KR20000011166A

KR20000011166A - 복합염료조성물을이용한폴리머겔상의ｄｎａ의검출방법및복합염료조성물

Info

Publication number: KR20000011166A
Application number: KR1019990001674A
Authority: KR
Inventors: 최중갑; 정다운; 유경수
Original assignee: 윤종여; 부광약품공업 주식회사
Priority date: 1998-07-20
Filing date: 1999-01-20
Publication date: 2000-02-25
Also published as: US6228655B1; WO2000005411A1; KR100337169B1

Abstract

본 발명은 폴리머 겔을 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법 및 복합염료 조성물에 관한 것으로서, 복합염료 조성물은 제누스 블루와 메틸 오렌지, 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지, 나일 블루와 메틸 오렌지, 또는 메틸렌 블루와 진콘을 함유하는 것이 될 수 있다.

Description

복합염료 조성물을 이용한 폴리머 겔상의 ＤＮＡ의 검출방법 및 복합염료 조성물{Detection method of DNA on polymer gels using counter-dye composition and counter-dye composition for the same}

본 발명은 상반된 전하를 띠는 2종의 염료를 함유하는 복합염료 조성물(counter-dye composition)을 이용한 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법 및 그를 위한 복합염료 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 폴리머 겔을 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하고 자외선 조사 없이 육안으로 직접 관찰함으로써, 신속하고 간단하며 안전하게 폴리머 겔상의 DNA를 고감도로 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

분자생물학을 비롯한 생명공학 분야의 급속한 발전과 더불어 이러한 연구의 수행을 뒷받침할 수 있는 제반 분석기술도 날로 발달하고 있다. 특히 폴리머 겔상의 DNA의 분리·정제 및 확인은 생명공학 분야의 필수 핵심기술로서 그 이용 및 중요성을 더해가고 있다. DNA의 분리 및 확인은 주로 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)과 같은 폴리머 겔상의 전기영동에 의해 이루어진다. 폴리머 겔은 다양한 형태와 크기로 제작이 가능하고 기공도(porosity)를 변화시킬 수 있기 때문에 그 응용범위가 넓다. 폴리아크릴아미드 겔은 1bp 차이까지도 구분해낼 만큼 분리능이 뛰어나지만 그 적용범위가 좁아 5∼500bp의 소단편(small fragment) DNA 분리에 적합하다. 또한 아가로스 겔은 200bp∼50kb의 DNA까지 적용범위가 넓어 많이 사용되고 있다.

폴리머 겔상에서 분리된 DNA 단편의 검출을 위해서는 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, 이하 EB라 약칭함)에 의한 DNA 염색방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다(문헌[Sharp, Ph. A., Sugden, B. and Sambrook, J., Detection of two restriction endonuclease activities inHaemophilus parainfluenzaeusing analytical agarose-ethidium bromide electrophoresis, Biochemistry 12(16), 3055-3063 (1973)]). EB는 하기 화학식 1과 같이 DNA의 나선구조 사이에 삽입(intercalation)될 수 있는 편평한(planar) 방향환(aromatic ring)을 갖는 구조를 가지며 DNA의 염기들 사이에 고정됨으로써 자외선 조사시 형광도가 증가된다.

DNA에 결합한 EB와 백그라운드의 EB 간의 형광도의 차이에 의해 DNA 밴드의 검출이 가능해지며 이들 사이의 형광도의 차이는 약 40배에 이른다. EB를 이용한 염색은 일반적으로 EB를 전기영동 완충액과 아가로스 겔에 0.5㎍/㎖이 되도록 가하고 전기영동이 끝난 후 투영기(transilluminator)상에 겔을 놓고 자외선을 조사하여 DNA 밴드를 검출하게 된다. 또한 전기영동 후 겔을 EB 용액(0.5㎍/㎖)에 침적시켜 염색시킨 후 물로 세척하고 투영기상에서 검출하는 방법이 사용되기도 한다(문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor University Press (1989)]).

상기 방법은 비교적 간단하고 감도가 높아(1∼10ng) 널리 사용되고 있지만 하기와 같은 심각한 문제점들을 갖고 있다. 즉 첫째, EB가 강력한 돌연변이원이므로 취급 및 폐기에 상당한 주의를 필요로 하고, 둘째, 단파장 영역(254∼310nm)의 자외선을 조사하여야 하므로 실험자 보호를 위한 차단장치가 필요하고, 셋째, UV광에 의해 오존과 같은 독성 물질이 배출되고, 넷째, 자외선 조사에 의해 DNA의 이합체화(dimerization), 닉킹(nicking), 블리칭(bleaching) 등 DNA의 손상이 일어날 수 있으며(문헌[Brunk, C. F., Simson, L. Analytical Biochemistry 82, 455-462 (1977)], 다섯째 기록을 남기기 위해서는 사진을 찍어야 하므로 촬영 장비가 필요하다는 점이다.

상기 EB 염색법의 문제점을 개선한 방법으로는 은 염색법(silver staining), 공촛점 레이저 주사 형광 영상 시스템(confocal laser scanning fluorescence imaging system)을 이용한 예비염색 DNA(prestained DNA) 검출법, 이미다졸 및 아연을 이용한 염색법 및 가시염료(visible dye)에 의한 염색법이 보고되어 있다.

은 염색법은 감도면에서 EB 염색법 보다 우수하며 자외선을 조사하지 않아도 되는 장점을 가지나, 그 절차가 매우 복잡하고 시약 구입비용이 많이 소요된다는 점에서 일반화에 제약을 받고 있다(문헌[Datar, R. H. and Bhisey, A. N. A sensitive method for permanent silver staining of DNA in agarose gels, Indian Journal of Biochemistry ＆ Biophysics 25, 373-375 (1988)], 문헌[Peats, S. Quantitation of protein and DNA in silver-stained agarose gels, Analytical Biochemistry 140, 178-182 (1984)], 문헌[Gottlieb, M. and Chavko, M. Silver staining of native and denatured eukaryotic DNA in agarose gels, Analytical Biochemistry 165, 33-37 (1987)] 및 문헌[Beidler, J. L., Hilliard, P. R. and Rill, R. L. Ultrasensitive staining of nucleic acids with silver, Analytical Biochemistry 126, 374-380 (1982)]).

공촛점 레이저 주사 형광 영상 시스템을 이용한 예비염색 DNA 검출법은 EB 호모다이머, 옥사졸 옐로우 호모다이머(oxazole yellow homodimer), 티아졸 오렌지 호모다이머(thiazole orange homodimer) 등으로 예비염색한 DNA를 전기영동한 후, 공촛점 레이저 주사 형광 영상 시스템으로 검출하는 방법이다(문헌[Ray, H. S, Quesada, M. A., Peck, K., Mathies, R. A. and Glazer, A. N., High-sensitivity two-color detection of double-stranded DNA with a confocal fluorescence gel scanner using ethidium homodimer and thiazole orange, Nucleic Acid Research 19(2), 327-333 (1991)]. 이 방법은 감도가 매우 높다는 장점을 가지나 사용이 복잡하고 값비싼 기기를 사용하여야 하는 문제점이 있다.

이미다졸 및 아연을 이용한 염색법은 Zn²⁺를 DNA에 결합시킨후 이미다졸을 가하여 백색의 불용성 침전을 생성시킴으로써 DNA를 검출할 수 있는 방법이다(문헌[Hardy, E., Sosa, A. E., Pupo, E., Casalvilla, R. and Fernandez-Patron, C., Zinc-imidazole positive: A new method for DNA detection after electrophoresis on agarose gels not interfering with DNA biological integrity, Electrophoresis 17, 26-29 (1996)], 문헌[Hardy, E., Pupo, E., Casalvilla, R., Sosa A. E., Trujillo, L. E., Lopez, E. and Castellanos-Serra, L., Negative staining with zinc-immidazole of gel electrophoresis-separated nucleoc acids, Electrophoresis 17, 1537-1541 (1996)]). 이 방법은 단백질 검출시 단백질 밴드를 제외한 겔 표면에 Zn²⁺-이미다졸 침전을 생성시키는 백그라운드(background) 염색법을 DNA 검출에 응용한 것으로서, EB와 같은 독성이 강한 물질이 아닌 시약들을 사용하고 그 감도 또한 EB 염색법에 비해 뒤떨어지지 않는다는 장점을 갖는다. 더욱이 자외선 조사를 필요로 하지 않으므로 DNA 손상을 비롯한 자외선 조사에 따른 여러가지 문제점들을 수반하지 않고, 가역 반응이므로 분취용(preparative)으로 적당하다. 그러나 이 방법 역시 상대적으로 복잡한 검출과정을 거쳐야 하며 영구적 보관이 불가능하고(증류수에 담근 채로 2달간 가능), DNA 밴드와 백그라운드의 대조가 시각적으로 명확하지 않다는 문제점이 있다.

가시염료에 의한 염색법은 브릴리언트 크레실 블루(Brilliant Cresyl Blue), 나일 블루(Nile Blue), 메틸렌 블루(Methylene Blue) 등 구조상 EB와 유사한 색소를 이용하여 자외선 조사 과정을 거치지 않고 염색 및 탈색과정만을 통해 DNA를 검출할 수 있는 방법이나, 염색 및 탈색에 장시간이 소요되며, 상대적으로 감도가 떨어진다(15∼40ng)는 문제점이 있다. 즉, 메틸렌 블루의 경우 탈색에 2시간∼수일이 소요되며, 브릴리언트 크레실 블루의 경우 25ng, 나일 블루의 경우 40ng, 메틸렌 블루의 경우 15∼20ng이 각각 검출한계이다(문헌[Santillan-Torres, J. L. and Ponce-Noyola, P., A novel stain for DNA in agarose gels, Trend genet 9(2), 40 (1993)], 문헌[Adkins, S. and Burmeister, M., Visualization of DNA in agarose gels as migrating colored bands: Applications for preparative gels and educational demonstrations, Analytical Biochemistry 240, 17-23 (1996)]).

그밖에도 바이오틴을 결합시킨 DNA를 블랏팅(blotting)과정 없이 직접 아가로스 겔상에서 검출하는 방법이 보고된 바 있으나(문헌[Sun Y., Detection of biotinylated nucleic acids directly on agarose gels, Biotechniques 16(5), 782-784 (1994)] 이것 역시 복잡한 과정을 거쳐야 한다.

한편, 제누스 블루(Janus Blue)는 DNA 나선구조에 삽입될 수 있는 편평한 방향환과 4급 아민 구조를 갖는 양이온성 염료이다. 문헌[Dutt MK, Microsc Acta, 1982, 85(4), pp361∼8]에서는, RNA를 냉인산으로 선별적으로 추출해낸 조직 단편에서 세포핵을 제누스 블루, 메틸렌 블루 및 제누스 레드를 함유하는 수용액으로 염색하는 방법을 개시한 바 있으나, 이것은 하기에서 상술하는 바와 같은 제누스 블루를 이용하여 폴리머 겔상의 DNA를 검출하는 본 발명의 방법과는 거리가 먼 것이다. 또한, 문헌[Steve Adkins et al., Analytical Biochemistry 240, 17-23, 1996]에서는, 표준 아가로스 겔에 여러가지의 상업적으로 입수가능한 가시염료(크리스탈 바이올렛(Crystal violet), 메틸 그린, 피로닌 Y, 티오닌, 베이직 블루 66, 베이직 레드 29, 제누스 블루, 사프라닌 O, 제누스 그린 B, 나일 블루, 피나시아놀, 스테인즈-올, 베이직 옐로우 11, 알시안 블루 8GX, 루테늄 레드 등)를 함유시켜 DNA 밴드가 분리되면서 자연광하에서 밴드를 관찰할 수 있는 방법을 개시하고 있다. 상기 문헌에 따르면, DNA 밴드는 겔로부터 약 50%의 수율로 수득되어 정제과정 없이 표준 효소 반응에 사용될 수 있으며, 특히 여러 염료중 나일 블루가 효과가 가장 우수한 것으로 보고하였다. 또한 40ng의 DNA까지 검출가능하며, 겔을 건조하면 4ng까지 검출감도를 향상시킬 수 있다고 보고하였다. 그러나, 본 발명과 염색방법상에서 상이하고, 검출감도면에서도 떨어지는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 폴리머 겔을 상반된 전하를 띠는 2종의 염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하고 자외선 조사 없이 육안으로 직접 관찰함으로써, 신속하고 간단하며 안전하게 폴리머 겔상의 DNA를 종래의 EB 염색법에 필적하는 고감도로 검출할 수 있는 방법과 그를 위한 복합염료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

도 1a는 pH 변화에 따른 제누스 블루의 DNA 염색강도를 나타내는 그래프;

도 1b는 제누스 블루:메틸 오렌지의 몰비에 따른 아가로스 겔상에서의 DNA 밴드의 강도를 나타내는 그래프;

도 1c는 제누스 블루-메틸 오렌지 복합염료에 의해 염색된 아가로스 겔상의 DNA 농도에 따른 DNA 밴드의 강도를 나타내는 그래프;

도 2a는 제누스 블루-메틸 오렌지 복합염료 염색법에 의한 폴리아크릴아미드 겔 염색시 메탄올 함량에 따른 DNA 밴드의 강도를 나타내는 그래프;

도 2b는 제누스 블루:메틸 오렌지의 몰비에 따른 폴리아크릴아미드 겔상에서의 DNA 밴드의 강도를 나타내는 그래프;

도 2c는 제누스 블루-메틸 오렌지 복합염료에 의해 염색된 폴리아크릴아미드 겔상의 DNA 농도에 따른 DNA 밴드의 강도를 나타내는 그래프;

도 3a 내지 3c는 아가로스 겔상에서 제누스 블루-메틸 오렌지(a) 및 크리스탈 바이올렛-메틸 오렌지(b) 복합염료 염색법 및 EB 염색법(c)에 의한 DNA 검출감도를 각각 나타내는 사진; 및

도 4a 내지 4c는 폴리아크릴아미드 겔상에서 제누스 블루-메틸 오렌지(a) 및 크리스탈 바이올렛-메틸 오렌지(b) 복합염료 염색법 및 EB 염색법(c)에 의한 DNA 검출감도를 각각 나타내는 사진.

본 발명은 첫째, 폴리머 겔을 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법에서, 복합염료 조성물은 제누스 블루와 메틸 오렌지(Methyl Orange), 크리스탈 바이올렛(Crystal Violet)과 메틸 오렌지, 나일 블루와 메틸 오렌지, 또는 메틸렌 블루와 진콘(Zincon)을 함유하는 것이 바람직하며, 제누스 블루와 메틸 오렌지, 또는 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지를 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 본 복합염료 조성물에서, 양이온성 염료와 음이온성 염료의 농도는 각각 0.001∼0.1w/v%인 것이 바람직하다. 또한, 폴리머 겔이 아가로스 겔인 경우, 복합염료 조성물로 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:0.4∼0.8의 몰비로 함유하는 것으로서, pH 4.7의 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액을 추가로 함유하는 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 폴리머 겔이 폴리아크릴아미드 겔인 경우, 복합염료 조성물로 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:1∼1.5의 몰비로 함유하는 것으로서, 40v/v% 메탄올 수용액을 추가로 함유하는 것을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 둘째, 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 조성물은 제누스 블루와 메틸 오렌지, 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지, 나일 블루와 메틸 오렌지, 또는 메틸렌 블루와 진콘을 함유하는 것이 바람직하며, 제누스 블루와 메틸 오렌지, 또는 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지를 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 본 조성물에서, 양이온성 염료와 음이온성 염료의 농도는 각각 0.001∼0.1w/v%인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 폴리머 겔이 아가로스 겔인 경우, 복합염료 조성물은 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:0.4∼0.8의 몰비로 함유하는 것으로서, pH 4.7의 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액을 추가로 함유하는 것이 더욱 바람직하며, 폴리머 겔이 폴리아크릴아미드 겔인 경우, 복합염료 조성물은 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:1∼1.5의 몰비로 함유하는 것으로서, 40v/v% 메탄올 수용액을 추가로 함유하는 것이 더욱 바람직하다.

이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 하기와 같다.

본 발명자들은 EB 자체 독성 및 돌연변이원성 뿐만 아니라 DNA 시료 및 인체에 유해한 자외선 조사과정을 필요로 하는 EB 염색법을 대체하면서, 신속하고 간단하면서도 EB 염색법에 필적하는 감도를 갖는 DNA 검출법을 개발하고자, 종래의 가시염료 염색법을 개량하는 연구를 거듭한 결과, 상반된 전하를 띠는 2종의 염료, 즉 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 복합염료 조성물을 사용함으로써 상기 목적을 달성할 수 있음을 발견해내고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 사용가능한 양이온성 염료는 제누스 블루(화학식 2), 크리스탈 바이올렛(화학식 3), 나일 블루(화학식 4) 또는 메틸렌 블루(화학식 5)이며, 음이온성 염료는 메틸 오렌지(화학식 6) 또는 진콘(화학식 7)이다.

본 발명에서는 양이온성 염료와 음이온성 염료를 적절히 짝지워 사용하는 것이 중요한 바, 제누스 블루와 메틸 오렌지의 복합염료, 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지의 복합염료, 나일 블루와 메틸 오렌지의 복합염료, 또는 메틸렌 블루와 진콘의 복합염료가 바람직하고, 제누스 블루와 메틸 오렌지의 복합염료 또는 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지의 복합염료가 더욱 바람직하며, 제누스 블루와 메틸 오렌지의 복합염료가 가장 바람직하다.

본 조성물은 양이온성 염료와 음이온성 염료가 이온쌍을 형성하여 침전하는 경향이 있으므로, 사용직전에 혼합하여 제조하는 것이 좋다. 본 조성물은 제조후 시간 경과에 따라 미세한 침전을 형성하는데, 과도한 침전 형성은 겔 백그라운드로의 염료 유입을 방해하여 좋지 못하나, 적절한 정도의 침전 형성은 겔 백그라운드에 대한 DNA 밴드의 강도를 상승시켜 DNA 검출감도를 상승시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 염료들의 대체가능한 염료를 하기 표 1에 나타내었다. 이들은 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것이다.

본 발명의 복합염료 염색법은 DNA 나선구조에 삽입될 수 있는 편평한 방향환을 가진 양이온성 염료를 주(主) 염료로 사용하고 음이온성 염료를 반대이온 효과를 갖는 보조 염료로 사용하는 것이다. 즉, 음이온성 염료는 양이온성 염료의 반대이온으로 작용하여 이온쌍을 형성함으로써, 양이온성 염료가 폴리머 겔에 염색되는 것을 방지하여 탈색과정을 단축시키며 DNA 밴드의 상대적인 강도를 증가시켜 검출감도를 향상시킨다. 즉, 염색에는 아가로스 겔의 경우 0.5∼1시간, 폴리아크릴아미드 겔의 경우 15∼30분 소요되며, 탈색은 알콜 수용액과 물에 침적시켜 실시하는데, 종래의 가시염료 염색법은 2시간∼수일에 걸치는 장시간의 탈색과정을 거쳐야 하는데 비하여, 약 10∼30분간의 탈색과정으로 충분하여 탈색시간을 단축시킬 수 있게 된다. 또한 독성 및 돌연변이원성이 강한 EB를 대체하고 자외선 조사 과정을 생략할 수 있어 실험자의 안전성도 보장할 수 있게 된다.

특히 제누스 블루와 메틸 오렌지를 함유하는 복합염료 조성물을 사용하면 감도 상승은 물론 염색전 전처리 조작이 거의 필요하지 않고 탈색공정이 신속하고 간편하여 가장 바람직한 바, 제누스 블루와 메틸 오렌지의 복합염료 조성물을 사용하는 경우에 대해 상술하면 다음과 같다.

제누스 블루의 DNA 염색효과는 용액의 pH 및 용매의 종류에 따라 차이를 보이는데, pH 4∼5에서 백그라운드에 대한 DNA의 강도가 높은 것으로 나타났다(도 1a; -○-; 9kb DNA, -●- ; 6kb DNA). 또한 낮은 pH에서는 DNA가 손상될 수 있으므로 특히 아가로스 겔을 pH 4.7에서 염색시킨다. 제누스 블루 단독으로 염색시킬 경우에는, 백그라운드의 강도가 높아 감도가 떨어지나 반대이온인 메틸 오렌지를 함께 사용하면 시간 경과에 따라 DNA 밴드의 강도는 높아지는 반면 백그라운드의 강도는 변함이 없어 검출감도는 상승한다.

제누스 블루에 대한 메틸 오렌지의 비율에 따른 DNA 밴드의 염색강도의 변화를 도 1b(아가로스 겔상에서의 DNA 밴드의 염색강도) 및 2b(폴리아크릴아미드 겔상에서의 DNA 밴드의 염색강도)에 나타내었다. 도 1b 및 도 2b로부터, 아가로스 겔상에서는 제누스 블루:메틸 오렌지의 몰비가 1:0.4∼0.8, 특히 1:0.4일 때, 폴리아크릴아미드 겔상에서는 제누스 블루:메틸 오렌지의 몰비가 1:1∼1.5, 특히 1:1.26일 때 밴드강도가 상승함을 알 수 있다.

본 발명에서는 염료입자의 크기가 중요하며 염료입자의 크기에 영향을 미치는 인자는 ⅰ) 염료의 농도와 혼합비율, ⅱ) 용매의 종류와 농도, ⅲ) 수소이온농도 등이다. 양이온성 염료와 음이온성 염료의 혼합비율은 염료의 특성에 따라 차이가 있으며 과도한 침전이 생성되지 않으면서 실험결과 백그라운드에 대한 밴드의 강도가 가장 높은 적정비율(표 2 참조)로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는, 아가로스 겔을 염색하는 경우에는, 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.7)을 용매로 하여 제누스 블루 0.007w/v%, 메틸 오렌지 0.00125w/v%(제누스 블루:메틸 오렌지=1:0.4의 몰비)를 함유하는 조성물로 30∼60분동안 진탕하며 염색시킨다. 또한, 폴리아크릴아미드 겔을 염색하는 경우에는, 염색전에 5분동안 증류수로 겔에 함유된 전기영동 완충액을 세척해낸 다음, 40v/v% 메탄올 수용액을 용매로 하여(도 2a 참조: 메탄올 함량에 따른 DNA 밴드의 강도를 나타냄) 제누스 블루 0.007w/v%, 메틸 오렌지 0.004w/v%(제누스 블루:메틸 오렌지=1:1.26의 몰비)를 함유하는 조성물로 15∼20분동안 진탕하며 염색시킨다. 상기 조건에서는 백그라운드겔로의 염료의 침투는 억제되고 DNA와의 결합은 방해되지 않아 DNA 밴드로의 염료 흡착이 효과적으로 일어날 수 있는 크기의 염료입자가 형성되기 때문이다. 도 1c와 도 2c에서는 제누스 블루-메틸 오렌지 복합염료에 의해 염색된 아가로스 겔과 폴리아크릴아미드 겔상에서 DNA 농도에 따른 염색된 DNA(9kb) 밴드의 강도를 나타내었는데, 이로부터 DNA 농도의 증가에 따라 DNA 밴드의 강도가 정량적으로 증가함을 알 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재하나, 이것은 본 발명의 구성 및 효과의 이해를 돕고자 하는 것이지 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1∼4] 복합염료 조성물을 이용한 아가로스 겔상의 DNA 검출

1g의 아가로스(시그마사, St. Louise, MO, U.S.A)를 0.5×TBE 완충액에 용해시켜 100㎖의 1% 아가로스를 제조하고 마이크로웨이브 오븐에서 용해시킨 다음 몰드에 붓고 굳혀 3mm 두께로 제조하였다. 45mM 트리스-보레이트 및 0.001M EDTA를 첨가하여 0.5×TBE 완충액을 제조하고 이것으로 전기영동 탱크(MUPID 21, Cosmo Bio Co., Ltd., 일본)를 채웠다. DNA 마커로 널리 사용되고 있는 λ DNA/Hind Ⅲ 분해물을 2단계씩 희석하여 DNA 시료 로딩 완충액에 혼합하여 10% 글리세롤, 0.05% 브로모페놀 블루를 함유하는 DNA 시료용액을 제조하였다. 각각 167, 83, 42, 21, 10, 5, 2.5ng의 λ DNA/Hind Ⅲ 분해물을 함유하는 시료용액을 1번 웰로부터 7번 웰까지 차례대로 첨가한 다음, 120V/30cm에서 1시간동안 전개시켜 전기영동을 실시하였다. 전기영동후 사용하는 복합염료의 종류에 따라 하기 표 2의 조건으로 염색하였다. 특히 제누스 블루와 메틸 오렌지를 사용하는 경우에는 0.007w/v%의 제누스 블루(Aldrich Chem., Co.; 염료함량; 70%, MW 506.01), 0.00125w/v%의 메틸 오렌지(Junsei Chem. Co., Ltd.; MW 327.34)를 함유하는 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액(pH 4.7)에 아가로스 겔을 담궈 약하게 흔들며 1시간동안 염색시켰다. 염색이 완료된 것을 확인한 후 건조시켰다. 이때 필요하면 알콜 함유 완충액으로 30분동안 세척하여 과량의 색소를 제거하고 염색된 DNA 밴드를 직접 육안으로 관찰하였다. 제누스 블루-메틸 오렌지 및 크리스탈 바이올렛-메틸 오렌지 복합염료를 사용하였을 때(실시예 1 및 2)의 결과를 도 3a 및 3b에 각각 나타내었다.

[실시예 5∼8] 복합염료 조성물을 이용한 폴리아크릴아미드 겔상의 DNA 검출

30% 아크릴아미드, 증류수, 5×TBE, 10% 암모늄퍼설페이트 및 TEMED를 혼합하여 몰드에 붓고 굳혀 폴리아크릴아미드 겔을 제조하였다. 1×TBE(98mM 트리스 보레이트, 2mM EDTA, pH 8.0) 완충액을 제조한 다음, 전기영동장치 저장소에서 상기 1×TBE 완충액을 채웠다. 폴리아크릴아미드 겔의 1번 웰로부터 각각 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5ng의 Φ X174 DNA/Hae Ⅲ 분해물 시료(시료 로딩 완충액 포함)를 로딩한 다음, 100V의 전압을 유지하면서 전기영동을 실시하였다.

전기영동후, 사용하는 복합염료의 종류에 따라 하기 표 3의 조건으로 염색하였다. 특히 제누스 블루와 메틸 오렌지 복합염료를 사용하는 경우 염색전에 전기영동 완충액을 제거하기 위하여 5분간 수세한 후, 0.007w/v%의 제누스 블루, 0.004w/v%의 메틸 오렌지를 함유하는 40v/v% 메탄올 수용액에 폴리아크릴아미드 겔을 담궈 약하게 흔들며 20분동안 염색시켰다. 염색이 완료된 것을 확인한 후, 필요시 40v/v% 메탄올과 증류수로 각각 10분간 세척하여 과량의 염료를 제거하고 건조하였다. 제누스 블루-메틸 오렌지 및 크리스탈 바이올렛-메틸 오렌지 복합염료를 사용하였을 때(실시예 4 및 5)의 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.

실시예 1∼8의 DNA 검출감도를 하기 표 4에 나타내었다.

[비교예 1]

실시예 1∼4와 실질적으로 동일하게 전기영동시킨 후, 아가로스 겔을 0.5㎍/㎖의 EB 수용액(시그마사)에 40분∼1시간동안 담근 후 증류수에서 5분간 세척하여 자외선(302nm) 투영기상에서 관찰하고 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 그 결과 를 도 3c에 나타내었다. 그 검출감도는 1∼10ng인 것으로 나타났다.

[비교예 2]

실시예 5∼8과 실질적으로 동일하게 전기영동시킨 후, 폴리아크릴아미드 겔을 0.5㎍/㎖의 EB 수용액(시그마사)에 30∼40분간 담근 후 증류수에서 5분간 세척하여 자외선(302nm) 투영기상에서 관찰하고 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 그 결과를 도 4c에 나타내었다.

따라서 본 발명의 복합염료 염색법을 사용하면, 독성 및 돌연변이원성이 강한 EB를 대체하고 자외선 조사과정을 생략할 수 있으며 염색 및 탈색에 소요되는 시간을 단축시키면서도 종래의 EB 염색법에 필적하는 감도로 폴리머 겔상의 DNA를 검출할 수 있으며, 건조후에도 해상도나 감도가 저하되지 않아 보관이 용이함을 알 수 있다.

본 발명에 따른 폴리머 겔상의 DNA 검출방법을 사용하면 독성 및 돌연변이원성이 강해 그 사용상 난점이 많고 폐기상의 번거로움이 뒤따르는 EB를 대체할 수 있고 자외선 조사과정을 생략할 수 있어 안전성이 뛰어나면서도 EB에 필적하는 감도로 DNA를 신속하고 간단하게 검출할 수 있다.

Claims

폴리머 겔을 양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 복합염료 조성물로 염색하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
제 1 항에 있어서, 복합염료 조성물은 제누스 블루와 메틸 오렌지, 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지, 나일 블루와 메틸 오렌지, 및 메틸렌 블루와 진콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염료를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
제 2 항에 있어서, 복합염료 조성물은 제누스 블루와 메틸 오렌지, 또는 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 염료와 음이온성 염료의 농도는 각각 0.001∼0.1w/v%인 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
제 3 항에 있어서, 폴리머 겔은 아가로스 겔이며, 복합염료 조성물은 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:0.4∼0.8의 몰비로 함유하는 것으로서, pH 4.7의 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
제 3 항에 있어서, 폴리머 겔은 폴리아크릴아미드 겔이며, 복합염료 조성물은 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:1∼1.5의 몰비로 함유하는 것으로서, 40v/v% 메탄올 수용액을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 폴리머 겔상의 DNA의 검출방법.
양이온성 염료와 음이온성 염료를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.
제 7 항에 있어서, 제누스 블루와 메틸 오렌지, 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지, 나일 블루와 메틸 오렌지, 및 메틸렌 블루와 진콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염료를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.
제 8 항에 있어서, 제누스 블루와 메틸 오렌지, 또는 크리스탈 바이올렛과 메틸 오렌지를 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.
제 7 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서, 제누스 블루와 크리스탈 바이올렛의 농도는 각각 0.001∼0.1w/v%인 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.
제 9 항에 있어서, 폴리머 겔은 아가로스 겔이며, 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:0.4∼0.8의 몰비로 함유하는 것으로서, pH 4.7의 10v/v% 에탄올-0.2M 소듐 아세테이트 완충액을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.
제 9 항에 있어서, 폴리머 겔은 폴리아크릴아미드 겔이며, 제누스 블루:메틸 오렌지를 1:1∼1.5의 몰비로 함유하는 것으로서, 40v/v% 메탄올 수용액을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는, 폴리머 겔상의 DNA 검출용 복합염료 조성물.