결합된 바이러스를 제거한다. 베로 세포 단층을 감염시키고 37℃에서 배양한지 5일 후에 생성된 플라크를 계수함으로써 상등액 중에서의 잔류 바이러스 감염도를 측정한다. 개개의 MRPR변이체 플라크를 골라서 베로 세포에서 증폭시킨다. 이로써 발생된 바이러스 변이체를 대상으로 하여, 신선한 막 수용체 제제에 대한 결합을 알아보기 위해 검사한다. 이러한 바이러스 변이체가 신선한 마우스 뇌막 수용체 제제에 결합되지 못한다는 것은 이들이 진정한 MRPR변이체라는 것을 확인시켜준다.Prior to use, aliquots of frozen membrane receptor preparations and viruses are removed from the −70 ° C. reservoir, thawed at 37 ° C. and maintained on 4 ° C. ice. 100 μl aliquots of virus are added to 900 μl of mouse brain membrane receptor formulation containing excess membrane receptor (s) and vortexed. A control virus sample is prepared in the same manner, but mixed with 900 μl Tris buffer (500 mM Tris, pH 7.6) instead of the membrane receptor formulation. Samples are incubated at 37 ° C. for 30 minutes on a rotating stand. After incubation, the virus-membrane receptor preparation suspension and control virus-tris buffer sample are centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to remove membrane material and bound virus. Residual viral infection in the supernatant is measured by counting plaques generated 5 days after infection of Vero cell monolayers and incubation at 37 ° C. Individual MRP R variant plaques are picked and amplified in Vero cells. Viral variants thus generated are tested for binding to fresh membrane receptor preparations. The inability of these viral variants to bind to fresh mouse meninges receptor preparations confirms that they are true MRP R variants.
실시예 6Example 6
마우스 병원성 연구Mouse pathogenicity study
NIH-스위스산 암컷 이계교배된 흰색의 3 내지 4주생 마우스를 할란(Harlan, Indianapolis, IN)으로부터 수득한다. 상기 마우스에 바이러스 20㎕를 뇌내 경로를 통해 접종하거나 바이러스 100㎕을 복강내 경로를 통해 접종한다. 병원성 연구는 투여 그룹 당 8마리의 마우스로 구성된다. LD50값과 평균 생존 시간(AST)을 결정한다. 감염도에 대해 조사된 마우스를 뇌내 또는 복강내 접종시킨지 2일 또는 7일이 지난 후에 희생시키고, 플라크 검정에 의한 감염도 역가 측정을 위하여 뇌와 혈청을 가공 처리한다.NIH-Swiss female females 3-4 week-old mice of cross-bred white are obtained from Harlan, Indianapolis, IN. The mice are inoculated with 20 μl of virus via the intracranial route or 100 μl of virus via the intraperitoneal route. Pathogenicity study consisted of 8 mice per dose group. LD 50 values and mean survival time (AST) are determined. Two or seven days after inoculation or intraperitoneal inoculation of mice examined for infectivity, the mice are sacrificed and the brain and serum are processed for determination of infectivity titers by plaque assay.
실시예 7Example 7
면역원성 연구Immunogenicity Studies
NIH-스위스산 암컷 이계교배된 흰색의 3 내지 4주생 마우스를 할란(Harlan, Indianapolis, IN)으로부터 수득한다. 각 MRPR변이체에 대한 4마리의 마우스에 바이러스 103pfu를 복강내 경로에 의해 접종한다. 접종시킨지 15일 후에 마우스를 희생시키고 심장 천자에 의해 혈액을 수집한다. 혈청 분획을 수집하고 -20℃에서 저장한다. 문헌[참조: Wills et al., 1992]에 기재된 바와 같이 중화 검정을 수행한다.NIH-Swiss female females 3-4 week-old mice of cross-bred white are obtained from Harlan, Indianapolis, IN. Four mice for each MRP R variant are inoculated with virus 10 3 pfu by the intraperitoneal route. Mice are sacrificed 15 days after inoculation and blood is collected by cardiac puncture. Serum fractions are collected and stored at -20 ° C. Neutralization assays are performed as described in Wills et al., 1992.
실시예 8Example 8
바이러스 RNA의 게놈을 서열화하고 분석함Sequencing and Analyzing the Genome of Viral RNA
바이러스 RNA의 RT-PCR, 클로닝 및 서열화를 앞서 기재된 바와 같이 수행한다[참조:Ni et al., 1994]. MICROGENIE(Queen and Korn, 1984), PCGENE 및 유전자 컴퓨터 그룹(Devereux et al., 1984)을 사용하여 핵산 데이터 및 추론된 아미노산 서열의 컴퓨터 분석을 수행한다.RT-PCR, cloning and sequencing of viral RNAs is performed as previously described (Ni et al., 1994). Computer analysis of nucleic acid data and inferred amino acid sequences is performed using MICROGENIE (Queen and Korn, 1984), PCGENE and the Gene Computer Group (Devereux et al., 1984).
실시예 9Example 9
MRPR변이체의 발생 및 확인Generation and Identification of MRP R Variants
C6-36 세포에서 성장시킨 일본 뇌염 바이러스 균주 P3(P3/C6-36)를 마우스 뇌, 원숭이 뇌 또는 원숭이 간 막 수용체 제제와 혼합하고 이를 37℃에서 30분 동안 함께 배양하며, 상기 혼합물을 펠릿화하고 상등액을 상기 언급된 바와 같이 플라크 형성시킨다. 일본 뇌염 P3 바이러스는 마우스 뇌와 원숭이 뇌막 수용체 제제에는 결합되었지만, 원숭이 간 막 수용체 제제에는 결합되지 않았다(표 Ⅲ). P3/C6-36 바이러스는 원숭이 뇌막 수용체에 완전하게 결합된다. 마우스 뇌막 수용체 제제 내성(MRPR)변이체를 선별하기 위하여, P3/C6-36 바이러스를 과량의 마우스 뇌막 수용체 제제와 혼합하는데, 이로써 감염도가 103.6감소되었다(표 Ⅲ). 마우스 뇌막 수용체 제제에 대한 결합을 일탈한 P3 바이러스의 3개의 플라크를 선별하고 이를 베로 세포에서 증폭시킨다.Japanese encephalitis virus strain P3 (P3 / C6-36) grown in C6-36 cells is mixed with mouse brain, monkey brain or monkey liver membrane receptor preparations and incubated together at 37 ° C. for 30 minutes, pelleting the mixture And the supernatant is plaqued as mentioned above. Japanese encephalitis P3 virus was bound to mouse brain and monkey meninges receptor preparations, but not to monkey hepatic membrane receptor preparations (Table III). P3 / C6-36 virus is fully bound to monkey meninges receptors. To screen for mouse meninges receptor preparation resistance (MRP R ) variants, P3 / C6-36 virus was mixed with excess mouse meninges receptor preparation, resulting in a 10 3.6 reduction in infectivity (Table III). Three plaques of P3 virus deviating from binding to the mouse meninges receptor preparation are selected and amplified in Vero cells.
#감염도: 바이러스에 MRP 또는 완충액을 접종시키고 바이러스 MRP 복합체를 상기 언급된 바와 같이 펠릿화시킨 상등액에 잔존하는 감염성 바이러스. *결합 지수: 완충액 중에서의 log10감염도.# Infection: Infectious virus remaining in the supernatant inoculated with MRP or buffer to the virus and pelleted the virus MRP complex as mentioned above. * Binding Index: log 10 infectivity in buffer.
베로 세포에서 플라크 정제하고 증폭시킨 후, 3개의 MRPR변이체 바이러스 중 어떠한 것도 신선한 마우스 뇌막 수용체 제제에 결합되지 않았는데(표 Ⅳ), 이는 이들 바이러스가 진정한 MRPR변이체라는 것을 확인시켜 주었다. 이와 병행해서, MRPR변이체를 발생시키기 위해 사용된 P3/C6-36 바이러스를 또한 베로 세포(P3/베로)에서 플라크 정제 및 증폭시켜, 표현형 P3 바이러스에 대한 베로 세포 계대접종의 효과를 결정한다. 이러한 P3/베로 바이러스는 P3/C6-36 바이러스의 경우와 유사한 결합으로 마우스 뇌막 수용체 제제에 결합되었다(표 Ⅳ).After plaque purification and amplification in Vero cells, none of the three MRP R variant viruses bound to fresh mouse meninges receptor preparations (Table IV), confirming that these viruses are true MRP R variants. In parallel, the P3 / C6-36 virus used to generate MRP R variants is also plaque purified and amplified in Vero cells (P3 / Vero) to determine the effect of Vero cell passage on phenotype P3 virus. This P3 / Vero virus was bound to the mouse meninges receptor preparation with similar binding as for the P3 / C6-36 virus (Table IV).
실시예 10Example 10
야생형 JE 바이러스 균주 P3과 이의 변이체들의 병원성Pathogenicity of Wild-type JE Virus Strain P3 and Its Variants
이계교배된 NIH-스위스산 마우스 그룹에 모 P3/C6-36 또는 P3/베로 바이러스, 또는 MRPR변이체들 중의 하나를 뇌내 또는 복강내 경로에 의해 접종한다. pfu/LD50값 및 AST±SEM을 측정한다. 모 P3/C6-36 바이러스와 P3/베로 바이러스를 비교한 결과, P3/베로 바이러스가 P3/C6-36 바이러스 보다 다소 덜 병원성이긴 하지만, 베로 세포에서의 플라크 정제 및 증폭이 뇌내 또는 복강내 접종시킨 P3 바이러스의 병원성(양 LD50값 측면에서 언급됨)에 대해 전혀 영향을 미치지 못하는 것으로 밝혀졌다. 비교해 보면, 3개의 마우스 뇌 MRPR변이체 모두는 복강내 접종시킨(즉, 신경 침입력) 모 P3 바이러스와 비교해서 200배 이상 약독화되었다(표 Ⅴ). 또한, 3개의 마우스 뇌 MRPR변이체 모두는 뇌내 접종시킨 후의 이들의 모 바이러스와 비교해서 신경 병원성이 상당히(500배 이상) 약독화되었다(표 Ⅱ). 마우스 뇌 MRPR변이체로 감염된 마우스의 평균 생존 시간 역시 모 P3 바이러스의 평균 생존 시간 보다 더 길다(표 Ⅴ).Two-crossed NIH-Swissian mouse groups are inoculated with either parental P3 / C6-36 or P3 / Verovirus, or MRP R variants by intracerebral or intraperitoneal route. pfu / LD 50 values and AST ± SEM are measured. Comparison of the parental P3 / C6-36 virus and P3 / Vero virus showed that plaque purification and amplification in Vero cells was inoculated into the brain or intraperitoneally, although P3 / Vero virus was somewhat less pathogenic than P3 / C6-36 virus. It has been found to have no effect on the pathogenicity of the P3 virus (mentioned in terms of positive LD 50 values). In comparison, all three mouse brain MRP R variants were attenuated at least 200-fold compared to the parental P3 virus inoculated (ie, neuroinvasion) (Table V). In addition, all three mouse brain MRP R variants were significantly attenuated (more than 500-fold) in neuropathicity compared to their parental virus after inoculation (Table II). The mean survival time of mice infected with mouse brain MRP R variants was also longer than the average survival time of the parental P3 virus (Table V).
중화 역가: 동종의 챌린지 바이러스의 50%를 중화시키기 위한 혈청의 최고 희석율로서 취함Neutralization titer: taken as the highest dilution of serum to neutralize 50% of homologous challenge viruses
실시예 11Example 11
뇌내 및 복강내 경로에 의해 접종시킨 MRPR변이체의 감염도 결정Determination of Infection Levels of MRP R Vaccines Inoculated by Intracranial and Intraperitoneal Pathways
상기 바이러스 1pfu를 뇌내 접종시키거나 바이러스 1000pfu를 복강내 접종시킨지 2일 및 7일 후에 마우스를 희생시켜 MRPR변이체가 마우스의 혈액과 뇌에서 복제될 수 있는지를 측정한다. 3개의 마우스 뇌 MRPR변이체 모두가 감염된 마우스에서 복제되었다(표 Ⅵ). 뇌 및 혈청에서의 MRPR변이체 감염도는 뇌내 접종시킨지 2일 후에는 이들의 모 바이러스 보다 낮다. 그러나, 모 P3 바이러스를 뇌내 경로에 의해 접종시킨 모든 마우스가 감염된지 7일 후에 사망하였다. MRPR변이체의 감염도는 복강내 접종시킨지 2일 및 7일 후에 혈청에서의 이들의 모 바이러스의 감염도 보다 상당히 더 낮다.Two and seven days after inoculation of 1 pfu of virus or 1000 pfu of virus intraperitoneally, mice are sacrificed to determine whether MRP R variants can be replicated in the blood and brain of mice. All three mouse brain MRP R variants were replicated in infected mice (Table VI). MRP R variant infectivity in brain and serum is lower than their parental virus 2 days after inoculation. However, all mice inoculated with parental P3 virus by intracranial route died 7 days after infection. The infectivity of MRP R variants is significantly lower than their parental virus infection in serum 2 and 7 days after intraperitoneal inoculation.
실시예 12Example 12
MRPR변이체의 면역원성Immunogenicity of MRP R Variants
마우스 뇌 MRPR변이체가 접종된 NIH-스위스산 마우스는 복강내 접종한지 15일 후에 감염된 모든 마우스에서 중화 항체를 유도하였다(표 Ⅶ).NIH-Swissian mice inoculated with mouse brain MRP R variants induced neutralizing antibodies in all infected mice 15 days after intraperitoneal inoculation (Table VII).
실시예 13Example 13
마우스 및 사람 뇌 MRPR변이체와 야생형 모 P3 바이러스 및 베로 세포에서 플라크 젱제 및 증폭된 P3의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변화Nucleotide and Amino Acid Sequence Changes of Plaque Suppression and Amplified P3 in Mouse and Human Brain MRP R Variants and Wild-type Parental P3 Virus and Vero Cells
모 P3 바이러스와 이의 MRPR변이체의 유전적 차이 및 수용체 흡착성 영역을 조사하기 위하여, P3 바이러스와 MRPR변이체의 프리-막(prM), 막(M) 및 외막(E) 단백질 유전자를 클로닝시켜 서열화한다. P3/베로 바이러스는 prM, M 및 E 단백질 유전자에 있어서 P3/C6-36 바이러스와 비교해 볼때 13개의 뉴클레오티드가 상이한데, 이로써 E-46, E-129, E-209, E-351 및 E-387의 위치에서 5개의 아미노산이 변화되었으며(표 Ⅷ), 이러한 위치가 P3/C6-36 바이러스와 비교해서 감소된 P3/베로 바이러스의 병원성과 관련이 있을 수 있다. 이들 아미노산 차이가 MRPR변이체의 바이러스 약독화와 관련이 있는 것으로 간주될 수 없다.To investigate the genetic differences between the parental P3 virus and its MRP R variants and the region of receptor adsorption, the pre-membrane (prM), membrane (M) and outer membrane (E) protein genes of the P3 virus and MRP R variants were cloned and sequenced. do. P3 / Veroviruses differ in 13 nucleotides in the prM, M and E protein genes compared to P3 / C6-36 virus, resulting in E-46, E-129, E-209, E-351 and E-387 Five amino acids were changed at the position of (Table VII), and this position may be related to the pathogenicity of reduced P3 / Vero virus compared to the P3 / C6-36 virus. These amino acid differences cannot be considered to be related to viral attenuation of MRP R variants.
3개의 마우스 뇌 MRPR변이체는 prM, M 및 E 단백질 유전자에서 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이들은 P3/C6-36 바이러스와 비교해서 23개의 뉴클레오티드가 상이하며 P3/베로 바이러스와 비교해서는 20개의 뉴클레오티드가 상이하다. 그러나, 이들 마우스 뇌 MRPR변이체는 잔기 E-306(G→E) 및 E-408(L→S)에서 모 P3/C6-36 및 P3/베로 바이러스와 비교해서 단지 2개의 아미노산 변화만을 나타낸다.Three mouse brain MRP R variants have identical nucleotide sequences in the prM, M and E protein genes. They differ in 23 nucleotides compared to P3 / C6-36 virus and 20 nucleotides in comparison to P3 / Vero virus. However, these mouse brain MRP R variants show only two amino acid changes in residues E-306 (G → E) and E-408 (L → S) compared to the parental P3 / C6-36 and P3 / Veroviruses.
실시예 14Example 14
E 단백질 2차 구조의 분석Analysis of E Protein Secondary Structure
모 바이러스 및 MRPR변이체의 E 단백질의 2차 구조를 PCGENE에서 노보트니(Novotny) 및 GGBSM 프로그램에 의해 E-306 및 E-408 주변 영역에서 분석한다. 이러한 노보트니 프로그램은 E-306 잔기 글리신이 글루탐산으로 돌연변이된 경우에는 전하를 띤 잔기 프로필, 알파 나선 성향, 베타 시트 성향 및 리버스 턴(reverse turn) 경향이 변하였고 E-408 잔기 루이신이 세린으로 대체된 경우에는 소수성 프로필, 알파 나선 성향, 베타 시트 성향 및 리버스 턴 성향이 변한다는 것을 보여주고 있다. GGBSM 프로그램은 잔기 E-306(G↔E) 또는 E-408(L↔S)이 변하게 되면 코일 프로필, 펼쳐진 프로필 및 나선 프로필이 변한다는 것을 지시해준다.The secondary structure of the E protein of the parental virus and MRP R variants is analyzed in the region around E-306 and E-408 by Novotny and GGBSM programs in PCGENE. This Novotny program changed the charged residue profile, alpha helix propensity, beta sheet propensity, and reverse turn tendency when E-306 residue glycine was mutated to glutamic acid, and E-408 residue leucine was replaced with serine. The case shows that the hydrophobic profile, alpha helix propensity, beta sheet propensity, and reverse turn propensity change. The GGBSM program indicates that changes in residue E-306 (G↔E) or E-408 (L↔S) change the coil profile, unfolded profile and spiral profile.
숙주 세포 표면 수용체에 바이러스가 결합하는 것이 바이러스 복제 주기의 제1 단계이며 이는 많은 바이러스의 조직 친화성과 병원성과 직접적으로 연관이 있다[참조: Fields ＆ Greene, 1982]. 이들의 중요성에도 불구하고, 바이러스에 대한 상대적 세포 수용체의 정체 및 이의 숙주 세포 기능에 대해서는 거의 공지되거나 광범위하게 허용된 바가 없다. 플라비바이러스의 E 단백질이 세포성 수용체에 대한 바이러스 결합과 연관됨으로써 세포성 친화성에 역할을 하는 것으로 추정되긴 하지만, 플라비바이러스에 대한 어떠한 세포성 수용체도 동정되지 않았다. 최근에, 첸(Chen) 등이 베로, CHO, 내피 및 신경교 세포와 결합된 뎅그열-2 바이러스의 E 단백질을 발현하였다. 재조합 E 단백질이 뎅그열 바이러스에 의한 베로 세포의 감염을 억제하였다.Binding of viruses to host cell surface receptors is the first step in the viral replication cycle, which is directly related to the tissue affinity and pathogenicity of many viruses (Fields & Greene, 1982). Despite their importance, little is known or widely accepted about the identity of relative cellular receptors against viruses and their host cell function. Although the E protein of flaviviruses is believed to play a role in cellular affinity by being associated with viral binding to cellular receptors, no cellular receptors for flaviviruses have been identified. Recently, Chen et al. Expressed the E protein of Dengue-2 virus associated with Vero, CHO, endothelial and glial cells. Recombinant E protein inhibited infection of Vero cells by dengue virus.
바이러스에 대한 세포 수용체를 생체내에서 조사하는 것은 동물 조직을 조작해야 하고 바이러스가 물리적 결합 검정을 수행할 정도로 충분히 정제시킬 수 없기 때문에 어려운 일이다. 본 발명은 막 수용체 제제(MRP)와 결합되지 않는 바이러스를 선별함으로써 발생시킬 수 있는 변이체를 선별하는 방법을 기술하고 있다(표 Ⅱ 및 Ⅲ). 모델로서, 마우스 뇌 MRP에 대한 일본 뇌염 바이러스의 결합을 조사하였다. 이러한 과정의 특이성은 일본 뇌염 바이러스가 원숭이 간 MRP에 결합되지 못한다는 사실에 의해 입증되었으며(표 Ⅲ), 변이체의 발생은 마우스 뇌 변이체가 신선한 마우스 뇌 MRP에 결합되지 못한다는 사실에 의해 밝혀졌다(표 Ⅲ). 3개의 마우스 뇌 MRPR변이체 모두는 이들의 야생형 모 P3 변이체에 비해 신경 침입력과 신경 병원성 모두가 상당히 약독화되었다(표 Ⅳ). 이는 MRPR변이체의 선별이 백신 후보를 발생시키기 위한 신규의 접근법으로 사용될 수 있다는 것을 제안하고 있다.In vivo investigation of cellular receptors for viruses is difficult because the animal tissue must be manipulated and the virus cannot be purified sufficiently to perform a physical binding assay. The present invention describes methods for selecting variants that can be generated by screening for viruses that do not bind to membrane receptor preparations (MRP) (Tables II and III). As a model, the binding of Japanese encephalitis virus to mouse brain MRP was investigated. The specificity of this process is evidenced by the fact that Japanese encephalitis virus does not bind to monkey liver MRP (Table III), and the development of the variant was revealed by the fact that mouse brain variants do not bind to fresh mouse brain MRP ( Table III). All three mouse brain MRP R variants significantly attenuated both nerve invasion and neuropathicity compared to their wild type parental P3 variants (Table IV). This suggests that selection of MRP R variants can be used as a novel approach to generate vaccine candidates.
일본 뇌염 P3 균주 마우스 뇌 MRPR변이체의 신경 병원성의 약독화는 바이러스의 수용체 흡착성 영역(플라비바이러스의 경우에는, E 단백질)에서 돌연변이시킨 바이러스 제제에서 변이체를 선별한 후에 수행할 수 있다. 이러한 변이체는 변화된 조직 친화성을 나타낼 수 있다. 잔기 E-306 및 E-408에서의 단지 2개의 통상의 아미노산 치환이 동정되었다(표 Ⅷ). 이들 2개의 치환으로 인해, E 단백질의 2차적 구조가 상당히 변하였다. 따라서, 이들 2개의 아미노산이 마우스 뇌 MRPR변이체의 약독화에 있어서 중요한 역할을 한다.Neuropathogenic attenuation of Japanese encephalitis P3 strain mouse brain MRP R variants can be performed after selection of the variants in a viral preparation mutated in the receptor adsorbable region of the virus (in the case of flaviviruses, E protein). Such variants may exhibit altered tissue affinity. Only two conventional amino acid substitutions at residues E-306 and E-408 were identified (Table VII). Due to these two substitutions, the secondary structure of the E protein changed significantly. Thus, these two amino acids play an important role in the attenuation of mouse brain MRP R variants.
약독화된 표현형에 E-306이 연관되어 있다는 것은 플라비바이러스에 대한 앞서의 연구와 일치하며 이로써 약독화된 바이러스 변이체를 발생하기 위한 MRP의 용도를 확인되었다. 야생형 일본 뇌염 바이러스의 4가지 기타 약독화된 유도체가 보고되었다. 두 그룹은 E-270 및 E-333, 또는 E-52, E-363 및 E-366에서 돌연변이된 모노클로날 항체 중화 내성(MAbR) 변이체를 보고하였다. 이들 변이체 모두는 마우스에 대한 마우스 신경 침입력 감소를 나타내었지만, 신경 병원성에 대해서는 아니다. 비교해 보면, SA14 바이러스로부터 유도된 일련의 생 백신은 E-138, E-176, E-315 및 E-435에서 4개의 E 단백질 치환이 이루어진 것이다. 이들 백신은 사람에 있어서 마우스 신경 병원성과 신경 침입력 모두에 대해 약독화시킨 것이다. 문헌[참조: Symiyoshi et al.](15)에는 E-138에서의 돌연변이가 마우스 신경 병원성을 약독화시키는데 있어서 주요 결정 요소라는 것을 제시하고 있다.The involvement of E-306 in the attenuated phenotype is consistent with previous studies on flaviviruses, confirming the use of MRP to generate attenuated virus variants. Four other attenuated derivatives of wild-type Japanese encephalitis virus have been reported. Both groups reported monoclonal antibody neutralizing resistance (MAb R ) variants mutated at E-270 and E-333, or at E-52, E-363 and E-366. All of these variants showed reduced mouse nerve invasion into mice, but not neuropathogenicity. In comparison, a series of live vaccines derived from SA14 virus consisted of four E protein substitutions at E-138, E-176, E-315 and E-435. These vaccines are attenuated for both mouse neuropathy and nerve invasion in humans. Symiyoshi et al. (15) suggest that mutations in E-138 are key determinants in attenuating mouse neuropathicity.
상기 돌연변이체 및 본 발명의 마우스 MRPR변이체에서의 아미노산 치환을 일본 뇌염 바이러스와 관련된 플라비바이러스인 참진드기-유래의 뇌염(TBE) 바이러스(Rey et al., 1995)의 E 단백질의 제안된 3차원적인 구조 모델 상에 지도화한 결과, 많은 돌연변이가 E 단백질의 영역 Ⅲ에 집중 발생된 것으로 나타났는데, 이는 영역 Ⅲ이 아마도 마우스 세포성 수용체에 대한 바이러스 흡착성 영역으로서 마우스 병원성에 있어서 중요하다는 것을 제안하고 있다. 이러한 사실은 레이(Rey) 등이 1995년에 제안한 것과 일치하며, 도약병 바이러스(E-308, E-310 및 E-311; Jiang et al., 1993; Gao et al., 1994), TBE 바이러스(E-387) 및 뎅그열 바이러스(E-383, E-384 및 E-385; Hiramatsu et al., 1996; E-390, Sanchez et al., 1996)에 대한 MAbR변이체는 모두 마우스 신경 병원성에 대해 약독화된 것이라는 것을 나타낸 기타 플라비바이러스의 연구에 의해 뒷받침되고, 이들 돌연변이는 E 단백질의 영역 Ⅲ에 대해 지도로 나타내었다.The amino acid substitutions in these mutants and mouse MRP R variants of the present invention were proposed as 3 of the E protein of true tick-derived encephalitis (TBE) virus (Rey et al., 1995), a flavivirus associated with Japanese encephalitis virus. Mapping on a dimensional structural model showed that many mutations were concentrated in region III of the E protein, suggesting that region III is probably important for mouse pathogenicity as a viral adsorptive region for mouse cellular receptors. Doing. This is consistent with the suggestion of Rey et al. In 1995 and includes the Leap Disease Virus (E-308, E-310 and E-311; Jiang et al., 1993; Gao et al., 1994), the TBE virus. MAb R variants for (E-387) and dengue virus (E-383, E-384 and E-385; Hiramatsu et al., 1996; E-390, Sanchez et al., 1996) are all mouse neuropathic Supported by studies of other flaviviruses that have been shown to be attenuated for, these mutations are mapped to region III of the E protein.
MRP 변이체의 잔기 E-408에서의 아미노산 치환체를 영역외의 것을 막 앵커(anchor) 영역에 연결시켜 주는 플라비바이러스 E 단백질의 간(stem) 영역에 위치시킨다. 최근에는, 막관통(transmembrane) 알파 나선형 간 영역이 E 단백질의 낮은-pH-유도된 올리고머성 전위에 대한 중요한 요소로서 제안되었다. E-408 치환으로 인해 알파 나선형과 바이러스 유도된 막 융합물이 변하게 된다.The amino acid substituent at residue E-408 of the MRP variant is located in the stem region of the Flavivirus E protein, which connects the extra-region to the membrane anchor region. Recently, transmembrane alpha helical hepatic regions have been proposed as important factors for the low-pH-induced oligomeric translocation of E proteins. E-408 substitutions alter the alpha helical and virus induced membrane fusions.
표 Ⅱ는 마우스 뇌 MRPR변이체의 신경 침입력이 이들의 모와 비교해서 신경 병원성 보다 더 약독화되었다는 것을 보여준다. 이러한 MRPR변이체가 복강내 경로를 통해 접종된지 2일 및 7일 후에 혈청에서는 발견되지만 뇌에서는 발견되지 않는다는 사실(표 Ⅳ)은 P3 바이러스 변이체가 혈관에서는 복제될 수 있지만, 혈액-뇌 장벽을 침투하는 것은 어렵다는 것을 지시해주고 있다.Table II shows that neuronal invasion of mouse brain MRP R variants was more attenuated than neuropathic compared to their parent. The fact that these MRP R variants are found in serum but not in the brain 2 and 7 days after inoculation via the intraperitoneal route (Table IV) suggests that P3 virus variants can replicate in blood vessels but penetrate the blood-brain barrier. It is hard to do.
본 발명은 일본 뇌염 바이러스 마우스 뇌 MRPR가 과량의 MRP의 존재 하에서 모 바이러스 시드(seed)로부터 시험관내에서 용이하게 선별될 수 있다는 것을 입증하였다. 선별된 바이러스 MRPR변이체는 마우스에서 약독화된 표현형을 지니고 있다. 본 발명은 바이러스의 표적 조직으로부터 MRPR변이체에 대해 선별하는 것은 약독화된 바이러스 균주를 발생시키기 위한 한 가지 효능있는 경로이고 상이한 조직으로부터의 MRP를 연속적으로 사용하는 다중 돌연변이 선별을 이용하여 약독화된 변이체를 발생시키는 것이 가능하다는 것을 제시하고 있다. 따라서, 본 발명은 바이러스 백신 후보(들)를 비교적 저렴하고도 신속하게 선별할 수 있게 해주는 신규의 방법을 제공해준다.The present invention demonstrated that Japanese encephalitis virus mouse brain MRP R can be easily selected in vitro from the parental virus seed in the presence of excess MRP. Selected viral MRP R variants have an attenuated phenotype in mice. The present invention is directed to screening for MRP R variants from the target tissues of a virus is one potent pathway for generating attenuated virus strains and attenuated using multiple mutation screening with successive use of MRP from different tissues. It is suggested that it is possible to generate variants. Thus, the present invention provides a novel method that allows for the selection of antivirus vaccine candidate (s) relatively cheaply and quickly.
표 Ⅹ는 본 발명의 방법이 마우스 뇌 MRP에 한정되지 않는다는 것을 나타낸다. 사람 뇌 MRP를 사용하여 마우스 신경 병원성에 대해 5,000,000,000배 정도 약독화시킨 MRPR를 발생시켰다. 더욱이, 당해 방법은 일본 뇌염 바이러스에 한정되는 것은 아니다(표 Ⅸ). 황열 바이러스의 원숭이 뇌 MRPR변이체는 젖 뗀 새끼 마우스에게 뇌내 접종한 후에 마우스 신경병원성에 대해 약독화시켰으며 랑가트 바이러스의 마우스 뇌 및 사람 뇌 MRPR변이체는 젖 뗀 새끼 마우스에게 뇌내 접종한 후에 마우스 신경 병원성에 대해 약독화시켰다.Table VII shows that the method of the present invention is not limited to mouse brain MRP. Human brain MRP was used to generate MRP R attenuated 5,000,000,000-fold for mouse neuropathicity. Moreover, the method is not limited to Japanese encephalitis virus (Table VII). The monkey brain MRP R variant of the yellow fever virus was attenuated for mouse neuropathogenicity after inoculation into lactating mice, and the mouse brain and human brain MRP R variants of langat virus were inoculated into lactating mice after inoculation with the mouse. Attenuated for neuropathogenicity.
실시예 15Example 15
바이러스 사람 뇌 및 사람 간 막 수용체 제제 일탈 변이체의 발생Generation of Viral Human Brain and Human Liver Membrane Receptor Deviation Variants
심장 발작으로 사망한 74세 여성 노인으로부터 사람 뇌를 수집하고 폐암으로 사망한 76세 남성 노인으로부터 사람 간을 수집한다. 최종 MRP를 2% 태아 송아지 혈청과 항생제를 함유하는 이글즈 최소 필수 배지(Sigma)에 재현탁시키는 것을 제외하고는 신경전달자 수용체 결합 검정에 대해 기재된 방법을 기초로 하여 뇌 및 간 막 수용체 제제(MRP)를 만든다. 모 야생형 JE 바이러스 P3 균주를 회백질 또는 백질로부터 유도된 사람 뇌 MRP와 함께 배양한 후에 6개의 사람 뇌 MRP 변이체를 선별한다. JE 바이러스의 감염도 역가 측정을 베로 세포에서 수행한다.Human brains are collected from 74 year old females who died of heart attacks and human livers from 76 year old males who died of lung cancer. Brain and hepatic membrane receptor preparations (MRP) based on the methods described for neurotransmitter receptor binding assays except resuspending final MRP in Eagles Least Essential Medium (Sigma) containing 2% fetal calf serum and antibiotics. ) Six human brain MRP variants are selected after incubating the parental wild type JE virus P3 strain with human brain MRP derived from gray matter or white matter. The infectivity titer of JE virus is performed in Vero cells.
실시예 16Example 16
JE 야생형 바이러스와 백신 바이러스 간의 수용체 결합 지수 비교Comparison of receptor binding index between JE wild type virus and vaccine virus
JE 바이러스와 MRP와의 상호작용의 특이성을 결정하기 위하여, 모기 C6-36 세포에서 성장시킨 야생형 균주 P3 바이러스(P3/C6-36)와 모기 C6/36 세포에서 성장시킨 약독화된 생 백신 균주 SA14-14-2(SA14-14-2/C6-36)[참조: Yu et al., 1981]를 혼합하고 37℃에서 30분 동안 마우스 뇌, 사람 뇌 또는 사람 간 MRP 또는 PBS와 함께 배양한다. 바이러스와 MRP를 펠릿화하고 상등액에 남아있는 바이러스를 베로 세포에서 플라크 형성시킨다. JE P3 바이러스는 마우스 뇌(MB), 사람 뇌 회백질(HBG) 및 사람 뇌 백질(HBW) MRP에 유사한 결합 지수(3.3 내지 4.0)로 결합되지만, 사람 간(HL) MRP에는 결합되지 않는다(결합 지수 0.3). 생 약독화된 JE 백신 균주 SA14-14-2 바이러스는 HBG 및 HBW MRP에 약하게 결합되었다(결합 지수 각각 0.7 및 0.8)(표 ⅩⅠ). 따라서, MRP를 이용한 결과는 야생형 JE 바이러스의 조직 친화성(즉, JE 바이러스의 향신경성) 및 약독화된 표현형의 백신 균주 SA14-14-2와 부합된다.To determine the specificity of the interaction between JE virus and MRP, wild type strain P3 virus (P3 / C6-36) grown in mosquito C6-36 cells and live attenuated vaccine strain SA14- grown in mosquito C6 / 36 cells 14-2 (SA14-14-2 / C6-36) (Yu et al., 1981) is mixed and incubated with mouse brain, human brain or human liver MRP or PBS for 30 minutes at 37 ° C. Pellet the virus and MRP and plaque form the virus remaining in the supernatant in Vero cells. JE P3 virus binds with similar binding indices (3.3 to 4.0) to mouse brain (MB), human brain gray matter (HBG), and human brain white matter (HBW) MRP, but not to human liver (HL) MRP (binding index) 0.3). The live attenuated JE vaccine strain SA14-14-2 virus was weakly bound to HBG and HBW MRP (binding indices 0.7 and 0.8, respectively) (Table VII). Thus, the results using MRP are consistent with the tissue affinity of the wild type JE virus (ie, neurotropicity of JE virus) and the vaccine strain SA14-14-2 of the attenuated phenotype.
실시예 17Example 17
사람 뇌 MRP 일탈 변이체의 발생Occurrence of Human Brain MRP Deviation Variants
사람 뇌 MRPR변이체를 선별하기 위하여, HBG와 HBW MRP 중의 어느 것과도 결합되지 않은 P3/C6-36 바이러스를 베로 세포에서 플라크 정제하고 증폭시킨다. 신선한 사람 뇌 MRP에 결합되지 못하는 것을 기준으로 하여 6개의 JE P3 사람 뇌 MRPR변이체 바이러스를 선별하고 이들이 진정한 MRPR변이체라는 것을 확인하였다. 바이러스를 HBG MRP와 배양하여 3개의 MRPR변이체를 유도하고 이를 각각 HBG MRPRⅠ, Ⅱ 및 Ⅲ으로 명명하였다. HBW MRP로 선별함으로써 기타 3개의 MRPR변이체를 유도하고 이를 각각 HBW MRPRⅠ, Ⅱ 및 Ⅲ으로 명명하였다. 6개의 사람 뇌 MRPR변이체 중의 어떠한 것도 HBG, HBW 또는 마우스 뇌 MRP와 결합되지 않았다.To select human brain MRP R variants, P3 / C6-36 virus that is not bound to either HBG or HBW MRP is plaque purified and amplified in Vero cells. Six JE P3 human brain MRP R variant viruses were selected based on their inability to bind fresh human brain MRP and confirmed that they were true MRP R variants. The virus was incubated with HBG MRP to induce three MRP R variants and named HBG MRP R I, II and III, respectively. Selection with HBW MRP induced three other MRP R variants and named them HBW MRP R I, II and III, respectively. None of the six human brain MRP R variants were associated with HBG, HBW or mouse brain MRP.
실시예 18Example 18
야생형 JE 바이러스 균주 P3 및 이의 사람 뇌 MRPR변이체의 마우스 병원성Mouse Pathogenicity of Wild-type JE Virus Strain P3 and Its Human Brain MRP R Variants
이계교배된 NIH-스위스산 마우스 그룹에 모 P3 바이러스, 또는 사람 뇌 MRPR변이체들 중의 하나를 뇌내 또는 복강내 경로에 의해 접종한다. 6개의 사람 뇌 MRPR변이체 모두는 마우스에 대하여 약독화되었다(표 ⅩⅡ). 베로 세포에서 계대접종시킨 야생형 모 JE P3 바이러스와 비교해 보면, 시험된 모든 사람 뇌 MRPR변이체는 마우스에게 복강내 접종시킨(즉, 신경 침입력) 후에는 이들의 모 바이러스와 비교해서 200배 이상 약독화되었으며 뇌내 접종시킨 후에는 이들의 모 바이러스와 비교해서 신경 병원성이 25백만배 이상 약독화되었다. 흥미롭게도, 사람 뇌 MRPR변이체는 마우스 뇌 MRPR변이체보다 신경 병원성에 대해 10,000배 이상 더 약독화되었다.Two-crossed NIH-Swissian mouse groups are inoculated with either the parental P3 virus, or one of the human brain MRP R variants by the intracranial or intraperitoneal route. All six human brain MRP R variants were attenuated for mice (Table XII). Compared to wild-type parental JE P3 virus passaged in Vero cells, all human brain MRP R variants tested were attenuated at least 200-fold compared to their parental virus after intraperitoneal inoculation (i.e. nerve invasion) in mice. After inoculation, the neuropathogenicity was attenuated by more than 25 million times compared to their parental virus. Interestingly, human brain MRP R variants were attenuated at least 10,000 times more neuropathic than mouse brain MRP R variants.
실시예 19Example 19
마우스에서 사람 뇌 MRPR바이러스 변이체의 면역원성Immunogenicity of Human Brain MRP R Virus Variants in Mice
HBG MRPRⅠ 또는 HBW MRPRⅠ 변이체 10,000pfu를 접종시킨 마우스는 복강내 접종시킨지 15일 후에 면역화된 모든 마우스에서 중화 항체를 유도하였다(표 ⅩⅢ). HBG MRPRⅠ 또는 HBW MRPRⅠ 변이체 바이러스 10,000pfu로 면역화된 마우스는 야생형 P3 챌린지로부터 보호되었다. 그러나, 마우스를 이들 MRPR변이체 1000pfu로 복강내 접종시킴으로써 면역화된 경우에는 야생형 모 P3 바이러스 챌린지로부터 보호되지 못하였다(표 ⅩⅣ). 이는 사람 뇌 MRPR변이체가, 바이러스 1000pfu를 복강내 접종으로 면역화시켜 마우스를 보호시킨 마우스 뇌 MRPR변이체 보다는 덜 면역원성이라는 것을 지시해준다.Mice inoculated with 10,000 pfu of HBG MRP R I or HBW MRP R I variants induced neutralizing antibodies in all immunized mice 15 days after intraperitoneal inoculation (Table VII). Mice immunized with 10,000 pfu of HBG MRP R I or HBW MRP R I variant virus were protected from wild type P3 challenge. However, mice were not protected from wild type parental P3 virus challenge when immunized by intraperitoneal inoculation with 1000 pfu of these MRP R variants (Table IV). This indicates that the human brain MRP R variant is less immunogenic than the mouse brain MRP R variant, which protected mice by immunizing virus with 1000 pfu intraperitoneally.
중화 역가: 동종의 챌린지 바이러스의 50%를 중화시키기 위한 혈청의 최고 희석율로서 취함.Neutralization titer: Taken as the highest dilution of serum to neutralize 50% of homologous challenge viruses.
마우스를 복강내 경로에 의해 면역화시키고 챌린지시킨다. #: 생존자의 수/그룹 중의 마우스 수. NT: 시험되지 않았음.Mice are immunized and challenged by the intraperitoneal route. #: Number of survivors / number of mice in group. NT: Not tested.
실시예 20Example 20
HBG 및 HBW MRPR변이체와 야생형 모 P3 바이러스의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변화 비교Comparison of Nucleotide and Amino Acid Sequence Changes of HBG and HBW MRP R Variants and Wild-type Parent P3 Virus
모 P3 바이러스 및 4개의 사람 뇌 MRPR변이체(HBG MRPRⅠ 및 Ⅱ, 및 HBW MRPRⅠ 및 Ⅱ)의 E 단백질 유전자를 RT-PCR에 의해 증폭시키고, 클로닝시킨 다음 서열화한다. HBG MRPRⅠ 및 Ⅱ 변이체는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, HBW MRPRⅠ 및 Ⅱ는 뉴클레오티드 1199에서 1개의 휴지의 뉴클레오티드(U/C) 차이를 나타내었다. 서열화된 HBG MRPR변이체와 HBW MRPR변이체 간에는 5/6 뉴클레오티드 차이가 있으며, 이로써 E-448 및 E-329에서 각각 독특한 아미노산 치환이 이루어진다(표 ⅩⅤ). 2개의 HBG MRPR변이체는 E 단백질 유전자에 있어서 P3/C6-36 바이러스와 비교해서 34개의 뉴클레오티드가 상이하기 때문에, 이로써 잔기 E-46, E-61, E-76, E-200, E-351, E-387, E-408, E-418, E-475 및 E-488에서 10개의 아미노산 치환이 이루어진다(표 ⅩⅤ). 2개의 HBW MRPR변이체는 P3/C6-36 바이러스와 비교해서 40/41개의 뉴클레오티드가 상이하기 때문에, 이로써 잔기 E-46, E-61, E-76, E-200, E-329, E-351, E-387, E-408, E-418 및 E-475에서 10개의 아미노산 치환이 이루어진다(표 ⅩⅤ). 이들 아미노산 변화는 E 단백질의 영역 Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ, 및 간-앵커 영역에 위치한다[참조: Rey et al., 1995].E protein genes of the parental P3 virus and four human brain MRP R variants (HBG MRP R I and II, and HBW MRP R I and II) are amplified by RT-PCR, cloned and sequenced. HBG MRP R I and II variants had the same nucleotide sequence, while HBW MRP R I and II showed one resting nucleotide (U / C) difference at nucleotide 1199. There is a 5/6 nucleotide difference between the sequenced HBG MRP R variants and the HBW MRP R variants, resulting in unique amino acid substitutions at E-448 and E-329, respectively (Table VII). Since the two HBG MRP R variants differ 34 nucleotides in the E protein gene compared to the P3 / C6-36 virus, this results in residues E-46, E-61, E-76, E-200, E-351. 10 amino acid substitutions are made in E-387, E-408, E-418, E-475 and E-488 (Table VII). Since the two HBW MRP R variants differ by 40/41 nucleotides compared to the P3 / C6-36 virus, this results in residues E-46, E-61, E-76, E-200, E-329, E- Ten amino acid substitutions are made at 351, E-387, E-408, E-418 and E-475 (Table VII). These amino acid changes are located in regions I, II and III, and liver-anchor regions of the E protein (Rey et al., 1995).
베로 세포에서 P3/C6-36 모 바이러스를 플라크 정제시키면, P3/C6-36 바이러스와 비교해서 E-46, E-129, E-209, E-351 및 E-387에 5개의 아미노산 치환이 이루어진 P3/베로 바이러스가 생성된다. 결과적으로, HBG MRPR변이체는 8개의 잔기 E-46, E-61, E-76, E-200, E-408, E-418, E-475 및 E-488에서 야생형 P3/베로 바이러스와 상이하다. 유사하게, HBW MRPR변이체는 또한 8개의 잔기 E-46, E-61, E-76, E-200, E-329, E-408, E-418 및 E-475에서 야생형 P3/베로 바이러스와 상이하다.Plaque purification of P3 / C6-36 parental virus in Vero cells resulted in five amino acid substitutions in E-46, E-129, E-209, E-351 and E-387 compared to P3 / C6-36 virus. P3 / Vero virus is generated. As a result, the HBG MRP R variant differs from wild type P3 / Verovirus at 8 residues E-46, E-61, E-76, E-200, E-408, E-418, E-475 and E-488. Do. Similarly, the HBW MRP R variant is also compatible with wild type P3 / Verovirus at 8 residues E-46, E-61, E-76, E-200, E-329, E-408, E-418 and E-475. Different.
실시예 21Example 21
아미노산 치환 해석Amino Acid Substitution Interpretation
레이 등은 1995년에 중앙 유럽산 참진드기-유래의 뇌염(TBE) 바이러스의 E 단백질의 가용성 부분의 3차원적인 구조를 보고하였다. 이러한 단백질은 각 단량체가 3개의 영역(Ⅰ, Ⅱ 및 Ⅲ)을 함유하는 이량체로서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 플라비바이러스 간의 시스테인의 전환으로 인해, 공개된 TBE 바이러스 구조의 것을 기초로 하여 JE 바이러스의 E 단백질을 모델로 할 수 있다. 도 3은 가장 중요한 아미노산 치환이 이루어진 JE 바이러스의 E 단백질의 가용성 부분을 다이아그램으로 나타낸 것이다. 이로부터 알수 있는 바와 같이, 아미노산 치환은 4개의 그룹[각각 E-61(영역 Ⅰ); E-46, E-76 및 E-200(영역 Ⅱ) 및 E-329(영역 Ⅲ)]에 집중 발생된다. E-408, E-418, E-475 또는 E-488 돌연변이가 플라비바이러스 E 단백질의 간-앵커 영역에서 발생되어 E 단백질의 영역외에서 형태상의 변화를 야기할 수 있다. E-46이 제안된 JE 바이러스 E 단백질의 3차원적인 구조에서 공간상 E-138 근처에 있다. 따라서, E-46의 돌연변이가 적어도 부분적으로는 사람 뇌 MRPR변이체의 약독화된 표현형과 관련이 있는 것으로 생각된다.Ray et al. Reported in 1995 the three-dimensional structure of the soluble portion of the E protein of central European true tick-derived encephalitis (TBE) virus. These proteins have been found to exist as dimers where each monomer contains three regions (I, II and III). Due to the conversion of cysteine between flaviviruses, one can model the E protein of JE virus based on the published TBE virus structure. 3 is a diagram showing the soluble portion of the E protein of JE virus with the most important amino acid substitutions. As can be seen from this, the amino acid substitutions are divided into four groups [E-61 (region I) respectively; E-46, E-76 and E-200 (area II) and E-329 (area III). E-408, E-418, E-475, or E-488 mutations can occur in the liver-anchor region of the Flavivirus E protein, causing morphological changes outside the region of the E protein. E-46 is spatially near E-138 in the three-dimensional structure of the proposed JE virus E protein. Thus, it is believed that mutations in E-46 are at least partially related to the attenuated phenotype of human brain MRP R variants.
실시예 22Example 22
황열 프렌치 향신경성 백신과 원숭이 뇌의 상호작용Interaction of Yellow Fever Neurotropic Vaccine with Monkey Brain
상기 언급된 방법을 사용하여 FNV와 원숭이 뇌(MKB)와의 상호작용을 조사한다. 황열 바이러스의 야생형 및 백신 균주를 다른 플라비바이러스, 즉 일본 뇌염(JE) 바이러스 균주 P3 및 뎅그열 혈청형 2(DEN-2) 균주 뉴 기니아 C(NGC)와 비교함으로써 결합 특이성을 측정한다. 향신경성 JE 바이러스 P3 균주는 MKB MRP에 결합되지만 원숭이 간(MKL) MRP에는 결합되지 않는 반면(표 ⅩⅥ), DEN-2 NGC 균주는 MKB MRP나 MKL MRP 어느 것에도 결합되지 않는다. 야생형 황열 균주 아시비(Asibi) 및 FNV는 MKL MRP에는 결합되지만 MKB MRP에는 거의 약하게 결합되는 반면, 백신 균주 17D-204는 MKB와 MKL MRP 모두에 거의 약하게 결합되었다. FNV 바이러스는 MKB에 결합되는 황열 바이러스의 유일한 균주이다. 흥미롭게도, 17D-204 백신 바이러스는 MKL 및 MKB MRP에 약하게 결합되었다. 이는 약독화된 17D 바이러스의 표현형과 간접적으로 연관이 있을 수 있다.The above mentioned method is used to investigate the interaction of FNV with monkey brain (MKB). Binding specificity is determined by comparing wild type and vaccine strains of yellow fever virus to other flaviviruses, namely Japanese Encephalitis (JE) virus strain P3 and Dengue serotype 2 (DEN-2) strain New Guinea C (NGC). The neurogenic JE virus P3 strain binds to MKB MRP but not to monkey liver (MKL) MRP (Table VI), whereas the DEN-2 NGC strain does not bind to either MKB MRP or MKL MRP. Wild-type yellow fever strains Asibi and FNV bound to MKL MRP but nearly weakly to MKB MRP, while vaccine strain 17D-204 was bound to weakly to both MKB and MKL MRP. FNV virus is the only strain of yellow fever virus that binds to MKB. Interestingly, the 17D-204 vaccine virus was weakly bound to MKL and MKB MRP. This may be indirectly related to the phenotype of the attenuated 17D virus.
실시예 23Example 23
황열 프렌치 향신경성 백신의 MRPR 변이체MRPR Variants of Yellow Fever Neurotropic Vaccine
4개의 MKB MRPR변이체를 FNV "균주" Yale[참조: Wang et al., 1995]에 대해 발생시키는데, 단 MRP를 시노몰거스(cynomolgus) 원숭이의 뇌로부터 유도한다. 3개의 MKB MRPR변이체를 pH 7.6의 완충액에서 선별하고 각각 MKB MRPRⅠ, MKB MRPRⅡ 및 MKB MRPRⅢ로 명명하였다. pH 6.0의 완충액에서 4번째 변이체를 선별하고 이를 MKB MRPR(pH 6.0)으로 명명하였다. pH 7.6에서 마우스 뇌 MRP와 함께 배양한 후에 FNV-Yale로부터 2개의 MRPR변이체를 선별하고 이를 MS MRPRⅠ 및 MS MRPRⅡ로 명명하였다.Four MKB MRP R variants are generated against the FNV “strain” Yale (Wang et al., 1995), except that MRP is derived from the brain of cynomolgus monkeys. Three MKB MRP R variants were selected in buffer at pH 7.6 and named MKB MRP R I, MKB MRP R II and MKB MRP R III, respectively. The fourth variant was selected in buffer at pH 6.0 and named MKB MRP R (pH 6.0). After incubation with mouse brain MRP at pH 7.6 two MRP R variants were selected from FNV-Yale and named MS MRP R I and MS MRP R II.
FNV-Yale은 뇌내 접종시킨 후에 마우스에 대해 고도로 신경병원성인 것으로 공지되어 있으며[참조: Wang et al., 1995] 4주생 암컷 NIH-스위스산 마우스에서 0.08의 pfu/LD50을 지니는 것으로 밝혀진 반면, pH 7.6에서 선별된 MKB MRPR변이체 바이러스는 400배 이상 약독화되었다(예를 들면, MKB MRPRⅡ에 대한 32pfu/LD50)(표 ⅩⅦ). MKB MRPR(pH 6.0)은 모 FNV-Yale 바이러스와 비교해서 87배 약독화되었으며 pH 7.6에서 선별된 MKB MRPR변이체 바이러스 보다는 덜 약독화되었다. 2개의 MS MRPR변이체가 또한, 모 FNV-Yale 바이러스와 비교해서 100배 이하 정도 약독화되었다(표 ⅩⅦ). 프리-막(prM)과 모 및 MRPR변이체 바이러스의 E 단백질 유전자를 서열화한 결과, 각 변이체가 단지 1개의 뉴클레오티드 변화를 나타냄으로써 모 FNV-Yale 바이러스와 비교해서 E 단백질에서 1개의 아미노산 만이 치환되었다. M 단백질 유전자에서는 어떠한 변화도 동정되지 않았다. MKB MRPR(pH 6.0)은 E-458에서 1개의 아미노산이 치환되었으며(G→R) pH 7.6에서 선별된 3개의 MKB MRPR변이체는 각각 MKB MRPRⅠ, MKB MRPRⅡ 및 MKB MRPRⅢ에 대해 E-260(G→A), E-274(Y→H) 또는 E-237(H→Y)에서 단일 아미노산 치환을 나타내었다. 2개의 MS MRPR변이체는 E-457(M→I)에서 동일한 아미노산 치환을 나타내었다.FNV-Yale is known to be highly neuropathogenic to mice after inoculation of the brain (Wang et al., 1995) and has been found to have a pfu / LD 50 of 0.08 in 4 week-old female NIH-Swissian mice, MKB MRP R variant viruses selected at pH 7.6 were attenuated at least 400-fold (eg, 32 pfu / LD 50 for MKB MRP R II) (Table VII). MKB MRP R (pH 6.0) was 87-fold attenuated compared to the parental FNV-Yale virus and less attenuated than MKB MRP R variant virus selected at pH 7.6. Two MS MRP R variants were also attenuated by up to 100-fold compared to the parental FNV-Yale virus (Table VII). Sequencing the E protein genes of the pre-membrane (prM) and parental and MRP R variant viruses showed that only one amino acid was substituted in the E protein as compared to the parental FNV-Yale virus, with each variant exhibiting only one nucleotide change. . No change was identified in the M protein gene. MKB MRP R (pH 6.0) was substituted with one amino acid at E-458 (G → R) and the three MKB MRP R variants selected at pH 7.6 were MKB MRP R I, MKB MRP R II and MKB MRP R III, respectively. Single amino acid substitutions were shown for E-260 (G → A), E-274 (Y → H) or E-237 (H → Y). Two MS MRP R variants showed identical amino acid substitutions at E-457 (M → I).
실시예 24Example 24
황열 바이러스 프렌치 향신경성 백신의 아미노산 치환Amino Acid Substitution of Yellow Fever Virus French Vaccine Vaccine
앞서의 연구는 야생형의 내장친화성 FVV의 E 단백질이 E-54, E-227 및 E-249에서의 3개의 공통의 아미노산 치환에 의해 FNV 바이러스의 4개 "균주"와 상이하다는 것을 보여주고 있다[참조: Wang et al., 1995]. 도 4는 레이 등(1995)에 의해 보고된 TBE 바이러스의 구조를 기초로 하여 가장 중요한 FNV 바이러스에서 발견된 아미노산 치환(E-54, E-227 및 E-249)을 갖는 YF 바이러스 E 단백질의 수용성 부분의 3차원적인 구조를 다이아그램으로 도시한 것이다. MKB MRPRⅠ, MKB MRPRⅡ 및 MKB MRPRⅢ의 E 단백질에서의 단일 아미노산 치환으로 인해, 모두 FNV 백신 바이러스에서 발견되는 E-249 치환물에 근접한, E-237, E-260 및 E-274 각각에서의 영역 Ⅱ에 돌연변이가 발생하는데, 이는 이러한 E 단백질의 영역이 원숭이 뇌에 대한 바이러스 결합과 연관이 있으며 FNV 바이러스의 증가된 원숭이 향신경성과 간접적으로 관련이 있을 수 있다는 것을 제시해준다. E-249 치환은 4개의 FNV 백신 바이러스 "균주"에 대해 독특하다(Wang et al., 1995). 지금까지 서열화된 어떠한 17D 백신 바이러스[참조:Rymna et al., 1977, Rice et al., 1985, Post et al., 1990, Dupuy et al., 1989]이나 28 야생형 균주[참조: Chang et al., 1996, Wang et al., 1996, Wang et al., 1997]도 이러한 치환을 나타내지 않았다.Previous studies have shown that the E protein of wild-type visceral affinity FVV differs from the four "strains" of FNV virus by three common amino acid substitutions at E-54, E-227 and E-249. Wang et al., 1995. 4 shows the water solubility of the YF virus E protein with amino acid substitutions (E-54, E-227 and E-249) found in the most important FNV viruses based on the structure of the TBE virus reported by Ray et al. (1995). The three-dimensional structure of the part is shown as a diagram. Due to single amino acid substitutions in the E proteins of MKB MRP R I, MKB MRP R II and MKB MRP R III, E-237, E-260 and E-, all close to the E-249 substitutions found in the FNV vaccine virus. Mutations occur in region II in each of 274, suggesting that this region of E protein is associated with viral binding to the monkey brain and may be indirectly related to the increased monkey neuropathy of the FNV virus. E-249 substitutions are unique for four FNV vaccine virus “strains” (Wang et al., 1995). Any 17D vaccine virus sequenced so far (Rymna et al., 1977, Rice et al., 1985, Post et al., 1990, Dupuy et al., 1989) or 28 wild type strains (Chang et al. , 1996, Wang et al., 1996, Wang et al., 1997] did not exhibit this substitution.
pH 7.6에서 선별된 MKB MRPR변이체의 E-260, E-274 또는 E-237에서의 치환은 간-앵커 영역에서의 E-458에서 아미노산 치환을 나타내는 pH 6.0에서 선별된 MKB MRPR변이체의 치환과는 구별된다. 이러한 치환이 pH 감소로 인해 발생되는 E 단백질의 형태적 변화에 기인되며 TBE 바이러스에 대한 보고내용[참조:Stiasny et al., 1996]과 부합되는 것으로 여겨진다. 또한, pH 7.6에서 선별된 YF FNV-Yale 균주의 2개의 MS MRPR변이체에서 발견되는 치환은 E 단백질의 간-앵커 영역에서의 E-457에서 이루어진다. 이는 적어도, FNV 바이러스의 E 단백질과 마우스 뇌 및 원숭이 뇌 세포 결합 부위의 상호작용이 어렵다는 것을 제시해주며, FNV 바이러스가 마우스 뇌 및 원숭이 뇌 세포 상의 상이한 세포 수용체를 인식한다는 것을 지시할 수 있다. 이러한 제시는, 황열 바이러스의 모든 균주가 뇌내 접종된 후에 마우스 뇌를 감염시키는 반면 FNV 만이 뇌내 접종된 후에 원숭이 뇌를 감염시키는 것으로 밝혀진 생물학적 연구[참조: Freestone, 1995]와 부합될 것이다.Substitution at E-260, E-274, or E-237 of MKB MRP R variants selected at pH 7.6 is substituted for MKB MRP R variants selected at pH 6.0 indicating amino acid substitutions at E-458 in the liver-anchor region Is distinguished from. This substitution is attributed to the morphological changes of the E protein caused by the pH decrease and is believed to be consistent with the report on the TBE virus (Stiasny et al., 1996). In addition, the substitution found in the two MS MRP R variants of the YF FNV-Yale strain selected at pH 7.6 is at E-457 in the liver-anchor region of the E protein. This at least suggests that the interaction of the E protein of the FNV virus with mouse brain and monkey brain cell binding sites is difficult and may indicate that the FNV virus recognizes different cellular receptors on mouse brain and monkey brain cells. This presentation would be consistent with a biological study (Freestone, 1995) found that all strains of yellow fever virus infect the mouse brain after inoculation in the brain, whereas only FNV infects the monkey brain after inoculation in the brain.
다음 문헌이 본원에서 인용되었다:The following documents are cited herein:
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다음 공개문헌이 본원에서 번호로 매겨져 인용되었다:The following publications are numbered herein and cited:
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본 명세서에서 언급된 모든 특허 또는 공개 문헌은 본 발명이 속하는 분야의 숙련인의 수준을 나타낸다. 이들 특허 및 공개 문헌은 개개의 공개 문헌 각각이 참조로 삽입되기 위해 구체적이고도 세세히 지시된 경우와 동일한 정도로 본원에 참조 문헌으로 삽입된다.All patents or publications mentioned in the specification are indicative of the level of skill in the art to which this invention pertains. These patents and publications are incorporated herein by reference to the same extent as if each individual publication was specifically and specifically indicated to be incorporated by reference.
당해 분야의 숙련인은 본 발명이 앞서 언급된 목적들을 수행하고 의도된 용도와 이점들 뿐 아니라 본 출원 본래의 이점을 획득하도록 잘 조정되었다는 것을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 실시예는 본원에 기재된 방법, 과정, 처리 공정, 분자 및 특정한 화합물과 함께, 바람직한 양태를 나타내고자 제시된 예일 뿐이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되서는 안된다. 청구의 범위에 한정된 본 발명의 범주 내에 포괄되는 변화 및 기타 용도가 당해 분야의 숙련인에 의해 인지될 것이다.Those skilled in the art will readily appreciate that the present invention has been well adapted to carry out the above-mentioned objects and to obtain the original advantages of the present application as well as the intended uses and advantages. The examples of the present invention, together with the methods, processes, treatments, molecules and specific compounds described herein, are merely examples presented to illustrate preferred embodiments and should not thereby limit the scope of the present invention. Changes and other uses which fall within the scope of the invention as defined by the claims will be appreciated by those skilled in the art.
Claims (8)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US?? | 1981-08-26 | ||
| US09098298A | 1998-06-05 | 1998-06-05 | |
| US9090982 | 1998-06-05 | ||
| PCT/US1998/011329 WO1998056896A1 (en) | 1997-06-13 | 1998-06-08 | Method of attenuating viruses |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20000068161A true KR20000068161A (en) | 2000-11-25 |
Family
ID=54750435
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019997001252A KR20000068161A (en) | 1998-06-05 | 1998-06-08 | Method of attenuating viruses |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20000068161A (en) |
-
1998
- 1998-06-08 KR KR1019997001252A patent/KR20000068161A/en active IP Right Grant
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