KR19990065395A - 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나비목해충중 배추나 케일등 채소류에 큰 피해를 입히는 배추좀나방에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 독소단백질 nr5 유전자는 기존의 Bt 독소단백질 유전자와 염기서열 및 아미노산서열이 다른 신규한 유전자이며, 이로부터 발현된 단백질은 배추좀나방에 대해서 살충활성을 가지고 있어 배추좀나방 및 다른 나비목 해충의 제어에 뛰어난 효과가 있다.

Description

바실러스 츄린겐시스 ｎｒ5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질

본 발명은 신규한 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis, 이하 Bt라 함) nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 나비목해충중 배추나 케일등 채소류에 큰 피해를 입히는 배추좀나방에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자 및 그로부터 발현된 재조합 단백질에 관한 것이다.

현재까지 인류의 식량증산에 크게 기여해 온 화학 합성 농약은 장기간의 사용과 남용으로 인해 환경오염, 생태계 파괴등 심각한 문제를 야기하고 있으며 매년 농약으로 인한 중독 사망자가 증가하는등 그 피해가 날로 늘어나고 있다. 뿐만 아니라 화학 합성 농약에 대한 저항성을 가진 병원균이나 곤충의 출현으로 인해 더 많은 양의 농약 사용이 불가피하게 되어 그 피해는 더욱 늘어날 전망이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여 무공해 내지 저공해 농약의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서, 미생물을 원체로 한 미생물 농약을 개발하여 사용하고 있는데 이중 인시목(Lepidopteran)이나 모기의 유충등 특정 해충에 대해 병원성이 높으며 공업수준의 배양이 용이한 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)를 원체로한 미생물 농약을 BT제라 하여 유용하게 사용해 오고 있다. Bt는 아포를 형성하는 그람 양성균으로 아포 형성과 함께 특정 곤충에 치사효과가 있는 내독소를 생성한다. 이 독소 단백질을 곤충의 중장내에 있는 단백질 분해 효소에 의해 활성화되어서 특정한 수용체에 결합하여 살충작용을 일으키므로 수용체를 가지고 있지 않은 사람이나 동식물 및 어류등에는 무해하여 자연 생태계에도 안전한 미래형 농약으로 알려져 있다. 현재까지 많은 종류의 Bt 균주가 흙, 죽은 곤충, 먼지, 식물등에서 분리되었으며(Appl. Environ. Microbiol. 57, 311-315) 분리된 균주로부터 많은 수의 독소단백질 유전자가 클로닝되어 알려지고 있는데 이들 독소단백질은 나비목, 파리목, 딱정벌레목등 다양한 곤충에 선택적 독성을 가지는 것으로 알려져 있으며 그들의 아미노산 서열의 상동성에 따라 Cry1에서 Cry18의 Cry 단백질과 Cyt으로 분류된다.

현재 경제적 측면에서 문제가 되는 주요 해충들은 대부분 나비목에 속해 있어 cry1 계열의 독소단백질 유전자에 대한 연구가 가장 많이 수행되었다. cry1 계열의 유전자들은 다시 아미노산 서열의 상동성에 따라 cry1A 에서 cry1K 까지 분류되고 있으며 이들은 다시 cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ad 및 cry1Ae등으로 세분화 된다. 이들 cry1A-cry1K 유전자들은 다양한 나비목해충에 대해 서로 다른 살충 특이성을 나타낸다. 그러나 지금까지 발견된 이러한 독소단백질로 제어할 수 없는 해충의 종류가 아직 많고, 또한 기존의 BT제에 저항성을 가진 해충이 출현하고 있으며 이를 극복하고자 현재에도 많은 연구자들이 새로운 독소단백질 유전자를 찾거나 살충스펙트럼이 넓은 재조합 균주의 개발을 시도하고 있다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로 배추좀나방등 나비목해충에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자와 그로부터 발현된 재조합 단백질을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니(morrisoni)로부터 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 통하여 새로운 유전자를 탐색하여, 이중 배추좀나방에 특이적으로 독성을 나타내는 새로운 유전자를 확인하고 이를 BT의 기존 유전자들과 염기서열을 비교분석하여 신규성을 조사하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 DNA 염기서열을 나타낸 그림이다.

도 2는 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 추정 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.

도 3은 본 발명의 nr5 유전자를 숙주인 대장균내에서 발현시키기 위한 재조합 플라스미드를 나타낸 사진이다.

도 4는 본 발명의 발현된 nr5 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 사진이다.

도 5는 본 발명의 발현된 nr5 단백질을 배추좀나방을 대상으로 살충성 검정을 실시한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 배추좀나방등 나비목해충에 특이적으로 살충성을 나타내는 신규한 유전자를 탐색하는 단계; 신규한 바실러스 츄린겐시스 nr5 유전자의 발현단계; 및 살충성을 검정하는 단계로 구성된다.

실시예 1. 독소 유전자의 탐색 및 클로닝

국내의 자연계로부터 분리된 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)균주로부터 DNA를 칼만등의 방법(Appl. Environ. Mirobiol. 59, 1131-1137, 1993)으로 분리하고, 이를 여러가지 제한효소로 절단한 후 cry1I 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션을 수행하였다.

이때 사용한 프로브는 DNA 단편이며, cry1I 유전자에 특이적으로 결합하는 이 프라이머를 사용하여 바실러스 츄린겐시스 HD1의 DNA로부터 연쇄효소 중합반응(polymerase chain reaction)으로 유전자의 일부를 증폭하고, 이를 다시 디그 DNA 라벨링 키트(DIG-DNA labeling Kit, 베링거 만하임 사)를 이용하여 라벨링한 후 사용하였다. 또한, 대조구로서 기존의 cry1Ia 유전자를 가지고 있는 BT HD1 균주와 cry1Ib 유전자를 가지고 있는 BT BP465(Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61: 2402-2407)로부터 분리한 DNA를 사용하였다. 이중 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로 동정된 분리균 BR30은 기존의 cry1Ia 유전자를 가진 BT HD1 및 cry1Ib 유전자를 가진 BT BP465와 비교하여 다른 크기의 시그날을 나타냈는데, 이는 BR30 균주에 cry1Ia와 상동성이 있는 유전자가 포함되어 있으며 이 유전자의 제한효소 지도가 기존의 cry1Ia 및 cry1Ib 유전자의 제한효소 지도와 다르다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 균주로부터 하기와 같은 방법으로 새로운 유전자를 클로닝하였다.

우선, BR30으로부터 분리된 DNA를 여러가지 제한효소로 절단한 다음 0.8% 아가로즈를 이용하여 DNA 전기영동한 후 나일론 멤브레인(베링거 만하임 사)으로 DNA를 부착시켜 디그 DNA 라벨링 키트(DIG-DNA labeling Kit, 베링거 만하임 사)를 이용하여 만들어진 위의 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션(suthern hybridization)을 수행하였다. 그 결과, 새로운 유전자는 EcoRI으로 절단된 4kb 정도의 DNA 단편 속에 5'말단이 포함되어 있으며 HindⅢ로 절단된 2.5kb 정도의 DNA 단편속에 3' 말단이 포함된다는 사실을 알 수 있었다.

둘째로, 상기와 같은 사실에 의거하여 BR30 DNA를 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하여 플라스미드 pGEM-7Zf(+)의 EcoRI 및 HindⅢ 위치에 각각 연결시킨 후 대장균에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균으로부터 원하는 유전자는 콜로니 하이브리다이제이션(Colony hybridization)(The DIG System User's Guide for Filter Hybridization, Boehringer Mannheim Biochemica, 40-43, 1993)을 통하여 탐색하였으며 이때 사용한 프로브는 상기의 서던 하이브리다이제이션에서 사용한 프로브와 동일한 것이다.

셋째로, 상기와 같은 방법에 의해 두 DNA 단편으로 나뉘어 클로닝된 유전자는 SepI 위치를 이용하여 N 말단과 C 말단을 연결하여 플라스미드 pGNR5를 완성하였다(data not shown). 이 새로운 유전자를 포함한 DNA 단편을 이래이즈 어 베이스 시스템(Erase-a Base System, 프로메가 사)을 이용하여 순차적으로 절단하고 생거의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463, 1977)을 사용하여 염기서열을 밝혔다. 그 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 nr5 유전자는 719개의 아미노산을 코딩하고 있으며 단백질의 분자량이 81.4KD로 추정된다. 이 유전자의 시작 코오돈의 7bp 앞에는 전형적인 리보좀 결합0부위가 존재하며 대부분의 cry 유전자에서 발견되는 5개의 블록이 잘 보존되어 있다. 이 새로운 유전자를 기존의 다른 cry1I 유전자의 아미노산 서열과 비교 분석해 본 결과 cry1Ia 및 cry1Ib와 각각 89.6%와 87.1%의 상동성을 보였다.

실시예 2. nr5 유전자의 발현

대장균에서 nr5 유전자를 발현시키기 위하여 본 발명자들은 강력한 프로모타인 tac 프로모타 뒤에 nr5 유전자를 삽입하였다. 대장균에서는 리보좀 결합부위와 해독개시 코오돈 사이의 거리가 유전자의 발현에 매우 중요하므로 이 거리를 맞추기 위해 먼저 두가지 프라이머, nr5a (5'-TCCCCCGGGATGAAAGAATCAAAA-3')와 nr5b (5'-CCTTTHGGGCCAAAGCTCACC-3')를 이용하여 nr5 유전자의 N말단을 증폭하였다. 이때 프라이머 nr5a는 SmaI 제한효소 인지 부위를 갖도록 설계하였다. 증폭된 DNA 단편은 플라스미드 pGNR5상의 nr5 유전자의 N 말단과 대체시킨후 전체 nr5 유전자를 플라스미드 pKK223-3(파마시아 사)의 SmaI과 PstI 부위에 삽입시켜 플라스미드 pKNR5S를 완성하였는데 그 결과는 도 3에 나타내었다.

또한, 플라스미드 pKNR5S를 함유한 대장균의 전체 단백질을 단백질 전기영동으로 확인한 결과 도 4에서 보는 바와 같이 약 81kD 정도의 독소 단백질 밴드를 확인하였는데 이는 nr5 유전자가 대장균 내에서 높은 수준으로 발현이 되었음을 나타낸다. 플라스미드 pKNR5S가 도입된 형질전환된 대장균을 한국과학기술원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1997년 11월 26일자로 기탁번호 KCTC 8854P로 기탁하였다.

실시예 3. Nr5 독소 단백질의 살충성 검정

대장균에서 발현된 Nr5 독소단백질은 배추좀나방을 대상으로 살충성 검정을 실시하였는데 살충성 검정은 신 등의 방법(Appl. Environ. Microbiol. 61, 2402-2407, 1995)에 따라 수행하고 배추잎을 먹이로 사용하였다. 실험결과, 도 5에서 보는 바와 같이 대장균에서 발현된 Nr5 독소단백질은 배추좀나방에 대해 살충성이 있음을 확인할 수 있었다.

이상 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 독소단백질 nr5 유전자는 기존의 Bt 독소단백질 유전자와 염기서열 및 아미노산서열이 상이한 신규한 유전자이며, 이로부터 발현된 단백질은 배추좀나방에 대해서 살충활성을 가지고 있어 배추좀나방 및 다른 나비목해충의 제어에 뛰어난 효과가 있어 생물농약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (10)

1. 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 하기 염기서열을 갖는 독소단백질 nr5 유전자.
2. 제 1항에 있어서, 상기 유전자의 염기서열중 염기 501에서 2660까지로 이어진 코딩부위를 가지는 것을 특징으로 하는 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 nr5 유전자.
3. 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 하기 아미노산 서열을 갖는 nr5 유전자.
4. 바실러스 츄린겐시스 아종 모리소니로부터 분리한 nr5 유전자에 의해 발현되는 나비목 독성 재조합 단백질.
5. 제 4항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 배추좀나방에 대해서 살충성을 가짐을 특징으로 하는 나비목독성 단백질.
6. nr5 유전자를 플라스미드 pKK223-3의 SmaI과 PstI 부위에 삽입시켜서 되는 플라스미드 pKNR5S.
7. nr5 유전자를 가지는 재조합 플라스미드로 형질전환시켜서 되는 E. coli 균주(KCTC 8854P).
8. 농업적으로 이용가능한 수용체와 대장균의 순수배양물 또는 이 대장균에서 생성되는 나비목독성 단백질로 구성됨을 특징으로 하는 살충제 조성물.
9. 나비목 독성 단백질의 살충효과량으로 나비목 곤충의 숙주식물에 살포함을 특징으로 하는 나비목 곤충의 조절방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 나비목 독성 단백질이 대장균내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 나비목곤충의 조절방법.