KR19990062375A - Compositions for Promoting Proliferation of Hematopoietic Stem Cells and Platelet Progenitor Cells Purified from Deer Antlers and Purification Methods Thereof - Google Patents
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Abstract
녹용(매화록)에서 조혈모세포 증식을 촉진하는 강력한 활성 성분이 있음을 확인하였고, 조혈모세포 성장 촉진 작용이 있는 활성 성분을 분리·정제하였다. 또한, 그 분리·정제된 활성성분 물질의 구조를 분석함과 아울러, 그 활성성분 물질을 합성하였다. 합성된 활성성분 물질은 조혈모세포 성장촉진 효과 뿐만아니라 혈소판 전구세포(megakaryocyte) 증식 효과도 나타냈다.It was confirmed that there is a strong active ingredient that promotes proliferation of hematopoietic stem cells in deer antler (plum), and the active ingredient having a hematopoietic stem cell growth promoting action was isolated and purified. In addition, the structure of the isolated and purified active ingredient was analyzed, and the active ingredient was synthesized. The synthesized active ingredient showed not only hematopoietic stem cell growth promoting effect but also platelet progenitor (megakaryocyte) proliferation effect.
조혈모세포 성장 촉진 작용의 효능을 검색하는 방법으로는 조혈모세포의 시험관내 콜로니 형성 효능을 측정하는 방법(조혈모세포를 채취하여 분리·정제된 물질에 노출시켜 시험관내에서 배양하여 조혈모세포 클론 형성도를 관찰)을 이용하였고, 녹용에서 활성 성분을 분리하는 방법으로는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 TLC 등을 이용하였다.As a method of detecting the effect of the hematopoietic stem cell growth promoting effect, a method of measuring the in vitro colony forming efficacy of hematopoietic stem cells is obtained. (The hematopoietic stem cells are collected and exposed to the separated and purified material. Observation), and silica gel column chromatography, TLC, and the like were used to separate the active ingredient from the antler.
Description
본 발명은 녹용(매화록)에서 조혈모세포 성장 촉진작용이 있는 활성 성분을 분리·정제하는 방법, 및 그 방법에 의하여 정제된 물질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 녹용의 성분 중에서 조혈모세포 및 혈소판 전구세포의 성장을 촉진시키는 물질에 관한 것이다.The present invention relates to a method for isolating and purifying an active ingredient having a hematopoietic stem cell growth promoting activity in antler (Plum), and a substance purified by the method. In particular, the present invention relates to a substance that promotes the growth of hematopoietic stem cells and platelet progenitor cells among the components of antler.
본래, 녹용은 사슴과(Cornu Cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로, 한방에서 인삼과 더불어 가장 널리 사용하고 있는 생약 중의 하나이다.Originally, the deer antler is dried by collecting unhorned shells of deer belonging to the family Cornu Cervi, and is one of the most widely used herbal medicines with ginseng in Chinese medicine.
녹용은 우리 나라를 비롯한 동북아시아 지역에서 수천년간 널리 이용되어 오고 있으며, 이중 우리 나라에서 사용되고 있는 녹용의 기원 동물로는 사슴과에 속하는 매화록 (Cervus nippon Temminick var. mantchuricus Swinhoe) 및 마록(Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Pavum) 등이 있다.Deer antler has been widely used for thousands of years in Korea and other Northeast Asian regions. Among them, the deer antler origin animal is Cervus nippon Temminick var. Mantchuricus Swinhoe and Cervus elaphus. L. Cornu Ceriv Pavum).
녹용은 강장작용, 생장·발육 촉진작용, 조혈작용, 신경쇠약 치료작용, 심부전증 치료작용, 오장육부의 기능항진 작용 등 다양한 효능이 있는 것으로 동의보감에 수록되어 있으며, 그외에도 자양보신, 신체활력 증강 및 심근운동 개선 등의 효과와, 피로회복, 신체저항력 증진, 건뇌안신 효과 등이 고대문헌에 기록되어 있다. 녹용의 효능에 관한 연구로서는 성장촉진 작용, 조혈작용, 혈청 콜레스테롤 저하 작용, 단백질 합성 촉진 작용, 항궤양 작용, 노화방지 효과, 진통작용, 항피로 효과, 면역활성 증강작용 및 진정작용 등이 있음이 보고되었다. 또한 동결건조하여 분말화한 녹용을 동물실험으로 동물에 투여했을 때, 강력한 진통작용, 고정 스트레스(immobilization stress)에 대한 항피로 효과, 미약한 면역활성 증강작용 및 진정작용을 보고하였다.Deer antler has various effects such as tonic action, growth and development promotion, hematopoietic action, neurodebilitating action, heart failure treatment action, and intestinal dysfunction of the five intestines. The effects of improving myocardial exercise, fatigue recovery, physical resistance enhancement, and pectoral angular effect have been recorded in ancient literature. Studies on the efficacy of antler include growth promoting action, hematopoietic action, serum cholesterol lowering action, protein synthesis promotion action, anti-ulcer effect, anti-aging effect, analgesic effect, anti-fatigue effect, immune activity enhancing effect and sedative effect. Reported. In addition, when lyophilized powdered antler was administered to animals in animal experiments, it reported strong analgesic effect, anti-fatigue effect against immobilization stress, weak immune activity enhancement effect and sedative effect.
녹용류의 성분에 관한 연구로는 유리 아미노산과 미량 원소의 조성 등이 밝혀졌고, 6탄당, 5탄당, 헥소사민, 우론산, 시알산, 산 무코다당류인 히알우론산과 황산 콘드로이틴 A, 지방산의 조성, 프로스탄글란딘류 등의 확인과, 당지질 및 인지질의 조성, 콜레스테롤, 히포크산틴, 콜레스트-5-엔-3β, 7α-디올, 콜레스테롤 에스테르, 폴리아민 등을 분리하여 보고한 바 있으며, 이밖에 에스트론, 에스트라디올 리셉터 등이 함유되어 있다고 알려져 있다.Studies on the components of the deer antler revealed the composition of free amino acids and trace elements, and the composition of hexasaccharide, pentose, hexamine, uronic acid, sialic acid, acid mucopolysaccharides, hyaluronic acid, chondroitin sulfate A, and fatty acids. , Prostaglandins and the like, the composition of glycolipids and phospholipids, cholesterol, hypoxanthine, cholester-5-ene-3β, 7α-diol, cholesterol esters, polyamines, etc. have been reported separately. Estrone and estradiol receptors are known to contain.
약재로서 녹용의 약효를 대략적으로 살펴보면 다음과 같다. 녹용은 성장 발육을 빠르게 하고, 조혈 기능을 자극하며, 혈구의 생산을 증가시키고, 골수세포의 증식을 촉진시키는 작용을 한다. 또한, 성선 기능에도 영향을 미쳐 에스트로겐 분비를 늘이며, 고환에서의 핵산대사를 왕성하게 한다. 심장 및 혈관 계통에서는 많은 양을 사용하면 모세 혈관이 확장되고 혈압이 내려가며 심장의 수축 진폭이 좁아지고 심장 박동이 느려지는 효과를 가져온다. 그러나, 녹용의 뛰어난 약효에도 불구하고 아직까지 그 약효를 나타내는 성분의 구조는 밝혀지지 않고 있다.As a medicinal herb medicinal roughly look as follows. Deer antler accelerates growth, stimulates hematopoietic function, increases blood cell production, and promotes proliferation of bone marrow cells. It also affects gonadotropin, increasing estrogen secretion and stimulating nucleic acid metabolism in the testes. In the heart and vascular system, a large amount can cause capillaries to expand, lower blood pressure, narrow the contraction amplitude of the heart, and slow the heart rate. However, despite the excellent efficacy of antler, the structure of the component showing the efficacy has not yet been found.
본 발명자는 상기와 같이 뛰어난 약효를 갖는 것으로 알려져 있는 녹용에서 조혈작용에 대한 효능을 갖는 성분을 찾고자 많은 연구를 하였다.The present inventors have done a lot of research to find a component having an effect on hematopoiesis in antler known to have excellent medicinal effects as described above.
현재 우리나라에서 제 1위의 사망 원인인 암질환은 매년 증가추세인 것으로 밝혀졌다. 항암치료 목적으로 사용되는 화학요법, 방사선 치료요법 등은 암세포 뿐만 아니라 일반 정상 골수세포, 특히, 면역·조혈기능을 조절하는 조혈세포(hematopoietic cell)도 아울러 손상시켜, 인체내의 조혈기관과 면역기능을 마비시키는 것이 심각한 문제점으로 지적되어 오고 있다. 이러한 심각한 골수세포의 손상으로 인하여 백혈구나 혈소판의 감소 결과 야기되는 면역기능의 마비는 곧 사망으로 이어지게 된다. 따라서, 조혈모세포원을 성장촉진시켜 저하된 면역기능 및 혈액세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사 후 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구 감소증, 선천성 면역 및 조혈모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로 인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등 임상 각 분야에 전반적으로 활용될 수 있는 신 물질 개발의 필요성이 절실히 요청되고 있는 실정이다.Currently, cancer disease, the number one cause of death in Korea, has been found to increase every year. Chemotherapy and radiation therapy used for chemotherapy damage not only cancer cells, but also normal normal bone marrow cells, especially hematopoietic cells that regulate immune and hematopoietic functions, thereby impairing hematopoietic organs and immune functions in the human body. Paralysis has been pointed out as a serious problem. This severe bone marrow cell damage leads to death of immune function paralysis resulting from reduced white blood cells or platelets. Therefore, malignant solid cancer, malignant blood disease, aplastic anemia, congenital intermittent disease, in which a condition requiring reduced immune function and blood cell function by promoting growth of hematopoietic stem cells, in particular, bone marrow function is reduced after anticancer drugs and irradiation There is an urgent need for the development of new substances that can be used in various clinical areas, including leukopenia, congenital immunity and hematopoietic cell deficiency, anemia caused by end stage renal failure, infection caused by leukocyte reduction, and myelosuppression due to aging population. It is requested.
면역기능 및 조혈기능의 증진을 위하여 조혈모세포에 대한 연구가 활발히 진행되고, 조혈모세포에 대한 지식이 급증함에 따라, 최근에는 조혈모세포 성장 촉진인자 중의 2-3 종류 (GM-CSF ; granulocyte macrophage-colony stimulating factor, G-CSF ; granulocyte-colony stimulating factor, Erythropoietin)는 상품화에 성공하였다. GM-CSF와 G-CSF는 과립구 및 거핵구는 물론 조혈모세포의 증식과 분화를 유도하고, 골수로부터 조혈모세포들이 말초혈액으로 이동하는 것(mobilization)을 촉진시킨다.As the research on hematopoietic stem cells has been actively conducted for the improvement of immune function and hematopoietic function, recently, 2-3 kinds of hematopoietic stem cell growth promoting factors (GM-CSF; granulocyte macrophage-colony) The stimulating factor, G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor, Erythropoietin) was successfully commercialized. GM-CSF and G-CSF induce proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells, as well as granulocytes and megakaryocytes, and promote mobilization of hematopoietic stem cells from bone marrow to peripheral blood.
상기와 같은 조혈모세포 성장 촉진인자를 발견하기 위해서, 본 발명자는 수천년간 동양에서 보혈강장제로 사용되어 온 녹용을 연구하였다. 그 결과, 본 발명자는 녹용의 성분 중에 조혈모세포의 성장을 촉진시키는 물질이 존재함을 관찰하였다. 지속적인 연구를 통하여 녹용에서 효능이 가장 높은 성분을 찾아내고 그 성분을 분리 정제하였다. 그리고, 그 성분의 구조를 밝혀냈다. 본 발명자의 연구로부터 활성성분들의 구조분석 후 합성가능한 물질을 타진하여 신약개발을 할 수 있을 것이다. 이러한 개발 신약은 많은 난치병, 혈액 및 면역질환 치료제로 사용될 수 있을 것이다. 또한 조혈모세포 촉진인자 개발은 혈액학, 종양학, 면역학, 감염학 및 신장학 등 임상 각 분야의 발전에 크게 기여할 수 있을 것이다.In order to find such hematopoietic stem cell growth promoters, the present inventors have studied the antler, which has been used as a tonic tonic for thousands of years. As a result, the present inventors observed that a substance which promotes the growth of hematopoietic stem cells is present in the component of antler. Through continuous research, the most potent ingredient was found in antler, and the component was isolated and purified. And the structure of the component was revealed. After the structural analysis of the active ingredients from the inventors' study, it will be possible to develop new drugs by synthesizing synthetic materials. This new drug could be used to treat many incurable diseases, blood and immune diseases. In addition, the development of hematopoietic stem cell promoters may greatly contribute to the development of clinical fields such as hematology, oncology, immunology, infectious science and nephrology.
최근 본 발명자가 연구할 때 까지 매화록 추출물의 여러 가지 생리활성작용 중에서 조혈계에 미치는 면역생물학적 작용을 체계적으로 규명하고 그 유효성분을 분리한 연구는 없었다.Until recently, the present inventors have systematically identified the immunobiological effects on the hematopoietic system among the various physiological activities of the plum extract and have not isolated the active ingredients.
따라서, 본 발명은 녹용에서 조혈모세포 촉진 인자를 찾아내고 그 구조를 밝히는 것을 발명의 목적으로 하고 있다. 이러한 조혈모세포 성장 촉진인자는, 조혈모세포원을 성장촉진시켜 저하된 면역기능 및 혈액세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사 후 골수기능이 저하된 상태에 있는 악성고형암, 악성혈액질환, 재생불량성빈혈, 선천성 간헐적 백혈구 감소증, 선천성 면역 및 조혈모세포 결여증, 말기 신부전증으로 인해 초래되는 빈혈, 백혈구 감소로 인한 감염, 인구 고령화로 인한 골수기능 저하증 등 임상 각 분야에 전반적으로 활용될 수 있을 것이다.Therefore, an object of the present invention is to find a hematopoietic stem cell promoter in antler and to reveal its structure. These hematopoietic stem cell growth promoting factors are diseases that require the growth of hematopoietic stem cell growth to promote immune function and the function of blood cells, in particular, malignant solid cancer, malignant blood disease, It can be used in various clinical fields such as aplastic anemia, congenital intermittent leukopenia, congenital immunity and hematopoietic cell deficiency, anemia caused by end stage renal failure, infection due to leukocyte reduction, and myelo function due to aging population. .
도1은 녹용(매화록)의 CHCl3추출액의 정제 성분의 고성능 TLC의 크로마토그램을 나타낸다.1 shows a chromatogram of high performance TLC of the purified component of CHCl 3 extract of Deer Antler (Plum).
도2는 CN-C-2-E-a-Mi의 포지티브(positive) FAB 매스 스펙트럼을 나타낸다.2 shows a positive FAB mass spectrum of CN-C-2-E-a-Mi.
도3은 CN-C-2-E-a-Mi의 네가티브(negative) FAB 매스 스펙트럼을 나타낸다.Figure 3 shows a negative FAB mass spectrum of CN-C-2-E-a-Mi.
도4는 도2의 m/z 577에서의 피크의 탠덤 매스 스펙트럼을 나타낸다.4 shows the tandem mass spectrum of the peak at m / z 577 of FIG.
도5는 본 발명의 최종 분리 물질인 C39H72O6의 구조 및 분자량을 나타낸다. 여기서 A는 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤의 구조를 나타내고, B는 1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-아세틸글리세롤의 구조를 나타낸다.5 shows the structure and molecular weight of C 39 H 72 O 6 , the final separation material of the present invention. Where A represents the structure of 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol, and B represents the structure of 1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol Indicates.
도6은 합성된 활성물질을 투여한 생쥐의 비장 사진을 나타낸다.Figure 6 shows a spleen picture of the mouse administered the synthesized active material.
도7 내지 도11은 합성된 활성물질을 투여한 생쥐 비장의 조직학적 구조변화를 나타내는 현미경 소견 사진이다.7 to 11 are microscopic findings showing the histological changes of the mouse spleens to which the synthesized active substance was administered.
조혈작용(Hematopoiesis)은 매우 특수한 기능과 한정된 수명을 가지고 있는 수많은 성숙 혈액세포들이 생성되어 계속적으로 공급되는 일련의 발생과정이다. 조혈계는 발생능력(developmental capacities)의 체계에 따라서 정렬될 수 있는 조혈 전구세포(hematopoietic precursor cell)들의 매우 복잡한 조직체계로 구성되어 있다. 모든 계통의 성숙 혈액세포들의 근원지는 골수인데, 이 조직은 여러 단계의 성숙 시기에 있는 세포들을 포함하고 있으며, 골수에서 생성된 혈액세포들은 일정시간 후에 말초조직에서 파괴되고, 이러한 과정은 동물의 일생을 통하여 계속적으로 일어나게 된다. 마우스의 조혈작용은 발생 초기 배(embryo)의 난황낭(Yolk sac)에서 7일부터 12일 사이에서 일어나고, 11일에서 21일 사이에는 간에서 가장 활발하나, 비장과 골수에서도 진행되며, 21일 이후부터는 골수에서 일어나게 된다. 조혈작용은 여러 가지 계통의 세포로 증식, 분화할 수 있는 조혈모세포군(hematopoietic stem cells : HSCs)에 의하여 유지되고 있다.Hematopoiesis is a series of developmental processes in which a large number of mature blood cells with very specific functions and a limited lifespan are produced and continuously supplied. The hematopoietic system consists of a very complex tissue system of hematopoietic precursor cells that can be aligned according to a system of developmental capacities. The source of mature blood cells of all lineages is the bone marrow, which contains cells at various stages of maturity, and the blood cells produced in the bone marrow are destroyed in peripheral tissues after some time, and this process is the life of the animal. It happens continuously through. Hematopoietic activity occurs in the embryonic yolk sac between 7 and 12 days and most active in the liver between 11 and 21 days, but also in the spleen and bone marrow. From the bone marrow. Hematopoietic action is maintained by hematopoietic stem cells (HSCs) that can proliferate and differentiate into cells of various lineages.
초기에 조혈모세포는 다능성 조혈모세포(Pluripotent Hematopoietic Stem Cells : PHSCs)라고 하는 데, 아직까지도 잘 밝혀져 있지 않은 여러 과정을 거쳐서 매우 다양한 성숙 혈액세포들로 분화할 수 있는 조혈전구세포들을 만들어 내게 되고, 이들 조혈전구세포들은 그 다음 단계의 더 분화된 세포들을 생산하게 된다.Initially, hematopoietic stem cells are called Pluripotent Hematopoietic Stem Cells (PHSCs), which go through a number of unknown processes to produce hematopoietic progenitor cells that can differentiate into a wide variety of mature blood cells. These hematopoietic progenitor cells produce the next, more differentiated cells.
HSCs(Hematopoietic Stem Cells)은 두가지 주요한 특징을 가지고 있다. 자신과 똑같은 세포를 만들어낼 수 있는 자기복제(Self-renewal) 능력과 성숙된 임파조혈세포의 모든 계통으로 분화할 수 있는 능력이다. 조혈모세포에 대한 연구는 동물에 준치사량(sublethal dose)의 방사선을 조사한 후 골수결핍으로 고통받는 동물에게 정상 골수세포를 주사함으로써, 이 결핍증이 회복될 수 있다는 것을 처음으로 알게 되었을 때부터 시작되었다. 이러한 전신 방사선 조사를 받은 마우스의 골수회복에 대한 최초의 정량적인 실험으로부터, 방사선 조사를 받은 동물의 비장과 골수에서 골수세포와 적혈구계통의 세포 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 갖는 조혈전구세포(multipotent hematopoietic stem cell)의 개념이 도입되었다. 자기복제 능력이 있는 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)에 의한 혈구세포들의 재구성과 조혈계통에 대한 발생생물학적 측면을 이해하기 위하여 순수한 조혈모세포(pluripotent hematopoietic stem cell)의 분리가 요구된다. 그러나 이 세포들은 매우 낮은 비율로서 존재하기 때문에 분리에 어려운 점이 많았으나, 플로우 시토메트리(flow cytometry)의 도입과 조혈모세포 표지항원 및 분화항원(diffentiation antigen)에 대한 단일클론항체의 개발로 HSCs(Hematopoietic Stem Cells)의 선별이 가능하며, 그들의 성질과 특징도 점차적으로 이해하게 되었다.Hematotopoietic Stem Cells (HSCs) have two main characteristics. It is the ability to produce self-renewal to produce the same cells as itself and to differentiate into all lines of mature lymphocytes. The study of hematopoietic stem cells began when the animal first discovered that the deficiency could be recovered by irradiating a sublethal dose of radiation and then injecting normal bone marrow cells into animals suffering from bone marrow deficiency. From the first quantitative experiments on bone marrow recovery of mice subjected to whole body radiation, hematopoietic progenitor cells (multipotent cells) with the ability to form bone marrow cells and erythroid cell colonies in the spleen and bone marrow of irradiated animals The concept of hematopoietic stem cell was introduced. In order to understand the reconstitution of hematopoietic cells by self-replicating hematopoietic stem cells and the developmental biological aspects of the hematopoietic system, isolation of pure hematopoietic stem cells is required. However, these cells were difficult to isolate because they exist at very low rates.However, the introduction of flow cytometry and the development of monoclonal antibodies against hematopoietic stem cell markers and differentiation antigens resulted in HSCs ( Hematopoietic Stem Cells) can be screened and their properties and characteristics gradually understood.
조혈작용에 대한 효능을 검색하는 대표적인 방법으로서는, 조혈모세포를 채취하여 검색물질에 노출시켜 시험관내에서 배양하여 조혈모세포 클론 형성도를 관찰하는 콜로니 형성 효능을 측정하는 방법과, 동물을 이용한 생체내 검색법으로서는 준치사량의 방사선 조사후 혹은 다량의 항암제를 투여하여 저하된 골수기능의 회복도를 측정하는 방법(비장에서의 콜로니 형성 유니트)이 있다. 녹용의 성분을 분리정제하는 방법으로는 용매 추출법, 실리카겔 크로마토그래피 등을 사용하며, 구조 분석방법으로 MASS, NMR 등을 사용한다.Representative methods for searching for efficacy on hematopoietic action include a method of measuring colony forming efficacy of collecting hematopoietic stem cells, exposing them to a search material, culturing them in vitro, and monitoring the formation of hematopoietic stem cell clones, and in vivo searching using animals. As a method, there is a method (colony forming unit in the spleen) for measuring the degree of recovery of the reduced bone marrow function after a subdivision dose or by administering a large amount of anticancer agents. Solvent extraction, silica gel chromatography, and the like are used to separate and purify the antler component, and MASS and NMR are used as the structural analysis methods.
이하에서는 실시예에 의해서 본 발명을 설명한다. 실시예는 단지 예시적인 것이며, 이것에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.Hereinafter, the present invention will be described by way of examples. The examples are illustrative only and do not limit the scope of the invention.
실시예 1Example 1
녹용(매화록) 1.75kg을 잘게 부숴 비이커에 넣고 녹용이 잠길 정도로 헥산(대략 6리터)을 가하고, 2시간 동안 80℃에서 가열하여 두 번 추출하여 여과하였다(이 여과액을 추출액 1이라고 함). 추출액 1을 감압하에 증류시켜 건조하여 엑기스(엑기스 CN-H) 24.6g을 얻었다.1.75 kg of deer antler (plum) was added to a crushed beaker, hexane (approximately 6 liters) was added to the antler, and the mixture was heated at 80 ° C. for 2 hours, extracted twice, and filtered (this filtrate was called extract 1). . The extract 1 was distilled off under reduced pressure to obtain 24.6 g of extract (extract CN-H).
잔사에 클로로포름을 잠길 정도로 가하고(대략 6리터), 2시간 동안 70℃에서 가열하여 두 번 추출하여 여과하였다(이 여과액을 추출액 2라고 함). 추출액 2를 감압하에 증류시켜 엑기스(엑기스 CN-C) 14g을 수득하였다. 다시 잔사에 70% 에탄올(대략 6리터)을 넣고 2시간 동안 90℃에서 가열하여 세 번 추출하여 여과하였다(이 여과액을 추출액 3이라고 함). 추출액 3을 감압하에 증류시켜 엑기스(엑기스 CN-E) 91g을 얻었다,Chloroform was added to the residue to the degree of immersion (approximately 6 liters), heated at 70 ° C. for 2 hours, extracted twice, and filtered (this filtrate was called Extract 2). Extract 2 was distilled off under reduced pressure to give 14 g of extract (extract CN-C). 70% ethanol (about 6 liters) was added to the residue, and the mixture was heated at 90 ° C for 2 hours, extracted three times, and filtered (this filtrate was called extract 3). The extract 3 was distilled off under reduced pressure to obtain 91 g of an extract (extract CN-E).
실시예 2Example 2
분말 실리카겔 350g에 클로로포름/메탄올(500:1) 혼합 용액을 넣고, 부풀린 후, 열린 칼럼[베드체적(bed volume)=600~650ml]에 채웠다. 엑기스 CN-C 12g을 최소량(엑기스를 녹일 수 있는 최소량)의 클로로포름/메탄올(500:1)에 녹인 후, 실리카겔이 채워진 칼럼에 적용시켰다. 용리액인 클로로포름/메탄올(500:1)을 마르지 않게 넣어주면서 50mL씩 받은 다음(이 때, 공체적(void volume)은 200ml이다), 이것을 TLC(전개 용매:클로로포름/메탄올=300:1)로 전개하였다. 이것을 요오드로 발색시킨 후, Rf에 따라 분리하였다. 이 때, 분리된 주요 부분이 모두 7개였다. 분리된 부분을 각각 감압 증류하여 건조시켰다. 각각을 CN-C-1 내지 CN-C-7로 표시하였다. 조혈모세포 증식활성을 지표로 계속 정제를 시도하였다.A chloroform / methanol (500: 1) mixed solution was added to 350 g of powdered silica gel, inflated, and filled into an open column (bed volume = 600 to 650 ml]. 12 g of extract CN-C was dissolved in a minimum amount (the minimum amount that could dissolve the extract) in chloroform / methanol (500: 1) and applied to a column filled with silica gel. Eluent chloroform / methanol (500: 1) was added 50 ml each while not drying (the volume of the void was 200 ml), and this was developed by TLC (developing solvent: chloroform / methanol = 300: 1). It was. It was developed with iodine and then separated according to Rf. At this time, there were seven main parts separated. The separated portions were each distilled under reduced pressure and dried. Each is represented by CN-C-1 to CN-C-7. Purification was continued as an indicator of hematopoietic stem cell proliferation activity.
실시예 3Example 3
녹용의 조혈작용 효능 검색Screening of Hematopoietic Effect of Deer Antler
본 발명자는 녹용 엑기스의 조혈작용 효능을 검색하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.The present inventors performed the following experiment to search for the hematopoietic effect of the antler extract.
1)마우스의 골수세포 분리 1) Isolation of Mouse Bone Marrow Cells
마우스 다리의 경골과 대퇴골로부터 RPMI 1640 영양배지(Gibco #430-1800)로 세척하여 골수를 분리하였다. 분리한 골수를 여과하여 단세포 부유액으로 만들고, 다시 RPMI 1640 영양배지로 3회 반복 세척 후, 세포수를 측정하였다. 비중이 1.063과 1.075 사이에 있는 간세포(幹細胞;stem cell) 풍부 분획을 얻어서 RPMI로 2회 세척하였다.Bone marrow was isolated by washing with RPMI 1640 nutrient medium (Gibco # 430-1800) from the tibia and femur of the mouse leg. The separated bone marrow was filtered to make a single cell suspension, and again washed three times with RPMI 1640 nutrient medium, and the number of cells was measured. A stem cell rich fraction having a specific gravity between 1.063 and 1.075 was obtained and washed twice with RPMI.
2)시료의 제조 2) Preparation of Sample
모든 녹용 시료는 0.8mg/ml DMSO 농도가 되도록 녹여서, 이것을 저장 용액(stock solution)으로 사용하였고 조혈작용 효능 검색에 이용하였다.All antler samples were thawed to a concentration of 0.8 mg / ml DMSO, which was used as a stock solution and used to search for hematopoietic efficacy.
3)CFU-C(colony forming unit in culture) 분석 실시 3) Conduct CFU-C (colony forming unit in culture) analysis
상기 1)에서와 같은 방법으로 분리된 세포들을 1.1% 메틸셀룰로스 판에 1.2×104세포/웰(cell/well)로 심은 후, 37℃ CO2인큐베이터에 배양하였고, 1주일 후에 콜로니의 수를 측정하였다.The cells isolated in the same manner as in 1) were planted in 1.1% methylcellulose plate at 1.2 × 10 4 cells / well, then cultured in a 37 ° C. CO 2 incubator, and after one week the number of colonies Measured.
콜로니 형성 효능(Colony Forming Efficiency;CFE) = (시료에 있는 콜로니의 전체 수) / (콘트롤에 있는 콜로니의 전체 수)Colony Forming Efficiency (CFE) = (total number of colonies in sample) / (total number of colonies in control)
각 실시예로부터의 녹용 엑기스 시료에 대하여 상기와 같은 조혈작용 효능 검색 실험을 수행하였다.The hematopoietic efficacy search experiments were performed on the antler extract samples from each example.
ⅰ) 실험동물실험) Experimental animal
SPF(Specific Pathogen free: 특정 병원체가 없는) 조건하에서 사육한 생후 6∼9주일된 C57B1/6 계의 수컷 마우스를 사용한다.Male mice of 6 to 9 weeks old C57B1 / 6 breeding under SPF (Specific Pathogen free) conditions are used.
ⅱ) 효능 검색Ii) efficacy search
마우스 뒷다리의 경골과 대퇴골로부터 RPMI 1640 배지 (Giboco#430-1800)로 플러싱(flushing)하여 골수세포를 분리해낸다. 분리한 골수를 코튼 필터(cotton filter)를 통과시켜 단세포 부유액으로 만든다. 이것을 다시 RPMI 1640 배지로 세척 후 헤모시토미터(hemocytometer)를 사용하여 세포수를 측정한다. 이 전체 BM세포를 밀도 1.090, 1.075, 1.063의 Percoll 용액을 이용하여 불연속 구배 원심분리(discontinuous gradient centrifugation)를 실시하여, 모세포-풍부 분획(stem cell-rich fraction)을 얻은 후 세척한다. 위에서 얻은 모세포-풍부 분획을 트리판 블루 염료 배제(trypan blue dye exclusion) 방법을 이용하여 세포의 생존율과 수를 측정한다. 각각의 녹용 시료를 0.8mg/ml의 농도가 되게 100% DMSO로 녹인다. 각 시료별과 농도별로 튜브를 준비하여 일정량의 FBS, 배지, 메틸셀룰로스, 세포 등을 넣고 혼합하여 웰 플레이트에 두 개씩 분주하여 5% CO2인큐베이터에 1주일 동안 배양한다. 1주일 후 염색하여 역위 현미경으로 콜로니 수를 센다. 콘트롤과 비교하여 활성 여부(콜로니 형성 효능)를 확인한다. 여기서 콘트롤은 녹용 시료만 넣지 않은 것이다.Bone marrow cells are isolated from the tibia and femur of the mouse hind limb by flushing with RPMI 1640 medium (Giboco # 430-1800). The isolated bone marrow is passed through a cotton filter into a single cell suspension. This was again washed with RPMI 1640 medium and the cell number was measured using a hemocytometer. The whole BM cells were subjected to discontinuous gradient centrifugation using Percoll solutions having densities of 1.090, 1.075, and 1.063 to obtain a stem cell-rich fraction and then washed. The parental-rich fractions obtained above measure the viability and number of cells using trypan blue dye exclusion method. Each antler sample is dissolved in 100% DMSO to a concentration of 0.8 mg / ml. Prepare a tube for each sample and concentration, add a certain amount of FBS, medium, methyl cellulose, cells, etc., mix two aliquots in a well plate and incubate for one week in a 5% CO 2 incubator. After 1 week, stain and count colonies under an inverted microscope. Compared to the control, the activity (colony forming efficacy) is confirmed. The control here does not contain only the antler sample.
콘트롤의 콜로니 수를 154로 보았을 때, 엑기스 CN-C를 0.001mg/ml의 농도가 되게 배양 용액에 녹여 세포에 넣고 배양한 후의 콜로니 수는 171이다. 여기서 콜로니 형성 효능은 171/154로 1.11(콘트롤 CFE=1)이다.When the number of colonies of the control was 154, the extract CN-C was dissolved in the culture solution to a concentration of 0.001 mg / ml, and the number of colonies after incubation was 171. The colony forming efficacy here is 171/154 with 1.11 (control CFE = 1).
상기의 조혈작용 효능 데이터를 표로 나타내면 다음과 같다.The above hematopoietic effect data are shown in the table below.
실시예 4Example 4
실시예 2에서 정제된 분획 중 조혈작용 효능이 높은 분획인 CN-C-2(380mg)을 취하였다. 분말 실리카겔 20g에 헥산/에틸아세테이트(50:1) 혼합 용액을 넣고 부풀려 칼럼(베드 체적=100ml)에 채웠다. 엑기스 CN-C-2를 용리액인 헥산/에틸아세테이트(50:1) 최소량에 녹여 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 2에서 한 것과 같이, 용리액을 넣어주면서 15ml씩 받아 TLC(전개용매:헥산/에틸아세테이트=50:1)로 전개하였고, 요오드 발색 후 Rf에 따라 6개의 부분으로 분리하였다. 분리된 부분을 각각 감압 증류시켜 건조하였다. 각각을 CN-C-2-A 내지 -F로 표시하였다.In Example 2, CN-C-2 (380 mg), a fraction of high hematopoietic efficacy, was taken from the purified fraction. A mixed solution of hexane / ethyl acetate (50: 1) was added to 20 g of powdered silica gel, and it was inflated and filled in a column (bed volume = 100 ml). Extract CN-C-2 was dissolved in a minimum amount of eluent hexane / ethyl acetate (50: 1) and applied to a silica gel column. As in Example 2, while taking the eluent was added 15ml each was developed by TLC (developing solvent: hexane / ethyl acetate = 50: 1), after iodine coloration was separated into six parts according to Rf. The separated portions were each distilled under reduced pressure and dried. Each is represented by CN-C-2-A to -F.
실시예 5Example 5
실시예 4에서 정제한 분획 중 조혈작용 효능이 높은 분획인 CN-C-2-E(70mg)을 취하였다. 분말 실리카겔 3.5g에 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5) 혼합 용액을 넣고, 부풀려 칼럼(체적=24ml)에 채웠다. 엑기스 CN-C-2-E를 용리액인 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5) 최소량에 녹여 실리카겔 칼럼에 적용시켰다. 실시예 3과 같이 용리액을 넣어 주면서 10ml씩 받아, TLC(전개용매:헥산/에틸아세테이트/아세트산=20:1:0.5)로 전개하였고, 요오드 발색 후 Rf에 따라 두 부분으로 나누었다. 나눠진 두 부분을 각각 감압 증류시켜 건조하였다. 두 부분을 a 및 b로 표시하였다.In the fraction purified in Example 4, CN-C-2-E (70 mg), which is a fraction with high hematopoietic effect, was taken. A mixed solution of hexane / ethyl acetate / acetic acid (20: 1: 0.5) was added to 3.5 g of powdered silica gel, and it was inflated and filled in a column (volume = 24 ml). Extract CN-C-2-E was dissolved in a minimum amount of hexane / ethyl acetate / acetic acid (20: 1: 0.5) as an eluent and applied to a silica gel column. 10 ml each was added while the eluent was added as in Example 3, and developed by TLC (developing solvent: hexane / ethyl acetate / acetic acid = 20: 1: 0.5), and was divided into two parts according to Rf after iodine coloration. The divided portions were dried by distillation under reduced pressure, respectively. Two parts are marked a and b.
실시예 6Example 6
실시예 5에서 나눈 부분 중에서 첫 번째 (엑기스 CN-C-2-E-a) 부분을 취하였다. 엑기스 CN-C-2-E-a에 메탄올 5ml을 넣고 섞은 후, 메탄올에 녹는 부분(엑기스 CN-C-2-E-a-Ms)과 메탄올에 녹지 않는 부분(엑기스 CN-C-2-E-a-Mi)으로 분리하였다. 엑기스 CN-C-2-E-a-Ms는 20mg을 수득하였고, 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi는 40mg을 수득하였다.The first (extract CN-C-2-E-a) part of the part divided in Example 5 was taken. After mixing 5 ml of methanol in extract CN-C-2-Ea, mix and dissolve in methanol (extract CN-C-2-Ea-Ms) and insoluble in methanol (extract CN-C-2-Ea-Mi). Separated. The extract CN-C-2-E-a-Ms obtained 20 mg, and the extract CN-C-2-E-a-Mi obtained 40 mg.
실시예 2, 4, 및 5의 TLC 결과를 도1에 나타내었다. 도1에서 보는 것과 같이, 엑기스 CN-C에 있는 밴드가 정제되어 가는 과정에서도 동일하게 나타남을 볼 수 있다. 따라서, 활성을 나타내는 부분이 정제 과정에서 변성되어 나타나거나 없어진 것이 아님을 알 수 있다. 처음에는 다른 부분 때문에 가려졌던 밴드가 정제되어감에 따라 진하게 발색되었다.The TLC results of Examples 2, 4, and 5 are shown in FIG. As shown in Figure 1, it can be seen that the band in the extract CN-C appears the same in the process of purification. Therefore, it can be seen that the part showing activity is not denatured or disappeared during purification. At first, the band, which was covered by other parts, developed deeper as it was refined.
실시예 7Example 7
조혈작용 활성 물질의 구조 분석Structural analysis of hematopoietic active substances
실시예 6으로부터 최종 정제된 두 물질 중에서 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi를 VG70-VSEQ 매스 스펙트로미터(mass spectrometer)로 분석하여 도2에 나타내었다. 분석 방법은 저해상도(Low Resolution)이며 이온화 방법으로는 포지티브(positive) FAB(fast atom bombardment)을 사용하였고, 이 때 매트릭스(matrix)로 3-니트로 벤질알코올을 사용하였다.Extract CN-C-2-E-a-Mi was analyzed in a VG70-VSEQ mass spectrometer among the two substances finally purified from Example 6, and is shown in FIG. 2. The analysis method was low resolution and positive fast atom bombardment (FAB) was used as the ionization method, and 3-nitro benzyl alcohol was used as a matrix.
분자이온 M+은 637.5이며, m/z 577.5는 아세트산(CHCOOH)이 제거된 3-데옥시-1-올레오일-2-팔미토일 글리세리드-3-카르보 양이온(3-deoxy-1-oleoyl-2-palmitoyl glyceride-3-carbocation)이고, m/z 383.3은 팔미테이트(palmitate) 그룹이 제거된 성분이며, m/z 239.2는 팔미토일(palmitoyl) 그룹을 나타낸다.The molecular ion M + is 637.5 and m / z 577.5 is 3-deoxy-1-oleoyl-2-palmitoyl glyceride-3-carbo cation without acetic acid (CHCOOH). 2-palmitoyl glyceride-3-carbocation), m / z 383.3 is the component from which the palmitate group has been removed, and m / z 239.2 represents the palmitoyl group.
도3은 엑기스 CN-C-2-E-a-Mi의 네가티브(negative) FAB(fast atom bombardment)의 결과를 나타낸다. m/z 255.2는 팔미테이트 음이온이고, m/z 281.3은 올레이트 음이온이다.3 shows the results of negative fast atom bombardment (FAB) of extract CN-C-2-E-a-Mi. m / z 255.2 is a palmitate anion and m / z 281.3 is an oleate anion.
도4는 도2의 m/z 577에 대한 탠덤 매스 스펙트럼(tandem mass spectrum)이다. m/z 393.3은 3-데옥시-1-올레일-2-팔미토일 글리세리드-3-카르보 양이온에서 -C13H27그룹과 프로톤(proton)이 제거된 구조이며, m/z 367는 -C15H29와 프로톤이 제거된 구조이다.4 is a tandem mass spectrum for m / z 577 of FIG. m / z 393.3 is a structure in which -C 13 H 27 group and proton are removed from 3-deoxy-1-oleyl-2-palmitoyl glyceride-3-carbo cation, and m / z 367 is- C 15 H 29 and protons removed.
도2 내지 도4의 매스 스펙트럼을 분석한 결과, 정제된 두 성분의 구조는 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤(1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol) 및 1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-아세틸글리세롤(1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol)로서, 이것의 구조를 도5에 나타냈다.As a result of analyzing the mass spectrum of FIGS. 2 to 4, the structure of the purified two components was 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol (1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl- 3-acetylglycerol) and 1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol (1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol), the structure of which is shown in FIG.
실시예 8Example 8
조혈모세포 및 혈소판 전구세포 증식 촉진인자의 합성Synthesis of Hematopoietic Stem and Platelet Progenitor Proliferation Factors
A.1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤의 합성 : 포스파티딜콜린의 아세톨리시스 A. Synthesis of 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol: acetolysis of phosphatidylcholine
포스파티딜콜린(1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-포스포콜린) 2~5 ㎎을 아세트산:아세틱 안하이드라이드(3:2) 1㎖에 녹여서 유리 바이알에 넣었다. 바이알을 단단히 묶고 8시간 동안 150℃의 오일 배쓰(oil bath)에 깊이 넣고 반응시켰다. 반응이 끝난 후 클로로포름:메탄올:물(8:4:3)로 3번 추출하고 물로 닦고 1시간 동안 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 합성물의 구조를 TLC, GC-MS 및 NMR로 확인하였다.2-5 mg of phosphatidylcholine (1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-phosphocholine) was dissolved in 1 ml of acetic acid: acetic anhydride (3: 2) and placed in a glass vial. The vial was tightly tied and deeply reacted in an oil bath at 150 ° C. for 8 hours. After the reaction, the mixture was extracted three times with chloroform: methanol: water (8: 4: 3), washed with water, and dried over anhydrous sodium sulfate for 1 hour. The structure of the composite was confirmed by TLC, GC-MS and NMR.
B.1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-아세틸글리세롤의 합성 : 계란 노른자로부터 포스파티딜콜린의 분리 B. Synthesis of 1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-acetylglycerol: isolation of phosphatidylcholine from egg yolk
계란 노른자 한 개에 에테르 40㎖를 넣고 교반하여 약 1시간 방치하였다. 윗쪽의 녹은 부분만 따라내어 물중탕에서 용매를 증발시킨 후, 30㎖ 정도의 아세톤을 넣고 교반하면 순수하지 않은 포스파티딜콜린이 침전물로 가라앉는다. 이 침전물을 용리액인 클로로포름:메탄올:물(65:25:4)에 녹였다. 분말 실리카겔을 클로로포름:메탄올:물(65:25:4)에 넣고 팽창시킨 후 열린 칼럼에 채웠다. 순수하지 않은 포스파티딜콜린 침전물을 채워진 칼럼에 적용시키고 20㎖씩 분획을 수거하였다. TLC로 표준물질 포스파티딜콜린과 비교하여 순수한 포스파티딜콜린(1-헥사데카노일-2-9-옥타데세노일-3-포스포콜린) 부분만 수거하였다. A의 방법과 같은 방법으로 수거된 물질의 아세톨리시스를 수행하여 원하는 물질을 합성하였다.40 ml of ether was added to one egg yolk and stirred for about 1 hour. After evaporating the solvent in the water bath with only the upper part of the melted water, 30 ml of acetone is added and stirred, and the pure phosphatidylcholine sinks into the precipitate. This precipitate was dissolved in chloroform: methanol: water (65: 25: 4) as eluent. Powder silica gel was poured into chloroform: methanol: water (65: 25: 4), expanded, and filled into an open column. A non-pure phosphatidylcholine precipitate was applied to the packed column and fractions were collected by 20 ml. Only pure phosphatidylcholine (1-hexadecanoyl-2-9-octadecenoyl-3-phosphocholine) portion was collected by TLC compared to the standard phosphatidylcholine. Acetolysis of the collected material was carried out in the same manner as in A to synthesize the desired material.
실시예 9Example 9
합성 물질을 사용한 생체내 효능 분석(생체내 CFU-S 분석)In vivo efficacy analysis using synthetic materials (in vivo CFU-S analysis)
6~10주령의 C57B1/6 생쥐를 137-Cs 방사선조사기(irradiator) (CIS #IBL 437)를 사용하여 8.0Gy 조사량으로 전신 방사선 조사한 후 Till McCulloch의 방법에 준하여 1.5 x 105개의 동종 골수세포를 꼬리정맥을 통하여 골수이식을 실시하였다. 생쥐는 대조군과 합성물질 투여군으로 나누었다. 골수이식 후 1일, 2일, 3일에 각 인자를 주사하고, 14일째에 비장을 적출하여 콜로니 형성을 관찰한 후 포르말린으로 고정하였다. 이 때 비장에 형성된 노듈(nodules)을 비교 관찰하였다.C57B1 / 6 mice aged 6 to 10 weeks were irradiated with 8.0Gy at a 137-Cs irradiator (CIS #IBL 437) and irradiated with 1.5G10 5 allogeneic bone marrow cells according to Till McCulloch's method. Bone marrow transplantation was performed through the tail vein. Mice were divided into control group and synthetic group. Each factor was injected on day 1, day 2, and day 3 after bone marrow transplantation, and spleens were extracted on day 14, and colony formation was observed and fixed with formalin. At this time, nodules (nodules) formed in the spleen were compared and observed.
그 결과를 도6에 나타냈다.The results are shown in FIG.
도6에서, A는 대조군이며, B는 녹용 수용성 추출물을 투여한 것이며, C는 합성 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 투여한 것이며(1㎎, 3일간 투여), D는 합성 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 투여한 것이며(0.1㎎, 3일간 투여), 그리고 E는 합성 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 투여한 것이다(0.01㎎, 3일간 투여).In Figure 6, A is a control, B is a antler water-soluble extract, C is a synthetic 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol (1 mg, 3 Daily administration), D is a synthetic 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol (0.1 mg, 3 days), and E is a synthetic 1-9-octadeceno It was administered 2--2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol (0.01 mg, 3 days administration).
도6의 결과를 보면, 대조군(A) 및 녹용 수용성 추출물(B)을 투여한 생쥐의 비장 보다 합성 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 투여한 생쥐 비장이 크기가 더 크고 노듈이 많이 생기며, 합성 물질의 투여량이 증가할수록 비장의 크기가 더욱 커지고 노듈이 더욱 많이 생긴다는 것을 알 수 있다(E<D<C).6 shows that the spleen of the mouse administered with synthetic 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol than the spleen of the mouse administered the control group (A) and the antler water-soluble extract (B). It can be seen that this size is larger and more nodules are produced, and as the dosage of the synthetic material increases, the spleen increases in size and more nodules occur (E <D <C).
도6의 결과로부터, 상기 합성물질의 조혈모세포 증식 촉진활성을 확인할 수 있다.From the results of FIG. 6, the hematopoietic stem cell proliferation promoting activity of the synthetic material can be confirmed.
실시예 10Example 10
생쥐 비장의 현미경 소견Microscopic Findings of the Mouse Spleen
6~10주령의 C3H/He 생쥐를 137-Cs 방사선조사기(irradiator) (CIS #IBL 437)를 사용하여 8.0Gy 조사량으로 전신 방사선 조사한 후 Till McCulloch의 방법에 따라 동종 생쥐로부터 분리된 1.5 x 105개의 골수세포를 RPMI 배지에 부유시켜 꼬리정맥에 주사하였다. 동종 골수이식 후 1일, 2일, 3일째에 대조군은 멸균된 PBS(1% BSA) 100㎕를 복강내 주사하였고, 실험군은 녹용추출물 또는 합성물질을 50㎎/㎏(녹용의 추출전 무게 기준) 농도로 100㎕씩 각각 복강내에 주사하였다. 동종 골수이식 후 14일째에 비장을 적출하여 10% PBS 완충 포르말린 용액에 고정한 후 절개하여 Hematoxylin/Eosin 염색을 실시한 다음, 조직학적 구조변화를 관찰하였다.The 6-10 weeks of age by the C3H / He mice using a 137 Cs-radiation emitter (irradiator) (CIS #IBL 437) after whole body irradiated with 8.0Gy radiation amount according to the method of Till McCulloch isolated from allogeneic mice, 1.5 x 10 5 Bone marrow cells were suspended in RPMI medium and injected into the tail vein. At 1, 2 and 3 days after allogeneic bone marrow transplantation, the control group was intraperitoneally injected with 100 μl of sterile PBS (1% BSA). 100 μl each was injected intraperitoneally. At 14 days after allogeneic bone marrow transplantation, the spleen was extracted, fixed in 10% PBS buffered formalin solution, and cut and subjected to Hematoxylin / Eosin staining.
그 결과는 도7 내지 도 11에서 보여진다.The results are shown in Figures 7-11.
도7은 대조군으로서, 인산염 완충액만 투여한 대조군의 저배율(40X) 및 고배율(400X)에서의 비장 사진이며, 비장이 전체적으로 위축(atrophy)되어 있다. 도8은 녹용 수용성 추출물을 투여한 군의 현미경 사진이다. 비장의 백색 수질(white pulp)에서 조혈모세포 및 전구세포의 증식을 관찰할 수 있다.7 is a spleen photograph at low magnification (40 ×) and high magnification (400 ×) of the control group administered with phosphate buffer only, and the spleen is atrophyed as a whole. Figure 8 is a micrograph of the group to which the antler soluble extract was administered. The proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells can be observed in the white pulp of the spleen.
도9는 합성물질 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 1㎎ 투여한 군의 현미경사진이다. 저배율(40X)에서는 비장의 백색 수질이 증대되어 있고, 고배율(100X 및 400X)에서는 조혈모세포 및 조혈모세포 전구세포의 증식과 혈소판 전구세포(megakaryocytes)가 산재되어 있다.Figure 9 is a micrograph of a group administered with 1 mg of the synthetic substance 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol. At low magnification (40X), the white water quality of the spleen is increased, and at high magnification (100X and 400X), proliferation of hematopoietic stem cells and hematopoietic stem cell progenitor cells and platelet progenitor cells (megakaryocytes) are interspersed.
도10은 합성물질 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 0.1㎎ 투여한 군의 현미경사진이다. 비장의 백색 수질에서 조혈모세포 증식과 혈소판 전구세포의 군집을 관찰할 수 있다.10 is a micrograph of a group administered with 0.1 mg of the synthetic substance 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol. In the white medulla of the spleen, hematopoietic stem cell proliferation and platelet progenitor cells can be observed.
도11은 합성물질 1-9-옥타데세노일-2-헥사데카노일-3-아세틸글리세롤을 0.01㎎ 투여한 군의 현미경사진이다. 비장의 백색 수질의 팽대와 조혈모세포, 전구세포 및 혈소판 전구세포의 군집을 관찰할 수 있다.Figure 11 is a micrograph of the group administered with 0.01 mg of the synthetic material 1-9-octadecenoyl-2-hexadecanoyl-3-acetylglycerol. The expansion of the white medulla of the spleen and the clusters of hematopoietic stem, progenitor and platelet progenitor cells can be observed.
도7 내지 도11의 결과로부터, 상기 합성물질의 조혈모세포 및 혈소판의 증식 촉진활성을 확인할 수 있다.7 to 11, the proliferation promoting activity of hematopoietic stem cells and platelets of the synthetic material can be confirmed.
본 발명자는 녹용으로부터 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진인자를 분리·정제하였고, 그 물질의 구조를 밝혀냈다. 본 발명에 의한 새로운 물질은 조혈모세포 및 혈소판 증식 촉진 작용을 함으로써, 면역기능 및 혈액 세포들의 기능 증진이 필요한 질환, 특히 항암제 및 방사선 조사 후 골수 기능이 저하된 상태에 있는 질환 등, 임상 각 분야에 걸쳐서 전반적으로 치료제로서 사용될 수 있을 것이다.The present inventors isolated and purified hematopoietic stem cells and platelet proliferation promoters from antler, and discovered the structure of the substance. The novel substance according to the present invention has a role in promoting hematopoietic stem cell and platelet proliferation, and in various clinical fields, such as a disease in which immune function and blood cell function are required to be enhanced, in particular, a condition in which bone marrow function is degraded after anticancer drugs and irradiation. Can be used as a therapeutic agent throughout.
Claims (6)
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KR100397220B1 (en) * | 2000-07-13 | 2003-09-13 | 전길자 | Extract of deer antler containing bone formation enhancing activity and its purifying method |
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