KR19990054118A - 사람의 단일사슬 유로키나제형 프라스미노겐 활성인자(scu-PA)를 대량 생산하는 재조합 CHO 세포주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람의 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(single chain urokinase-type plasminogen activator, scu-PA)를 대량 생산하는 재조합 CHO 세포주에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 많은 양의 사람 scu-PA 단백질을 발현시킬 수 있는 신규의 재조합 scu-PA 발현벡터, 이 발현벡터와 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자를 가진 미니진(minigene) 플라스미드로 동시에 트랜스펙션된(transfected) CHO 세포주 및 전기 재조합 세포주로부터 재조합 scu-PA의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 강력한 발현벡터 pcPUK로 트랜스펙션된 재조합 CHO 세포주는 생리적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 scu-PA를 안정적으로 다량 생산 및 분비한다. 이러한 재조합 세포주를 이용하면, 혈전용해제로 사용되는 scu-PA 단백질을 대량으로 공급할 수 있다.

Description

사람의 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(scu-PA)를 대량 생산하는 재조합 CHO 세포주

본 발명은 사람의 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(single chain urokinase-type plasminogen activator, scu-PA)를 대량 생산하는 재조합 CHO 세포주에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 많은 양의 사람 scu-PA 단백질을 발현시킬 수 있는 신규의 재조합 scu-PA 발현벡터, 이 발현벡터와 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자를 가진 미니진(minigene) 플라스 미드로 동시에 트랜스펙션된(transfected) CHO 세포주 및 전기 재조합 세포주로부터 재조합 scu-PA의 제조방법에 관한 것이다.

뇌출혈, 뇌혈전, 심부전, 심근경색 등으로 대표되는 혈관계 질환은 혈관내의 혈전이 원인이 되는 것으로, 현재 의학적으로 많은 관심과 함께 연구가 활발히 진행되고 있다. 혈액은 생체 내에서 응고와 용해작용이 항상 평형을 이루고 있으며, 정상적으로 순환되는 동안에는 혈전이 형성되지 않는다. 그러나, 여러 가지 원인으로 균형이 깨져 혈전이 형성되면, 혈관을 막게 되므로 혈액의 순환이 방해되어 조직으로의 영양분 및 산소 공급이 중단되게 된다. 이러한 혈전으로 야기되는 혈관계 질환을 예방 및 치료하기 위한 노력은 혈전의 생성을 막는 항혈전제의 개발과 이미 형성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제의 개발로 집중되고 있고, 이러한 노력의 결과로 항혈전제인 헤파린(heparin), 쿠마린(coumarin), 히루딘(hirudin) 등과 혈전용해제인 u-PA(urokinase-type plasminogen activator)와 t-PA(tissue-type plasminogen activator) 등이 개발되어 왔다.

혈액응고 과정에서 생긴 피브린 폴리머인 혈전(thrombus)은 피브린 용해 시스템에서 플라스미노겐(불활성의 프로효소)이 활성화되어 생성된 플라스민(활성효소)에 의해 용해되며, 이 과정에서 효소의 전환에 중요한 역할을 담당하는 효소는 세린계 단백질분해효소인 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator)들인 것으로 알려져 있다(참조: Robbins, K. et al.(1967) J. Biol. Chem. 242:2333-2342; Collen, D. (1980) Throm. Haemost. 43:77-89). 그러나, 플라스민은 피브리노겐에 대해서도 높은 분해 활성을 가지고 있기 때문에, 단독으로 혈액 내에 과량 존재할 경우 출혈의 위험성이 있게 된다. 이러한 문제를 방지하기 위하여, α2-안티플라스민(α2-antiplasmin)과 α2-마크로글로불린(α2-macroglobulin) 등의 생체 내 억제인자가 혈액에 존재하고 있다.

또한, 플라스미노겐의 활성화는 플라스미노겐 활성인자에 의해 피브린 응괴(fibrin clot)가 형성된 곳에서만 일어나도록 정교하게 조절되고 있다. 피브린 용해(fibrinolysis)는 혈전의 용해 뿐만 아니라, 조직의 복구(참조: Valinsky, J.E. and Le Douarin, N. M. (1985) EMBO J. 4:1403-1406), 암세포의 전이(cancer metastasis), 대식세포(macrophage)의 기능, 난형성(참조: Grondahl-Hansen, J. et aJ. (1988) J. Invest. Dermatol. 90:790-795) 및 배이식 등에도 관련된다는 사실이 보고되고 있다.

현재까지 보고된 인체 내의 플라스미노겐 활성인자로는 tPA와 u-PA가 있다(참조:Rijken, D. C. et al. (1981) J. Lab. Clin. Med. 97:477-486). t-PA는 혈전이 생성된 부의의 내피새포(endothelial cell)에서 분비되지만, u-PA는 대부분 신장에서 생성되어 전구체 상태(pro-urokinase, pro-UK)로 혈액 내에 항상 존재하고 있으며, 이 플라스미노겐 활성인자는 PAI(plasminogen activator inhibitor)에 의해 활성이 조절되고 있다.

u-PA는 요(urine) 뿐만 아니라 신장세포 및 특정한 암세포의 배양액 등에서 분리된 당단백질로서, 411개의 아미노산을 가지고 있어 분자량이 54kDa이며, 두개의 사슬로 연결되어 있다. 유로키나제의 양은 호르몬, 종양의 변형(neoplastic transfornntion), 성장인자 뿐만 아니라, 그 외 많은 효과인자(effectors)에 의해 주로 mRNA 전사 수준에서 조절되고 있는 것으로 추측되고 있다. 유로키나제는 세포의 종양의 기질(extracellular tumor matrix)의 분해와 같은 세포의 단백질분해를 시작하고 조절하는 역할을 하여, 세포 증식, 침윤(invasion), 전이에 관련되어, 있는 것으로 알려져 있다(참조: Dano, K. et al. (1985) Advanced Cancer Research 44:139-266; Markus, Gl. (1988) Enzyme 40:158-172).

또한, 유로키나제는 피브린을 용해시킬 수 있는 기능이 있기 때문에, 일찍부터 생리적인 혈전용해제로서 치료에 사용되어 왔고, 심정맥 혈전(deep-vein thrombosis), 관상폐색(coronary obstructions) 등에도 사용되어 왔으나, 피브린에 대한 특이성이 없어 전신 출혈을 일으킬 수 있어 부작용이 많이 나타난다. 즉, 유로키나제는 피브린용해 과정에서 비특이적인 전신성(systemic) 플라스미노겐 활성 및 피브리노겐의 분해에 관여하며, 여러 가지 혈액응고 단백질들을 분해하는 문제점을 가지고 있다(참조: Ducket, F. (1978) in Fibrinolytics and Antifibrinolytics(Markwadt, F., ed.)pp209-237; Voger, G. (1978) Fibrinolytics and Antifibrinolytics(Markwadt, F., ed.)pp179-207).

반면에, 인체 자궁 조직 외에도 여러 조직에서 분리된 t-PA는 혈액 내 5ng/ml 농도로 존재하며, 아미노산 527개를 갖는 분자량 70kDa의 당단백질로서 핑거 도메인(finger domain)과 두 번째 크링글 도메인(kringle domain)이 피브린과의 결합에 관여한다. 혈액 내에서의 t-PA는 PAI-I과 복합체를 이루거나 자유형(free form)으로 존재하는데, 내피세포나 간세포의 수용체에 의해 빠르게 제거된다. 혈중 내 반감기가 5-8분으로 매우 짧아 장시간 정맥으로 주사해야 하며, 고역가를 투여함으로 가격이 비싼 편이다. 반면에, tPA는 피브린에 대한 우수한 친화성을 가지며, 혈전에 결합한 경우에만 활성화되어 다른 전신성 플라스미노겐 활성이나 혈장 막(plasma membrane)의 분해를 일으키지 않는 특성을 갖고 있다(참조: Matsuo, O. et al. (1981) Nature 291:590-591; Rijin, D. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 27:2920-2925).

이러한 uPA나 tPA 이외에도 피브린에 대한 결합능력 향상, 플라스민에 대한 저항성 향상, 효소활성의 증가를 목적으로 한 많은 돌연변이체들이 개발되었으며, 또한 피브린, 혈소판에 대한 단일클론항체와 플라스미노겐 활성인자의 갈합체, 키메릭 플라스미노겐 활성인자들, SP(staphylokinase), bat-PA 등의 새로운 플라스미노겐 활성인자들이 보고되고 있다.

최근에는 uPA나 tPA의 단점을 보완하는 측면에서 피브린과 특이적 반응을 보이며, 생체내에서 반감기가 상대적으로 긴 유로키나제 전구체로서의 scu-PA(single chain urokinase-type plasminogen activator)에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 유전공학을 이용한 대량발현 및 생산이 시도되고 있어서 이 물질이 치료제로서의 가치가 한층 높아지고 있다.

인간의 scu-PA는 프로-유로키나제(pro-urokinase)로 언급되기도 하는데, 12개의 이황화결합을 가진 당단백질이며(참조: Wun, T. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:7262-7268; Holmes, W. E. et al. (1985) Bio/Technology 3:923-929), 구조적으로 크게 세부분 즉, EGF-유사 도메인(EGF-like domain), 크링글 도메인, 세린계 단백질분해효소 도메인으로 나눌 수 있다. scu-PA는 효소적으로 불활성 상태인 단일사슬 전구체 형태로서 세포로부터 분비되면 세포 표면에 있는 수용체에 결합한다. 이러한 scu-PA는 세린계 단백질분해효소(플라스민, 혈장 칼리크레인(kallikrein), 트립신), 메탈로프로테아제(써모리신) 또는 시스테인계 단백질분해효소(카덮신 B 및 L) 등에 의해, 활성화된 상태인 이중사슬의 분자(two-chain molecule)로 전환되는데(참조: Stump, D. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261-17120-17126; Ichinose, A. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261-3486-3489; Goretzki, L. et al. (1992) FERS Letters. 297-112-118), 이때 3차 구조의 변형(conformational change)이 야기되며 피브린에 대한 친화성은 오히려 감소되는 것으로 알려져 있다(참조: Shunji, K. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:12377-12381).

scu-PA는 Zn²⁺이 존재할 때 그것의 조절적 역할에 의해 피브린과 가역적, 특이적으로 포화되는 반응을 나타낸다(참조: Hunsain, S.S.(1993) J. Biol. Chem. 268:8574-8579). 실제로, scu-pA는 피브린 응괴 표면에서 t-pA와는 다른 방법으로 활성화되어 피브린을 분해할 뿐만 아니라, 혈액내 플라스미노겐, 피브리노겐, 팩터 V(factor V) 그리고 팩터 Ⅷ 등의 단백질을 분해하지 않아 출혈을 일으키지 않는 것으로 알려지고 있다(참조: Liu, J. and Gurewich, V. (1992) Biochemisrty 31-6311-6317). 또한, scu-PA는 uPA와는 달리 세린계 단백질분해효소 억제제에 대한 반응성 및 기타 여러 효소적 특성이 차이나는 유로키나제의 자이모겐(zymogen)형으로 밝혀져 있다(참조: Gurewich, V. et al. (1984) J. Clin. Invest. 73:1731-1739). 그리고, t-PA와는 달리 혈장내에서 반응성이 없으며 안정하고, 특히 다른 세린계 단백질분해효소 계통의 자이모겐들과는 달리 고유활성을 가지고 있는 것으로 연구되고 있다(참조: Lijnen, H. R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265-5232-5236). 이러한 고유활성으로 scu-PA는 DIFP(diisopropyl fluorophosphate)에 대한 가역적 불활성화 같은 정성적인 특성의 차이도 가지고 있다(참조: Liu, J. and Gurewich, V.(1995) J. Biol. Chem. 270-8408-8410).

예전부터 이미 여러 연구자들은 요(참조: HUSAIN, S. et al. (1983) Arch. Biochem. Biochem. Biophys. 220:31-38)나 혈장(참조: Wun, T. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257-3276-3283)에서 scu-PA를 단일사슬 형태로 정제분리하였으며, 사람 scu-PA cDNA를 E. coli(참조: Holmes, W. E. et al. (1985) Bio/Technology 3:923-92914; Hibono, Y. et al. (1988) Agric. Biol. Chem. 52:329-336; Brigelius-Flohe, R. et al. (1992) Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:640-649; Orsini, G. et al. (1991) Eur. J. Biochem. 195:691-697), 효모(참조: Melnick, L. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:801-807) 및 포유동물세포(참조: Wun, T. C. et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:7262-7268; Skriver, L. et al. (1982) Eur. J. Biol. Chem. 124:409-414; Nielsen, L. S. et al. (1982) Biochemistry 21:6410-6415; Nelles, L. et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:5286-5689; Winkler, M. E. et al. (1985) Biotechnology 3:990-1000) 등의 여러 가지 발현체계에서 발현하고 정제하려는 시도도 있었다. 재조합 scu-PA가 E.coli에서 발현되었을 때는 세포질에 봉입체(inclusion body)로 축적되기 때문에, 재결합(refolding)을 통해 생물학적으로 활성이 있는 scu-PA를 얻으려는 많은 노력이 있었으나, 그 수율은 여전히 낮았다(참조: Hibono, Y. et al. (1988) Agric. Biol. Chem. 52:329-336; Brigelius-Flohe, R. et al. (1992) Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:640-649; Winkler, M. E. et al. (1986) Biotechnology 25:4041-4045; Derman, A. et al. (1993) Science 262:1744-1747). 반면에, 전술한 포유동물세포 발현체계의 경우에는 완전한 활성을 갖는 scu-PA 단백질을 생산하기는 하나, 그의 수율이 매우 낮다는 문제점이 있었다. 따라서, scu-PA 단백질을 대량으로 발현하는 포유동물 세포주의 개발이 당업계에서 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 전술한 당업계의 요구를 충족시킬 수 있는 재조합 scu-PA 단백질의 제조방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 강력한 CMV(cytomegalovirus) 프로모터하에서 scu-PA 단백질을 대량 발현시킬 수 있는 신규의 동물세포 발현벡터를 개발하고, 이것을 CHO(Chinese Hamster Ovary) 동물세포에 트랜스펙션시켜 재조합 동물세포주를 개발함으로써, 그 세포주로부터 생리적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 scu-PA가 다량으로 생산 및 분비되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫번째 목적은 CMV를 프로모터로 사옹하는 재조합 scu-PA의 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 목적은 전기 발현벡터로 트랜스펙션된 재조합 CHO 세포주를 제공하는 것이다.

본 발명의 세번째 목적은 전기 재조합 CHO 세포주를 배양하고, 그의 배양상층액으로부터 재조합 scu-PA를 수득하는 공정을 포함하는, 재조합 scu-PA의 제조방법을 제공하는 것이다.

제1도는 재조합 발현벡터 pcPUK를 구축하는 과정 및 그의 유전자 지도를 나타낸다.

제2도는 재조합 CHO 세포주들의 비생산성(specific productivity)을 비교한 그래프이다.

제3도는 재조합 CHO 세포주들의 면역블롯 분석 결과를 나타내는 사진이다.

제4도는 재조합 CHO 세포주들의 게놈 DNA를 서던블롯 분석한 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명자들은 인간 신장 유래의 scu-PA cDNA가 CMV(cytomegalovirus) 프로모터에 의해 발현이 조절되는 동물세포 발현벡터를 제조하였다. 즉, 플라스미드 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)을 제한효소 HindIII 및 EcoRV로 절단하고, 인간의 scu-PA cDNA를 삽입하여, 보다 많은 scu-PA 단백질을 발현시킬 수 있는 새로운 재조합 동물세포 발현벡터 pcPUK를 개발하였다. 이때, 발현벡터 pcPUK는 scu-PA 단백질의 411개 아미노산 뿐만 아니라, 그의 N-말단에 20개 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드를 코딩하고 있다.

이렇게 제조된 발현벡터 pcPLK를 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자가 결실된 CHO 세포(DG44)에, DHFR 유전자를 가진 미니진(minigene) 플라스미드와 함께 트랜스펙션시켜 재조합 세포주를 얻었다. 이어, MTX(methotrexate)에의 적응을 통해 최종적으로 scu-PA를 다량으로 분비하는 동물세포주를 확립하였다. 이 재조합 CHO 세포주를 배양함으로써, 생리적 활성을 갖는 scu-PA를 세포배양액으로부터 다량으로 얻게 된다.

이렇게 얻어진 재조합 세포주를 이용하면, scu-PA 단백질을 대량 공급하게 되어 심혈관 질환 치료를 의한 혈전용해제로서 사용할 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 븐 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 의한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범의가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : scu-PA의 발현을 위한 발현벡터의 제조

동물세포에서의 scu-PA 발현을 의한 재조합 벡터를 제조하기 위하여, scu-PA 유전자는 사람 TCL-598 세포주에서 유래된 scu-PA 유전자를 가지고 있지만 발현양이 낮은 재조합 CHO 세포주(참조: H.G. Kim et al. (1995) Cytotechnology 17:165-172)로부터 게놈 DNA를 분리하고 PCR하여 얻었다. PCR에 사용된 센스 프라이머는 5'-CCCAAGCTTATGAGAGCCCTGCTGGCGCGCCTGCTTCTC-3'이고, 안티센스 프라이머는 5' -TCCCCCGGGTCAGAGGGCCAGGCCATT-3'이 었다. 센스 프라이머에는 HindIII 제한효소 부위가, 안티센스 프라이머에는 SmaI 제한효소 부위가 각각 삽입되어 있도록 제조하여 클로닝을 용이하게 하였다.

이들 프라이머를 이용하여 얻은 약 1.3kb scu-PA PCR 절편(사람 scu-PA 유전자의 -6번 염기부터 코딩부위의 1293번 염기까지를 포함하는 DNA 절편)을 SmaI과 HindIII 제한효소로 차례로 절단한 후, 미리 제한효소 HindIII와 EcoRV로 절단된 플라스미드 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)에 삽입하여 pcPUK로 명명되는 재조합 발현벡터를 제조하였다(참조: 제1도). 발현벡터 pcPLK는 scu-PA 단백질의 발현 개시코돈 ATG 및 종결코돈 TAG까지 모두 431개 아미노산을 코딩하게 되지만, 여기에는 세포외 분비에 필요한 신호서열(signal sequence)로서 20개 아미노산을 N-말단에 가지고 있기 때문에, 발현된 scu-PA 단백질이 세포밖으로 분비될 때 신호 펩타이드는 완전히 절단되어 성숙 scu-PA를 얻을 수 있도록 한다.

실시예 2 : 재조합 CHO 세포주의 제조 및 재조합 scu-PA의 발현

재조합 CHO 세포주를 제조하기 위하여, 우선 CHO(DG44, DHFR^-) 세포는 α-MEM(뉴클레오시드와 데옥시뉴클레오시드의 첨가 유)(GibcoBRL, USA)에 10% FBS를 첨가한 성장배치에서 37℃, 5% CO₂조건하에서 배양하였으며, 이 CHO 세포주에 약 300:1∼100:1 정도의 다양한 비율로 혼합된 발현벡터 pcPLK와 DHFR미니진 플라스미드(참조: Som. Cell Mol. (1986) 12:555-556)을 동시에 트랜스펙션시켜, scu-PA 유전자들이 CHO 세포내 염색체에 여러 가지 형태로 삽입되도록 하였다. DHFR 미니진은 선별마커 및 MTX에 의한 유전자 증폭을 의해 사용하였으며, 재조합 유전자들을 CHO 세포내로 도입하기 위한 방법으로는 변형된 CaCl₂방법이나 리포펙타민(lipofectamine) 방법을 사용하였다.

이와 같이 트랜스펙션된 CHO 세포주들은 α-MEM(뉴클레오시드와 데옥시뉴클레오시드의 첨가 무)(GibcoBRL, USA)에 10% FBS를 첨가한 선택배지에서 37℃, 5% CO₂조건하에서 48시간 동안 배양한 다음, 세포를 1:10의 부피비로 계대 배양하고 선택배지에서 2주동안 콜로니를 형성시켰으며, 생성된 각각의 콜로니들을 분리하여 마이크로플레이트에서 성장시켰다. 이들 콜로니들중에서 scu-PA를 발현하는 재조합 세포주들을 선별하기 위하여, 세포외로 분비된 scu-PA의 활성은 피브린 플레이트를 사용한 피브린 용해활성(참조: 하기의 (i))의 측정으로 조사하였다. 재조합 세포주들의 배양배지에는 아프로티닌을 10KIU/ml 농도로 첨가함으로써, scu-PA가 단일사슬에서 이중사슬로 전환되는 것을 방지하였다.

그런 다음, 삽입핀 scu-PA 유전자의 증폭을 통해 발현양을 증가시키기 위하여, 5, 10, 20, 50, 100, 200nM 다양한 농도의 MTX가 첨가된 24웰 배양 플레이트에서 각 재조합 세포주들의 MTX적응을 수행하였다. 약 2주 정도 배양한 후, 생성된 클로니들을 확인하고 각 세포주마다 가장 높은 두 가지 농도의 MTX에 적응된 것들을 선별하여 다음 단계에 적응시켰다. 첫째 단계에 적응된 각 클론들은 MTX 농도를 2배씩 높여가며 배양하였으며, 100nM 이상의 농도에 적응되었을 때 아미드 분해활성(amidolytic activity)(참조: 하기의 (ii))을 측정하는 scu-PA 활성을 조사하여 각각의 클론들과 상호 비교하였다. 계속적인 MTX 적응과정을 거치면서 상대적으로 높은 활성을 보이는 클론들을 선정한 후, 안정적으로 scu-PA를 발현하며 세포성장속도가 정상 CHO 세포주와 유사한 재조합 CHO 세포주를 선별하였다(참조: 제2도).

제2도에서, 제 1레인 내지 제 10레인은 재조합 CHO 세포주 MGpUK-4, MGpUK-5(2uM MTX에서 적응), MGpUK-12(2uM MTX에서 적응), MGpUK-13(1uM MTX에서 적응), MGpUK-18(1uM MTX에서 적응), MGpUK-19(1uM MTX에서 적응), MGpUK-34(1uM MTX에서 적응), MGpUK-40(1uM MTX에서 적응), MGpUK-58(10uM MTX에서 적응), MGpUK-59(1uM MTX에서 적응)를 각각 나타내고, 제 11레인은 TCL-598 세포주에서 유래된 scu-PA 유전자를 포함하는 종래의 재조합 CHO 세포주(참조: H.G. Kim et al. (1995) Cytotechnology 17:165-172)(10uM MTX에서 적응)를 나타낸다. 제2도에서 보듯이, 본 발명의 재조합 세포주들은 기존의 다른 세포주들보다 훨씬 향상된 정도로 scu-PA를 분비함을 알 수 있으며, 이들 재조합 세포주들은 10% FBS를 가진 α-MEM 선택배지에서 배양하였을 때, 약 30-40ug/10⁶cells/day 정도의 비 생산성(specific productivity)을 보여주고 있는 바, 이 값을 달리 표현하면 평균 약 6,000 IU/10⁶cell/day(2,000 IU/ml) 정도로 나타낼 수 있고 계속되는 배양에서도 높은 발현양을 안정하게 유지하고 있음을 확인하였다. 이러한 생산성은 scu-PA와 유로키나제(이중사슬 형태)의 단백질과 반응하여 단백질의 양을 알아낼 수 있는 ELISA에 의해 정량적으로 재확인할 수 있었다.

(i) scu-PA의 피브린 용해활성

0.7% 피브리노겐을 함유한 용액 10ml에 트롬빈(100NIH unit/ml) 100ul를 가하여 만든 피브린 플레이트에 배양상층액 10ul를 주입하고, 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 나타나는 피브린의 용해도와, 다양하게 희석한 유로키나제의 피브린 용해도를 위와 같은 방법으로 측정한 값을 기준으로 비교하였다.

(ii) scu-PA의 아미드 분해활성

scu-PA의 아미드 분해활성은 96웰 플레이트에 재조합 세포주들로부터 얻은 배양상층액 50ul를 두 군데의 웰에 넣고, 반응액(50mM Tris/HCl(pH 8.8), 80mM NaCl, 0.02% Tween 80) 30ul를 첨가한 다음, 한쪽에는 플라스민 완충용액 (50mM sodium phosphate, pH 7.4) 10ul를 넣었고, 다른 쪽에는 플라스민(0.5U/ml) 10ul를 넣고 37℃에서 20분간 방치하여 scu-PA를 활성화시켰다. 그 다음에, 아프로티닌(100KIU/ml) 10ul를 각각 첨가하여 플라스민의 반응을 정지시킨 다음, S-2444 펩타이드(Sigma Chemical Co., USA) 기질용액(반응액 내의 0.6mM S-2444)을 각각 100ul씩 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켜, 발색정도를 405nm에서 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. scu-PA의 활성은 플라스민을 가하고 scu-PA를 활성화시켜 얻은 값과 플라스민을 가하지 않고 얻은 값의 차이를 같은 방법으로 얻어진 다양한 농도의 표준 유로키나제의 활성과 비교하여 결정하였다.

실시예 3 : 면역블롯 분석

실시예 2에서 발현된 scu-PA 단백질의 분자량을 확인하고 이중사슬 형태로의 전환여부를 알아보기 위하여, 토끼 항-scu-PA 다클론항체로 면역블롯팅하였다. 즉, 1uM MTX에 적응된 재조합 세포주들을 배양하여 얻은 배양상층액을 2x 단백질 시료용 완충용액과 1:1로 섞은 후, 환원 조건에서 12% SDS-폴리아크릴아미드 젤로 전개하고 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 1차 항체로는 토끼 항-scu-PA 다클론항체(Techrloclone사, USA)를 1:500으로, 2차 항체로는 퍼록시다제가 표지된 염소 항-토끼 IgG를 1:1000으로 희석하여 사용하였고, DAB(3,3'-디아미노벤지딘)를 기질로 이용하였다(참조 : 제3도).

제3도에서, 제 M레인은 분자량 마커이고, 제 1레인은 트랜스펙션되지 않는 CHO(DG44, DHFR^-) 세포이며, 제 2레인 내지 제 8레인은 재조합 CHO 세포주 MGpUK-4, MGpUK-5, MGpUK-12, MGpUK-13, MGpUK-34, MGpUK-49, TCL-598 세포주에서 유래된 scu-PA 유전자를 포함하는 종래의 재조합 CHO 세포주(참조: H.G. Kim et al. (1995) Cytotechnology 17:165-172)(10uM MTX에서 적응)를 각각 나타낸다. 제3도에서 보듯이, 본 발명의 재조합 CHO 세포주에서 발현되는 scu-PA는 종래의 CHO세포주에서 발현되는 scu-PA와 유사한 크기인 약 50∼55kDa의 분자량을 가지고 있었으며, 약 90% 이상이 단일사슬 형태로 존재한 반면에 약 10% 정도만이 각각 약 31∼33kDa 및 18∼20kDa 크기의 서브유닛을 가진 이중사슬 힝태로 존재함을 확인할 수 있었다. 또한, 발현된 scu-PA가 50∼55kDa 크기의 단백질로서 크기가 약간 다르게 두개로 나타나는 것은 아마도 프로세싱 과정 중에서 글리코실레이션이나 포스포릴레이션 정도의 차이에 의한 것으로 추측된다. 실제로 세포내(세포용해물)에 있는 scu-PA들은 약 50kDa 크기를 갖는 단백질인 바, 세포외로 분비되는 과정에서 scu-PA 단백질들이 완전히 프로세싱됨으로써 크기가 일부 증가하였음을 예측할 수 있었다.

실시예 4 : 게놈 서던블롯 분석

scu-PA 유전자가 재조합 CHO 세포주 염색체의 어느 부분에 위치하는지와 그의 복제수(copy number)를 확인하여 다양한 재조합 세포주를 얻기 위하여, 1∼2uM MTX 농도에 적응된 재조합 세포주들의 게놈 DNA를 분리한 후, EcoRI 제한효소로 절단하고 0.8% 아가로스 젤에서 전개하였다. 전개된 DNA들은 나일론 막으로 옮긴 다음, [³²P-dCTP]가 표지된 scu-PA DNA 프로브로 혼성화(hybridization)하여 나타나는 밴드 패턴을 관찰하였다(참조: 제4도).

제4도에서, 제 1레인은 트랜스펙션되지 않는 CHO(DG44, DHFR^-) 세포를 나타내고, 제 2레인은 TCL-598 세포주에서 유래된 scu-PA 유전자를 포함하는 종래의 재조합 CHO 세포주(참조: H. G. Kim et al. (1995) Cytotechnology 17-165-172)(10uM MTX에서 적응)를 나타내며, 제 3레인 내지 제 13레인은 재조합 CHO 세포주 MGpUK-4, MGpUK-5, MGpUK-12, MGpUK-13, MGpUK-16, MGpUK-18, MGpUK-19, MGpUK-34, MGpUK-46, MGpUK-49, MGpUK-58을 각각 나타낸다. 제4도에서 보듯이, 재조합 세포주들의 염색체 DNA내에 존재하는 scu-PA 유전자들의 삽입된 형태와 복제수를 알 수 있는데, 대략 4가지 유형으로 나눌 수 있었으며, 삽입된 scu-PA 유전자가 충분히 증폭되어 있음을 알 수 있었다. 또한, 삽입된 유전자의 유형에 따라 세포의 형태와 scu-PA 생산량이 비슷하게 나타남을 알 수 있었기 때문에, 재조합 세포주의 선별에 기준으로 이용할 수 있을 것이다.

이들 재조합 CHO 세포주 중에서, MGpUK-5를 MGpUK라 명명하고,1997년 10월 23일 국제기탁기관인 재단법인 한국세포주연구재단(Korean Cell Line Research Foundation: KCLRF)에 기탁번호 KCLRF-BP-00015로 기탁하였다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 강력한 발현벡터 pcPLK로 트랜스펙션된 재조합 CHO 세포주는 생리적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 scu-PA를 안정적으로 다량 생산 및 분비한다. 이러한 재조합 세포주를 이용하면, 혈전용해제로 사용되는 scu-PA 단백질을 대량으로 공급할 수 있다.

Claims (4)

1. 인간 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(single chain urokinase-type plasminogen activator)의 cDNA를 포함하며, 그의 발현이 CMV (cytomegalovirus) 프로모터에 의해 조절되는, 하기와 같은 유전자 지도를 갖는 발현벡터 pcPUK:
2. 제1항의 발현벡터 pcPUK 및 DHFR(dihydrofolate reductase) 미니진 (minigene) 플라스미드로 동시에 트랜스펙션된 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주.
3. 제1항의 발현벡터 pcPUK 및 DHFR(dihydrofolate reductase) 미니진 (minigene) 플라스미드로 동시에 트랜스팩션된 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포주 MGpUK(KCLRF-BP-00015).
4. (i) 제1항의 발현벡터 pcPUK 및 DHFR(dihydrofolate reductase) 미니진(minigene) 플라스미드를 DHFR 유전자가 결실된 CHO 세포주(DG44)에 동시에 트랜스펙션시켜 재조합 세포주를 제조하는 공정;

   (ii) 전기에서 제조된 재조합 세포주를 MTX(methotrexate)에 적응시켜, 세포내의 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자의 유전자를 증폭시키는 공정; 및,

   (iii) 전기에서 유전자 증폭된 재조합 세포주를 배양하고, 배양상층액으로부터 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자를 수득하는 공정을 포함하는,

   재조합 단일사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자의 제조방법.