KR19990048898A

KR19990048898A - 비름의 항바이러스성 단백질(amaranthin) 유전자

Info

Publication number: KR19990048898A
Application number: KR1019970067725A
Authority: KR
Inventors: 권석윤; 백경희
Original assignee: 백경희
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 1999-07-05

Abstract

본 발명은 비름(Amaranthus viridis)으로부터 분리한 신규의 항 바이러스성 단백질 amaranthin 유전자를 제공한다. 또 상기 단백질을 암호화하는 유전자로부터 번역되는 아미노산서열을 가지는 항바이러스성 재조합 단백질을 제공한다.

Description

비름의 항바이러스성 단백질(ａｍａｒａｎｔｈｉｎ) 유전자

본 발명은 비름(Amaranthus viridis)으로부터 분리한 신규한 유전자에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 나물등 으로 식용되는 비름과식물인 참비름(Amaraanthus viridis)에서 발현되는 항바이러스성 단백질인 amaranthin을 암호화하는 유전자 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 항바이러스성 단백질에 관한 것이다. 자리공 및 분꽃 등의 중심자목을 주종으로 한 항바이러스성 식물단백질에 대한 연구는 양자리공에서 양자리공 항바이러스성 단백질(PAP : Phytolacca antiviral protein)을 순수분리한 것을 시초로 하여 시작되었다.(Irvin, J. D., Arch. Biechem. Biophys., 169 : 522∼528, 1975). 그 후 여러 식물에서 항바이러스성 단백질이 분리되었는데, 대표적인 것으로 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis)에서 분리한 리신(Ricin)(Halling, K. C. et al, Nucleic Acid Res., 13 : 8019∼8033, 1985), 분꽃(Mirabilis jalapa)에서 유래한 미라빌리스 항바이러스 단백질(MAP : Mirabilis antiviral protein)(Kataoka, J. et al., J. biol. Chem., 266 : 8426∼8430, 1991) 및 트리코산테스 키릴로위(Trichosanthes kirilowii)에 있는 α-트리코산틴(α-trichosanthin)(Zhang, X et al, Nature, 321 : 477∼478, 1986)등이 그 예들이다. 이들 항바이러스성 단백질은 리보좀 불화성화 단백질(RIP : ribosome inactivating protein)의 일종으로 RNA N-글리코시다제 활성(N-glycosidase activity)이 있는 것으로 알려져 있다.(Endo, Y. et al., J. Biol. Chem., 263 : 8735∼8739, 1988).

이러한 활성을 지닌 RIP의 영향을 받지 않고 RIP를 합성하는 식물체가 안전하게 존재할 수 있는 메카니즘은 자기 RIP에 대하여 상대적으로 저항성을 지닌 리보좀을 생성하거나, 또는 RIP가 활성되기 전에 신호 펩타이드(signal peptide)에 의하여 소포체와 골지체를 거쳐 세포밖으로 이동되기 때문인 것으로 추측된다.

일반적으로, RIP는 크게 두가지 타잎으로 분류된다. 타잎 1의 RIP에는 대표적으로 PAP, MAP, 트리코산틴 등이 속하는데, 이들 타잎 1 RIP들은 구조적으로 매우 유사하며, 대부분 한 개의 폴리펩타이드로 이루어져 있다. 특히 전기 여러 가지 RIP를 합성하는 유전자의 염기서열을 결정하여 비교한 결과, 대부분의 타잎 1 RIP의 유전자 서열에는 인트론(intron)이 없으며, 이로부터 합성된 mRNA는 N-말단과 C-말단에 단백질이 성숙되는 과정에서 제거되는(post-translational cleavage) 펩타이드를 포함한 RIP의 전구체 단백질을 암호화 하고, N-말단에는 소수성(hydrophobic) 아미노산으로 구성된 신호 펩타이드를 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다.(Kataoka, J. et al., J. Biol. Chem,. 266 : 8426∼8430, 1991). 또한, 타잎 2의 RIP에는 대표적으로 리신 등이 속하는데, 타잎 2 RIP는 두개 혹은 네 개의 폴리펩타이드로 구성되어 있으며, 이 가운데 적어도 한 개의 폴리펩타이드는 RNA N-글리코시다제 활성(N-glycosidase activity)을 나타내는 것으로 보고되고 있다.(Lewis, M.S. et al., J. Biol. Chem., 261 : 11571∼11577, 1986). 한편, 전기 RIP가 지닌 바이러스 저항성을 이용하여, 유전공학적 기법에 의한 바이러스 저항성 식물의 제조나, RIP의 AIDS 및 암 치료제로서의 이용 가능성이 모색되고 있으며(Lodge, J. K. et al., Proc Natl. Acad. Sci., USA, 90 : 7098∼7093) ; Ramarkrishnan, S. D. et al., Annu. Rev. Rharmacol. Toxicol., 32 : 579∼621, 1992), 특히, 바이러스 감염에 의한 작물의 피해가 막심함에도 불구하고 뚜렷한 특효약이 없어 속수 무책인 현실을 감안하다면 바이러스 저항성이 부여된 형질전환 식물체의 제조는 매우 주요한 의의를 갖는다고 볼 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 비름(Amaraanthus viridis)으로부터 분리한 신규한 항바이러스성 단백질인 amaranthin의 유전자를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전기 항바이러스성 단백질이 유전자로부터 번역되는 아미노산 서열을 가지는 항바이러스 재조합 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위하여 비름과식물인 비름의 항바이러스 성질을 추적하여, 이로부터 항바이러스 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하고 공지된 항바이러스성 단백질 유전자와 비교한 후 염기서열을 결정하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 설명한다.

도 1은 비름의 잎 cDNA 라이브러리에 대한 중합효소 연쇄반응을 실시하여 제조한 반응산물을 아가로스 젤 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2는 비름 잎 cDNA 라이브러리에서 분리한 amaranthin의 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 amaranthin과 여러 리보좀 불활성화 단백질(RIP)의 활성부위의 아미노산 서열을 비교한 것이다.

본 발명은 비름(Amaranthus viridis) 잎으로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 분리한 총 RNA로부터 mRNA를 분리정제한 후 cDNA를 합성하는 단계; 비름의 cDNA로 부터의 항바이러스성 단백질 유전자 분리에 이용되는 프로브(probe)를 제조하기 위하여 자리공등 몇 종류의 식물로부터 분리한 공지된 항바이러스성 단백질 유전자의 염기서열을 비교하는 단계; 염기서열이 가장 잘 보존된 올리고뉴클레오티드를 플라이머(primer)로 하여, 전기에서 분리한 비름의 DNA에 대한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction : PCR)을 실시하는 단계; 제조된 PCR 반응산물을 아가로스 젤상에서 전기 영동하는 단계; 제조한 RIP 프로브(probe)를 이용하여 amaranthin 유전자를 순수분리 하고 순수분리한 amaranthin 유전자에 대하여 sanger의 다이디옥시 사슬 종결(dideoxy chain termination) 방법(Sanger, 1981)으로 전체 염기서열을 결정하는 단계로 구성된다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명하다.

실시예1 : 비름으로 부터의 cDNA 라이브러리 제조

비름(Amaranthus viridis) 잎 10g을 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음 RNA 추출용 완충용액(0.18M Tris, 0.09M LiCl, 45mMEDTA, 1% SDS)을 첨가하여 10,000rpm에서 20분간 원심분리한 후, 상등액을 취하고 페놀/클로로포름 추출(phenol/chloroform extraction)을 수행하여 단백질 및 여러 불순물을 제거하였다. 그런다음, 클로로포름 추출(chloroform extraction)을 한차례 수행한 후 상등액 취하여 LiCl을 이용하여 침전시켜서 총 RNA를 분리하였다. 분리한 총 RNA를 올리고(dT) 셀룰로스 칼럼을 이용하여 mRNA를 분리하고 정제하였으며, 분리한 5μg의 mRNA를 취하여 ZAP-cDNA 합성키트(Stratagene, U.K.)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA에 EcoRI 어댑터(adapter)를 붙인 후, 세파크릴(Sephacryl) S-400 스펀 칼럼으로 합성된 cDNA를 크기에 따라 분획하였다. 분획된 DNA를 Uni-Zap XR 벡터(Stratagene, U.K.)와 결합한 후 패키징 익스트랙트(packaging extract)를 사용하여 실험실적 패키징(in-vitro packaging)을 수행하였다.

실시예2 : 항바이러스성 단백질 유전자 분리를 위한 프로브의 제조

비름의 cDNA라이브러리로 부터의 항바이러스성 단백질 유전자 분리에 이용되는 프로브를 제조하기 위하여, PCR을 이용한 증폭을 다음과 같은 방법으로 실시하였다: 공지된 4가지 항바이러스성 단백질 즉, 양자리공 항바이러스성 단백질의 PAP(Phytolacca antiviral protein)(Irvin, J. D., Arch. Biechem. Biophys., 169 : 522∼528, 1975), 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis)의 리신(Ricin) (Halling, K. C. et al, Nucleic Acid Res., 13 : 8019∼8033, 1985), 분꽃(Mirabilis jalapa)의 미라빌리스 항바이러스 단백질(MAP : Mirabilis antiviral protein)(Kataoka, J. et al., J. Biol. Chem., 266 : 8426∼3430, 1991) 및 트리코산테스 키릴로위(Trichosanthes kirilowii)의 α-트리코산틴(α-trichosanthin) (Zhang, X et al, Nature, 321 : 477∼478, 1986)을 암호화하고 있는 유전자의 염기서열을 상호 비교하여, 잘 보존된 RIP활성 부위를 참조하여 프라이머(primer)를 합성하였다. 따라서, RIP 활성부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드 5'-CGIGCIGC(T/C)TCIGANACCAT-3' 및 벡터(pBlueScript SK(-)) 올리고뉴클레오티드 5'-TCTAGAACTAGTGGATC-3'를 프라이머로 하여 PCR를 수행하였다. PCR은 DNA 합성기(DNA synthesizer, ABI, USA)를 이용하여 합성하고, DNA 열순환기(Cetus/Perkin-Elmer, USA)를 사용하여 Vent^tmDNA 중합효소(NEB, USA)로 변성(denaturation)(94℃, 1분), 결합(annealing)(53℃, 1분), 연장(extention)(72℃, 1분)을 30회(cycle) 진행시켰다. 반응이 종결된 다음 페놀/클로로포름/이소아밀알콜 혼합용액으로 상등액을 추출하고, NaCl을 200mM이 되도록 첨가한 다음, 전체부피의 2배에 해당하는 에탄올을 첨가하였다. 원심분리하여 증폭된 DNA를 분리하고, 이를 20ul의 TE용액에 현탁시켰다. 이렇게 제조된 PCR 반응산물을 아가로스 젤상에서 분리한 결과, 약 700bp의 DNA 단편이 합성되었음을 확인하였다(도 1). 도 1에서, 제 M레인은 1kb DNA 크기마커이며(GIBCO-BRL), 제 1레인은 전기 비름의 PCR 반응산물을 각각 나타낸다. 전기 약 700bp의 DNA 단편을 'AmPCR'이라 명명하였다.

실시예3 : 항바이러스성 단백질 유전자의 분리 및 염기서열 결정

Amaranthin 유전자를 분리하기 위하여 상기 실시예 2에서 증폭된 PCR 반응산물인 AmPCR 0.7kb 절편을 DIG_Labeling & Detection 키트(Boehringer Mannheim, GErmany)를 이용하여 표지하고 이를 프로브(probe)로 사용하였다. 먼저 82-mm 페트리 디쉬(petri dish)에 약 6×10⁵pfu의 프라크(plaque)가 형성되도록 대장균(E. coli) XL1-Blue에 파아지(phage)를 감염시켜, 37℃에서 12시간 배양하여 스크리닝을 수행하였다. 스크리닝으로부터 26개의 클론을 얻었고 클론 중 4개의 재조합 Uni-ZAP XR 파아지들이 지니고 있는 파아지미드(phagemid)를 대장균인 XL1-blue로 옮기기 위하여 R408 헬퍼파지(helper phage)를 이용하여 생체내 절단(in vivo excision)을 수행하였으며, 생성된 콜로니들을 각각 3개씩 선별하여 알칼리 용혈(alkaline detergent) 방법으로 플라스미드를 분리하고, EcoRI과 KpnI으로 이중절단하여 amaranthin 유전자를 지니고 있는 콜론들을 선별하였다.

염기서열을 결정하기 위하여 분리한 콜론 중 19번 콜론을 선택하여, pBlueScript SK(-) 벡터에 서브클로닝(subcloning)시켰다. 19번 클론 DNA를 EcoRI과 KpnI으로 이중절단한 후 자가연결(self ligation)을 수행하여 형질전환가능한 XL1-Blue에 형질전환시킨 다음, 50㎍/㎖ 앰피실린이 함유된 LB 배지(10g/1 Bactotrypton, 5g/1 Yeast exrtact, 5g/1 Nacl, pH 7.5)에서 생성된 콜로니들을 선별하여 알칼리 용혈 방법으로 플라스미드를 분리하여, 0.7kb 절편을 지니고 있는 콜로니들을 선발하였다.

각 콜로니로부터 얻은 DNA를 정제하여 SK 프로모터 프라이머, T7 프로모터 프라이머를 사용하여 디데옥시 사슬 종결법으로 시쿼나제(Sequenase, USB)를 사용하여 amaranthin cDNA 삽입체(insert)의 염기서열을 결정하였다. 이와 같이 염기서열이 결정된 플라스미드를 pAVRIP19이라고 명명하고, 상기 플라스미드벡터가 도입된 미생물은 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pAVRIP19로 명명하였으며 1997년 11월 13일 한국생명공학연구소 유전자 은행에 기탁번호 KCTC 8850P로 기탁하였다.

한편, 도 2에서 보는 바와 같이, pAVRIP19이 지니고 있는 amaranthin cDNA 삽입체의 염기서열을 결정한 결과, 전체크기는 약 1.047bp 이며, 이 가운데 항바이러스성 단백질을 합성하는 구조유전자 부분은 813bp로 이루어진 하나의 개방 해독틀(open reading frame)로 되어 있으며, 대부분의 식물이나 동물의 mRNA에서 볼 수 있는 폴리아데닐 신호(polyadenylation signal)가 폴리아데닐 부위(polyadenylation site)에 있음을 볼 수 있었다. 도 2에서 (*)는 종결코돈을 나나내며, 아미노산 서열은 IUPAC 명명법에 따라 작성되었다.부위는 여러식물에서 RIP활성에 관여하는 매우 잘 보존된 아미노산을 가각 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 항바이러스성 단백질은 아미노산 286개로 구성된 약 30kDa의 단백질로서, 인트론이 없는 타잎 1 RIP임을 알 수 있었다. 도 3은 현재까지 알려진 리보좀 불활성화 단백질(RIP)들, 즉, cPAP, Abrin A chain, Luffin-a, MAP, Ricin A chain 및 Trichosanthin 등에서 발견되는 아미노산 서열이 분리한 amaranthin 유전자에서도 존재함을 보여주며(AIQMVAEAARFKYI), 이 부위가 RIP의 효소활성을 나타내는 활성부위로 추측할 수 있었다. 그리고 MAP 유전자의 아미노산 서열과 비교해 본 결과 30.6% 동일성을 나타내었으며, PAP와는 25%의 동일성을 알 수 있었다.

이상에서 실시예 및 실험결과에서 입증하였듯이, 본 발명에서는 식용이 가능한 비름에서 신규한 리보좀 불활성화 단백질의 하나인 amaranthin 유전자를 순수분리하였으며, 이러한 항바이러스성 단백질 유전자를 이용하여 재조합 amaranthin에 의해 생물학적으로 활성을 지닌 항바이러스성 단백질을 보다 용이하게 생산할 수 있음은 물론 식물체에 도입하여 항바이러스성 식물체를 제작할 수 있으며 나아가 AIDS 등 치료에 사용되는 면역결합체 등의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있어 육종 및 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

비름(Amaranthus viridis)에서 분리한 하기와 같은 염기서열을 갖는 항바이러스성 단백질 amaranthin 유전자 :
amaranthin 유전자를 포함하는 발현 벡터 pAVRIP19가 도입된 미생물 Agrobacterium tumefaciens LBA4404/pAVRIP19 (KCTC 8850P).
제2항 발현 벡터를 이용하여 생산된 비름의 항바이러스성 재조합 단백질(amaranthin).