KR19990016880A - Method for producing bacteriorhodosin using halobacteria - Google Patents
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Abstract
본 발명은 필터가 부착된 연속 배양장치를 이용하여 할로박테리아를 고농도로 배양하면서 박테리오로돕신을 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 박테리오로돕신의 제조방법에 의하면, 종배양된 할로박테리아를 내부 필터 발효기 또는 외부 필터 발효기에 접종하여 회분배양한 다음, 연속배양으로 전환하여 할로박테리아를 고농도로 배양하고, 용존산소 농도를 낮게 유지하여 고농도로 배양된 할로박테리아에 의해 박테리오로돕신이 대량으로 제조된다. 본 발명의 방법으로 박테리오르돕신을 제조하면, 고농도로 배양된 할로박테리아에 의해 미래의 전자 소자로 가장 유력시되고 있는 박테리오로돕신을 대량으로 제조할 수 있다.The present invention relates to a method for producing a large amount of bacteriododocin while culturing halobacteria at a high concentration using a continuous culture apparatus equipped with a filter. According to the method for producing the bacteriododoxin of the present invention, the seeded halobacteria are inoculated in an internal filter fermenter or an external filter fermenter, and then batch-cultured, and then converted into continuous culture to incubate the halobacteria at a high concentration, and keep the dissolved oxygen concentration low. The bacteriododocin is produced in large quantities by halobacteria cultured at high concentration. By producing bacteriordopsin by the method of the present invention, it is possible to produce a large amount of bacteriordopsin which is most likely to be used as an electronic device of the future by halobacteria cultured at high concentration.
Description
본 발명은 박테리오로돕신(bacteriorhodopsin)의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 필터가 부착된 연속 배양장치를이용하여 할로박테리아를 고농도로 배양하면서 박테리오로돕신을 대량으로 제조하는 방법에 관한것이다.The present invention relates to a method for the preparation of bacteriorhodopsin. More specifically, the present invention relates to a method for producing a large amount of bacteriododocin while culturing halobacteria at a high concentration using a continuous culture apparatus equipped with a filter.
할로박테리아는 호염성 원시 미생물(Archaebacterium)로서, 호기 조건에서는 산소를이용한 호흡대사를 통해 ATP를 생산하지만, 산소가 제한된 혐기적 조건에서는 박테리오로돕신이라는 세포막 단백질을 통해 ATP를 생산한다. 이러한 박테리오로돕신은 제한된 산소조건 하에서 할로박테리아의 세포내에 합성되는 화학적으로 변형된 자색의 세포막을 구성하는 단백질로서, 리신잔기의 엡실론 아미노기와 시프염기(Schiff's base)를 통하여 연결되어 있는 카로티노이드의 레티날(retinal)을 색소포(chromophore)로서 갖고 있다. 이와 같은 구조로 구성되어 있는 박테리오로돕신이 빛을 받으면 레티날의 이성질화 현상에 의해 시프염기의 양자이탈이 일어나고, 레티날은 시프염기가 양자를 재흡입할 때 기저상태로 돌아오며, 양자 흡입시 막내부의 양자가 소비되고, 양자이탈 시에는 이 양자가 막 밖으로 방출되는 방법으로 광순환(photocycle)이 이루어진다(참조: Henderson et al., Nature, 257:28-32(1975)).Halobacterium is a basophilic Archaebacterium that produces ATP through oxygen-respiratory metabolism in aerobic conditions, but produces ATP through a cell membrane protein called bacteriododoxin in anaerobic-limited anaerobic conditions. This bacteriododocin is a protein that constitutes a chemically modified purple cell membrane synthesized in cells of halobacteria under limited oxygen conditions. The carotenoid retinal is linked through an epsilon amino group of lysine residue and Schiff's base. ) As a chromophore. When the bacteriorhodosin, which is composed of such a structure, receives light, the proton departure of the sieve base occurs due to the isomerization of the retinal, and the retinal returns to the base state when the sieve base reinhales the proton, Negative protons are consumed, and when protons are released, a photocycle occurs in such a way that the protons are released out of the membrane (Henderson et al., Nature, 257: 28-32 (1975)).
이러한 빠르고 가역적인 광순환 특성을 지닌 박테리오로돕신은 기존 반도체의 한계를 극복하고자 하는 차원에서 새로이 발전하고 있는 생물전자공학 분야에서 전자소자, 바이오칩(biochip) 및 3차원 메모리소자를 개발하는데 있어서 가장 유력시되고 있는 생체분자이기도 하다. 특히, 박테리오로돕신은 다른 생체분자와는 달리 고온, 건조 및 전해질같은 용액에서도 안정성이 있으며, 다양한 ph 범위에서도 활성을 유지하는 등 산업적으로 이용하기에 가장 접합한 특성을 가지고 있다(참조: Oesterhelt et al., Quarterly Rev. Biophys., 24:425-478(1991)).Bacteriorhodosin, which has fast and reversible optical circulation characteristics, is the most influential in developing electronic devices, biochips, and three-dimensional memory devices in the newly developed bioelectronics field in order to overcome the limitations of existing semiconductors. It is also a biomolecule. In particular, unlike other biomolecules, bacteriododoxin is stable in solutions such as high temperature, drying, and electrolytes, and has the most conjugated characteristics for industrial use, such as its activity in various pH ranges (see Oesterhelt et al. , Quarterly Rev. Biophys., 24: 425-478 (1991)).
이러한 박테리오로돕신을 생산하는 할로박테리아에 대한 연구는 주로 1960년대 내지 1970년대에 이루어져 할로박테리아의 생리학적 특성 및 박테리오르돕신의 제조에 관련된 연구가 일부 진행되어 왔다. 이러한 연구결과에 따르면, 할로박테리아는 매우 느리게 성장하고 아미노산을 다량 함유한 복합질소원이 필요하며(참조: Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31:667-678(1974)), 다른 탄소화합물은 이용하지 않는 반면에 글리세롤을 포함한 배지에서는 성장이 향상된다는 보고도 있다(참조: Onichi et al., Can. J. Microbiol., 11:365-373(1965);Gochnauer et al., Can. J. Microbiol., 15: 157-1165-1969)). 아울러, 최근에는 종래에 비해 할로박테리아의 성장을 1.5 내지 2배까지 촉진하는 배지가 제안되기도 했다(참조:미합중국 특허 제 1,363,778호(1994)).The research on halobacteria producing such bacteriodopsin has been mainly conducted in the 1960s to 1970s, and some studies related to the physiological characteristics of halobacteria and the production of bacteriordopsin have been conducted. According to these studies, halobacteria grow very slowly and require complex nitrogen sources containing high amounts of amino acids (Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31: 667-678 (1974)), and other carbon compounds are used. In contrast, growth has been reported in media containing glycerol (Onichi et al., Can. J. Microbiol., 11: 365-373 (1965); Gochnauer et al., Can. J. Microbiol). , 15: 157-1165-1969). In addition, in recent years, a medium for promoting the growth of halobacteria by 1.5 to 2 times has been proposed (see US Patent No. 1,363,778 (1994)).
또한, 할로박테리아는 산소농도가 낮고 빛이 있는 조건에서 박테리오로돕신을 다량으로 제조하는 반면에 완전한 혐기상태에서는 박테리오로돕신을 제조하지 않을 뿐 아니라, 할로박테리아 자체도 성장을 못하는 것으로 밝혀졌다(참조: Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:3821-3825(1980); SShand et al., J. Bacteriol., 173:692-699(1991)). 이와 함께, 박테리오로돕신은 할로박테리아의 성장과정 중 쇠퇴기 말기에서부터 발현되기 시작하며, 빛 또는 산소농도와 같은 다양한 환경조건에 의해 영향을 받는 것으로 알려졌다(참조: Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31:667-678(1974)).In addition, halobacteria have been found to produce a large amount of bacteriodopsin in low oxygen and light conditions, while not producing bacteriodopsin in complete anaerobic conditions, and halobacteria themselves have not been shown to grow (Hartmann et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 3821-3825 (1980); SShand et al., J. Bacteriol., 173: 692-699 (1991). Along with this, bacteriodhodopsin begins to be expressed at the end of the period of decline during the growth of halobacteria and is known to be affected by various environmental conditions such as light or oxygen concentrations (see Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31: 667). 678 (1974).
한편, 할로박테리아의 성장과 박테리오로돕신의 제조에 대한 연구가 진행되면서, 일부에서는 할로박테리아의 단백질인 박테리오루베린(bacterioruberin)이 박테리오로돕신과 경쟁적으로 발현되는 것을 밝혀내고, 박테리오루베린의 발현을 억제시킨 변이주를 이용하여 박테리오로돕신을 제조하는 방법을 개발하기도 하였다(참조: Shand et al., J. Bacteriol., 176:1655-1660(1994); Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5478-5482(1989);Krebs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:859-863(1990)).On the other hand, as research on the growth of halobacteria and the production of bacteriorodopsin progressed, in part, it was found that bacteriorubirine (bacterioruberin), which is a protein of halobacterial, was competitively expressed, and the mutant strain that suppressed the expression of bacteriorubberin. (Shand et al., J. Bacteriol., 176: 1655-1660 (1994); Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86). 5478-5482 (1989); Krebs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 859-863 (1990).
그러나, 이러한 연구결과들은 할로박테리아의 성장 및 박테리오로돕신의 제조에 대한 기초적인 연구성과에 불과하며, 산업적으로 박테리오로돕신을 대량으로 제조할 수 있는 방법은 개발되지 못하고 있다. 예를 들면, 쿠쉬너(Kushiner)는 회분식 발효방법으로 할로박테리아를 100L 규모로 배양하기도 하였으나(참조:Kushner, Biotechnol. Bioeng., 8:237-245(1966)), 이와 같은 회분식 발효조건에서는 할로박테리아의 성장과정에서 배출되는 노폐물이 배지에 축적되어 미생물의 성장이 억제된다는 문제점이 노출되어 산업적으로 이용하는 데에는 한계가 있었다. 이렇듯, 아직까지는 회분식 발효를 통하여 할로박테리아를 배양하면서 20 내지 50㎎/L의 박테리오르돕신을 제조하는 등(참조: Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31:6670678(1974)), 소량의 박테리오로돕신만이 발효를 통하여 제조되고 있는 실정이다.However, these findings are only basic researches on the growth of halobacteria and the production of bacteriorhodoxin, and methods for producing the bacteriorodosin in large quantities have not been developed. For example, Kushiner cultivated halobacteria on a 100 L scale by batch fermentation (Kushner, Biotechnol. Bioeng., 8: 237-245 (1966)). Waste products discharged during the growth of bacteria accumulate in the medium, and the problem of inhibiting the growth of microorganisms has been exposed, and there was a limit to industrial use. As such, to produce a 20 to 50 mg / L of bacteriordopsin while culturing halobacteria through batch fermentation (Oesterhelt et al., Methods Enzymol., 31: 6670678 (1974)), a small amount of bacteriodopsin It is the situation which is manufactured through this fermentation.
따라서, 미래의 전자소자로서 가장 유력시 되고 있는 박테리오로돕신의 산업적인 규모의 생산을 위하여, 할로박테리아를 대량으로 배양하고 이들 미생물을 이용하여 박테리오로돕신을 제조하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 절실히 대두되었다.Therefore, there is an urgent need to develop a method for producing a bacteriodopsin using a large amount of cultivated halobacteria and using these microorganisms for the industrial scale production of bacteriodopsin, which is the most potent electronic device of the future.
이에, 본 발명자들은 미래의 전자 소자로서 가장 유력시되고 있는 박테리오로돕신을 대량으로 제조하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 내부 또는 외부에 필터를 장착한 배양기에서 할로박테리아를 우선 회분식으로 배양한 다음 연속배양으로 전환하여 고농도로 할로박테리아를 배양하고, 배양기내 용존 산소의 농도를 낮추어 박테리오로돕신이 발현되도록 하면, 박테리오로돕신을 대량으로 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Therefore, the present inventors have diligently researched to manufacture a large amount of bacteriododocin, which is considered to be the most potent electronic device of the future. As a result, the halobacteria were first cultured in a batch culture apparatus equipped with an internal or external filter, and then switched to continuous culture. By culturing the halobacteria at a high concentration and lowering the concentration of dissolved oxygen in the incubator to express the bacteriodopsin, it was confirmed that the bacteriodopsin can be produced in large quantities, thereby completing the present invention.
결국, 본 발명의 목적은 할로박테리아를 이용하여 박테리오로돕신을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.After all, it is an object of the present invention to provide a method for producing a large amount of bacteriododocin using halobacteria.
제1도는 본 발명에 의한 할로박테리아의 고종도 배양과 박테리오로돕신의 제조를 위한 내부필터 발효기를 개략적으로 도시한 그림이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the internal filter fermenter for high-cultivation of halobacteria and the production of bacteriododoxin according to the present invention.
제2도는 본 발명에 의한 할로박테리아의 고농도 배양과 박테리오로돕신의 제조를 위한 외부필터 발효기를 개략적으로 도시한 그림이다.2 is a schematic diagram illustrating an external filter fermenter for high concentration culture of halobacteria and preparation of bacteriododoxin according to the present invention.
이하에서는, 본 발명에 의한 박테리오로돕신의 제조방법을 공정별로 나누어 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the method for producing bacteriododocin according to the present invention will be described in detail by dividing the process.
제1공정: 할로박테리아의 종배양Process 1: Species Culture of Halobacteria
할로박테리아를 8 내지 12 g/L, 가장 바람직하게는 10g/L의 복합질소원을 함유한, pH가 5 내지 8, 바람직하게는 6내지 8인 단순배지에 접종하여, 30 내지 40℃, 가장 바람직하게는 35℃에서, 200 내지 300rpm으로 진탕하면서 660nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 소규모로 배양한다. 이때, 할로박테리아는 후술하는 실시예에서 예시한 할로박테리움 할로비움(Halobacteriumhalobium R1 ATCC NO. 29341)을 포함하는 박테리오로돕신을 생산하는 할로박테리움 속(Halobacterium sp.)의 균주를 이용한다.Halobacterium is inoculated into a simple medium having a pH of 5 to 8, preferably 6 to 8, containing 8 to 12 g / L, most preferably 10 g / L of a complex nitrogen source, most preferably 30 to 40 ° C. Preferably at 35 ° C., incubated in small scale until absorbance at 660 nm is 2.0 while shaking at 200 to 300 rpm. In this case, halobacteria uses a strain of the genus Halobacterium sp. That produces bacteriorhodoxin, including Halobacterium halobium (Halobacterium halobium R1 ATCC NO. 29341), which is illustrated in the following examples.
제2공정:할로박테리아의 고농도 배양Second Step: High Concentration Cultivation of Halobacteria
전기공정에서 배양한 접종용 할로박테리아를 외부 또는 내부에 필터가 장착된 발효기에 8 내지 12g/L, 가장 바람직하게는 10g/L의 복합질소원을 함유하며, pH는 5 내지 8, 바람직하게는 6 내지 8인 단순배지를 넣고, 1 내지 3%(v/v), 가장 바람직하게는 2%(v/v)의 비로 접종하여, 30 내지 40℃, 가장 바람직하게는 250rpm으로 교반하면서 660rpm에서 배양기내 배양액의 흡광도가 2.0이 될 때까지 회분식으로 배양한다. 그런 다음, 신선한 배지를 공급하고 발효기내의 필터를 통해 배출 및 재순환하며, 산소를 공급하여 용존 산소의 농도가 20% 이상이 되도록 하고 빛을 공급하여, 200 내지 400 rpm, 가장 바람직하게는 300rpm으로 교반하면서 연속 배양하여 할로박테리아를 고농도로 배양한다.The inoculum halobacteria cultured in the electrical process contains 8 to 12 g / L of complex nitrogen source, most preferably 10 g / L, in a fermenter equipped with a filter externally or internally, and the pH is 5 to 8, preferably 6 Simple medium of 8 to 8, inoculated at a ratio of 1 to 3% (v / v), most preferably 2% (v / v), incubator at 660 rpm while stirring at 30 to 40 ℃, most preferably 250 rpm Incubate batchwise until the absorbance of the culture medium is 2.0. Then, fresh medium is fed and discharged and recycled through a filter in the fermentor, oxygen is supplied so that the concentration of dissolved oxygen is 20% or more, and light is supplied, followed by stirring at 200 to 400 rpm, most preferably 300 rpm. While culturing halobacteria in a high concentration.
제3공정: 박테리오로돕신의 제조Third Step: Preparation of Bacteriorhodosin
전기 공정의 연속배양을 통해 할로박테리아가 고농도로 성장하면, 용존산소가 1 내지 10 %, 바람직하게는 3 내지 7%가 되도록 산소의 공급을 감소시켜 대량으로 배양된 할로박테리아가 박테리오로돕신을 제조하도록 한다.When halobacteria grow at high concentrations through the continuous culture of the electrical process, the halobacteria cultured in large quantities can be produced by reducing the supply of oxygen such that dissolved oxygen is 1-10%, preferably 3-7%. .
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예1: 다양한 복합질소원을 이용한 할로박테리아의 배양Example 1 Cultivation of Halobacteria Using Various Complex Nitrogen Sources
할로박테리움 할로비움(Halobacterium halobium R1 ATCC NO. 29341)를 L당 염화나트륨 250g, 염화마그네슘 6수화물 20g, 염화칼슘 2수화물 0.2g, 염화칼륨 2g 및 아미노산을 포함하는 복합질소원 10g을 함유하며, pH를 7.0으로 조정한 단순배지 50ml가 들어 있는 플라스크에 접종하여 35℃에서 약 250rpm으로 약 70시간 동안 진탕배양기(Vision Scientific Co., Korea)에서 배양하였다. 이때, 복합질소원으로는 효모추출물(yeast extract), 카제인 가수분해물(casein enzymatic hydrolysate), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 카사미노산:(casamindnd acid)또는 프로테아제 펩톤(protease peptone)을 각각 첨가하여 배양하였고, 각 복합질소원별로 할로박테리아의 성장과 박테리오르돕신의 수율 정도르 측정하여 그 결과를 표1에 나타내었다.Halobacterium halobium (Halobacterium halobium R1 ATCC NO.29341) contains 250 g of sodium chloride, 20 g of magnesium chloride hexahydrate, 0.2 g of calcium chloride dihydrate, 2 g of potassium chloride, and 10 g of a complex of nitrogen containing amino acids, and a pH of 7.0 The flask was inoculated with 50 ml of the adjusted simple medium and incubated in a shaker (Vision Scientific Co., Korea) for about 70 hours at 35 ° C. at about 250 rpm. In this case, as the nitrogen source, yeast extract, yeast extract, casein enzymatic hydrolysate, peptone, tryptone, casasmindnd acid or protease peptone are added, respectively. The growth of the halobacteria and the yield of the bacteriodidocin for each of the multiple nitrogen sources was measured and the results are shown in Table 1.
할로박테리아의 성장은 660nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 확인하였으며, 박테리오로돕신은 배양액:4N NH4OH:4N NaoH가 9:05:5(v/v)가 되도록 혼합하여 568nm에서 흡광도를 측정하고, 박테리오로돕신으로부터 레티날이 제거되도록 24시간 동안 빛에 노출시킨 다음, 당시 568nm에서 흡광도를 측정하여 그 차이로써 정량하였다(참조: Shand et al., J. Bacteriol., 173:4692-4699(1991)).The growth of halobacteria was confirmed by measuring the absorbance of the culture at 660 nm, and the bacteriododocin was mixed so that the culture medium: 4N NH 4 OH: 4N NaoH was 9: 05: 5 (v / v) to measure the absorbance at 568 nm and the bacteriododocin After exposure to light for 24 hours to remove the retinal from the light, the absorbance at 568 nm at that time was measured and quantified as the difference (Shand et al., J. Bacteriol., 173: 4692-4699 (1991)).
상기 표 1에서 보듯이, 할로박테리움 할로비움을 다양한 복합질소원이 각기 10g/L 의 농도로 첨가된 배지에서 70시간동안 배양하였을 경우, 효모추출물이 첨가된 배지에서 가장 빠르게 성장하였으며, 또한 박테리오로돕신의 제조정도도 가장 높았다. 그러므로, 하기 실시예에서는 효모추출물을 복합질소원으로 첨가한 배지만을 이용하여 660nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 할로박테리아를 배양하여 발효기에서의 배양을 위한 접종용으로 사용하였다.As shown in Table 1, when halobacterium halovium was incubated for 70 hours in a medium in which various complex nitrogen sources were added at a concentration of 10 g / L, respectively, the yeast extract was the fastest growing medium, and also of bacteriododocin The manufacturing degree was the highest. Therefore, in the following examples, the halobacteria were cultured until the absorbance at 660 nm was 2.0 using only the medium to which the yeast extract was added as a composite nitrogen source, and used for inoculation for culturing in the fermentor.
실시예 2: 내부 필터 발효기를 이용한 할로박테리아의 고농도 배양 및 박테리오로돕신의 제조Example 2: High Concentration Cultivation of Halobacteria and Internal Bacterial Fermenter
내부 필터 발효기(internal membrane bioreactor system)를 이용한 할로박테리아의 고농도 배양을 위하여, 제1도에 도시한 바와 같이 내부 필터 장치가 장착된 발효기에 실시예 1에서와 동일한 배지 1.5L를 넣은 다음, 실시예1에서 배양한 할로박테리아를 2%(v/v)의 양으로 접종하여, 실시예1과 동일한 조건에서 발효기내 배양액이 660nm에서의 흡광도가 2.0이 될 때까지 회분 배양하였다. 이때, 내부 필터 발효기는 필터, 산소 또는 공기공급기, 온도조절기, pH조절기 및 용존산소표시시가 장착되어 있는 배양기와 연속배양을 위하여 배지공급기, 배출배지 저장기 및 타이머로 구성되어 있는 것을 사용하였으며, 발효기내의 필터는 세라믹 재질의 필터로서, 총 면적이 360㎠이고 공경이 0.1㎛인 비대칭형 필터를 사용하였다(참조: 제1도).For high concentration culture of halobacteria using an internal membrane bioreactor system, 1.5L of the same medium as in Example 1 was placed in a fermentor equipped with an internal filter device as shown in FIG. The halobacteria cultured in 1 were inoculated in an amount of 2% (v / v), and the batch culture was carried out under the same conditions as in Example 1 until the absorbance at 660 nm became 2.0. At this time, the internal filter fermenter used a filter, an oxygen or air supply, a temperature controller, a pH controller and a culture medium equipped with a display of dissolved oxygen, and a medium feeder, a discharge medium reservoir, and a timer for continuous culture. The filter in the fermenter was a ceramic filter, and an asymmetric filter having a total area of 360 cm 2 and a pore size of 0.1 μm was used (see FIG. 1).
그런 다음, 희석율(D)이 0.066hr-1의 비가 되도록 신선한 배지를 공급하고 용존 산소의 농도를 20%로 유지하면서 35℃, 300rpm에서 연속배양하였다.연속배양 중, 발효기 내의 배지는 발효기내부에 장착된 필터를 통해 여과하면서 뽑아냈는데, 처음에는 타이머에 설정된 시간 동안 정방향으로 배지를 배출하다가 4.5초 동안 정지 후 역방향으로 배지를 다시 배양기내로 배출하여 발효기내의 필터가 미생물에 의해 막히지 않도록 하였고, 여과액의 총 부피는 새로 공급되는 배지의 부피와 동일하도록 설정하였다. 이와 같은 방법으로 150 시간동안 할로박테리아를 배양하면서 미생물의 성장을 660nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다 150시간째 부터는 욘존 산소의 농도가 3 내지 7%가 되도록 유지하여 박테리오로돕신이 제조되도록 하면서 단백질의 함량과 박테리오로돕신의 제조량을 정량하였다. 이때, 단백질 농도는 바이오라드 DC 단백질 분석장치(Bio-Rad DC protein assay kit, Bio-Rad Pacific Ltd., USA)를 이용하여 분석하였으며, 박테리오로돕신은 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 정량하였다.Thereafter, fresh medium was supplied at a dilution rate (D) of 0.066 hr −1 and continuously cultured at 35 ° C. and 300 rpm while maintaining the concentration of dissolved oxygen at 20%. During continuous culture, the medium in the fermentor was kept in the fermentor. Filtration was carried out by filtration through an attached filter, and the medium was discharged in the forward direction for the time set in the timer, and then stopped for 4.5 seconds, and the medium was discharged back into the incubator in the reverse direction to prevent the filter in the fermenter from being blocked by microorganisms. The total volume of was set equal to the volume of freshly fed medium. In this way, the growth of microorganisms was measured at 660 nm while the halobacteria were incubated for 150 hours. After 150 hours, the concentration of protein was produced while maintaining the concentration of zonal oxygen at 3 to 7%. The amount of production of bacteriododocin was quantified. At this time, the protein concentration was analyzed using a Biorad DC protein assay kit (Bio-Rad DC protein assay kit, Bio-Rad Pacific Ltd., USA), the bacteriododoxin was quantified according to the method described in Example 1.
이상의 배양결과, 연속배양이 종료되고 박테리오로돕신의 제조가 시작되는 150시간째에 할로박테리아는 660nm에서의 흡광도가 약 12에 이를 때까지 고농도로 배양되었으며, 이렇게 배양된 할로박테리아는 전체 단백질 중 2.4 내지 2.5%, 즉 125 내지 130mg/L의 박테리오로돕신을 제조하는 것을 확인하였다.As a result of the above culture, halobacteria were incubated at high concentration until the absorbance at 660 nm reached about 12 at 150 hours after continuous culture was terminated and the production of bacteriododocin was started. Thus, the cultured halobacteria were 2.4 to 2.5 of the total protein. It was confirmed to produce%, ie 125-130 mg / L of bacteriododocin.
실시예 3: 외부 필터 발효기를 이용한 할로박테리아의 고농도 배양 및 박테리오로돕신의 제조Example 3: High concentration culturing of halobacteria and preparation of bacteriododoxin using an external filter fermenter
외부 필터 발효기(external membrane bioreactor system)를 이용한 할로박테리아의 고농도 배양을 위하여, 제2도에 도시한 바와 같은 외부 필터 장치가 장착된 발효기를 이용하여 회분배양하고 희석율(D)을 0.1hr-1의 비로 하여 연속배양한 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 할로박테리아를 배양하고 박테리오로돕신을 제조하였다. 이때, 외부 필터 발효기는 산소 또는 공기공급기, 온도조절기, pH조절기 및 용존산소표시기가 장착되어 있는 배양기와 배지공급기, 펌프 및 필터로 구성되어 있는 것을 사용하였으며, 필터는 유효면적이 650㎠이며 분자량이 50만 이하인 것만을 통과시키는 폴리 술폰 재질의 초여과필터(A/G Technlogy Co., USA)를 사용하였다(참조: 제2도).For high concentration cultivation of halobacteria using an external membrane bioreactor system, batch culture was carried out using a fermenter equipped with an external filter device as shown in FIG. 2 and the dilution rate (D) of 0.1 hr −1 . Except for continuous culture in the ratio, halobacteria were cultured in the same manner as in Example 2, and bacteriodopsin was prepared. At this time, the external filter fermenter was composed of an incubator equipped with an oxygen or air supply, a temperature controller, a pH controller and a dissolved oxygen indicator, a medium feeder, a pump, and a filter. The filter has an effective area of 650 cm 2 and a molecular weight. A polysulfone ultrafiltration filter (A / G Technlogy Co., USA) was used to pass only 500,000 or less (see FIG. 2).
이상의 방법으로 배양하면서 할로박테리아의 성장, 단백질의 농도 및 박테리오로돕신의 제조량을 실시예 1 및 실시예 2의 방법에 따라 측정하였으며, 그 결과 연속배양이 종료되고 박테리오로돕신의 제조가 시작되는 150 시간 째에 할로박테리아는 660nm에서의 흡광도가 14 까지의 고농도로 배양되었으며, 이렇게 배양된 할로박테리아는 전체 단백질 중 2.5%, 즉 200mg/L 의 박테리오로돕신을 제조하는 것을 확인하였다.The growth of the halobacteria, the concentration of the protein and the production amount of the bacteriododocin were measured according to the method of Examples 1 and 2, and the halo at the end of the continuous culture and the production of the bacteriododocin was started at 150 hours. Bacteria were incubated at high concentrations of absorbance up to 14 at 660 nm, and the incubated halobacteria produced 2.5% of the total protein, ie, 200 mg / L of bacteriodopsin.
이상의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 할로박테리아를 내부 필터 발효기 또는 외부 필터 발효기에서 회분배양을 하고 나서 연속배양을 하여 할로박테리아를 성장시킨 다음, 용존산소의 농도를 낮게 유지하는 방식으로 할로박테리아가 박테리오로돕신을 제조하도록 하면, 고농도로 배양된 할로박테리아에 의해 박테리오로돕신이 다량으로 제조될 수 있음을 확인하였다,.As can be seen from the above results, according to the method of the present invention, the halobacteria are batch cultured in an internal filter fermentor or an external filter fermenter, followed by continuous culture to grow halobacteria, and then the concentration of dissolved oxygen is kept low. When the halobacteria in the manner to produce the bacterio rhodopsin, it was confirmed that a high concentration of the bacterio rhodopsin can be produced by the halobacteria cultured.
이상에서 상세히 설명하고 입중하였듯이, 본 발명은 할로박테리아를 내부 필터 발효기 또는 외부 필터 발효기에서 회분 배양을 하고 나서 연속배양을 하여 할로박테리아를 성장시킨 다음, 용존산소의 농도를 낮게 유지하는 방식으로 할로박테리아가 박테리오로돕신을 제조하도록하여, 고농도로 배양된 할로박테리아에 의해 박테리오로돕신을 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.As described and described in detail above, the present invention is a halobacteria by growing the halo bacteria in a continuous culture after the batch culture of the halo bacteria in an internal filter fermentor or an external filter fermenter, and then keep the concentration of dissolved oxygen low It is to provide a method for producing a large amount of bacteriodopsin by halobacteria cultured at a high concentration to allow the production of the bacteriododosin.
본 발명의 박테리오로돕신 제조방법을 이용하면, 고농도로 배양된 할로박테리아에 의해 미래의 전자 소자로 가장 유력시되고 있는 박테리오로돕신을 대량으로 제조할 수 있다.By using the bacteriododocin production method of the present invention, it is possible to produce a large amount of bacteriododocin, which is most likely to be used as an electronic device of the future by halobacteria cultured at high concentration.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1019970039595A KR100222389B1 (en) | 1997-08-20 | 1997-08-20 | Process for producing bacteriorhodopsin with halobacteria |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR100222389B1 KR100222389B1 (en) | 1999-10-01 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR (1) | KR100222389B1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100461906B1 (en) * | 2001-09-12 | 2004-12-14 | 비케이비 주식회사 | Process For Preparation of Bacteriorhodopsin Using Halobacterium sp. |
| KR101439634B1 (en) * | 2012-10-26 | 2014-09-15 | 주식회사 바이오에프디엔씨 | Method for mass production of recombinant protein of antibacterial peptide beta-defensin 3 and homologs thereof |
-
1997
- 1997-08-20 KR KR1019970039595A patent/KR100222389B1/en not_active IP Right Cessation
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|---|---|
| KR100222389B1 (en) | 1999-10-01 |
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