KR20000016773A - Method for biochemical analysis of antioxidant - Google Patents
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Abstract
Description
발명의 배경Background of the Invention
기술분야Technical Field
본 발명은 일반적으로 영양 및 생리 화학 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 산화방지제 기능의 신규한 생화학적 분석법에 관한 것이다.The present invention relates generally to the field of nutrition and physiological chemistry. More particularly, the present invention relates to novel biochemical assays of antioxidant function.
관련 기술의 설명Description of the related technology
각각의 세포들은 산화 응력을 유발하는 유리 라디칼이라고 하는 고도로 반응성이고 불안정한 분자에 지속적으로 노출된다. 이들 부적합한 분자는 생활의 정상 부산물이고, 산소의 대사, 즉, 세포 호흡, 면역 시스템 세포(외래 물질의 억제) 및 대사에 필수적인 다수의 효소 반응에 의해 생성된다. 유리 라디칼의 환경적 공급원으로는 연기, 이온화 방사선, 공기 오염, 화학약품(칼시노겐, 다수의 석유화학품, 살균제, 염료, 용매, 세포 정지제 등), 독성 중금속 및 산화(산패) 지방이 있다. 가장 통상적인 유리 라디칼 중의 일부로는 과산화물(superoxide), 하이드록실, 단독 산소, 및 과산화물(peroxide)이다. 특정 원자가의 철 및 구리는 유리 라디칼의 형성을 촉매할 수 있으며, 이들 유리 라디칼은 수명이 짧지만, 라디칼 형성의 연쇄 반응을 촉진시켜, 변형되고 손상된 생물학적 분자의 반류가 뒤따른다.Each cell is constantly exposed to highly reactive and labile molecules called free radicals that cause oxidative stress. These inappropriate molecules are normal by-products of life and are produced by a number of enzymatic reactions essential for the metabolism of oxygen, ie cellular respiration, immune system cells (inhibition of foreign substances) and metabolism. Environmental sources of free radicals include smoke, ionizing radiation, air pollution, chemicals (calcinogen, many petrochemicals, fungicides, dyes, solvents, cell stoppers, etc.), toxic heavy metals, and oxidized (lost) fats. . Some of the most common free radicals are superoxides, hydroxyls, sole oxygen, and peroxides. Certain valences of iron and copper can catalyze the formation of free radicals, which have a short lifespan, but promote the chain reaction of radical formation, followed by the reflux of modified and damaged biological molecules.
유리 라디칼은 살아있는 유기체에 독성이고, 모든 생물학적 분자에 구조적 손상을 일으킨다. 분자 손상은 유전자 코드의 변형, 세포막 통합성의 붕괴, 영양학적 장애, 내분비 불균형, 알레르기 증가, 혈관 내피 파괴, 및 결합조직 분해 및 염증으로 해독한다.Free radicals are toxic to living organisms and cause structural damage to all biological molecules. Molecular damage is translated into alterations in genetic code, disruption of cell membrane integrity, nutritional disorders, endocrine imbalances, increased allergies, vascular endothelial destruction, and connective tissue degradation and inflammation.
유리 라디칼의 유해한 영향으로부터의 보호 작용은 산화방지제라고 하는 광범위한 범위의 분자에서 발견되었다. 유리 라디칼, 및 이들의 쇄 부산물은 산화방지제에 의해 중화되어 덜 유해한 생성물로 전화될 수 있다. 산화방지제는 효소(예: 과산화물 디스무타제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제), 필수 영양소(예: 베타 카로텐, 비타민 C 및 E, 셀레늄 및 시스테인) 또는 다양한 내인성 화합물(예: 글루타티온) 또는 식이성 화합물(예: 바이오플라바노이드) 일 수 있다. 따라서, 인체는 유리 라디칼의 상이한 소진제(quencher)를 갖는다.Protective actions against the deleterious effects of free radicals have been found in a broad range of molecules called antioxidants. Free radicals, and their chain byproducts, can be neutralized by antioxidants and converted into less harmful products. Antioxidants can be enzymes (e.g. peroxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase), essential nutrients (e.g. beta carotene, vitamins C and E, selenium and cysteine) or various endogenous compounds (e.g. glutathione) or dietary compounds (Eg, bioflavanoids). Thus, the human body has different quenchers of free radicals.
사람에 대한 연구는 영양소 산화방지제의 부족한 섭취가 암, 심장혈관계 질환, 관절염, 백내장 등에 걸릴 높은 위험성과 관련됨을 제시하고 있다. 또한, 영양소 산화방지제의 다량의 섭취는 만성 퇴행성 질환의 낮은 발병률과 관련된다. 고무적인 연구는 산화방지제 영양소 보충물을 개입시켜 사람에게 치료적 이점을 제공할 수 있음을 나타낸다.Studies in humans suggest that poor intake of nutrient antioxidants is associated with a high risk of cancer, cardiovascular disease, arthritis, and cataracts. In addition, high intakes of nutrient antioxidants are associated with low incidence of chronic degenerative diseases. Encouraging studies indicate that intervention with antioxidant nutrient supplements can provide a therapeutic benefit to humans.
산화방지제 상태의 실험실의 분석은 여러가지 이유로 상투수단이 되지는 못하고 있다. 유리 라디칼은 움직임이 극히 신속하여 일반적으로 직접 측정할 수 없다. 유리 라디칼 손상의 부산물은 말론디알데히드(MDA), 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 또는 혈청 또는 뇨중의 지질 과산화물로서 측정할 수 있다. 이들 시험은 산화 응력의 지표이지만 특정 유형의 생체 분자(대개 다중불포화 지질 및 핵산)에 대한 손상을 반영할 뿐이다. 혈청 또는 세포중의 산화방지제 영양소 수준 및 세포중의 산화방지제 효소의 활성을 측정하면 특정 성분의 결핍 수준을 확인할 수는 있지만, 산화방지제의 상호반응 및 실지 기능에 대한 정보는 거의 제공되지 않는다. 산화성 스트레스에 대한 다른 시험은 연구 설정용에 사용 가능하나 이들의 복잡성과 비용 때문에 상용 임상 연구용으로는 적합치 못하다.The laboratory's analysis of antioxidant status has not become a contradiction for many reasons. Free radicals are extremely fast in motion and generally cannot be measured directly. By-products of free radical damage can be measured as malondialdehyde (MDA), thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) or lipid peroxides in serum or urine. These tests are indicative of oxidative stress but only reflect damage to certain types of biomolecules (usually polyunsaturated lipids and nucleic acids). Measuring the levels of antioxidant nutrients in serum or cells and the activity of antioxidant enzymes in cells can identify deficiency levels of certain components, but little information is provided on antioxidant interactions and practical function. Other tests for oxidative stress can be used for research settings but are not suitable for commercial clinical research because of their complexity and cost.
선행 기술에는 인체 내의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석할 수 있는 간단하고 저렴한 수단이 없다. 본 발명은 당해 기술 분야에서 오랫동안 필요했고 요망되었던 것을 충족시킨다.There is no simple and inexpensive means in the prior art to biochemically analyze the function of antioxidants in the human body. The present invention fulfills what has been needed and desired for a long time in the art.
발명의 요약Summary of the Invention
본 발명의 한가지 양태에서는, 다음 성분: 글루코스 및 세포내에서 글루코스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄수화물, 생물학적으로 이용가능한 형태의 판토텐산, 콜린 또는 생물학적으로 이용 가능한 형태의, 세포내에서 콜린을 생성할 수 있는 물질, 클로라이드, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는, 생물학적으로 이용 가능한 형태의 무기 이온, 쿠멘 하이드로퍼옥사이드, 탈이온수, 및 검정하는 임파구를 자극하기에 유효한 양의 미토겐을 함유하고, pH가 약 6.8 내지 7.6인, 완충된, 무혈청 용액을 포함하고, 영양 결핍, 불충분 및 불균형을 측정하고 임파구의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하는데 효과적임을 특징으로 하는, 사람의 임파구내에서의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하기에 유용한 세포 배양 배지(cell culture medium)가 제공된다.In one embodiment of the invention, the following components: glucose and carbohydrates selected from the group consisting of compounds capable of biologically producing glucose intracellularly, in a bioavailable form of pantothenic acid, choline or in a bioavailable form, intracellularly Stimulating lymphocytes in biologically available forms, including cumene, phosphate, calcium, magnesium, potassium, sodium, iron, cumene hydroperoxide, deionized water, and assays Contains a buffered, serum-free solution containing an effective amount of mitogen and a pH of about 6.8 to 7.6, and is effective in determining nutritional deficiency, insufficiency and imbalance, and in biochemical analysis of lymphocyte antioxidant function. Characterized by biochemical antioxidant function in human lymphocytes The useful cell culture medium (cell culture medium) is provided to analyze a.
본 발명의 또다른 양태로, 본 발명의 세포 배양 배지에 개체로부터의 임파구를 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 임파구의 반응을 개체들의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개체 내의 세포의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하는 방법이 제공된다.In another aspect of the invention, the method comprising the steps of inoculating lymphocytes from an individual into the cell culture medium of the present invention; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing the response of lymphocytes to the average response of lymphocytes from a control group of individuals, a method of biochemically analyzing the antioxidant function of cells in an individual.
본 발명의 또다른 양태로, 시험하는 영양소의 농도를 제한한, 본 발명의 세포 배양 배지에 개체로부터의 임파구를 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 상기 임파구의 반응을 개체들의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에 필요한 특정 영양소에 대한 비정상적인 영양 필요량의 측정방법이 제공된다.In another embodiment of the invention, inoculating lymphocytes from an individual into a cell culture medium of the invention, wherein the concentration of the nutrient to be tested is limited; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing the response of the lymphocytes to the mean response of lymphocytes from a control group of individuals.
본 발명의 또다른 양태로, 영양소, 생화학적 중간체 또는 생성물 또는 세포 반응에 유해한 영향을 미치는 농도의 약제를 포함하는 기타 혈액 성분중의 하나 이상을 함유하는 본 발명의 세포 배양 배지에 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 당해 배지에서의 반응을 영양소, 생화학적 중간체 또는 이의 생성물 또는 시험하는 약제를 포함하는 기타 혈액 성분의 유해 작용에 영향을 미치는 것으로 추측되는 물질의 원료가 보충된 동일한 배지에서의 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 영양소, 생화학적 중간체 또는 이의 생성물 및 약제를 포함하는 기타 혈액 성분의 유해 작용에 민감한 개체에서 유해 작용을 극복하는 영양소 인자 또는 생화학적 중간체를 확인하는 방법이 제공된다.In another embodiment of the present invention, the method comprises inoculating a cell culture medium of the present invention containing one or more of nutrients, biochemical intermediates or other blood components, including concentrations of agents that adversely affect the product or cellular response; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing the reaction in the medium with the reaction in the same medium supplemented with a source of a substance suspected of affecting the deleterious effects of nutrients, biochemical intermediates or products thereof or other blood components, including the drug being tested. Methods are provided for identifying nutrient factors or biochemical intermediates that overcome adverse effects in individuals susceptible to the adverse effects of nutrients, biochemical intermediates or other blood components, including nutrients, biochemical intermediates or products thereof, and pharmaceuticals.
본 발명의 다른 추가 측면, 특징, 및 이점은 설명을 목적으로 제공된 본 발명의 바람직한 양태에 대한 다음 설명으로부터 자명해질 것이다.Other additional aspects, features, and advantages of the invention will be apparent from the following description of the preferred embodiments of the invention provided for purposes of explanation.
도면의 간단한 설명Brief description of the drawings
본 발명의 상기한 특징, 이점 및 목적뿐만 아니라 자명하게될 기타 사항을 달성하고 상세하게 이해할 수 있도록, 상기 간략하게 요약된 본 발명은 첨부되는 도면에서 설명되는 이의 특정 양태를 참고로 하여 더욱 상세하게 기술될 것이다. 이들 도면은 명세서의 일부를 형성한다. 그러나, 첨부되는 도면은 본 발명의 바람직한 양태를 설명하는 것이며 따라서 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.In order to attain and understand in detail the above-described features, advantages and objects of the present invention as well as other matters which become apparent, the present invention, briefly summarized above, is described in more detail with reference to specific embodiments thereof described in the accompanying drawings. Will be described. These drawings form part of the specification. The accompanying drawings, however, illustrate preferred embodiments of the invention and therefore should not be considered as limiting the scope of the invention.
도 1은 참조 범위의 오염으로부터의 쿠멘 하이드로퍼옥사이드의 용량 반응 곡선을 나타낸다.1 shows the dose response curves of cumene hydroperoxide from contamination of the reference range.
발명의 상세한 설명Detailed description of the invention
본 발명은 개체 세포의 신규한 생화학적 분석을 제공하는 세포내 비타민 결핍과 전체 산화방지제 기능을 평가하는 혈액 시험에 관한 것이다. 이러한 분석은 영양소 및 산화방지제 시스템이 개체의 말초 임파구내에서 실제로 얼마나 우수하게 작용하는가를 반영한다. 세포내 비타민 상태를 미리 측정할 수 없는 경우, 본 발명의 방법학은 결핍이 임상적 문제를 일으키기 전에 이를 정확하게 검출할 수 있도록 한다.The present invention is directed to a blood test that assesses intracellular vitamin deficiency and overall antioxidant function, providing novel biochemical analysis of individual cells. This analysis reflects how well the nutrient and antioxidant system actually works in the individual's peripheral lymphocytes. If intracellular vitamin status cannot be measured in advance, the methodology of the present invention allows for the accurate detection of deficiencies before they cause clinical problems.
본 발명이 개발될때까지, 비타민 시험은 임상적 관찰 및 특정 효소 또는 단백질 마커(marker)와 함께, 혈청, 뇨 또는 모발중의 정지 수준의 측정치를 기본으로 하였다. 이러한 시험은 단기간의 정지 수준을 표시하는 것으로, 이들 화합물이 효소 조인자로서 참여하는 수많은 복잡한 대사 경로를 평가하지는 않는다. 따라서, 다른 방법이 종종 보고되지만 기능적으로 부정확하여, 임상적으로 쓸모가 없다.Until the present invention was developed, vitamin testing was based on clinical observations and measurements of quiescent levels in serum, urine or hair, along with specific enzyme or protein markers. These tests indicate short-term stop levels and do not evaluate the numerous complex metabolic pathways in which these compounds participate as enzyme cofactors. Thus, while other methods are often reported, they are functionally incorrect and are clinically useless.
본 발명의 방법은 정지 수준을 측정하는 대신, 비타민, 무기질, 아미노산 및 산화방지제 시스템이 개체의 백혈구내에서 실제로 어떻게 작용하는가를 분석한다. 다른 방법과는 달리, 기능적인 것으로 청구한 방법까지도, 본 발명의 방법은 대사적으로 활성인 말초 임파구를 이용하고 DNA 합성(세포 성장)을 측정하여 미토겐 반응을 제한하는 기능성 세포내 결핍을 확인한다. 따라서, 본 발명의 방법은 혈청 수준 시험이라기보다는 전체 대사 기능을 반영하는 시험 결과, 또는 분리된 생화학적 경로를 이용하는 시험을 제공한다.Instead of measuring the level of arrest, the method of the present invention analyzes how vitamins, minerals, amino acids and antioxidant systems actually work in the individual white blood cells. Unlike other methods, even the method claimed as functional, the method of the present invention utilizes metabolically active peripheral lymphocytes and measures DNA synthesis (cell growth) to identify functional intracellular deficiencies that limit mitogen responses. do. Thus, the methods of the present invention provide test results that reflect the overall metabolic function, rather than serum level tests, or tests that use separate biochemical pathways.
임파구는 (1) 세포 매개된 면역 시스템에 대한 숙주이고 용이하게 자극받아 성장하고(유사분열생식); (2) 시간 평균한, 장기간의 영양소 상태를 반영(임파구의 생존기는 약 6개월임)하며; (3) 다른 세포에 대해 공통인 대사 경로를 포함하고, 신속하게 DNA 합성 및 세포 성장을 하게 하는 핵을 함유하고, 표준 정맥천자(venipuncture)로 용이하게 수집할 수 있기 때문에, 명백한 이점을 제공한다.Lymphocytes are (1) hosts for cell mediated immune systems and are easily stimulated to grow (mitotic reproduction); (2) reflects the long term nutrient status, averaged over time (lymphocyte survival is about 6 months); (3) provides a distinct advantage because it contains a metabolic pathway common to other cells, contains nuclei that allow for rapid DNA synthesis and cell growth, and can be easily collected by standard venipuncture .
본 발명의 방법은 혈청 또는 단백질이 없는, 화학적으로 정의된 배양 배지를 사용하여 각 환자의 임파구내에서의 DNA 합성(세포 성장)을 세포내에서 측정함으로써 기능적 결핍을 확인하는 유일한 혈액 시험법이다. 대조 배지는 최적 임파구 성장, 또는 미토겐 반응을 지지하는데 필요한 각각의 필수 영양소를 최소량으로 함유한다. 세포 대사에 관련된 19종의 상이한 비타민, 무기질 및 아미노산의 기능성 상태는 배지중 각 영양소의 조작에 따라 임파구가 성장하도록 하여 발생되는 DNA 합성을 측정함으로써 직접 측정한다. 더욱 중요하게는, 본 발명의 방법은 유리 라디칼 및 기타 형태의 산화 응력에 의해 유발된 손상에 저항하는 세포의 전체 능력을 평가하는 전체 산화방지제 기능 시험법을 제공한다. 광범위한 상호반응, 중복, 회복 및 재충전 능력을 갖는 - 상당수의 세포의 산화방지제 때문에, 전체 기능을 측정하는 것이 전체 산화방지제 상태를 평가하는 가장 정확하고 임상적으로 유용한 방법이다. 각 환자의 살아있는, 대사적으로 활성인 임파구를 이용함으로써, 본 발명의 방법은 어떠한 선행 기술의 실험실 시험법보다도 더욱 정확하고 임상적으로 유용한, 비타민과 무기질 상태의 분석을 제공한다.The method of the present invention is the only blood test to confirm functional deficiency by measuring intracellularly DNA synthesis (cell growth) in lymphocytes of each patient using chemically defined culture media without serum or protein. The control medium contains the minimum amount of each essential nutrient necessary to support optimal lymphocyte growth, or mitogen response. The functional status of 19 different vitamins, minerals and amino acids involved in cell metabolism is measured directly by measuring the DNA synthesis produced by allowing lymphocytes to grow according to the manipulation of each nutrient in the medium. More importantly, the method of the present invention provides a total antioxidant functional assay that assesses the overall ability of a cell to resist damage caused by free radicals and other forms of oxidative stress. Because of the large number of cell antioxidants-with extensive interaction, redundancy, recovery, and recharge capabilities-measuring overall function is the most accurate and clinically useful way to assess overall antioxidant status. By using the live, metabolically active lymphocytes of each patient, the method of the present invention provides an analysis of vitamin and mineral status, which is more accurate and clinically useful than any prior art laboratory assay.
기능성 적합성을 평가하기 위하여 임파구 성장을 측정함으로써, 본 발명의 방법은 광범위하게 변화하는 각 환자의 독특한 요구량을 반영한다. 따라서, 소위 표준으로 측정되는 바와 같은 "평균" 환자보다는 개체의 특정 생화학적 요구량에 대해 보충할 수 있다.By measuring lymphocyte growth to assess functional suitability, the method of the present invention reflects the unique needs of each patient that varies widely. Thus, one may make up for the specific biochemical needs of the individual rather than the “average” patient as measured by so-called standards.
공개된 연구에 따르면, 미국 인구의 70%가 장기간의 비타민 및 무기질 결핍의 위험에 처해 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결핍은 몸의 효율적인 기능과 질병에 대한 저항력에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 과학적 증거에 의해, 비타민 결핍을 치료함으로써 면역력이 향상되고 만성 퇴행성 건강 질환의 예방 또는 치료에 도움이 된다고 나타난다. 연구에 의해 또한, 상당한 세포내 기능 결핍이 이미 비타민을 섭취하고 있는 환자의 40% 이상에서 발생한다고 나타난다. 또한, 권장되는 식이 허용량(Recommended Dietary Allowance; RDAs)는 각각의 비타민 및 무기질 필요량을 만족시키기 위한 적합한 지침은 아니다.According to published research, 70% of the US population is at risk of long-term vitamin and mineral deficiencies. This deficiency can adversely affect the body's efficient function and disease resistance. Scientific evidence indicates that treating vitamin deficiencies improves immunity and helps prevent or treat chronic degenerative health diseases. Studies also indicate that significant intracellular dysfunction occurs in over 40% of patients who are already taking vitamins. In addition, the recommended dietary allowances (RDAs) are not suitable guidelines for meeting individual vitamin and mineral needs.
다수의 개체가 본 발명으로부터 이익을 얻을 수 있다. 비타민 결핍의 치료은 건강을 유지하고자 하는 건강한 환자에 있어서 필수적이다. 이들 환자에 대한 기본 시험은 극히 중요하다. 성장하는 생체의 의학 연구는 비타민 결핍과 관련된 수많은 질환 과정을 계속해서 관측하는 것이다. 이러한 연구로 최적의 비타민, 무기질, 아미노산 및 산화방지제 상태의 예방 및 치료학적 이점이 - 심장 질환 및 다양한 형태의 암의 예방에 기여하는 것으로부터, 면역 시스템 기능을 자극하고 생리학적 기능에 있어서 노화의 완화에 이르기까지 증명된다. 또한, 알코올 중독 및 약제 남용과 같은 건강 질환, 관절염, 만성 피로, 당뇨병, HIV/AIDS 및 기타 면역 장애, 반점성 퇴행, 권태 및 피로, 다발성 경화증, 신경관 결함, 비만증, 골다공증 및 임신이 비타민 및 무기질 결핍에 의해, 직접적 또는 간접적으로 영향받을 수 있으며, 이들의 보충이 이러한 만성 건강 질환의 저지 또는 예방에 기여하는 것으로 밝혀졌다.Many individuals can benefit from the present invention. Treatment of vitamin deficiency is essential for healthy patients who wish to stay healthy. Basic trials for these patients are extremely important. Medical research in growing organisms continues to monitor numerous disease processes associated with vitamin deficiency. This research has shown that the prevention and therapeutic benefits of optimal vitamin, mineral, amino acid and antioxidant status-contribute to the prevention of heart disease and various forms of cancer, stimulate immune system function and reduce the Proven to mitigation. In addition, health diseases such as alcoholism and drug abuse, arthritis, chronic fatigue, diabetes, HIV / AIDS and other immune disorders, speculative degeneration, boredom and fatigue, multiple sclerosis, neural tube defects, obesity, osteoporosis and pregnancy are vitamins and minerals Deficiencies can be affected directly or indirectly, and their supplementation has been found to contribute to the prevention or prevention of these chronic health diseases.
본 발명의 바람직한 양태는 하기에 상세하게 기술되지만, 본 발명의 검정법의 다양한 기본 성분, 예를 들면, 용액, 배양 배지, 염 및 기타 성분은 미국 특허 제4,499,064호에 기술되어 있다.While preferred embodiments of the invention are described in detail below, various basic components of the assays of the invention, such as solutions, culture media, salts and other components, are described in US Pat. No. 4,499,064.
본 발명은 다음 성분: 글루코스 및 세포내에서 글루코스를 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 탄수화물, 생물학적으로 이용 가능한 형태의 판토텐산, 콜린 또는 생물학적으로 이용 가능한 형태의, 세포내에서 콜린을 생성할 수 있는 물질, 클로라이드, 포스페이트, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 및 철을 포함하는, 생물학적으로 이용 가능한 형태의 무기 이온, 쿠멘 하이드로퍼옥사이드, 탈이온수, 및 검정하는 임파구를 자극하기에 유효한 양의 미토겐을 함유하고, pH가 약 6.8 내지 7.6인, 완충된, 무혈청 용액을 포함하고, 영양 결핍, 불충분 및 불균형을 측정하고 임파구의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하는데 효과적임을 특징으로 하는, 사람의 임파구내에서 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하기에 유용한 세포 배양 배지에 관한 것이다.The present invention provides the following components: carbohydrates selected from the group consisting of glucose and compounds capable of biologically producing glucose in the cell, biologically available forms of pantothenic acid, choline or in the biologically available form, producing choline in the cell In an amount effective to stimulate biologically available forms of inorganic ions, cumene hydroperoxide, deionized water, and assayed lymphocytes, including those that can be, chloride, phosphate, calcium, magnesium, potassium, sodium, and iron A buffered, serum-free solution, containing mitogen and a pH of about 6.8 to 7.6, characterized in that it is effective in determining nutritional deficiency, insufficiency and imbalance, and in biochemical analysis of lymphocyte antioxidant function, Useful for biochemical analysis of antioxidant function in human lymphocytes Cells relates to a culture medium.
하나의 양태에서, 세포 배양 배지는 생물학적 이용 가능한 형태의 아미노산 및 비타민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 영양소가 영양 보충물로부터 제외되었는지 또는 영양 보충물중에 제한 또는 억제량으로 존재하는지에 대해 시험한 영양소 보충물로 보충된다. 이 경우, 비타민은 비오틴, 폴린산 또는 생물학적으로 이용 가능한 형태의 폴산, 니코틴아미드 또는 니코틴산, 리보플라빈, 티아민, 비타민 B6및 비타민 B12, 및 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되며; 여기서 그룹으로서, 각각 억제 농도를 초과하지 않는 양으로 존재하는 상기 아미노산 또는 아미노산을 생물학적으로 생성할 수 있는 화합물은 L-아르기닌, L-시스테인, L-글루타민, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린을 포함한다.In one embodiment, the cell culture medium is a nutrient supplement tested to determine whether the nutrient is selected from the group consisting of amino acids and vitamins in a bioavailable form or is present in a limited or inhibited amount in the nutritional supplement. Is supplemented with. In this case, the vitamin is selected from the group consisting of biotin, folic acid or folic acid, nicotinamide or nicotinic acid, riboflavin, thiamine, vitamin B 6 and vitamin B 12 , and compounds capable of producing them intracellularly in biologically available forms. Become; Wherein, as a group, compounds capable of biologically producing said amino acids or amino acids, each present in an amount not exceeding an inhibitory concentration, include L-arginine, L-cysteine, L-glutamine, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L-methionine, L-phenylalanine, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, and L-valine.
일반적으로, 본 발명의 세포 배양 배지는 산화방지제 기능을 정확하게 생화학적으로 분석하도록 하는 농도의 쿠멘 하이드로퍼옥사이드를 함유한다. 바람직하게는, 세포 배양 배지중의 쿠멘 하이드로퍼옥사이드의 농도는 약 50 내지 약 500μM이다.In general, the cell culture medium of the present invention contains a concentration of cumene hydroperoxide that allows for accurate biochemical analysis of antioxidant function. Preferably, the concentration of cumene hydroperoxide in the cell culture medium is about 50 to about 500 μΜ.
또다른 양태에서, 본 발명의 세포 배양 배지는 대략적으로 최대 반응을 도출시키는 농도의 피루베이트, 아데닌 및 이노시톨 또는 세포내에서 이들을 생성할 수 있는 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 자극성 영양소 하나 이상으로 보충된다. 일반적으로, 아미노산 보충물의 각각의 아미노산은 시험하는 아미노산을 제외하고는 세포의 최대 반응에 대해 유효한 대략적인 최소 농도로 존재한다. 또한, 배지에 세린 및 글리신 중의 하나 또는 둘 모두 없는 경우에는, 비타민 B6및 이용 가능한 형태의 폴산 중의 하나 또는 둘 모두의 세포 반응에 대한 유효 농도를 상기 배지에 포함시킨다. 또다른 양태에서, 배지에 판토텐산 및 콜린산 중의 하나가 없는 경우, 배지중에서의 세포 배양은 배양 배지에 없는 반응 제한량의 판토텐산 및 콜린을 보충시킬 경우 영양 결핍 및 비정상적 필요량을 측정하는데 효과적이다.In another embodiment, the cell culture medium of the invention is supplemented with at least one irritant nutrient selected from the group consisting of pyruvate, adenine and inositol or compounds capable of producing them in cells at approximately concentrations that elicit maximum responses. In general, each amino acid of the amino acid supplement is present at an approximate minimum concentration effective for the maximum response of the cell, except for the amino acid under test. In addition, when one or both of serine and glycine are not in the medium, an effective concentration for the cellular response of one or both of vitamin B 6 and folic acid in the available form is included in the medium. In another embodiment, where the medium is free of one of pantothenic acid and choline acid, cell culture in the medium is effective to determine nutritional deficiency and abnormal requirements when supplementing the reaction limiting amounts of pantothenic acid and choline that are not in the culture medium.
본 발명은 또한, 시험하는 영양소의 농도를 제한한, 본 발명의 세포 배양 배지에 개체로부터의 임파구를 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 상기 임파구의 반응을 개체들의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 개체에 필요한 특정 영양소에 대한 비정상적 영양 필요량의 측정방법에 관한 것이다.The invention also comprises inoculating lymphocytes from an individual into a cell culture medium of the invention, which limits the concentration of nutrients to be tested; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing the response of the lymphocytes with the average response of lymphocytes from a control group of individuals.
본 발명은 또한, 영양소, 생화학적 중간체 또는 생성물 또는 세포 반응에 유해한 영향을 미치는 농도의 약제을 포함하는 기타 혈액 성분중의 하나 이상을 포함하는 본 발명의 세포 배양 배지에 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 영양소, 생화학적 중간체 또는 이의 생성물 또는 시험하는 약제를 포함하는 기타 혈액 성분의 유해 작용에 영향을 미치는 것으로 추측되는 물질의 원료가 보충된 동일한 배지에서의 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 영양소, 생화학적 중간체 또는 이들의 생성물 및 약제를 포함하는 기타 혈액 성분의 유해 작용에 민감한 개체에서 상기 유해 작용을 극복하는 영양 인자소 또는 생화학적 중간체를 확인하는 방법에 관한 것이다.The invention also comprises inoculating a cell culture medium of the invention comprising one or more of nutrients, biochemical intermediates or other blood components, including products or concentrations of medicaments that have a deleterious effect on the cellular response; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing with a reaction in the same medium supplemented with a raw material of a substance suspected of affecting the deleterious effects of nutrients, biochemical intermediates or products thereof or other blood components including the agent under test. The present invention relates to a method for identifying a nutrient factor or biochemical intermediate that overcomes the adverse effects in an individual sensitive to the harmful effects of biochemical intermediates or other products and their blood components, including drugs.
본 발명은 청구의 범위 제1항의 세포 배양 배지에 개체로부터의 임파구를 접종시키는 단계; 접종시킨 세포 배양 배지를 배양시키는 단계; 및 당해 임파구의 반응을 개체들의 대조 그룹으로부터의 임파구의 평균 반응과 비교하는 단계를 포함하여, 개체내의 세포의 산화방지제 기능을 생화학적으로 분석하는 방법을 제공한다. 이러한 양태의 다양한 측면을 하기에 상세히 기술한다.The present invention comprises inoculating lymphocytes from an individual into the cell culture medium of claim 1; Culturing the inoculated cell culture medium; And comparing the response of the lymphocytes to the average response of lymphocytes from a control group of individuals, thereby providing a method for biochemical analysis of the antioxidant function of cells in the individual. Various aspects of this embodiment are described in detail below.
다음 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위하여 제공되었으며, 어떤 방식으로든 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.The following examples are provided to illustrate various aspects of the invention and are not intended to limit the invention in any way.
실시예 1Example 1
환자의 혈액 채취Patient blood collection
산-시트레이트-덱스트로스로 보존한 10㎖ 전혈 표본 2개가 본 발명의 방법에 필요하다. 금식시킬 필요는 없다. 필요한 모든것은 혈액 채취 공급이다. 이어서 본 발명의 검정법을 수행할 수 있거나 환자의 혈액을 실온에서 적합한 실험실에 보관하여야 한다. 혈액을 원심분리시킬 필요는 없다. 포괄적인 시험 결과는 환자의 결핍의 적합하고, 과학적 방법에 근거한 분석을 제공한다.Two 10 ml whole blood samples preserved with acid-citrate-dextrose are required for the method of the present invention. There is no need to fast. All that is needed is a blood sampling supply. The assay of the present invention may then be performed or the patient's blood should be stored in a suitable laboratory at room temperature. There is no need to centrifuge blood. Comprehensive test results provide an analysis based on appropriate, scientific methods of patient deficiency.
실시예 2Example 2
샘플 가공: 세포 분리Sample Processing: Cell Separation
모든 공정은 샘플 멸균성을 보장하는 층류 후드(laminar flow hood) 하에서 멸균 기술을 이용하여 수행한다. 각 환자의 혈액 샘플은 실험실에서 수용시 수납 번호를 부여한다. 이 수납 번호를 샘플 번호로 이용하여 가공, 데이타 수집 및 데이타 분석 단계를 통하여 순환시킬 수 있다. 환자 샘플을 가공하는데 관련되는 모든 시험관, 원심분리관, 미세역가판 및 데이타 출력정보(printout)는 상기 샘플 (수납) 번호로 라벨링(labelling)한다.All processes are performed using sterilization techniques under a laminar flow hood to ensure sample sterilization. Each patient's blood sample is given a receipt number upon receipt in the laboratory. This acceptance number can be used as a sample number to cycle through the processing, data collection and data analysis steps. All test tubes, centrifuge tubes, microtiter plates and data printouts involved in processing patient samples are labeled with the sample (receipt) number.
각 환자의 샘플은 각각 전혈 8㎖를 함유하는, 2개의 산-시트레이트-덱스트로스(황색 상부) 베큐테이너형 관으로 이루어져 있다. 수납(샘플) 번호를 부여한 후, 전혈을 6회 전위시켜 혼합한다. 전혈이 들어있는 2개의 시험관을 50㎖ 1회용 원심분리관 속에 합한다.The sample of each patient consisted of two acid-citrate-dextrose (yellow top) bacutainer tubes, each containing 8 ml of whole blood. After the storage (sample) number is assigned, the whole blood is displaced six times and mixed. Two test tubes containing whole blood are combined in a 50 ml disposable centrifuge tube.
500㎕ 분취량을 각 샘플로부터 무균적으로 이동시켜 12x17㎜ 관에 넣는다. 상기 분취량을 사용하여 코울터 셀 카운터(Coulter Cell Counter), 모델 T540에서 전혈 세포수를 계수한다. 코울터로부터의 전혈 세포수 출력정보는 수납 번호로 라벨링하여 환자에 대한 작업계획표(worksheet)에 부착한다.500 μl aliquots are aseptically removed from each sample and placed in a 12 × 17 mm tube. The aliquots are used to count whole blood cells in the Coulter Cell Counter, model T540. Whole blood cell count output from the coulter is labeled with an accession number and attached to a worksheet for the patient.
15㎜ 원추형 원심분리관 각각에 히스토파크(Histopaque) 1077[피콜(Ficoll)/나트륨 디아트리조에이트, 시그마 케미칼스(Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri)] 5.0㎖를 가하여 각 샘플에 대해 2개의 피콜 구배관을 준비한다. 10㎖ 피펫과 전자 피펫 보조기를 사용하여, 전혈 8㎖를 천천히 각각의 피콜 구배관상에 층화시킨다. 피콜 구배관을 캡핑(capping)하여 2160 RPM에서 20분간 원심분리시킨다.5.0 ml of Histopaque 1077 (Ficoll / Sodium Ditrizoate, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) was added to each 15 mm conical centrifuge tube to give 2 samples for each sample. Prepare two picol gradients. Using a 10 ml pipette and an electronic pipette aid, 8 ml of whole blood is slowly layered onto each picol gradient. The picol gradient tube is capped and centrifuged at 2160 RPM for 20 minutes.
원심분리를 완료한 후, 구배관을 원심분리기로부터 조심스럽게 이동시켜 구배가 파괴되는 것을 피한다. 중간 피콜 층의 계면에서 발견되는 담황갈색 피막(임파구를 함유함)을 5㎖ 피펫을 사용하여 15㎖ 1회용 원심분리관으로 옮긴다. 담황갈색 피막을 인산염 완충 염수 - 0.72% 글루코스 용액(PBS-G)과 합하여 최종 용적이 12㎖가 되도록 한다. 관을 캡핑시키고 6회 전위시켜 담황갈색 피막과 PBS-G를 혼합한다.After completion of centrifugation, the gradient tube is carefully moved out of the centrifuge to avoid breaking the gradient. The pale yellow film (containing lymphocytes) found at the interface of the middle picol layer is transferred to a 15 ml disposable centrifuge tube using a 5 ml pipette. The pale yellow coat is combined with phosphate buffered saline-0.72% glucose solution (PBS-G) to a final volume of 12 ml. The tube is capped and displaced six times to mix the pale brown film and PBS-G.
담황갈색 피막과 PBS-G를 함유하는 관을 2160RPM에서 5분간 원심분리시킨다. 원심분리 후 상등액을 세포 펠릿으로부터 아스피레이팅(aspirating)시켜 경사시킨다. 세포 펠릿을 PBS-G 12㎖ 속에 재현탁시킨 다음 6회 전위시켜 세포 펠릿이 적절하게 분산되도록 한다. 이어서 샘플을 상기한 바와 같이 다시 원심분리시킨다.The tube containing the pale yellow film and PBS-G is centrifuged for 5 minutes at 2160 RPM. After centrifugation, the supernatant is aspirated from the cell pellet and decanted. The cell pellet is resuspended in 12 ml PBS-G and then inverted six times to allow the cell pellet to disperse properly. The sample is then centrifuged again as described above.
2차 원심분리 후, 상등액을 아스피레이팅시켜 경사시킨다. 세포 펠릿을 PBS-G 6.0㎖에 재현탁시킨다. 세포 펠릿을 파괴하여 전자 피펫 보조기에 부착된 5㎖ 피펫을 사용하여 PBS-G와 혼합한다. 균질한 세포 현탁액을 수득한 후, 상기 현탁액으로부터의 200㎕ 분취량을 12x75㎜ 관으로 옮긴다. 상기 분취량을 이용하여 코울터 셀 카운터 모델 T540을 사용하여 초기 세포 현탁액(ICS) 산출을 수행한다.After the second centrifugation, the supernatant is aspirated and decanted. The cell pellet is resuspended in 6.0 ml PBS-G. Break the cell pellet and mix with PBS-G using a 5 ml pipette attached to an electronic pipette aid. After obtaining a homogeneous cell suspension, 200 μl aliquots from the suspension are transferred to a 12 × 75 mm tube. The aliquots are used to perform initial cell suspension (ICS) calculations using the Coulter cell counter model T540.
상기 분취량으로부터의 출력정보는 샘플 번호로 라벨링하여 작업계획표에 부착한다. 임파구 수가 입방밀리당 3900 내지 1200셀(THSD/㎣)인 경우 샘플은 평판(plate) 접종이 준비된 상태이다. 가하는 세포 현탁액의 용적은 표 3에 나타내었다. 임파구 수가 3.9THSD/㎣ 보다 큰 경우 샘플을 재희석시켜야 한다. 그러나, 임파구 수가 1.2THSD/㎣ 미만인 경우 샘플은 거부된다.The output information from the aliquots is labeled with a sample number and attached to the work schedule. When the lymphocyte count is 3900 to 1200 cells per cubic millimeter (THSD / mm 3), the sample is ready for plate inoculation. The volume of cell suspension to add is shown in Table 3. If the lymphocyte count is greater than 3.9 THSD / mm 3, the sample should be rediluted. However, if the lymphocyte count is less than 1.2 THSD / mm 3, the sample is rejected.
적합한 재희석에 필요한 PBS-G의 추가량은 수학식 1을 이용하여 결정한다:The amount of PBS-G needed for proper redilution is determined using Equation 1:
상기 수학식 1에서,In Equation 1,
C는 임파구 농도(THSD/㎣)이고,C is lymphocyte concentration (THSD / dL),
V는 용적이다.V is the volume.
C2= 3.0THSD/㎣ 인 경우, 이는 최종 세포 현탁액의 바람직한 임파구 농도이다. 예를 들면, 초기 세포 현탁액 양이 6.0㎖(LY#는 5.6 THSD/㎣)인 경우,If C 2 = 3.0 THSD / dL, this is the preferred lymphocyte concentration of the final cell suspension. For example, if the initial cell suspension amount is 6.0 ml (LY # is 5.6 THSD / dL),
C1,V1= C2V2 C 1 , V 1 = C 2 V 2
(5.6)(6.0 ㎖) = (3.0)(X)(5.6) (6.0 mL) = (3.0) (X)
최종 용적 X는 11.2㎖이다.The final volume X is 11.2 ml.
적합한 용적의 PBS-G를 재현탁된 세포에 가하여 최종 용적이 11.2㎖가 되도록 한다. 본 예에서는, 최종 용적 11.2㎖의 경우 원래 6.0㎖에 5.2㎖를 가해야 한다. 필요한 용적의 PBS-G를 (ICS)에 가하여 최종 세포 현탁액(FCS)을 제조한다. LY# 수 및 PBS-G 용적은 스펙트럭스 테스트 워크시트(Spectrox Test Worksheet)에 기록한다.Appropriate volume of PBS-G is added to the resuspended cells to a final volume of 11.2 ml. In this example, 5.2 ml should be added to the original 6.0 ml for a final volume of 11.2 ml. The required volume of PBS-G is added to (ICS) to prepare the final cell suspension (FCS). LY # number and PBS-G volume are recorded in the Spectrox Test Worksheet.
재희석한 후, 재희석시킨 세포 현탁액으로부터의 200㎕ 분취량을 새로운 12x75㎜ 관으로 옮겨 상기한 바와 같이 세포수를 산출한다. 재희석시킨 세포 현탁액 출력정보(최종 세포 현탁액 LY#)를 작업 계획표에 부착하고 접종 용적을 기록한다.After rediluting, 200 μl aliquots from the rediluted cell suspension are transferred to a new 12 × 75 mm tube to calculate cell number as described above. Re-diluted cell suspension output information (final cell suspension LY ′) is attached to the worksheet and the inoculation volume is recorded.
실시예 3Example 3
평판 접종Reputation inoculation
최종 세포 현탁액을 멸균 트로프 속에 놓는다. 층류 후드내에 배지를 함유하는 미세역가판을 놓는다. 멸균 0 내지 50㎕ 배리어 팁이 장착되어 있는 12개 채널 수동식 마이크로피펫터를 사용하여, 표시된 양(표 1에 따름)의 최종 세포 현탁액을 플레이트의 "H"열로 각 웰(well)에 분배한다.The final cell suspension is placed in a sterile trough. The microtiter plate containing the medium is placed in a laminar flow hood. Using a 12 channel manual micropipetter equipped with a sterile 0-50 μl barrier tip, the final cell suspension in the indicated amount (according to Table 1) is dispensed into each well in the “H” column of the plate.
다음 용적은 기술된 최종 세포 현탁액 임파구 수(LY#)를 기준으로 한 평판 접종에 사용하는 것이다.The next volume is for plate inoculation based on the final cell suspension lymphocyte count (LY 수) described.
배지에 세포를 가한 후, 쿠멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 용액을 다음 방법으로 "H"열에 가한다:After adding the cells to the medium, cumene hydroperoxide (CuOOH) solution is added to the "H" column in the following manner:
(1) 컬럼 1, 2, 3에 100μM CuOOH 10㎕를 공급;(1) feed 10 μl of 100 μM CuOOH to columns 1, 2, 3;
(2) 컬럼 4, 5, 6에 200μM CuOOH 10㎕를 공급;(2) feeding 10 μl of 200 μM CuOOH to columns 4, 5, 6;
(3) 컬럼 7, 8, 9에 300μM CuOOH 10㎕를 공급; 및(3) 10 μl of 300 μM CuOOH to column 7, 8, 9; And
(4) 컬럼 10, 11, 12에 400μM CuOOH 10㎕를 공급.(4) 10 µl of 400 µM CuOOH was supplied to columns 10, 11 and 12.
미세역가판에 CuOOH를 가한후, 상기 평판의 커버를 덮고 CO2배양기 속에 넣고 37 ℃에서 96시간 동안 유지시킨다.After adding CuOOH to the microtiter plate, the cover of the plate was covered and placed in a CO 2 incubator and maintained at 37 ° C. for 96 hours.
실시예 4Example 4
라벨링Labeling
모든 라벨링 공정은 방사성동위원소실(Radioisotope Room)에서 수행한다. 적정한 티미딘(H3-TdR) 작업 용액을 냉장고로부터 이동시켜 수욕중에서 37 ℃로 가온시킨다. 96시간 후, 미세역가판을 배양기로부터 제거한다. H3-TdR 작업 용액을 멸균 트로프에 놓고 0 내지 50㎕ 멸균 배리어 팁이 장착되어 있는 12개 채널 수동식 마이크로피펫터를 사용하여 H3-TdR 작업 용액 10㎕를 미세역가판의 "H"열로 각 웰에 분배한다. 평판을 37℃ 배양기로 회귀시켜 24시간 동안 유지시킨다. 날짜 및 라벨링을 수행하는 기술자의 성명의 이니셜을 샘플 로그 시트에 기록한다.All labeling processes are carried out in a Radioisotope Room. The appropriate thymidine (H 3 -TdR) working solution is removed from the refrigerator and warmed to 37 ° C. in a water bath. After 96 hours, the microtiter plate is removed from the incubator. H 3 -TdR working solution was placed in a sterile trough 0 to 50㎕ sterile barrier tips is H using from 12-channel manual micropipette attached 3 -TdR working solution 10㎕ the "H" column of the microtiter plates, each Dispense into wells. The plate is returned to the 37 ° C. incubator and maintained for 24 hours. Record the date and initials of the technician performing the labeling in the sample log sheet.
실시예 5Example 5
수집collection
모든 수집(harvesting) 공정은 방사성 동위원소실에서 수행한다. 단일 유리섬유 필터 매트(Packard Part No. 6005416)는 2번 연필을 사용하여 샘플 번호로 라벨링한다. 진공 펌프를 작동시키고 건조 오븐을 100 ℃로 설정한다. 수집기에 부착되어 있는 증류수 카보이(carboy)를 채운다. H3-TdR을 가한지 24시간 경과후 미세역가판을 배양기로부터 이동시킨다. 날짜와 수집을 수행한 기술자의 성명의 이니셜을 샘플 로그 시트에 기록한다.All harvesting processes are carried out in a radioisotope chamber. A single fiberglass filter mat (Packard Part No. 6005416) is labeled with a sample number using pencil # 2. Start the vacuum pump and set the drying oven to 100 ° C. Fill the distilled carboy attached to the collector. The microtiter plate is removed from the incubator 24 hours after H 3 -TdR is added. Record the date and initials of the technician who performed the collection in a sample log sheet.
개방된 위치에서, O-링 노출된 세포 수집기(Packard Model No. C9619)의 경우, 유리섬유 필터 매트를 거친면이 O-링과 접촉하도록 수집기상에 위치시킨다. 세포 수집기를 밀폐시키고 필터 매트를 세정 트레이로부터의 증류수로 습윤시킨다. 수집기를 진공 사이클(VAC)에 방치한다. 뚜껑을 미세역가판으로부터 제거하고 평판을 수집기 탐침 팁하에 놓는다. 탐침의 팁이 평판의 기저부와 접촉할때 까지 평판을 수집기 탐침상으로 천천히 올린다. 아스피레이팅시킨 배지의 경우, 미세역가판을 천천히 원형 운동으로 움직임으로써 웰의 기저부를 탐침 팁으로 스크러빙한다. 10초간 계속해서 스크러빙한다. 수집기 탐침 팁과 접하고 있는 미세역가판의 경우, 계속해서 스크러빙하고 "세척" 버튼을 10초간 누른다. 웰로부터 액체를 아스피레이팅시키고 상기 단계를 반복한다. 평판을 이동시키고, 세정 트레이를 메탄올로 충전시키고, 트레이를 들어올려, 메탄올을 아스피레이팅시키고 트레이를 하강시킨다.In the open position, for an O-ring exposed cell collector (Packard Model No. C9619), a fiberglass filter mat is placed on the collector so that the rough side contacts the O-ring. The cell collector is sealed and the filter mat is wetted with distilled water from the wash tray. The collector is left to vacuum cycle (VAC). The lid is removed from the microtiter plate and the plate is placed under the collector probe tip. Slowly raise the plate onto the collector probe until the tip of the probe contacts the base of the plate. For aspirated media, the microtiter plate is slowly scrubbed in a circular motion to scrub the base of the well with the probe tip. Continue scrubbing for 10 seconds. For microtiter plates in contact with the collector probe tip, continue scrubbing and press the "clean" button for 10 seconds. Aspirate the liquid from the wells and repeat the above steps. The plate is moved, the cleaning tray is filled with methanol, the tray is lifted up, the aspirating methanol is lowered and the tray is lowered.
상부에 부착되어 있는 필터 매트로, 수집기를 개방하고 계속해서 VAC 상에서 5초간 작업한다. 5초 후, VAC를 동시에 끄고 필터 매트를 수집기 표면으로부터 제거한다. 필터 매트를 건조 오븐의 거친 면을 위로 하여 10분간 위치시킨다. 필터 매트를 오븐으로부터 제거하고 실온으로 냉각시킨다.With the filter mat attached to the top, open the collector and continue to work on the VAC for 5 seconds. After 5 seconds, turn off the VAC simultaneously and remove the filter mat from the collector surface. Place the filter mat for 10 minutes with the rough side of the drying oven facing up. The filter mat is removed from the oven and cooled to room temperature.
실시예 6Example 6
방사능 측정Radioactivity measurement
모든 측정 공정은 방사성 동위원소실에서 수행한다. 필터 매트를 거친면을 위부로 하여 측정 카세트에 적재한다. 필터 매트상에 콜리메터(collimator; 필터 매트를 보유하는 스테인레스 스틸 박판)를 놓는다. 카세트를 패커드 매트릭스 9600 베타 입자 방사능 측정기(Packard Matrix 9600 Beta Particle Radioactivity Counter)에 부하한다. Q-가스(헬륨중 1.3% n-부탄)를 매트릭스 9600 속으로 유동시키기 시작한다. "시작" 버튼을 눌러 계수 프로토콜을 활성화시켜 각 웰중의 전체 방사능을 3분간 측정한다. 각 샘플의 계수를 매트릭스 9600의 하드 드라이브에 저장한다. 또한, 초기 방사성 계수의 하드 카피를 출력한다.All measurement processes are carried out in a radioisotope chamber. The filter mat is placed on the measuring cassette with the rough side facing up. Place a collimator (stainless steel sheet holding the filter mat) on the filter mat. The cassette is loaded into a Packard Matrix 9600 Beta Particle Radioactivity Counter. Q-gas (1.3% n-butane in helium) begins to flow into the matrix 9600. Press the "Start" button to activate the counting protocol and measure the total radioactivity in each well for 3 minutes. The coefficients of each sample are stored on the hard drive of the Matrix 9600. It also outputs a hard copy of the initial radioactivity coefficient.
실시예 7Example 7
데이타 전환Data conversion
데이타를 매트릭스 9600 하드 드라이브로부터 3.5 디스켓상으로 다운로드시킨다. 마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel)에서 수행된 매크로를 사용하여 초기 데이타를 보고형 포맷으로 전환시킨다. 상기 매크로를 각 데이타 포인트로부터의 플레이트 백그라운드로 서브트랙하여, 삼중 웰 수치에 대한 평균치를 얻고, 이 수치를 100%와 동등하게 설정한 평판 대조 수치의 %로 나타낸다.Download data from the Matrix 9600 hard drive onto a 3.5 diskette. Macros run in Microsoft Excel are used to convert the initial data into a reportable format. The macro is subtracked in the plate background from each data point to obtain an average value for triple well values, expressed as% of plate control value set equal to 100%.
실시예 8Example 8
데이타 분석(정규화)Data analysis (normalization)
본 발명의 방법은 전체 산화방지제 기능을 측정하는 것이다. 미토겐에 의해 성장하도록 자극된 임파구를 사용하여, CuOOH의 수개의 투여량을 사용한 임파구의 성장 반응과 사용하지 않은 임파구의 성장 반응을 측정하여 산화방지제 기능을 표시한다. CuOOH는 각 개체로부터의 임파구의 산화방지제 기능을 시험하기 위하여 사용되는 산화 응력이다. 초기 참고 범위는 정립되어 있다. 그러나, CuOOH가 본질적으로 불안정하기 때문에, 유통기한이 상대적으로 짧으며, 이의 활성이 시간이 경과함에 따라 쇠퇴한다. 그러므로, 처음 제조되었을때 상이한 강도를 주기적으로 사용하여야 한다. 각각의 배치(batch)는 유통기간내의 상이한 시점에서 습득되며 일일 공정을 원래의 참고 범위 수치로 맞추어야한다. 사용되는 CuOOH의 투여량 (100μM, 200μM, 300μM, 400μM)은 1993/1994의 CuOOH의 원래 로트 번호로 정립되어 있다.The method of the present invention is to measure overall antioxidant function. Using lymphocytes stimulated to grow by mitogen, the growth response of lymphocytes using several doses of CuOOH and the growth response of unused lymphocytes are measured to indicate antioxidant function. CuOOH is the oxidative stress used to test the antioxidant function of lymphocytes from each individual. Initial reference ranges have been established. However, since CuOOH is inherently unstable, the shelf life is relatively short, and its activity declines over time. Therefore, different strengths should be used periodically when first produced. Each batch is learned at different points in the shelf life and the daily process should be adjusted to the original reference range values. The dosage of CuOOH used (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM) was established with the original lot number of CuOOH of 1993/1994.
수치의 정규화는 샘플의 일일 배치에 대해 수행한다. CuOOH에 대한 4개점 투여량-반응 곡선을 각 시험에 대해 수행하여, 각각의 일일 배치에 대한 데이타를 원래의 참고 범위로 맞출 수 있으며, 새로운 수치를 사용하여 시험을 보고할 수 있다. 정규화는 각 날짜에 대한 각각의 CuOOH 투여량의 평균값, 중앙값, 범위 및 편차를 발견하여 수행한다. 원래의 참고 범위에 가장 근접한 수치(들)(대조 성장률의 50%)를 t-시험으로 통계학적으로 비교한다. 참고 범위와 가장 근접하게 매치되는 CuOOH 투여량을 시험 결과에 대해 사용한다. 또한, CuOOH 투여량간의 중간 수치(예: 200+300/2)를 사용할 수 있다. 정규화는 마이크로소프트 엑셀 스프레드시트 프로그램을 사용하여 수행한다.Normalization of numerical values is performed on daily batches of samples. Four-point dose-response curves for CuOOH can be performed for each test to bring the data for each daily batch back to the original reference range and report the test using the new values. Normalization is performed by finding the mean, median, range and deviation of each CuOOH dose for each day. The numerical value (s) closest to the original reference range (50% of the control growth rate) are statistically compared by t-test. The CuOOH dose that most closely matches the reference range is used for the test results. In addition, intermediate values (eg 200 + 300/2) between CuOOH doses may be used. Normalization is performed using a Microsoft Excel spreadsheet program.
실시예 9Example 9
개요summary
환자 샘플의 일일 배치에 대한 정규화를 수행한다. 통계학적 분석을 수행하여 엑셀의 설명 통계 기능(Descriptive Statistics function in Excel)을 사용하여 각각의 CuOOH 투여량의 평균값, 중간값, 범위, 및 편차를 측정한다. 참고 범위에 가장 가까운 투여량을 선택하여, 엑셀로 t-시험을 수행하여 CuOOH 투여량이 참고 범위와 상이한지 또는 동일한지를 측정한다. 1.0에 가장 가까운 투-테일 P 수치 (및 0.05 보다 더 큰 수치)를 보고용으로 사용한다. 결과를 출력하고, 배치에 대한 폴더와 함께 보관한다.Normalization of daily batches of patient samples is performed. Statistical analyzes are performed to determine the mean, median, range, and deviation of each CuOOH dose using the Descriptive Statistics function in Excel. By selecting the dose closest to the reference range, a t-test is performed with Excel to determine whether the CuOOH dose is different or equal to the reference range. The two-tailed P value closest to 1.0 (and greater than 0.05) is used for reporting. Output the results and keep them with the folder for the batch.
실시예 10Example 10
장치, 시약 및 용액Apparatus, Reagents and Solutions
본 발명의 검정에는 다음 장치가 사용된다: 층류 후드, 원심분리기, 벡크만 GS-6, 세포 계수기(Coulter Model T540), 12개 채널 피펫터(5 - 500㎕), 전자 피펫 펌프(Drummond), 캡이 있는 멸균 50㎖ 원추형 플라스틱 튜브, 12 x 75㎜ 폴리프로필렌 튜브, 캡이 있는 멸균 15㎖ 원추형 플라스틱 원심분리관, 피펫터(0-20, 0-200, 0-100㎕ 범위), 멸균 유리 1회용 피펫 - 5.0㎖, 10.0㎖, 시험관 랙 및 에어로졸 배리어 피펫 팁(0-50㎕). 표 2a 및 2b는 본 발명의 방법에서 사용되는 여러가지 시약 및 이들의 공급원을 나타내었다.The following apparatus is used in the assay of the present invention: laminar flow hood, centrifuge, Beckman GS-6, Cell Counter (Coulter Model T540), 12 channel pipette (5-500 μL), electronic pipette pump (Drummond), Sterile 50 ml conical plastic tube with cap, 12 x 75 mm polypropylene tube, sterile 15 ml conical plastic centrifuge tube with cap, pipettor (range 0-20, 0-200, 0-100 μl), sterile glass Disposable Pipettes-5.0 ml, 10.0 ml, test tube rack and aerosol barrier pipette tips (0-50 μl). Tables 2a and 2b show the various reagents and their sources used in the process of the invention.
실시예 11Example 11
용액solution
모든 용액은 조직 배양 등급 탈이온수(tcd H2O)를 사용하여 제조한다.All solutions are prepared using tissue culture grade deionized water (tcd H 2 O).
인산염 완충염수(PBS) + 0.72% 글루코스(PBS-G) 용액을 제조하기 위하여, tcd H20를 사용하여 패키지 지침에 따라서 PBS를 제조한다. 충분한 10% 글루코스 용액을 가하여 최종 글루코스 농도가 0.72%가 되도록 한다. 상기 용액을 여과하여 멸균시키고 냉장고에 (2-8 ℃에서) 보관한다.To prepare a phosphate buffered saline (PBS) + 0.72% glucose (PBS-G) solution, PBS is prepared according to the package instructions using tcd H 20 . Sufficient 10% glucose solution is added to bring the final glucose concentration to 0.72%. The solution is filtered and sterilized and stored in a refrigerator (at 2-8 ° C).
농축된 (2X) 스톡 배지를 제조하기 위하여, (2X) 스톡 배지 1ℓ는 다음 성분을 함유한다: (1) HEPES 23.80g; (2) 염화나트륨 14.02g; (3) 이염기성 인산칼륨 1.05g; (4) 황산마그네슘 0.241g; (5) 아데닌 하이드로클로라이드 1.0㎖(10μM); (6) 나트륨피루베이트 30.0㎖(100 mM); (7) 0.5% 페놀 레드 0.5㎖; (8) 항생제 혼합물 5.0㎖; (9) 5N 수산화나트륨 8.0㎖; (10) Fe/EDTA 20.0㎖(1.0mM FeSO4/0.4mM Na2EDTA). 모든 물질을 철저히 혼합한 후, 5N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.60으로 조정한다. tcd H20를 사용하여 1.0ℓ의 최종 용적으로 맞춘다. 상기 용액을 0.2μM 필터를 통하여 여과하여 멸균시키고 4 ℃에서 냉장고에 보관한다. 이런 상황하에서, 안정성은 약 4주이다.To prepare concentrated (2X) stock medium, 1 L of (2X) stock medium contained the following ingredients: (1) 23.80 g HEPES; (2) 14.02 g sodium chloride; (3) 1.05 g of dibasic potassium phosphate; (4) 0.241 g of magnesium sulfate; (5) 1.0 mL (10 μM) of adenine hydrochloride; (6) 30.0 mL sodium pyruvate (100 mM); (7) 0.5 ml of 0.5% phenol red; (8) 5.0 ml of antibiotic mixture; (9) 8.0 ml of 5N sodium hydroxide; (10) 20.0 mL Fe / EDTA (1.0 mM FeSO 4 /0.4 mM Na 2 EDTA). After thoroughly mixing all the materials, adjust the pH to 7.60 with 5N sodium hydroxide. Adjust to a final volume of 1.0 L using tcd H 20 . The solution is sterilized by filtration through a 0.2 μM filter and stored at 4 ° C. in the refrigerator. Under these circumstances, stability is about four weeks.
100% 평판 대조용으로 사용되는 기본 배지 및 본 발명의 신규한 방법은 다음과 같다. 여과후 멸균 기술을 사용하여야 한다. 기본 배지는 층류 후드하에서 제조한다. 모든 시약을 혼합하여 tcd H20를 사용하여 최종 목적하는 용적이 되도록 한다. 멸균병 속으로 진공 여과하여 용액을 멸균시킨다. PHA 스톡 용액의 적합한 용량을 가한다.The basal medium used for 100% plate control and the novel method of the present invention are as follows. After filtration sterilization techniques should be used. The basal medium is prepared under a laminar flow hood. All reagents are mixed to make the final desired volume using tcd H 20 . The solution is sterilized by vacuum filtration into sterile bottles. Appropriate dose of PHA stock solution is added.
실시예 12Example 12
쿠멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH) 스톡 용액Cumene Hydroperoxide (CuOOH) Stock Solution
쿠멘 하이드로퍼옥사이드(Sigma C 0524)는 제한된 유통기간을 갖는다. 재료의 유효 기간은 시그마로부터 입수한 날로부터 3개월이다. 병으로부터 CuOOH를 피펫팅할때, CuOOH의 증가된 점도를 알아야 한다. 피펫 팁 속으로 액체를 아스피레팅했음이 완결되었음을 확인하여야 한다. 이는 과도한 시간이 소요되며 피펫 팁이 적절히 채워졌는지 확인하여야 한다. 또한, 피펫 팁의 외부면상의 과량의 CuOOH를 제거하기위하여 팁을 닦아야 한다. 유사하게, CuOOH를 완전히 분배하여야 한다. 상기 공정에 이어서, 3개월간 바람직한 안정성을 갖도록 냉장 상태(2 내지 8℃)에서 상기 용액을 보관할 수 있다.Cumene hydroperoxide (Sigma C 0524) has a limited shelf life. The shelf life of the material is three months from the date of receipt from Sigma. When pipetting CuOOH from a bottle, one should know the increased viscosity of CuOOH. Confirmation of completion of aspirating liquid into the pipette tip. This will take excessive time and ensure that the pipette tip is properly filled. In addition, the tip should be cleaned to remove excess CuOOH on the outer surface of the pipette tip. Similarly, CuOOH must be fully distributed. Following the process, the solution can be stored in the refrigerated state (2-8 ° C.) to have the desired stability for 3 months.
제1 CuOOH 스톡 용액(PBS-G중 1.0M CuOOH)의 경우, 9.5㎕ 쿠멘 하이드로퍼옥사이드(CuOOH)를 990.5㎕ PBS-G와 혼합한다.For the first CuOOH stock solution (1.0 M CuOOH in PBS-G), 9.5 μl cumene hydroperoxide (CuOOH) is mixed with 990.5 μl PBS-G.
상기 공정에 이어서, 3개월간 바람직한 안정성을 갖도록 냉장 상태(2 내지 8℃)에서 상기 용액을 보관할 수 있다.Following the process, the solution can be stored in the refrigerated state (2-8 ° C.) to have the desired stability for 3 months.
제2 CuOOH 스톡 용액(PBS-G중 100mM)은 세포 분리전에 매일 제조하여야 한다. 밤새 보관하여서는 안된다. 제2 CuOOH 스톡 용액을 제조하기 위하여, 제1 스톡 용액 200㎕를 PBS-G 1800㎕와 혼합한다.Second CuOOH stock solution (100 mM in PBS-G) should be prepared daily before cell separation. It should not be stored overnight. To prepare a second CuOOH stock solution, 200 μl of the first stock solution is mixed with 1800 μl of PBS-G.
쿠멘 하이드로퍼옥사이드 작업 용액의 경우, 세포 분리 전에 매일 4개의 작업 용액을 제조한다. 상기 용액을 환자의 판을 부하하기 위한 CuOOH 전달판(별개의 미세역가판)에 가한다. 상기 용액은 밤새 보관하여서는 안된다. 4개의 작업 용액은 다음과 같다:For cumene hydroperoxide working solution, four working solutions are prepared daily prior to cell separation. The solution is added to a CuOOH transfer plate (separate microtiter plate) for loading the patient's plate. The solution should not be stored overnight. The four working solutions are as follows:
(1) 100μM CuOOH: 제2 CuOOH 스톡 110㎕를 PBS-G 4890㎕와 혼합한다;(1) 100 μM CuOOH: mix 110 μL of the second CuOOH stock with 4890 μL of PBS-G;
(2) 200μM CuOOH: 제2 CuOOH 스톡 220㎕를 PBS-G 4780㎕와 혼합한다;(2) 200 μM CuOOH: Mix 220 μL of the second CuOOH stock with 4780 μL of PBS-G;
(3) 300μM CuOOH: 제2 CuOOH 스톡 330㎕를 PBS-G 4670㎕와 혼합한다;(3) 300 μM CuOOH: 330 μL of the second CuOOH stock is mixed with 4670 μL of PBS-G;
(4) 400μM CuOOH: 제2 CuOOH 스톡 440㎕를 PBS-G 4560㎕와 혼합한다.(4) 400 μM CuOOH: 440 μl of the second CuOOH stock is mixed with 4560 μl of PBS-G.
실시예 13Example 13
티미딘(ThY) 스톡 용액Thymidine (ThY) Stock Solution
티미딘(ThY) 스톡 용액(냉): (1.33 mM ThY, 0.322 g/ℓ)는 다음과 같이 제조한다: ThY(시그마 T 9250) 0.161g을 칭량하여 tcd H2O에 최종 용적 500㎖로 용해시킨다. 무균 기술을 이용하여 상기 용액을 멸균병으로 진공여과하여 멸균시킨다. 상기 용액을 50㎖ 원심분리관으로 분량한다. 단기간의 보관의 경우, 상기 용액을 1개월간 안정적으로 냉장(4℃)할 수 있다. 장기간의 보관의 경우, 상기 용액을 6개월간 안정적으로 냉장(-70℃)할 수 있다. 티미딘 작업 용액을 사용하여 세포의 레벨링용 방사성 티미딘(H3TdR)을 희석하여야 한다.Thymidine (ThY) stock solution (cold): (1.33 mM ThY, 0.322 g / L) is prepared as follows: 0.161 g of ThY (Sigma T 9250) is weighed and dissolved in tcd H 2 O to a final volume of 500 ml. Let's do it. The solution is sterilized by vacuum filtration into sterile bottles using aseptic technique. Aliquot the solution into a 50 ml centrifuge tube. In the case of short-term storage, the solution can be stably refrigerated (4 ° C) for 1 month. In case of long term storage, the solution can be stably refrigerated (-70 ° C) for 6 months. Thymidine working solution should be used to dilute the radioactive thymidine (H 3 TdR) for leveling the cells.
티미딘 작업 용액(ThY + 3H-TdR)을 제조하기 위하여, 300㎖ 멸균 탈기 tcd H2O를 다음 성분에 가한다: 1.33mM ThY(Cold) 1.15㎖,3H-TdR(ICN Part No. 24066) 1.70㎖, 및 300μCi/mmol 특이 활성. 상기 공정에 이어서, 상기 용액을 1주간 바람직한 안정성으로 냉장 상태(4℃)에서 보관할 수 있다.To prepare thymidine working solution (ThY + 3H-TdR), 300 ml sterile degassing tcd H 2 O was added to the following components: 1.33 mM ThY (Cold) 1.15 ml, 3 H-TdR (ICN Part No. 24066). ) 1.70 mL, and 300 μCi / mmol specific activity. Following this process, the solution can be stored in the chilled state (4 ° C.) for 1 week with desirable stability.
본 명세서에서 언급된 특허 또는 공보는 본 발명에 관한 기술 분야의 숙련가의 기술 수준의 지표이다. 이들 특허 및 공보는 각각의 공보가 특별하게 개별적으로 참고문헌으로 인용된다고 표시되는 바와 동일한 정도로 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다.Patents or publications mentioned in the specification are indicative of the level of skill of those skilled in the art of the present invention. These patents and publications are hereby incorporated by reference to the same extent as if each publication is indicated to be specifically incorporated by reference.
당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 대상을 수행하고 언급된 목적과 이점 뿐만 아니라 고유의 것들을 수득하는데 채택될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다. 본 명세서에 기술된 방법, 공정, 처리, 분자, 및 특정 화합물과 함께 본 실시예는 일례로서, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다. 첨부되는 특허청구의 범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 의도내에서 당해 분야의 숙련가들은 변화시키고 달리 사용할 수 있다.Those skilled in the art will readily recognize that the present invention can be adapted to carry out the subject matter and obtain the inherent ones as well as the objects and advantages mentioned. This example, along with the methods, processes, treatments, molecules, and specific compounds described herein, is illustrative and does not limit the scope of the invention. Those skilled in the art can make changes and use differently within the intention of the present invention as defined by the scope of the appended claims.
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