KR19990029815A

KR19990029815A - 전사 인자의 표적 유전자의 확인 방법

Info

Publication number: KR19990029815A
Application number: KR1019980038105A
Authority: KR
Inventors: 울프강 디알 월스트; 알래인 디알 프로치안츠
Original assignee: 게에스에프 포슝스첸트룸 퓌어 움벨트 운트 게준트하이트 게엠베하; 센트리 내쇼날 데 라 레체르체 시엔티피큐
Priority date: 1997-09-15
Filing date: 1998-09-15
Publication date: 1999-04-26
Also published as: JPH11187876A; EP0902092A3; US6656735B1; DE19740578A1; EP0902092A2

Abstract

본 발명은 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자의 확인 방법으로서, 하기와 같은 단계로 이루어지는 방법에 관한 것이다:

(a) 배양액내의 진핵 세포로 기능적 배열로 적어도 하기의 성분들을 포함하는 유전자 트랩 벡터를 도입하는 단계:

- 리포터 유전자

- 폴리아데닐화 부위

- 선택 마커 유전자;

(b) 상기 벡터를 함유하는 세포를 선택하는 단계;

(c) 상기 선택된 세포를 분석될 전사인자, 대응하는 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 대응하는 전사인자의 보조인자와 접촉시키는 단계;

(d) 리포터 유전자 활성의 변화를 갖는 세포를 확인하고 배양하는 단계; 및

(e) 상기 표적 유전자, 전사인자의 보조인자 및/또는 전사인자 책임있는 성분을 확인하는 단계.

Description

전사 인자의 표적 유전자의 확인 방법

본 발명은 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자(cofactor)의 확인 방법에 관한 것이다.

후생동물 분화를 조절하는 수많은 유전자들 중에서, 호메오유전자(homeogene)들은 세포 종족 결정과 다세포 도메인의 형태학적 동일성을 이룩하는데 중요한 역할을 담당한다. 그것들은 유기체의 모든 조직층에서 그리고 분화동안 다른 단계들에서 발현된다. 그것들은 고도로 보존된 60개의 아미노산 DNA 결합 도메인 호메오도메인에 의해서 특징되는 전사 인자의 큰 부류(family)인 호메오단백질을 코드한다.

포유동물의 인그라일드(Engrailed) 호메오단백질, 인그라일드-1 및 인그라일드-2(En1 및 En2)는 처음에는 도메인내의 1 원체절(somite; En1의 경우에) 및 5 원체절(En2의 경우에) 단계에서 조상 신경피막에서 발현되고, 후에 중뇌-후뇌 영역으로 분화할 것이다. 그리고 나서 En1은 척수에서, 원체절의 피부근절(dermomyotome)에서 그리고 limb bud의 ventral 외배엽에서 발현된다. En1은 중/후뇌, 가슴판(sternum) 및 ventral limb bud의 분화에 필수적임을 유전자 불활성화 실험은 보여주는 반면에, En2 돌연변이는 약간의 중/후뇌의 표현형(phenotype)을 형성하는데만 단지 역활할 뿐이다.

그러나 En2에 의한 En1의 유전자 치환 실험은 두 단백질이 동일한 생화학적 특성을 가지고 En1과 En2의 돌연변이에서 관찰되는 뇌 분화에서 다른 표현형들이 초기 신경 생성과정동안 두 유전자의 발현시 일시적 차이에 기인됨을 보여준다. 그러므로, 이 연구에서 En1 및 En2는 흔히 인그라일드로서 요약되고 불린다.

인그라일드의 경우에서 예시된바와 같이, 발현 패턴 및 분명한 호메오유전자로 돌연변이화된 뮤린 태아(embryo)에서 생성되는 형태학적 변형의 분석은 분화동안 이들의 호메오유전자의 기능을 이해하는데는 별로 가치가 없었다. 그러나 그들의 정확한 기능 모드의 이해는 그들의 기능을 발휘하게 하는 유전적 네트워크의 확인에 필요하다. 인그라일드 돌연변이체 표현형을 고려하면, 잠재적 표적은 조직 패턴닝(비밀화된 분자들), 세포 형태의 특이화(다른 전사 인자들), 세포 유주(세포 및 기질 점착 분자) 및 세포 형태발생(구조 단백질)에 관련되었을 것이다.

초파리에서, 돌연변이체에서 비표지화 기능 상관관계의 유전적 접근 및 다사성(polytene) 염색체에서 DNA-결합 부위 조사는 어떠한 주어진 전사인자의 표적유전자를 스크린할 수 있게 하였다. 이러한 기술의 응용은 헤드게호그(hedgehog), 데카펜타프레긱(decapentaplegic), 구비투스-인테루푸스(cubitus-interrupus(ci)), 폴리호메이틱(polyhometic) 및 β3-투불린(β3-tubulin)과 같은 수많은 추정의 인그라일드 표적 유전자들을 확인케 한다. 단지 ci 및 β3-투불린만이 인그라일드의 직접적인 표적유전자임을 보여진다. 과실파리에 사용되고 그리고 원칙적으로 그러한 유전적 경로에 접근을 부여하는 유전적 방법은 척추동물에는 용이하게 적용할 수 없는데 이는 스크린되어야 하는 매우 많은 자손 및 다사성 염색체의 무용성 때문이다. 척추동물에서, 대부분의 추정의 호메오단백질 표적 유전자는 프로모터 분석에 의해 또는 무척추동물, 주로 초파리에서 이미 확인된 유전자와의 상동성에 의해 우연히 확인되어 왔다. 대부분의 경우에서, 확인된 유전자가 진짜 표적유전자라는 증거는 오히려 부수적인 문제로 남아있다. 최근 NCAM에 대한 연구에 의해 밝혀진 몇가지 예외를 가지고, 이 표적 유전자의 거의 어느것도 생체내에서 호메오유전자에 의해 조절되지 않는 것이 밝혀진 것은 매우 주목할만하다.

유전자 트랩 벡터는 그 자체로 알려져 있었고 예를들면, Hill 및 Wurst, 1993a 및 Hill 및 Wurst, 1993b에 기재되어 왔다. 이 문헌들은 그들의 완전한 형태로 언급되어 있다.

-종래문헌(Literature)-

본 발명의 목적은 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자의 확인 방법을 제공하는 것인데, 상기 방법은 이들 성분, 표적 유전자 및 보조인자를 체계적으로 결정할 수 있게 하고 선행기술에서 알려진 결점을 피하게 한다.

이 목적은 하기와 같은 단계를 갖는 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자의 확인 방법에 의한 본원발명에 따라 달성된다:

(a) 배양액내의 진핵 세포로 유전자 트랩(trap) 벡터의 도입하는 단계, 상기 유전자 트랩 벡터는 기능적 배열로 적어도 하기의 성분들을 나타낸다:

- 리포터 유전자

- 폴리아데닐화 부위

- 선택 마커 유전자

(b) 이 벡터를 함유하는 세포를 선택하는 단계;

(c) 이 선택된 세포를 분석되어야 하는 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자와 접촉시키는 단계;

(d) 리포터 유전자 활성의 변화를 보이는 그러한 세포를 확인하고 배양하는 단계; 및

(e) 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자를 확인하는 단계.

도 1a 내지 1c은 클로닝 전략을 도시한다.

도 2a 내지 2c는 세균으로 생성된 EnHD는 DNA와 결합하고 배양액에서 세포로 효과적으로 내재화함을 도시한다.

도 3a 내지 3c은dt/BPAG1좌로서 트랩된 유전자의 확인을 보여준다.

도 4는 EnHD는 PC12 세포에서 BPAG1n mRNA의 수준을 조절을 보여준다.

도 5a 내지 5d는 EnHD는 인그라일드를 발현하는 케라티노사이트(keratinocytes)에서 BPA G1e mRNA와 BPAG1e 단백질 수준을 상승제어를 보여준다.

도 6a 내지 6d은 인그라일드는 시험관에서 BPAG1e 프로모터내의 여러곳에서 결합함을 보여준다.

도 7a 내지 7b은 인그라인드 2는 BPAG1e 프로모터 활성을 억제하고 EnHD는 이것을 활성화시킴을 보여준다.

도 8은 PT2 벡터 설명 및 본 발명의 방법에서 그것의 기능을 보여준다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 유전자 트랩 벡터는 적어도 리포터 유전자, 폴리아데닐화 부위 및 작동할 수 있는 결합에 배열되는 선택 마커 유전자를 함유한다. 그리고 나서, 만약 전사인자의 첨가후에 상기 리포터 유전자는 전사인자 책임있는 성분의 조절하에 있다면, 리포터 유전자의 전사는 이 유전자 트랩 벡터의 진핵세포의 게놈으로의 통합이 뒤따라 변형된다. 본 발명에 따라, 변형은 리포터 유전자의 유도 및 억제 즉, 전사 속도의 증가 및 감소를 의미한다. 리포터 유전자로서는 진핵세포에서 검출될 수 있는 어떤 유전자로도 사용될 수 있다. 예를들면, 그러한 유전자는 LacZ 유전자, 루시페라제 유전자, 녹색 형광 단백질 유전자 및 CAT 유전자이다. 당분야의 당업자에게 알려진 다른 적절한 리포터 유전자는 표적유전자 및 시험되는 전사인자에 의존하여 선택된다.

게다가, 발현을 위해, 폴리아데닐화 부위가 요구되는데, 이것은 리포터 유전자 및 선택적으로 벡터상에 배열된 유전자들에 작동적으로 연결된다.

유전자 트랩 벡터의 도입후에 통합된 형태로 상기 유전자 트랩 벡터를 함유하는 그 세포들을 확인하기 위해, 부가적으로 선택 마커 유전자가 도입된다. 선택 마커 유전자는 진핵세포에서 선택가능한 유전자, 예를들면, 네오마이신 또는 히그로마이신 내성 유전자와 같은 항생물질 내성 유전자일 수 있다.

유전자 트랩 벡터상에, 선택 마커를 위한 선택된 표적 세포에서 활성적인 프로모터가 배열될 수 있다. 가능한 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터 또는 β 액틴 프로모터이다.

본 발명의 구체예에서, 융합 단백질은 리포터 유전자와 내성 마커 유전자 사이에 형성되어 있고; 이 경우들에서는 리포터 유전자와 내성 마커 유전자는 자신의 프로모터를 지니지 않는다. 대신에, 표적 세포에서 발현되는 유전자로 통합에 뒤이어, 대응 유전자 산물의 발현이 세포성 프로모터에 의해 조절된다.

리포터 유전자와 내성 마커 유전자를 위한 자신의 프로모터를 지니지 않는 유전자 트랩 유전자의 사용에 의해, 활성 유전자로의 통합이 확인된다. 예를들면, 그러한 벡터는 스플라이스 수용체(acceptor) 부위, 리포터 유전자, 내성 마커 유전자 및 폴리아데닐화 부위를 함유한다. 마커 유전자의 예로는 lacZ 유전자를 들 수 있고, 내성 유전자의 예로는 네오마이신 내성 유전자를 들 수 있다.

표적 세포로의 유전자 트랩 벡터의 도입은 당업계에서 공지된 모든 방법에 의해 달성된다. 이것는 트랜스펙션 방법, 리포펙션 방법, 일렉트로포레이션 및 레트로바이러스 벡터를 이용하는 방법에 의해 예시된다.

유전자 트랩 벡터는 벡터상에 존재하는 유전자의 발현, 표적 세포로의 통합뿐만 아니라 그들의 복제를 보장하도록 제어 및 조절 서열등의 유전자들을 더 함유한다. 상세하게는 상기에서 언급된 Hill 및 Wurst, 1993a 및 Hill 및 Wurst, 1993b의 문헌을 참조하라.

유전자 트랩 벡터는 표적 세포로 도입되는데, 상기 표적 세포의 선택은 조사되어야 할 전사인자 책임있는 성분, 조사되어야 할 전사인자의 표적 유전자 및 조사되어야 할 전사 인자의 보조-인자에 의존된다. 예를들면, 바람직한 표적 세포는 태아 스템 세포 라인, 섬유아세포 세포 라인, 신경 세포 라인, 종양 세포 라인 및 효모 세포이다.

태아 스템 세포 라인으로의 유전자 트랩 벡터의 도입은 키메라 포유동물의 창조를 위해 사용될 수 있는 이점이 있다. 이와 같은 키메라와 야생형 동물과의 교차에 의해 통합에 의해 유발된 돌연변이는 다음 세대롤 전달된다. 그럼에 의해, 표적 유전자의 확인 외에도 그것의 기능이 전 유기체에서 연구될 수 있다.

태아 세포로의 유전자 트랩 벡터의 도입에 뒤이어 상기 세포는 통합된 형태로 유전자 트랩 벡터를 함유하는 그 세포들을 선택하도록 선택조건에서 유지된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 유전자 트랩 벡터는 예를들면 구성적으로 활성인 유전자로의 통합을 선택하기 위해 부가적으로 네가티브 선택을 위한 리포터 유전자 함유한다. 예를들면, 리포터 유전자로서 티미딘 키나제 유전자, 디프테리아 유전자 또는 HAT 유전자가 유전자 트랩 벡터로 삽입된다. 구성적으로 활성인 유전자로의 통합에 대한 선택을 위한 리포터 유전자로서 티미딘 키나제 유전자의 사용에서, 세포는 갠사이클로비르(gancyclovir)에 노출된다. 그럼에 의해 티미딘 키나제를 발현하는 세포는 보이지 않게 된다.

제조의 다음 단계에서 벡터를 함유하는 세포의 선택에 뒤이어, 세포는 전사인자와 접촉된다. 상기 전사인자는 통합된 또는 비-통합된 형태로, 세포 배양 배지 또는 세포내의 플라스미드상에 존재하는 전사인자를 코드화하는 유전자로 첨가되고, 유도가능한 프로모터의 조절하에 있다.

전사 인자가 세포 배양 배지로 첨가되면, 그것은 세포 핵으로 들어가기 위해 세포막을 통과할 수 있어야만 한다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 전사 인자는 상기 전사 인자가 세포막을 통과하게 하는 호메오유전자를 함유한다. 특히, 호메오유전자의 세번째 나선은 그것을 위해 적절하다. 이 도메인은 60 아미노산을 포함하고 하기에서 설명된다. 물론, 이 단백질들이 세포막을 통과하도록 하는 도메인들이 더 이용될 수 있다. 만약 조사되어야 할 전사 인자가 그것이 세포막을 통과하게 하는 서열을 함유하고 있지 않다면, 상기 서열들은 전사 인자 단백질의 적절한 부위에 부착될 수 있다.

예를들면, 전사 인자를 코드화하는 유전자는 진크 핑거(zink finger) 유전자, pou 유전자, 호메오박스-함유 유전자, HGM-박스-함유 유전자 또는 윈게드(winged) 나선 유전자로부터 선택된다.

유전자 트랩 벡터가 전사 인자 책임있는 성분의 조절하에 있는 유전자로 삽입된다면, 유전자 트랩 벡터상에 존재하는 리포터 유전자는 상기 성분에 전사 인자의 부가 및 결합에 뒤이어 발현된다. 리포터 유전자의 발현은 그 지체로 알려진 방법으로 검출될 수 있다. LacZ 유전자인 리포터 유전자의 경우에, Hill 및 Wurst, 1993에 기재된 바와 같이, β-갈락토시다제 활성으로 염색된다. 사용된 리포터 유전자의검출은 당분야에서 잘 알려져 있다.

리포터 유전자 활성의 변화를 보이는 그 세포들은 확인되고 배양된다. 그리고 나서, 그 자체로 알려진 방법에 의해, 전사 인자의 표적 유전자, 전사 인자의 보조-인자 또는 전사 인자 책임있는 성분은 확인되고 분석될 수 있다.

하기에서, 본 발명에 따른 방법은 포유동물 호메오박스 유전자의 유전적 제어 경로에서 유전자의 확인에 대하여 예시적으로 보여진다. 이 점에서, 태아 스템 세포(ES)에서 유도 유전자 트랩 접근은 생물학적 막을 통하여 호메오펩티드의 이동과 관련되어 있다. 본 발명의 이 구체체예는 세포막을 통하여 다른 호메오도메인 및 호메오단백질은 배양 배지에 첨가될 때 결국 핵으로 들어가도록 이동된다는 사실을 이용한다. 그러므로, 그들은 신경 성장의 조정을 초래하는 호메오단백질 책임있는 성분의 조절하에 리포터 유전자의 전사를 조절할 수 있다.

세포에서 뒤이은 과정은 유지되는 내재화된 호메오도메인의 특이한 DNA 결합 특성을 요구한다; 이것은 이동된 호메오단백질이 내인성 호메오단백질의 전사 활성과 성호작용하고 그래서 호메오단백질의 조절하에 있는 유전자의 확인에 적합하다는 것을 보여준다. 태아 스템 세포(EC)에 유전자 트랩 통합을 갖는 라이브러리를 스크린하는 유도제로서 외인성으로 부가된 호메오단백질의 사용에 의해, 직접적인 호메오단백질 표적 유전자를 포함하는 호메오단백질의 유전적 조절 경로에서 유전자는 확인될 수 있다. En2가 미분화된 ES 세포에서 발현되기 때문에, 이 신규하고 강력한 유도 유전자 트랩 기술은 인그라일드의 유전적 제어 경로에서 활성적인 표적 유전자를 조사하기 위해 ES 세포와 함께 예시적으로 이용될 수 있다. 화학적 유도제로서, En2 호메오도메인 (EnHD)의 사용으로 의해, 우리는 30,000 유전자 트랩 통합을 스크린하였고 인그라일드 단백질의 표적으로서dt/BPAGI좌를 확인하였다.

첨부된 도면들은 본 발명을 더 예시한다.

도 1a 내지 1c에서는,

(1a) LacZ 앞에 그것의 스플라이스 수용체 부위를 가진 PT2 벡터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터의 조절하에 간사이클로비르에서 네가티브 선택 및 NeoR(Neo) 유전자의 포지티브 선택을 허용하는 티미딘 키나제(tk) cDNA 앞에 내부 리보좀 삽입 부위(IRES).

(1b) 이 도표에서, 인그라일드의 호메오도메인(EnHD)이 세포막을 가로질러 이동되고 (단계1), 그리고 이용할 수 있는 부위에 결합하거나 내인성 인자, 이 경우는 인그라일드(En)와 경쟁하는 직접 핵으로 향한다 (step 2). 염색질 구조가 최소한으로 혼란되기 때문에 상기 방법은 상호작용의 특이성에 알맞다고 추정된다.

(1c) 30,000 ES 세포의 클론들은 일렬화된 PT2 벡터의 일렉트로포레이션에 뒤이어 이주선택이 이루어졌다. 내성체 클론들은 폴리에스테르 막 위에 복사된다. EnHD는 B-gal 활성을 위해 염색된 막을 함유하는 배양 배지에 첨가되고 푸른 콜로니는 마스터 플레이트로부터 채취된다. 세가지 독립적인 분석에서 유도의 확인 후에, 포지티브 클론은 증폭되고 추정 표적은 5′-RACE에 의해서 클론된다. 30,000개의 클론중 20개는 폴리에스테르 리플리카 분석에서 반응한다는 것이 발견되고, 8개는 마이크로적정 웰에서 세개의 연이어 비의존적인 유도에서 확인되었다.

도 2a 내지 2c에서,

(2a) E. Coli 추출물(코마시 염색)으로부터 정제된 EnHD의 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동.

(2b) 정제된 EnHD의 증가하는 양을 갖는 (0, 10, 20, 50 및 100ng) 0.5ng³²P-ATP로 표지된 NP6 올리고뉴클레오티드를 인큐베이트함으로서 수행되는 밴드 쉬프트 분석.

(2c) ES 세포 (상부 패널) 또는 GMA24FIA (하부 패널)은 FITC-EnHD (300ng/ml)(왼쪽) 또는 FITC 만으로(오른쪽) 2시간동안 인큐베이트되었다. 공초점의 부위는 FITC-EnHD가 핵에서 bar=5㎛로 내재되어 축적한다는 것을 보여준다.

도 3a 내지 3c에서

(3a) 웰당 10,000 ES-C3 세포는 EnHD의 농도를 증가시키면서 인큐베이트되었다. 24시간의 인큐베이트 후, C3세포는 고정되고 β-갈락토시다제 활성을 위해 염색된다. 각 칼럼은 4개의 독립된 웰의 평균을 나타낸다.

(3b) ES-C3 mRNA의 5'-RACE는 BPAGln2-EnLacZ 혼성체 cDNA의 225 뉴클레오티드의 클론닝을 나타냈다: 엑손 A의 56개 뉴클레오티드, 액틴 결합 도메인(ABD, 밑줄된)의 45개 뉴클레오티드에 의해서 뒤이어져, 벡터의 스플라이스 수용체 부위(굵은 글씨)에 융합된다.

(3c)dt/BPAG1좌는 (적어도) 두개의 프로모터에 의해서 조절된 세개의 전사체를 코드화한다. 두개의 신경 특이적 이소폼인 BPAG12n1 및 BPAG1n2는 ABD(빗금 박스)와 매개 필라멘트 결합 도메인(IFBD)(수직선)를 가지고 있다. BPAG1e 이소폼은 내부 프로모터에 의해서 유래되고 ABD 도메인은 부족하다. ABD를 코드하는 게놈 영역은 적어도 100kb를 포함하고 있고, 그것의 엑손/인트론 조직화은 거의 알려지지 않았다. 혼성 전사체의 서열로부터 우리는 융합 단백질의 구조를 추론할수 있다: BPAG1n2-특이 c-말단부를 넘어 EnLacZ 서열(굵은선)을 갖는 프레임에서 15개의 ABD 아미노산(밑줄)있다. 통합 부위는 ABD의 첫번째 인트론내에 존재한다고 여겨진다.

도 4에서,

NFG(50ng/ml)로 프라이밍한 3일후 PC12 세포는 사이클로헥사마이드 존재할하에서 EnHD(300ng/10 5 cell)과 같이 하룻동안 인큐베이트되었다. BPAG1n 전사체는 액틴 결합 도메인 프로브를 가진 노던 블로트 분석에 의해서 확인되었다. 12kb 전사체는 그 발현이 EnHD의 첨가에 의해서 감소되는 반면, GAPDH의 발현은 일정하게 유지된다는 것이 측정되었다. 실험은 세번 반복되었고 mRNA 집적의 감소는 7%(students' t-test, p0.05)의 표준편차를 가지고 30%이다.

도 5a 내지 5d에서,

(5a) 배양액에서 GMA24FIA 케라티노사이트는 폴리클로날 항-인그라일드 (aEnhb-1) 항체 (첫번째 항체가 없는 오른쪽 패널)로 염색되었다, Bar=

(5b) EnHD(오른쪽 통로)를 가지고 하루종일 처리된 GMA24FIA 세포는 BPAG1e transcript의 5배 증가를 보여준다, 반면, GPDH mRNA 의 축적은 변형되지 않는다.

(5c) GMA24FIA 세포는 사일클로헥사미드의 존재하에 EnHD와 같이 하룻동안 인큐베이트되었고 BPAG1e 전사체는 인시츄(in situ) 혼성화에 의해 검출 되었다.

(5d) 첫째, 세포는 사이클로헥사미드에 EnHD의 첨가 또는 제거한채 하룻동안 처리되고 사이클로헥사미드는 BPAG1e 면역 염색시키기 2시간 전에 제거되었다.(BP patients autoantisera, Dr. C. Post, Paris)

도 6a 내지 6d에서,

(6a) 내부 프로모터/인헨서의 단편을 갖는 E. Coli 에서 생성된 인그라일드 단백질의 이동 쉬프트 분석. BPAG1e 프로모터는 BstNI를 가지고 소화했고, 말단 표시된 단편들은 En2에 결합하는가에 대해 조사되었다. 레인1; 2㎕ E. Coli 추출물로 조절한다. 레인2: E. Coli추출물로부터 반정제된 En2 2㎕. 2개의 단편은 (-89 내지 -810, -2226 내지 -1569, 음 가닥)은 고 친화성 결합활성을 나타낸다.

(6b) 정제된 EnHD를 갖는 프로모터 단편의 DNase I 풋 프린트 분석. 단편들은 말단 표지되고 실험방법에서 기술한것 처럼 EnHD와 같이 인큐베이트된다. 두개의 왼쪽 대부분의 레인들은 -2226 내지 -1569 까지의 단편들에 해당된다. 그뒤의 4개의 레인들은 중앙의 롱런(long run)과 오른쪽의 숏런(short run)을 가지고 -810 내지 -89 단편에 대응한다. 풋프린트는 검은 막대로 지적되어 있다. 0은 단백질이 없는 대조구이고 10은 EnHD이다(10㎕, 6mg)

(6c) 전체길이 En2를 갖는 풋프린팅에서 시험된 두 영역의 겔쉬프트 분석. 오른쪽 겔쉬프트는 올리고뉴클레오티드 CTCAAATAATTAGTCATTAAAAAAA ATAAAGGCATATGAGCCAGCCT를 이용해서 수행되었고, 왼쪽 올리고뉴클레오티드 CGCAG AATATTGGCTCAGTAACTAAGTGTG를 이용해서 수행되었다. 0: 추출물 없음, C: E. Coli 추출물, En: En2 발현 E. Coli 추출물.

(6d) BPAG1e 프로모터의 2개의 풋프린트된 영역(검은 박스)의 서열. 보호된 영역들은 굵게 표시되었다.

도 7a 내지 7b에서,

(7a) pBP-luc로 공트렌스펙션에 이용된 두개의 구조체의 도식적 표현

(7b) GMA24FIA 세포는 pBP-luc 단독으로 트렌스펙트되거나 위에서 언급한것 처럼 En2 혹은 En2A의 함량 증가로 트렌스펙트 되었다. 48시간후 루시페라제 활성이 세포 용해물에서 측정되었다. 각 수치는 4개의 독립된 웰의 평균에 해당한다. 두개의 구조체의 효과는 반대되고 함량에 의존한다.

실험 전략

도 1은 본발명에 따라 개발된 신규한 전략의 원리를 설명한다. ES 세포는 선형화된 PT2 유전자 트렙 벡터로 일렉트로포레이션 된다. 이 벡터는 내부 리보좀 도입부위(IRES)에 연결된 티미딘 키나제(tk) 유전자에 의해 이어지는 프레임 내의 스플라이스 수용체 부위로 융합된 리포터 유전자 LacZ를 함유한다. 그래서 이중 시스트론 정보는 lacZ 와 tk를 함유하게 할것이다(도 1a). 배지에 간사이클로비르의 첨가에 의해, tk 유전자를 발현하는 클론이 제거될수 있고 그리하여 구성적으로 활성인 유전자로 통합에 대항하여 선택할수 있게 한다. 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터의 조절하에 위치된 네오마이신 내성 등를 코드화하는 두번째 유전자는 트렌스펙트된 클론이 포지티브 선택이 가능케 한다. 클론은 폴리에스테르 필터위에 복사되고 EnHD와 같이 인큐베이트 된다. EnHD에서 N-말단 도메인의 생략을 통해 인그라일드는 주로 전사를 억제한다고 가정하면, 내인성과 경쟁에 의해서, EnHD의 도입은 그 억제를 상승시킨다.(도 1b) 이것은 폴리에스테르 필터상에 다시 순차적으로 마스터 플레이트 상에 LacZ 발현 클론을 확인케 할것이다. 추정된 인그라일드 표적은 5′ RACE-PCR 전략을 사용하여 클론될 수 있다.(도1c). 이 도식에서(도1b), 우리는 LacZ가 직접적 인그라일드 표적내에 통합된 경우를 나타낸다. 그러나 LacZ는 또한 인그라일드에 의해 간접적으로 제어된 유전자내에 통합된후 발현될수 있다.(예를 들면, 그것의 유전적 조절경로에서). 이 연구에서 우리는 닭 인그라일드 호메오도메인(EnHD)를 사용했다. 왜냐하면 특이적 항체가 조류 폴리펩티드와 내인성 표유동물 인그라일드를 구별하기 위해 이용되기 때문이다. En1이 돌연변이되고 En2로 치환된 마우스의 정상적 분화와 다른 EnHD중 고도의 서열보존이 성공한 경우, 이런 연구세계에서 사용된 호메오도메인은 우리가 En1과 En2 포유동물 표적 두개 모두를 확인케 해준다. 인그라일드 호메오도메인은 배양액에서 세포에 의해 통합된다. 도 1a 내지 1c에서 기술된 프로토콜은 수많은 ES 세포에 의해 통합되어질 배양배지에 EnHD가 첨가되는 것을 요구한다. EnHD는 E. Coli에서 생성되어 헤파린 세파로스에서 정제된다. EnHD의 정제는 SDS-PAGE 분석해서 코마시블루로 염색해서 80% 이상이다.(도2a). EnHD의 결합특성을 시험하기 위해 겔쉬프트 실험이 초파리의 인그라일드를 결합하는 것으로 알려진 NP6부위의(TCAATTA AAT) 6개 복사체를 함유하는 DNA 단편을 사용해서 수행되었다. 도 2b에서 보여진것 처럼, 4개의 별개의 복합체들은 EnHD의 양이 EnHD 가 시험관에서 효과적으로 NP6에 결합함을 보여주는 10ng에서 100ng까지 점차적으로 증가될때, 형성된다. EnHD는 앞서 기술한 것처럼 형광 이소티오시아네이트(FITC)로 표지되고 4℃에서 2시간동안 배양액내의 ES세포로 첨가된다. 도2c(상부패널)는 EnHD가 효과적으로 ES 세포에 의해 흡수되어짐을 보여준다. FITC 단독으로(위편 및 오른편 패널) 처리시 염색이 일어나지 않았고, 공초첨 부위는 펩타이드가 실제 세포내에서 나타난다고 확증했다. 비슷한 결과가 이번 연구에서 사용되어진 세포라인, GMA24FIA 케라티노사이트(도2c, 아래패널)에서 면역 세포화학에 의해서 FITC 표지된 EnHD에서 관찰될수 있다. 요약하면 우리는 EnHD는 배양액에서 세포에 의해 효과적으로 포획된다고 결론 지을수 있다.

추정된 인그라일드 표적 유전자의 확인

ES 세포에 30,000개의 독립적 유전자 트렙 벡터 통합의 라이브러리는 배양배지에 EnHD의 첨가로 인그라일드에 대한 반응성에 대해 스크린 되고 그뒤 프로토콜은 도1a 내지 1c에 런(run) 이소도식화 되며 20개의 반응 클론의 확인을 이끌었다. 이들 20개의 클론의 반응은 순차적으로 3개의 독립적 실험에서 96개의 웰 플레이트에서 반복되었다. 클론중 8개는 리포트 유전자 발현의 유도를 보여 주었다. 도3a는 클론 ES-C3을 나타내고 그것은 본 실험의 목적이고 LacZ를 발현하는 세포가 EnHD의 첨가에 의해서 함량의존 방식으로 얼마나 증가되는가를 밝혀준다. 클론 ES-C3에 유전자 트랩 벡터 통합에 의해 생성된 융합 전사체는 5′-RACE에 의해 특성화 되었다. 대략적으로 225bp 단편은 증폭되고 클론되고 순차적으로 서열화 된다. 이서열은(도3b) 유전자 트랩 벡터 서열의 스플라이스 수용체를 함유하는 혼성 cDNA를 드러내고 BPAG1n2(Bullous Pemphigoid Antigen neural2)로 일컫는 다이스토닌(genebank. ref. gb U25158)의 typeII 뉴런에서 밝혀진 서열과 100% 동일성을 보이는 101 뉴클레오티드를 드러냈다. 이 서열에서, 45개의 다이스토닌 엑손 A(도3c)에 5nt와 다이스토닌의 액틴 결합도메인의 C-말단부에 대한 엑손 코딩의 5' 말단에 대응된다. BPAG1n2와 LacZ 서열은 플레임에서 관찰된 β-갈락토시다제의 활성과 일치하는 융합 단백질의 발현을 허용한다. 이 혼성 cDNA의 존재는 PCR 프라이머의 2개의 독립된 세트를 사용하는 RT-PCR에 의해 확인 되었다. 혼성 mRNA가 ES-C3세포에 존재한다는 것을 더 밝히기 위해, RNAse보호 분석은 BPAG1n2-LacZ cDNA 와 ES-C3 세포와 정상 ES 세포로 부터의 총 RNA로부터 만들어진 안티센스의 RNA 프로브를 사용해서 수행되었다. 기대된 것처럼, 혼성 mRNA에 대응하는 200뉴클레오티드 단편은 대조RNA에서가 아닌 ES-C3 세포 RNA에서 보호되었다. dt/BPAG1 좌의 조직화는 도 3c에 나타난다. dt/BPAG1 좌는 BPAG1n1, BPAG1n2 및 BPAG1e를 코드하는 적어도 3개의 다른 이소폼에 코드화 된다. 전자의 두개 이소폼은 신경계에서 발현되고 후자는 표피 기저층의 케라티노사이트에서 발현된다. 뉴런 이소폼의 아미노 말단부는 기능적 액틴-결합도메인(ABD)의 존재에 의해서 BPAG1e의 그것과는 다른 반면, 공통적으로 모든 세개의 이소폼은 카르복실 말단부는 매개 필라멘트 결합 도메인(IFBD)을 갖는다. 혼성 cDNA 서열에 대해서 유전자 트랩 벡터는 2개의 뉴런 이소폼의 절단을 이끈 dt/BPAG1 좌의 ABD 영역의 인트론에 대부분 삽입된다.

생체외에서 EnHD에 의해 BPAG1n 발현의 체내 조절

인그라일드와 dt/BPAG1n 사이의 유전적 제어를 더 조사하기 위해 우리는 양쪽 유전자가 발현하는 신경 세포를 사용했다. 레트 페오크로로사이토마 세포는 교감신경계의 뉴런같은 표현형을 채택하고 신경 증식 인자(NGF)의 첨가후 dt/BPAG1n과 En1을 발현 시켰다. En1과 En2의 호메오도메인이 기능적으로 동일하기 때문에 EnHD는 En1 표적 부위에 결합할수 있어야 한다. 그래서 인그라일드와 경쟁할수 있어야 한다. PC12 세포는 NGF와 같이 3일 동안 인큐베이트 시키고, 사이클로헥사마이드의 존재시 EnHD(300ng/10⁵세포)로 하룻동안 처리시켰다. 도4a는 2개의 뉴런 이소폼에 대응하는 2개의 mRNA를 인식하는 dt-ABD 프로브로 수행된 노던 블럿 분석을 나타낸다. 2개의 mRNA는 그들의 크기에 기준해 보면 구별될수 없고 15kb의 단일 밴드는 EnHD 첨가후 단지 12시간만에 mRNA 축적에서 2배의 감소가 감지된다. 포스포이매이저 분석에 의해 정량화된 이러한 감소는 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 발현이 변형되지 않은채 남아있기 때문에 mRNA 전사 또는 축적에서 일반적 감소로 기인되지 않는다. 동일한 실험이 3번 반복되었고 동일한 정량적 결과를 주었다.(도4) 사이클로헥사미드가 번역을 저해하기 때문에 후자의 실험결과는 EnHD는 이 모델에서 BPAG1n 전사의 조절에 직접 작용한다는 것을 제안한다.

생체내에서 EnHD에 의한 BPAG1e 발현의 조절

CNS에 BPAG1n과 인그라일드의 중첩 발현 패턴 외에도 우리는 En1과 BPAG1n가 또한 기저 표피층에 나타난 케라티노사이트에서 동시에 발현함을 관찰했다. 그래서 우리는 뉴런 BPAG1 이소폼 뿐아니라 표피 이소폼(BPAG1e) 또한 인그라일드에 의해 조절되는지를 조사했다. 그 목적을 위해, 우리는 기저 케라티노사이트처럼 행동하는 인간 케라티노사이트 불멸화된 세포라인(GMA24FIA 세포라인) 에서 BPAG1e와 인그라일드의 발현을 연구했다. En1과 En2를 인식하는 다중클론 항체인 αEnHB-1은 세포핵을 염색하고(도5a) 이들 세포들이 En1을 발현함을 보여주는 웨스턴 블롯에서 단일 52kDa 단백질을 인식한다. 노던 블롯 분석을 수행함에 의해 BPAG1e mRNA에 대응하는 9kb의 단일 전사체가 검출되었고(도5b) BPAG1n 이소폼에 대응하는 15kb 전사체는 검출되지 않았다. GMA24FIA 세포가 EnHD(도2D) 를 내재한다고 확신하고, 우리는 BPAG1e 발현시에 호메오도메인 내재의 효과를 분석했다. 도 5b에 도시된 바와 같이 EnHD의 하룻동안 첨가는 적어도 5가지의 인자에 의해 BPAG1e mRNA 함량을 증가시킨다. 도5c의 인시츄 혼성화는 제어가 직접적이라고 제시하는 사이클로헥사마이드의 존재할때 조차도 BPAG1e mRNA의 양에서 EnHD의 강력한 효과를 보여준다. 마침내, GMA24FIA 세포는 사이크로헥사마이드의 존재하에 EnHD가 있는 것과 없는 것을 하룻동안 인큐베이트 하고, 세척하고 그리고 다시 단백질 합성케하는 사이클로헥사마이드 없이 24시간동안 인큐베이트 된다. 도5d에서 도시된 바와같이 EnHD는 세포막아래에서 BPAG1e 합성 및 축적에 상당히 긍적적 효과를 가졌다. BPAG1e 발현은 GMA24FIA 세포에서 EnHD에 의해 활성화 된다고 이들 데이타는 밝힌다.

BPAG1의 내부 프로모터/인헨서는 인그라일드 단백질의 표적이다

내부 프로모터/인헨서는 BPAG1좌내에서 확인된다. 이 내부 프로모터/인헨서는 인그라일드를 발현하는 CNS의 영역에서 뿐만이 아니라 표피 케라티노사이트에 LacZ 리포트의 생체내 발현을 지시한다.(즉, 중뇌). 그러므로 BPAG1n과 BPAG1e 이소폼의 제어제로서 행동한다. BPAG1 내부 프로모터/인헨서내에 대한 추정된 결합부위의 위치를 밝히기 위해 겔쉬프트 분석을 부분적으로 정제된 닭 En2(En2) 단백질과 프로모터 영역(-2466 내지 -93)의 표지된 BstNI 제한 엔도뉴클레아제 단편을 사용해 수행되었다. 도6a에 보여진 것처럼, 2개의 큰 단편(-2226 내지 -1569)와 (-810 내지 -89)이 기능적 결합 위치의 존재를 나타내는 En2의 위치로 옮겨진다. 두개의 단편은 EnHD를 가진 DNase I 풋프린팅에 의해 분석 되었다. 풋프린팅 반응은 두개의 표지된 가닥으로 수행되고 동일한 결과를 주었다. 그러므로, 한 가닥에 대한 결과만이 각각 단편에 대해 보여진다. (-810 내지 -89)와 (-2226 내지 -1569) 단편은 각각 5가지 특이적 풋프린트를 나타냈다. 도6d에서 보여지듯, 여러가지 보호구역(볼드내에)이 호메오도메인 단백질에 대한 ATTA 컨센서스 코어 서열을 함유하는데 이중 몇가지는 NP6 서열 TCAATTAAAT와 거의 동일하고, 그것이 초파리에서 인그라일드에 대한 표적이 되는 것으로 보여져 왔다. 두개의 EnHD 풋프린트는 어떠한 ATTA 서열로 포함치 않는다.(도6d)

EnHD에 대한 결합 위치가 전체-길이 인그라일드2에 의해 인식되는지를 실험하기 위해, 겔쉬프트 분석이 세균적으로 생성된 En2로 수행되었다. 두개의 다른 보호된 구역에 대응하는 2쌍의 올리고뉴클레오티드가 사용되었다. 하나(-2225 내지 -2180)는 3개의 진짜 ATTA 모티프를 함유하는데 반해 다른것(-694 내지 -665)은 어떠한 ATTA서열(도6d에 밑줄)도 없다. 도6c에 보여진것 처럼, En2는 두쌍의 올리고뉴클레오티드를 가진 두개의 쉬프팅 복합체를 형성하고 En2는 효과적으로 어떠한 ATTA코어도 없는 서열을 포함하는 풋프린팅 분석에서 EnHD에 의해 보호되는 적어도 2개의 서열과 효과적으로 결합함을 나타낸다.

BPAG1 내부 프로모터/인헨서의 활성은 En2에 의해 조절된다.

케라티노사이트와 CNS에서 발현된 리포터 유전자에 특이한 발현을 부여하는 BPAG1e의 2.3kb Hind III/BamHI 게놈 단편 (위치-2463 내지 -89)는 PGL2 유도된 벡터(pBP-luc)에서 루시페라제 유전자 앞에 위치되었다. 리포터 유전자는 GMA24FIA 세포에서 전체-길이 En2를 코드하는 플라스미드 또는 N-말단 도메인이 결실된 En2을 코드하는 플라스미드와 공-트렌스펙션된다.(En2ÆN) 후자의 En2ÆN의 양적 증가를 가지고 pBP-luc를 공-트렌스펙션하는 것은 함량의존 프로모터 활성의 증가를 초래하고 반면에 전체-길이 En2는 반대이며 또한 함량의존 효과를 가진다(도7). 플라스미드를 나타내는 β-갈락토시다제를 갖는 양쪽플라스미드의 증가량의 공-트렌스펙션은 두개의 플라스미드가 세포 생존에 아무런 영향을 주지 못한다는 것을 보여준다. 요약해서, En2는 직접적으로 BPAG1e 프로모터 활성을 제어하고 GMA24FIA 세포내에서, En2와 En2ÆN는 이 활성에 대해 반대 효과를 지닌다고 결론 지을수 있다.

유전자 트랩 기술은 ES 세포내에서 불규칙적으로 변이시키고 확인하기 위해 사용되어져 왔다. 이들 유전자 트랩 통합은 시험관에서 혹은 체내에서 특이적 발현 패턴에 대해 더 많이 스크린 될수 있다. 이제, 우리는 호메오도메인 함유 단백질에 의해 조절되는 유전자를 변이시키고 확인하기 위한 이 기술을 더 많이 개발해 왔다. 이 신규한 접근은 2개의 혼성체 시스템 및 다른 표시와 같은 다르게 발현되는 유전자를 태그된(tagged) 표적유전자는 쉽게 클론 될수 있고 PCR을 사용하여 특성화 될수 있다. 트랩된 표적 유전자의 발현은 차후에 키메라 F1 자손에서 리포터 유전자 활성을 연구될수 있다. 그래서 세포 및 조직 특이 상호작용을 미리 결정지을 수 있게 한다. 리포트 유전자의 발현을 유전적 상호작용의 네트워크를 면밀히 조사하기 위해 유용한 마커로서 사용될수 있다. 통합은 점(germ) 라인 전달 후 연구될수 있는 돌연변이 표현형으로 초래한다.

특이적 유전적 경로안에 하류에 활성인 유전자로 이것을 위해서는 LacZ 유전자의 내부 리보좀 도입부위(IRES) 3'로 융합된 티미딘 키나제 유전자가 PT 유전자 트랩벡터에 포함된다. 구성적으로 활성 유전자로의 대부분의 통합은 선택배지에 간사이크로비르의 첨가에 의해 제거 될수 있다. 이 신규한 이중시스트론 벡터의 사용은 리플리카 플레이팅 기술과 더불어 우리가 많은 양의 유전자 트랩벡터 통합을 스크린 할수 있게 하고 외부에서 외인성의 첨가된 호메오도메인 함유 전사인자의 표적유전자를 특이적으로 확인 할수 있게 한다.

이동에 의해 인그라일드 표적유전자의 확인

전체-길이 Hoxa-5와 Hoxc-8 뿐만 아니라 안테나페디아(AntpHD), Hoxa5HD 와 FtzHD의 호메오도메인은 배양액에서 살아있는 세포의 핵과 세포질로 들어갈수 있다. 비록 생물학적 막을 가로지르는 이동기작이 완전히 이해되지는 않지만, 변이체로 한 실험은 이동을 키랄 수용체를 요구하지 않고 종래의 엔도사이토시스를 포함하지 않음을 제시한다. 이 기술의 분명한 장점은 정렬된 환경안에서 그들 스스로를 발견하고 엔도사이토시스 경로안에서 분해됨이 없이 세포질과 핵에 폴리펩티드가 접근케 한다. 이중 윗부분은 전체-길이 호메오도메인 및 호메오 단백질의 도입인 경우 매우 중요한데, 이는 핵에서 염색질의 구조에 의해 접근하게 하는 부위에만 결합하게 할것이다. 그러므로 만약 제거되지 않는다면 비 특이적 상호작용의 양은 감소될 것이다.

인그라일드에 의해 BPAG1n 발현의 조절

이 연구에서 우리는 배양배지에 첨가될때, EnHD에 반응하는 ES 세포안에서 8개의 유전자 트랩벡터 통합을 확인했다. 클론중의 하나인 ES-C3에서 통합은 dt/BPAG1좌에서 일어났다. BPAG1n의 ABD 도메인의 인트론내에 유전자 트랩벡터의 통합부위는 BPAG1n이 인그라일드의 하류에 있다고 제시한다. 인시츄에서 혼성화는 BPAG1n이 인그라일드를 발현되지 않는 영역을 포함하여 쥐의 태아 CNS의 여러 도메인에서 발견되었다. 인그라일드 도메인의 발현 바깥쪽은 BPAG1n이 또한 다른 조절 단백질에 대한 표적, 아마 배타적으로는 아닌 다른 호메오단백질임을 제시한다. 사실 호메오단백질 결합을 위한 동일위치의 편재성 때문에 유사하거나 동일한 프로모터 영역은 다른 호메오단백질 및 호메오도메인에 의해서 인식될 것으로 기대된다.

생체내에서는 인그라일드 돌연변이체에서 BPAG1n 발현의 감소는, BPAG1n이 인그라일드의 유전적 조절경로 안에 있다고 확인해 준다. 후자의 관찰은 E12.5 태아에서 인그라일드는 BPAG1n발현의 액티베이터로서 행동하는 반면, ES 세포, 케라티노사이트, 피부근절에서는 인그라일드가 리프레서와 같이 행동한다. 이것은 분화단계 및 고려된 세포상황에 따라 리프레서 혹은 액티베이터일수 있는 초파리 인그라일드의 기능과 일치한다. 이런 관점에서 E8.5내지 E12.5 마우스의 중뇌의 내부 BPAG1프로모터/인헨서에 의해 유도된 LacZ 리포터 유전자의 활성은 뉴론 인그라일드의 발현지역에서 인그라일드 책임있는 성분의 긍정적 조절에 의해 증진된다.

인그라일드에 의한 BPAG1e 발현 조절

dt/BPAG1좌는 또한 BPAG1e를 코드화하고 케라티노사이트에서 단백질은 케라틴 필라멘트를 헤미데스모좀에 연결시켜 헤미데스모좀의 구조를 유지하는데 중요하다. BPAG1e의 상류의 내부 프로모터/인헨서 서열은 몇개의 추정되는 호메오단백질 결합부위를 포함한다. 인시츄 활성화 연구가 표피에서 BPAG1e 표현수준이 인그라일드가 없을때 상당히 증가한다는 것을 보여주는데 더해서 후자의 관찰은 BPAG1e와 인그라일드 사이의 유전적 상호작용을 제시했다. 그래서 우리는 En1과 BPAG1e는 생체내 및 기저 케라티노사이트에서 불멸화된 케라티노사이트 세포라인, GMA24FIA에서 발현됨을 증명했다. 이러한 세포 라인을 이용하여 우리는 EnHD 첨가는 BPAG1e 발현을 증가시키고 이러한 증가는 또한 사이클로헥사미드의 존재시 발견된다는 것을 보여줄 수 있었다. BPAG1n의 경우처럼, 이들 실험은 인그라일드에 의해 BPAG1e의 직접적 조절을 강하게 제시하나, BPAG1e mRNA의 안정성에 EnHD의 효과가 총체적으로 배제하지 않는다. 또한 EnHD의 첨가는 전사체의 양을 증가시킨다는 것은 PC12에서 일어나는 것과는 대조적으로 케라토사이트에서는 인그라일드가 리프레서로 작용함을 제시하는 것으로 매우 가치가 있다.

dt/BPAG1는 인그라일드에 의해 직접 조절된 프로모터/인헨서 서열을 표현한다

BPAG1e의 상류의 내부 프로모터 존재는 추정적인 인그라일드 표적유전자를 확인하기 위해 본 발명에서 취한 접근의 유효성을 확증시키는데 매우 유용하다. 이 프로모터는 특히 흥미가 있는데, 왜냐하면 그것이 중뇌에서 LacZ의 발현을 유도한다는 것은 BPAG1e가 CNS에서 발현되거나 배타적으로는 아니나 이 도메인은 BPAG1n의 발현을 위한 신경계에서 인그라일드 인핸서로서 작용함을 제시하기 때문이다. 후자의 해석은 BPAG1n과 같이, 내부 프로모터에 의해 유도된 LacZ는 인그라일드 발현 도메인에서 상승 조절된다는 사실에 의해 뒷받침된다.

상기에서 본 발명은 특이적 유전자 트랩벡터와 인그라일드2 단백질에 대해 설명했다. 본 발명은 특이적 구체예에만 한정되지 않는다. 위의 적용에 근거하여 이분야에서 숙련된 사람은 기술된 발명으로부터 동떨어짐이 없이 언급한 구체예를 변형 시킬수 있다.

실험과정, 세포배양

ES 세포는 D3ES 세포 증식배지에서 증식되었다.(Wurst and Yoyner, 1993) 레트뇌의(P₀) 초기소뇌와 메텐세팔릭 배양이 앞서 언급된 것처럼 준비되었다.(Joliot, 1991), PC12 세포는 10%말 혈청(Seromed) 및 5% 태아송아지의 혈청(GIBCO)를 함유하는 DMEM/F12 배지에서 배양되었다. 실험을 위해 사용된 PC12 세포는 50ng/ml NGF(Boehringer)를 가지고 3일동안 인큐베이트 되었다. GMA24FIA는 인간의 케라티노사이트 스트레인 GMA의 공급(feeder) 비의존 서브클론이다. GMA24FIA는 EGF와 공급된 정상의 KGM에서 증식되었다.

유전자 트랩

유전자 트랩과정은 Hill과 Wurst에 의해 상세히 기술되었다. 그러나 명확한 개요는 하기에 주어진다 : ES 세포는 증강되어서 HindIII 선형화된 PT2 유전자 트랩벡터로 일렉트로포레이트 된다. 일렉트로포레이션후 세포는 10mm 젤라틴으로 덮혀진 플레이트에 분주하고 G418(200μg/ml) 및 2mM 간사이클로비르를 함유하는 ES 배지안에서 8일동안 배양된다. 선택의 8일후, 폴리에스테르 막은 세포의 위쪽에 위치되고 유리 구슬로 덮고서 배지가 첨가되고 세포는 추가로 48시간동안 배양된다. 그다음 폴리에스테르 필터는 제거되고 PBS는 헹구고 EnHD(30ng/10⁴세포)을 함유하는 유도 배지를 갖는 새로운 접시에 분주된다. 48시간후 Hill과 Wurst에서 언급된것처럼 막은 고정화되고 β-갈락토시다제 활성을 측정키 위해 염색된다. β-갈락토시다제 포지티브 클론은 추출하여 증강시키고 3개의 독립적 실험에서 96개 웰 플레이트에서 재 실험된다.

EnHD와 닭의 인그라일드2의 발현 및 정제

닭의 인그라일드2(EnHD) 단백질의 60 아미노산 호메오도메인은 아래의 프라이머를 사용하여 닭의 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드로부터 분리되었다.:

5′-TTTCATATGGAAGACAAGCGGCCCCG-3'과

5′-GGGGGATCCCTACGCCTT CTTGATCTTGGCTC-3'

PCR 산물은 pBluescript에 연결된다. 그 구조체는 그다음에 pET-3a 발현 벡타로 서브클론된다. 이플라스미드는 BL21(DE3)pLysS로 형질 전환되고 EnHD의 발현은 0.8mM IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 단백질은 완충액 A(20mM HEPES, pH 7.9, 1mM EDTA, 5mM MgCl₂, 0.2M NaCl, 0.02mg/ml DNase I 및 프로테아제 저해제 : 0.5mM Pefablokl 10μg/ml Pepstatin, 10μg/ml Aprotinin, 1μg/ml α2-마크로글로불린)에 세균을 초음파 처리함에 의해 분리되었다. 그다음 스트렙토마이신 술페이트 침전에 의해 처리되고(20mg/ml 최종농도, Boehringer), KCl를 사용하여 헤파린-세파로스 칼럼(Pharmacia) 위로 서서히 용출시키는 FPLC를 사용해 정제한다. 순도는 SDS-PAGE분석후 코마시 염색에 의해 측정되고 단백질량은 Bradford 방법에 의해 결정되었다.(Kit Micro BCA, Pierce). EnHD의 FITC-표지화는 이전에 기술된 것처럼 행해진다.(Joliot, 1991)

닭의 En2 단백질을 생성하기 위해, En2의 완전한 cDNA를 혼합하는 1.1kb E. Coli 단편은 다음의 어뎁터 올리고뉴클레오티드의 삽입에 의해 얻어지는 중간체 백터의 E. Coli 부위로 삽입되었다. NdeI와 BamHI로 소화된 pBluescript에 5′-AG CTTCATATGGAGGAGGGCGGCCGCAGCCCCCGGGAGGAGGAATTCG-3'과

5′-GATCCGAATTCCTCCTCCCGGGGGCTGCGGCCGCCCTCCTCCATATGA-3'. 5'비코드 서열은 SmaI에 의해 소화되어 제거된다. 그다음 En2 서열은 발현 벡터 pET-3a의 NdeI와 BamHI 부위로 삽입된다.

닭의 인그라일드(ChEn2) 단백질은 EnHD에 대해 기술된것 처럼 생성된다. 반쯤 정제된 단편은 세균을 용해해서(Bourbon, 1995)에 따라 헤파린 세파로스로 추출된 추출물을 인큐베이트하여 얻어졌다. 헤파린이 결합단편은 그다음 투석되고 농축된다.(Centriprep, Amicon) ChEn2는 4D9 항체(Patel et al. 1989)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인되고 겔쉬프트 분석을 위해 사용되었다.

5′-RACE

총 RNA는 표준공정을 사용하여 ES-C3 세포로부터 분리되었다.(Kit RNase, Quiagen). ES-C3 세포로부터 총 RNA 200ng은 Superscript II역전사 효소(Gibco/BRL) 과 제조자의 지시에 따라 LacZ 유전자 서열의 5′ 영역에 위치한 프라이머(5′-TGGCGAAGGGGGATGTGC-3')를 사용해서 역전사되었다. 10번째 cDNA가 말단 전달효소를 사용해 dCTPs로 테일(tail)된다.(Gibco/BRL). C-테일된 cDNA는 유전자 트랩 벡터의 스플라이스 수용체 영역으로부터의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭되었다.:

5′-GACTCTGGCGCCGCTGCTCTGTCAG-3'과 폴리-G 프라이머: 5′-CUACUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTACGGIGGGIIGGGIIG-3'.

50ml PCR 반응의 1μl는 그다음 스플라이스 수용체 영역 주변의 프라이머(5′-ACCTGTTGGTCTGAAACTCAGCCT-3'), 폴리G 프라이머의 5′부위를 인식하는 프라이머:(5′-CUACUACUAGGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')를 사용하여 두번째 PCR 반응시 사용된다. cDNA 단편은 pAMP 플라스미드로 클론되고(GIBCO/BRL) 그리고 정제된다. 융합 전사체의 존재를 확인하기 위해 ES-C3 세포로부터 총 RNA 400ng은 무작위 헥사머 프라이머를 사용하여 역전사 되었다. PCR의 첫 라운드는 BPAG1n2 서열로부터 상류 프라이머를 사용해서 수행되었다: (5′-TGCTGGACCCAGCCGAGAGGGCTGTGC-3')과 LacZ 프라이머(5′-CGCCAGG GTTTTCCCAGTCACGACGACGTTG-3'). 단편은 분리되고 pBluescript로 클론되며 서열화 된다.

노던 블롯 분석과 인시츄 혼성화

세포는 사이클로헥사미드 10^-6M의 존재 유무하에서 EnHD(300ng/10⁵세포)로 하룻동안 처리되었다. 노던블롯과 인시츄 혼성화는 표준기술을 사용해서 행해졌다(Ausubel, 1994). 글리세르알데히드-3-포스페이트-디하이드로게나제는(GAPDH)는 대조구로 사용된다. 노던 블롯은 포스포이메이저를 가지고 정량화 된다. 케라티노사이트에서 BPAG1e 전사체를 검출하기 위해 프로브는 테그-폴리머라제와 그다음 올리고뉴클레오티드 프라이머: 5′-GGAAGTTCTTCCTCTACT-3' 과 5′-GGTTGAAACT ACTCAGAG-3'을 사용하여 PCR에 의해 GMA24FIA cDNA로부터 분리되었다. 그 결과 519bp 증폭된 DNA산물은 (Tamai, 1993)에 따라 위치 3048에서 위치 3567까지 확장된다. 이 PCR 산물은 Klenow 효소를 사용해서 블런트 말단화 된다. 그리고 pBluescript의 E. Coli부위에 클론된다. BPAG1n 이소폼은 액틴 결합 도메인에 혼성화 하는 dt-ABD프로브에 대응하는 664bp DNA 단편을 사용해서 검출되었다.(Bernier, 1995)

트렌스펙션 분석

BPAG1e 프로모터의 조절하에 루시페라제를 표현시키기 위해서 게놈 람다 zap클론(mdt 1.4.I.2, R, Kothary 박사에 의해 제기됨)으로부터 유래된 7kb SacI/Sa1I단편이 pBluescript에 서브클론된다.(Stratagene). 이 단편은 BPAG1e 및 ABD-dt 프로브와 이중 혼성화에 의해 결정된 것처럼 전체 내부 유전자 영역을 포함하였다. 그다음 6.5kb BamHI 절편이 PGL2bas의 Bg1II 부위에 삽입되었다. 마침내, 2.3kb HindIII단편이 pBP-luc로 되는 PGL2bas의 HindIII 부위로 전이되었다. pBP-luc는 pTL1En2 또는 pLT1En2ÆNter와 함께 GMA-48에서 트렌스펙트 되었다. 공 트랜스펙션 분석은 앞서 언급한것 처럼 인산칼슘 침전에 의한 상등액에서 행하여진다. 각 조건은 4배로해서 이뤄졌다.

겔쉬프트와 DNase I 풋프린팅

DNA 절편은 폴리뉴클레오티드 키나제와 (γ³²P) ATP에 의해 말단이 표시되었다. EnHD 혹은 En2 단백질을 발현하는 E. Coli로부터의 추출물과 E. Coli추출물의 대조구가 20mM Tris-HCl, pH 7.9, 35mM KCl, 2.5mM MgCl, 1μg 폴리-dIdC 및 15% 글리세롤 내의 표시된 프로브로 첨가되고 10분 동안 얼음위에서 인큐베이트되며 그다음 순수 6% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석되었다.

DNase I 풋프린트를 위해 프로모터 단편은 Klenow 효소를 사용해 말단이 표시되었다. 풋프린팅 분석은 최종 부피가 50μl의 EnHD 와 20mM Tris-HCl, pH 7.9, 35mM KCl, 2.5mM MgCl₂,1μg 폴리-dIdC, 4% 폴리비닐-알콜과 15% 글리세롤을 200ng단편과 함꼐 10분간 얼음 위에서 인큐베이트 함에 의해 수행되었고 그리고 나서 10mM MgCl₂, 4mM CaCl₂안에 동량의 DNase I이 첨가되었다. 인큐베이션 2분후 반응은 동량의 종결 완충액을 동량 첨가에 의해 종결된다.(Ausubel, 1994), DNA는 페놀과 클로로포름으로 추출되고 에탄올 침전후 6% 서열화 겔상에서 분석되었다. 겔쉬프트를 위한 올리고 뉴클레오티드의 서열은 : 5′-GAAAAAGTA ATTGAACATTTTTCC-3', 위쪽 나선). 풋프린팅에서 2개의 보호된 구역에 대응하는 겔쉬프트 분석에 사용된 올리고 뉴클레오티드의 서열은 :

(5′-GGCTGGCTCATATGCCTTTATTTTT TTTAATGACTAATTATTTGAG-3', -2222 내지 -2176, 상부가닥) 및 (5′-CACACTTAGTTACTGAGCCAATATTCTG CG-3', -695 내지 -664, 상부가닥).

본 발명에 따르면, 세포에 스며들 수 있는 펩타이드는 예를 들면, 호메오단백질 표적의 확인을 위해 사용될수 있다는 것을 보여주었다. 더욱이 AntpHD의 3번째 나선에 폴리펩타이드의 결합에 의해 그리고 그것의 내재화에 의해 본 방법은 예로서 호메오도메인과 다른 DNA결합 도메인처럼 활성화된 도메인이 확인된 다른 단백질에까지 확장될수 있음이 분명하다. 그러나 우리가 합성해오고 생산해온 100개 아미노산 이하의 길이를 가진 모든 폴리펩티드는 세포의 세포질에 들어가고 대부분은 핵에 들어간다. 벡터로서 사용되는 AntpHD의 3번째 나선은 16개의 아미노산을 포함하기 때문에 최소 84개의 아미노산을 가진 활성 도메인이 살아있는 세포에 도입될수 있고, 그래서 새롭고 강력한 유전자 트랩 기술의 길을 열었다는 것은 상당히 고무적이다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(i) 출원인:

(A) 성명: GSF-Forschungszentrum fuer Umwelt und Gesundheit GmbH

(B) 거리: Ingolstaedter Landstrasse 1

(C) 시: Neuherberg

(D) 주: Bayern

(E) 나라: Deutschland

(F) 우편번호: 85764

(ii) 발명의 명칭: Verfahren zur Identifizierung von Zielgenen von Transkriptionsfaktoren

(iii) 서열의 수: 25

(iv) 컴퓨터 해독 형태:

(A) 매질 타입: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC compatible

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: PatenIn Release #1.0, #1.30 버전 (EPO)

(v) 현 출원 데이타:

출원번호: DE 197 40 578.9

(2) 서열번호 : 1

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 47 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CTCAAATAAT TAGTCATTAA AAAAAATAAA GGCATATGAG CCAGCCT 47

(2) 서열번호: 2

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 30 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CGCAGAATAT TGGCTCAGTA ACTAAGTGTG 30

(2) 서열번호: 3

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 10 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TCAATTAAAT 10

(2) 서열번호: 4

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 26 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TTTCATATGG AAGACAAGCG GCCCCG 26

(2) 서열번호: 5

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 32 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GGGGGATCCC TACGCCTTCT TGATCTTGGC TC 32

(2) 서열번호: 6

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 48 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

AGCTTCATAT GGAGGAGGGC GGCCGCAGCC CCCGGGAGGA GGAATTCG 48

(2) 서열번호: 7

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 48 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GATCCGAATT CCTCCTCCCG GGGGCTGCGG CCGCCCTCCT CCATATGA 48

(2) 서열번호: 8

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 18 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TGGCGAAGGG GGATGTGC 18

(2) 서열번호: 9

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 25 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GACTCTGGCG CCGCTGCTCT GTCAG 25

(2) 서열번호: 10

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 46 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT ACGGRGGGRR GGGRRG 46

(2) 서열번호: 11

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 24 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

ACCTGTTGGT CTGAAACTCA GCCT 24

(2) 서열번호: 12

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 32 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CUACUACUAC UAGGCCACGC GTCGACTAGT AC 32

(2) 서열번호: 13

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 27 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TGCTGGACCC AGCCGAGAGG GCTGTGC 27

(2) 서열번호: 14

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 28 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TGGCGAAAGG GGGATGTGCT GCAAGGCG 28

(2) 서열번호: 15

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 28 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

AGCAGATGAG CGGGACAAAG TTCAAAAG 28

(2) 서열번호: 16

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 28 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CGCCAGGGTT TTCCCAGTCA CGACGTTG 28

(2) 서열번호: 17

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 18 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GGAAGTTCTT CCTCTACT 18

(2) 서열번호: 18

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 18 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GGTTGAAACT ACTCAGAG 18

(2) 서열번호: 19

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 24 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GAAAAAGTAA TTGAACATTT TTCC 24

(2) 서열번호: 20

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 46 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

GGCTGGCTCA TATGCCTTTA TTTTTTTTAA TGACTAATTA TTTGAG 46

(2) 서열번호: 21

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 30 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CACACTTAGT TACTGAGCCA ATATTCTGCG 30

(2) 서열번호: 22

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 225 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

TGCTGGACCC AGCCGAGAGG GCTGTGCTTC GGATAGCAGA TGAGCGGGAC AAAGTTCAAA 60

AGAAAACATT TACAAAATGG ATAAATCAGC ATCTCATGAA GGGTCCCAGG TCCCGAAAAC 120

CAAAGAAGAA GAACCCTAAC AAAGAGGACA AGCGGCCTCG CACAGCCTTC ACTGCTGAGC 180

AGCTCCAGAG GCTCAAGGCT GAGTTTCAGA CCAACAGGTC GACAA 225

(2) 서열번호: 23

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 72 아미노산

(B) 서열의 타입: 아미노산

(C) 쇄의 수: 단일

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: 단백질

Leu Asp Pro Ala Glu Arg Ala Val Leu Arg Ile Ala Asp Glu Arg Asp

1 5 10 15

Lys Val Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Ile Asn Gln His Leu Met

20 25 30

Lys Gly Pro Arg Ser Arg Lys Pro Lys Lys Lys Asn Pro Asn Lys Glu

35 40 45

Asp Lys Arg Pro Arg Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu Gln Arg Leu

50 55 60

Lys Ala Glu Phe Gln Thr Asn Arg

65 70

(2) 서열번호: 24

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 657 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CTGAATTGCA ACCTGCCCTG CCCCTTGTTT AGCTTCCCAA GTACTGGGCT TACAGTAGAC 60

TTGCACTGTA ACACAAGCCT AGATAATAAA CTTCTTTTGT GATATGTATG CAGTCTGTAA 120

CAATACAAAG TGGATTATGA TGCACATTAA AATTCTGATA CTGCTGTAGT GACCAAAACT 180

ATCTTTTCTT GGTGTCTTTA ATTCAAATGG CTCATTTAAT GCTTCATTTT AACTACCTGT 240

AAGGGCTGCA CCCTAAGCAT TTACAGTTCA TTTTAGTTCA TAGGCTGCTT ATGTAGACAT 300

GGTAACTTTA TGAGTTAACA AGGATGCAGC CAGTAATAAA GGGTGGACTT GCCTTTGCAT 360

TCATAATGTA ATATATTATC TTTAATTCAT TACTCCATGG CAACACTGAA GTCGGTGTCT 420

AAGACAGTGA GGACACAGCT ACACTGCGTG TCTCTGTTTT GTGCTTGGCA TTGAGCAAAG 480

GCACTGGTAA GGGACCCAAA ATGATAGCTC CTCTCTACAT TCTCAGAGCG GATACCTAAG 540

TAACAAGTGG CTTAAACACT CCATGAAGAA ATATGAAATT ATAACCAAGG AAAGAACCCT 600

GAACAATACT CAAATAATTA GTCATTAAAA AAAATAAAGG CATATGAGCC AGCCTGG 657

(2) 서열번호: 25

(i) 서열의 특징:

(A) 서열의 길이: 639 염기쌍

(B) 서열의 타입: 핵산

(C) 쇄의 수: 2본쇄

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자의 타입: DNA (게놈성)

CTTAAATATG CTGTGGCGTG ATATGCAATG CACTGCAAAT ACTATGCTGA TAACTATTCT 60

AAAGAATCCT GCCTACAGCC ATTCATTTGC TTGCTGAGGT TTGCCTTTTG TAGCCAGCAT 120

TAAAGCCCTG CAAGTACGGG CAGAGCAGGA CGATTGGGCG TCACTGGGAA AGATATGCCA 180

AATATTTTCA CCAAGAGTCA TCCAGCTTCA ACCACCTAAA AAACAACTCA GGTACACAGG 240

AGCCCGGGCA GCACCAGTGA AGGTAATGCT ATCAATACCA AGCACCAACC AGAAACACAA 300

AGCTCAGATC ACACAGCTGG ACAAATGCTG GACAGCAAGC AGATCCCACG TGCTTCCTAA 360

CACAAGGTAA AATGCTGGAC TAATCAATAA GTCAATAATC AATAAGCAAG CACACAAATT 420

TAATGAGAAA CCAAATCTGT TTCCATTTGA CCATCTCTTC CATTGTTCAC CGCATTAAAT 480

TAACTGGAAA AATGTTCAAT TACTTTTTCT TTGTGTGATA AACTCTCTCT CCTAAGCCAC 540

TACTGTTTGG ATTCTAAAAG CCAAAGACTC CACGCAGAAT ATTGGCTCAG TAACTAAGTG 600

TGAATGTGTC TGGGCTTGCT TCTTCTTCAC ACAGACTAG 639

Claims

전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 전사인자의 보조인자의 확인 방법으로서, 하기와 같은 단계로 이루어지는 방법:

(a) 배양액내의 진핵 세포로 기능적 배열로 적어도 하기의 성분들을 포함하는 유전자 트랩 벡터를 도입하는 단계:

- 리포터 유전자

- 폴리아데닐화 부위

- 선택 마커 유전자;

(b) 상기 벡터를 함유하는 세포를 선택하는 단계;

(c) 상기 선택된 세포를 분석될 전사인자, 대응하는 전사인자 책임있는 성분, 표적 유전자 및/또는 대응하는 전사인자의 보조인자와 접촉시키는 단계;

(d) 리포터 유전자 활성의 변화를 갖는 세포를 확인하고 배양하는 단계; 및

(e) 상기 표적 유전자, 전사인자의 보조인자 및/또는 전사인자 책임있는 성분을 확인하는 단계.
제1항에 있어서, 유전자 트랩 벡터의 도입은 일렉트로포레이션, 트랜스펙션, 리포펙션 또는 레트로바이러스 벡터에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 진핵세포에서 검출가능한 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터는 마커 유전자를 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터는 태아 스템 세포에서 활성적인 선택 마커 유전자를 위한 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 선택 마커 유전자는 항생물질 내성 마커 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터는 네가티브 선택을 위한 리포터 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 구성적으로 활성인 유전자에서 통합에 대해 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터를 함유하는 세포를 위한 상기 선택은 단계 (a)에서 얻어지는 상기 세포를 상기 선택 마커 유전자에 특이적인 선택 제제에 노출시킴에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 제제는 항생물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전사인자는 단계 (b)에서 얻어진 상기 세포의 세포 배양 배지로 첨가되거나, 또는 상기 전사 인자를 코드화하는 유전자가 상기 세포로 도입되는 갓을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전사인자의 코드하는 상기 유전자는 진크 핑거 유전자, Pou 유전자, 호메오박스 함유 유전자, HGM-박스 함유 유전자 및 윈게드 나선 유전자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 전사인자는 그것이 세포막을 통과하게 하는 호메오도메인을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터는 배양액내의 태아 스템 세포 라인, 섬유아세포 라인, 뉴론 세포 라인, 종양 세포 라인 및 효모세포로 구성된 군으로부터 선택되는 진핵 세포로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서 얻어지는 상기 세포는 키메라 포유동물의 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 트랩 벡터는 리딩 프레임에서 각각 기능적 결합하는, 선택 마커 유전자 뿐만 아니라 스플라이스 수용체 부위에 융합되는 리포터 유전자, 구성적으로 활성인 유전자에서 통합에 대항해서 선택적인 리포터 유전자, 내부 리보좀 도입 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.