KR19980073699A - Method of forming thin layer of apatite crystals containing apatite crystals having low crystallinity - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결정도(crystalliniy)가 낮은 인회석으로 구성된 박막층(thin layer of apatites)을 고형기질면(solid substrate) 위에 형성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 저온에서 전하를 갖는 고형기질면 위에 인회석이 부착하여 성장하도록 하므로써 기질 위에 얇은 인회석층을 형성하는 방법이 제공된다.BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method of forming a thin layer of apatites made of apatite having a low crystalliniy on a solid substrate, more specifically, apatite on a solid substrate having a charge at a low temperature. By adhering and growing, a method of forming a thin apatite layer on a substrate is provided.
Description
본 발명은 결정도(crystalliniy)가 낮은 인회석을 포함하는 박막층(thin layer of apatites)을 고형기질면(solid substrate) 위에 형성하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 전하를 갖는 고형기질면 위에 인회석이 부착하여 성장하도록 하므로써 기질 위에 얇은 인회석층을 형성하는 방법에 관한 것이다.BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method of forming a thin layer of apatites comprising apatite having a low crystalliniy on a solid substrate, and more specifically, apatite is formed on a solid substrate having a charge. A method of forming a thin apatite layer on a substrate by allowing it to grow by adhesion.
인회석 결정은 여러종류의 칼슘-포스페이트 결정중에서 생체 석회화 조직에 존재하는 유일한 것으로서(H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)) 생체 적합성이 있다. 따라서 인회석결정은 뼈 대체물질로서 사용되거나 혹은 금속으로 만들어진 생체재료의 표면에 인회석 막을 형성시켜 조직과 접촉하게 하여 조직의 적합성을 높이는데 사용되어왔다(R. G. T. Geesink, Clin. Orthop. Relat. Res. 261, 39-58 (1990), M. G. Dunn and S. H. Maxian, J. Long Term Effect. Med. Implants 1, 193-203 (1991)).Apatite crystals are the only ones present in biocalcified tissue among various calcium-phosphate crystals (H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)). . Therefore, apatite crystals have been used as bone substitutes or to form apatite membranes on the surface of metal biomaterials to make them come into contact with tissue (RGT Geesink, Clin. Orthop. Relat. Res. 261). , 39-58 (1990), MG Dunn and SH Maxian, J. Long Term Effect.Med.Implants 1, 193-203 (1991)).
인회석은 그 물리화학적 성질이 매우 다양한데, 칼슘과 인산 그리고 수산기로 구성된 순수 수산화인회석은 결정도가 매우 높고 큰 막대모양이지만, 생체내에서 분리해낸 인회석 결정의 경우에는 Melvin J. Glimcher, Hyun-Man Kim, Christian Rey : Isolation of the Calcium-Phosphate Crystals of Bone, US Patant 5,565,502 Oct. 15, (1996)에서 알 수 있었던 바와 같이 결정도가 매우 낮고 크기가 작은 얇은 판 모양의 결정이다(H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)). 이러한 뼈 인회석 결정은 순수한 수산화 인회석 결정과는 다른 물리화학적 성질을 갖는다. 특히 뼈인회석 결정의 표면에는 반응성이 높은 비결정성 불안정 이온이(non-apatitic labile ions) 풍부하게 존재한다(C. Rey et al., Calcif. Tissue Int. 45, 157-164 (1989), C. Rey et al., Calcif. Tissue Int. 46, 157-164 (1990)). 따라서 뼈 결정은 반응성이 매우 높다. 또한 크기가 매우 작기 때문에 단위 표면적이 매우 넓다(A. S. Posner et al., Bone Mineral Composition and Structure in 'Skeletal Research' pp167-192 Academic Press, (1979)). 이러한 점들은 뼈 조직에 존재하는 유기-무기 계면(organic-inorganic interface)에 높은 친화력을 부여한다(C. Rey and M. J. Glimcher, Short Range Organization of the Ca-P Mineral Phase in Bone and Enamel; Changes with Age and Maturation in 'Chemistry and Biology of Mineralized Tissues', eds. H. Slavkin and P. Price, pp5-18, Elsevier Science Pub. (1992)). 그러나 뼈 인회석 결정이 갖는 이와 같은 물리화학적 성질은 크기가 크고 결정도가 높은 수산화 인회석에서는 기대할 수 없다. 왜냐하면 이러한 인회석 결정은 표면의 반응성이 낮고 단위 표면적이 좁기 때문이다.Apatite has a wide variety of physicochemical properties. Pure hydroxyapatite composed of calcium, phosphoric acid, and hydroxyl groups has a very high crystallinity and a large rod shape, but in the case of apatite crystals separated in vivo, Melvin J. Glimcher, Hyun-Man Kim, Christian Rey: Isolation of the Calcium-Phosphate Crystals of Bone, US Patant 5,565,502 Oct. 15, (1996), it is a lamellar crystal with very low crystallinity and small size (H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995) ). These bone apatite crystals have different physicochemical properties from pure hydroxide apatite crystals. In particular, the surface of bone apatite crystals is rich in highly reactive non-apatitic labile ions (C. Rey et al., Calcif. Tissue Int. 45, 157-164 (1989), C. Rey et al., Calcif.Tissue Int. 46, 157-164 (1990)). Thus, bone crystals are very reactive. In addition, because of their very small size, the unit surface area is very large (A. S. Posner et al., Bone Mineral Composition and Structure in 'Skeletal Research' pp167-192 Academic Press, (1979)). These points give high affinity to the organic-inorganic interface present in bone tissue (C. Rey and MJ Glimcher, Short Range Organization of the Ca-P Mineral Phase in Bone and Enamel; Changes with Age) and Maturation in 'Chemistry and Biology of Mineralized Tissues', eds.H. Slavkin and P. Price, pp 5-18, Elsevier Science Pub. (1992)). However, such physicochemical properties of bone apatite crystals cannot be expected from hydroxyapatite with large size and high crystallinity. This is because these apatite crystals have a low surface reactivity and a narrow unit surface area.
지금까지 조직 적합성을 높이기 위하여 타이타늄과 같은 기질표면에 인회석을 도포하고자 많은 노력이 있었다. 그러나 지금까지 개발된 방법에 의해서는 결정도가 높은 인회석 결정이 형성되었으며 이와 같은 인회석으로는 높은 표면 반응성을 기대할 수 없었다. 플라즈마 도포법(plasma coating) 방법으로 만들어진 인회석 결정은 고온에서 생성되어 성장하기 때문에 결정도가 매우 높고 크기가 크며 생체 반응성이 매우 낮은 수산화 인회석이 형성되고, 또한 부산물로서 다른 종류의 칼슘-포스페이트나 칼슘옥사이드 같은 물질도 생성되는 것으로 알려져 있다(H.-G. Pfaff et al., Properties of HA-Coatings in 'Bioceramics' vol 6., eds. P. Ducheyne and D. Christiansen, pp419-424, Butterworth-Heinemann Ltd. (1993)). 그러나 아직까지 이와 같은 부산물이 생체적합성에 어떤 부정적인 영향을 미칠 것인지 확실히 규명되어 있지 않다. 이에 뼈 인회석 결정과 같이, 결정도가 낮아서 생체 반응성이 높고 크기가 작아서 반응표면적이 넓은 인회석 결정막을 기질 표면에 형성시키는 방법의 개발이 요구되어왔다.To date, a great deal of effort has been made to apply apatite to substrate surfaces such as titanium to enhance tissue compatibility. However, apatite crystals with high crystallinity have been formed by the methods developed so far, and high surface reactivity could not be expected with such apatite. Apatite crystals produced by plasma coating are formed and grown at high temperatures to form hydroxyapatite which is very high in crystallinity, large in size and very low in bioreactivity, and is a by-product of other types of calcium-phosphate or calcium oxide. The same substance is also known to be produced (H.-G. Pfaff et al., Properties of HA-Coatings in 'Bioceramics' vol 6., eds.P. Ducheyne and D. Christiansen, pp 419-424, Butterworth-Heinemann Ltd (1993)). However, it is not yet clear what negative impact these byproducts will have on biocompatibility. Accordingly, there has been a demand for the development of a method for forming an apatite crystal film on the surface of a substrate due to its low crystallinity, high bioreactivity and small size, such as bone apatite crystal.
높은 생체 반응성을 갖는 결정을 표면에 부착시키기 위한 조건중 우선적으로 고려해야 될 것은 저온에서 결정을 형성하는 것이다. 그러나 저온에서는 이미 형성된 결정을 고형 기질표면에 부착시킬 수는 없었다. 왜냐하면 이미 형성된 결정은 표면반응성이 낮아 표면에 부착하지 않기 때문이다. 이에 본 발명자들은 처음부터 저온에서 결정을 기질표면에서 직접 형성시키므로써 결정을 기질표면에 부착시킬 수 있는 방법을 개발하였다. 그리하여 결정도가 낮고 크기가 작은 생체 결정과 유사한 성질을 인회석 결정으로 구성된 인회석 박막을 기질표면에 형성할 수 있어서 본 발명을 완성하게 되었다.Among the conditions for attaching the crystal having high bioreactivity to the surface, the first consideration is to form the crystal at low temperature. At low temperatures, however, the crystals that had already formed could not be attached to the solid substrate surface. This is because the crystals already formed do not adhere to the surface due to their low surface reactivity. Therefore, the present inventors have developed a method for attaching the crystal to the substrate surface by forming the crystal directly on the substrate surface at low temperature. Thus, an apatite thin film composed of apatite crystals having similar crystallinity and small size to biological crystals can be formed on the substrate surface, thereby completing the present invention.
본 발명의 목적은 저온에서 고형기질(solid substrate) 표면 위에 결정도가 낮고 크기가 작은 인회석 결정을 직접 형성시키므로써, 고형기질면 위에 반응성이 높은 인회석을 포함하는 박막(thin layer of apatite crystals)을 형성하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to form thin layer of apatite crystals containing highly reactive apatite on the surface of a solid substrate by directly forming low crystallinity and small size of apatite crystals on a solid substrate surface at low temperature. To provide a way.
본 발명자들은 고형기질면에 인회석 결정을 형성시키는 데 있어서, 위에서 언급한 바와 같이 기존의 기술들에 의해 형성된 결정이 생체반응성이 낮기 때문에 생체반응성이 높은 인회석 결정을 기질 표면에 형성시키고자 하였다. 이를 위해 저온에서 인회석 결정을 형성하므로써 결정도가 낮고 결정표면에 반응성이 높은 이온을 풍부하게 갖는 인회석 결정을 얻고, 용액내에서는 결정의 형성을 억제시켜 기질면 위에서 결정을 직접 생성시키므로써 결정이 기질에 부착하도록 하여 본 발명을 완성하게 되었다.In forming the apatite crystals on the surface of the solid substrate, the present inventors have attempted to form a highly bioreactive apatite crystals on the surface of the substrate because the crystals formed by the existing techniques as described above have low bioreactivity. For this purpose, apatite crystals are formed at low temperature to obtain apatite crystals having low crystallinity and abundant reactivity to the crystal surface, and inhibit the formation of crystals in solution to directly produce crystals on the substrate surface. The present invention was completed by attaching.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 저온에서, 칼슘과 포스페이트를 함유하는 용액내에서 인회석 결정형성을 억제한 상태에서, 전하를 갖는 고형기질면에 인회석 결정이 생성되어 성장되도록 하므로써 고형기질 표면에 부착된 인회석 결정을 포함하는 박막을 형성하는 방법에 관한 것이다.The present invention includes apatite crystals attached to a surface of a solid substrate by allowing apatite crystals to be formed and grown on a solid substrate surface having a charge at a low temperature, while suppressing apatite crystal formation in a solution containing calcium and phosphate. A method for forming a thin film.
본 발명의 형성 방법은 (가) 고농도의 칼슘용액과 포스페이트 용액을 혼합하여 인회석 결정을 형성시킬 때 무형 칼슘 포스페이트 과립(amorphous calcium phosphate granule)의 생성을 지연시키는 단계; (나) (가)단계에서 얻은 지연 용액에서 이미 형성된 무형 칼슘 포스페이트 과립을 제거함으로써 새로운 결정이 용액내에서 형성되지 않도록 억제시킨 칼슘 포스페이트 과포화 메타스터블(metastable)용액을 얻는 단계; (다) (나)단계에서 얻은 용액내에서 전하를 갖는 고형 기질 표면에 무형 칼슘 포스페이트 과립을 형성시키는 단계; (라) (다)단계에서 얻은 기질 표면에 부착한 무형 칼슘 포스페이트 과립을 인회석 결정으로 변환시키고 이차 결정화(seondary crystallization)에 의해 많은 인회석 결정을 생성시켜 성장시키는 단계를 포함한다.The formation method of the present invention comprises the steps of: (a) delaying the production of amorphous calcium phosphate granules when a high concentration of calcium and phosphate solutions are mixed to form apatite crystals; (B) obtaining a calcium phosphate supersaturated metastable solution in which new crystals are prevented from forming in the solution by removing the already formed intangible calcium phosphate granules from the delayed solution obtained in step (a); (C) forming intangible calcium phosphate granules on the charged solid substrate surface in the solution obtained in step (b); (D) converting the intangible calcium phosphate granules attached to the substrate surface obtained in step (c) into apatite crystals, and producing and growing a large number of apatite crystals by secondary crystallization.
상기한 본 발명에 따르면 전하를 띈 표면을 갖는 모든 재질의 표면에 생체반응성과 관계있는 비결정성 불안정 표면이온을 갖는 인회석을 형성시킬 수 있고, 바람직하게는 세포를 배양하는 세포배양용기의 바닥표면이나 인공매식제로 사용되는 타이타늄과 같은 금속표면에 뼈결정과 유사한 성질의 인회석을 형성시킬 수 있다.According to the present invention, it is possible to form apatite having amorphous unstable surface ions related to bioreactivity on the surface of all materials having a charged surface, and preferably, the bottom surface of the cell culture vessel for culturing cells It is possible to form apatite with bone crystal-like properties on a metal surface such as titanium used as a prosthetic agent.
인공합성된 인회석 결정 또는 탄산인회석 결정과 인회석 결정 형성을 억제하는 억제재를 산용액(acid solution)에 녹여 억제재와 칼슘 및 포스페이트를 함유한 산 이온 용액(acidic ion solution)을 만든다. 상기 억제재로는 유리된 칼슘 및 포스페이트 이온 간의 결정 형성을 억제할 수 있는 물질로서 젤라틴 등이 포함된다. 인공합성된 인회석 결정대신 뼈조직에서 분리한 인회석 결정(H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995))을 사용할 수도 있다. 뼈조직을 산용액으로 탈회한 탈회용액을 사용할 수도 있는데, 이 경우에는 탈회용액내로 인회석 형성 억제재인 젤라틴 등이 탈회과정에서 용해되어나오기 때문에 별도의 억제재 첨가 없이 탈회용액을 그대로 사용할 수 있다. 산 이온 용액을 만들거나 골조직을 탈회하는데 사용하는 산용액은 어떤 종류의 산을 사용하여도 무방한데 그 농도는 최종 산농도가 0.1몰이 되도록 0.2몰 산용액을 사용한다. 산 용액과 같은 농도의 트리스[히드록시메틸]아미노메탄을 증류수에 녹여 알칼리 용액을 만든다. 산 용액과 알칼리 용액을 혼합하여 pH 7.0 내지 7.6의 용액을 만들어 균질핵형성(homogenous nucelation)에 의해 무형 칼슘 포스페이트 과립을 형성시킨다. 이 때 산 용액에 함유된 억제재가 무형 칼슘 포스페이트 과립의 형성을 지연시키고, 이로써 무형 칼슘 포스페이트 과립을 형성하지 못한 자유 칼슘이온과 포스페이트 이온이 용액 내에 그대로 존재하게 되어 용액 농도는 포화농도 이상인 과포화상태로서 메타스터블상태가 된다. 그 농도는 대략 4.0 내지 25.0 mM2[Ca×PO4]이다. 다음 단계는 중화시킨 용액에서 무형 칼슘 포스페이트 과립을 제거하는 과정으로서, 0.22㎛의 여과 크기를 갖는 휠터를 사용하는데 이는 용액으로부터 과립을 제거함과 동시에 세균을 제거할 수 있기 때문에 후에 세포배양이나 조직에 사용할 때 별도로 멸균과정을 거치지 않아도 되는 잇점이 있다. 별법으로는 원심분리에 의하여 과립을 침전시켜 제거한다. 무형 칼슘 포스페이트 과립이 제거된 메타스타블용액을 0 내지 10℃ 가량의 저온에서 수용액내에서는 무형 칼슘 포스페이트 과립이 형성되지 않도록 하면서 전하를 갖는 표면에서는 이질핵형성(heterogenous nucleation)에 의해 무형 칼슘 포스페이트 과립이 서서히 형성 되도록 한다. 본 발명자들은 전하를 갖는 바닥에 형성된 칼슘 포스페이트 과립이 표면에 부착되어 형성되는 것을 발견하였다. 무형 칼슘 포스페이트 과립은 이어서 인회석으로 전환되고 2차 핵형성(secondary nucleation)에 의해 이미 형성된 결정 주위에 다시 또 다른 결정들이 형성되어 결정의 수가 증가한다. 이 때 형성되는 결정은 전하를 띄는 표면과 결정 간에 서로 부착하여 표면을 덮는 두께 0.5 내지 1.0㎛의 얇은 인회석 막을 형성한다. 즉 본 발명에서 형성된 결정은 저온에서 형성시켰기 때문에 뼈결정과 유사하게 결정도가 낮고 크기가 작으며 반응성이 높은 불안정한 이온환경을 가질 수 있고, 가질 표면에서 이질핵형성에 의해 결정을 직접 형성시켰기 때문에 기질 표면에 강하게 부착할 수 있다.An artificial synthetic apatite crystal or carbonate apatite crystal and an inhibitor that inhibits formation of apatite crystal are dissolved in an acid solution to form an acidic ion solution containing the inhibitor and calcium and phosphate. The inhibitor includes gelatin and the like as a substance capable of inhibiting crystal formation between free calcium and phosphate ions. Instead of artificially synthesized apatite crystals, apatite crystals isolated from bone tissue (H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)) may be used. Demineralization solution in which bone tissue is demineralized with an acid solution may also be used. In this case, the demineralization solution may be used as it is without adding an additional inhibitor because gelatin, which is apatite formation inhibitor, is dissolved in the deliming process. The acid solution used to make acid ion solution or demineralization of bone tissue can be used with any kind of acid. Use 0.2 mole acid solution so that the final acid concentration is 0.1 mole. Tris [hydroxymethyl] aminomethane at the same concentration as the acid solution is dissolved in distilled water to form an alkaline solution. The acid solution and the alkaline solution are mixed to form a solution of pH 7.0 to 7.6 to form intangible calcium phosphate granules by homogenous nucelation. At this time, the inhibitor contained in the acid solution delayed the formation of the intangible calcium phosphate granules, whereby free calcium ions and phosphate ions that did not form the intangible calcium phosphate granules remained in the solution, and the concentration of the solution was supersaturated above the saturation concentration. It becomes a metastable state. The concentration is approximately 4.0 to 25.0 mM 2 [Ca × PO 4 ]. The next step is to remove the intangible calcium phosphate granules from the neutralized solution, using a filter with a filtration size of 0.22 μm, which can be used for cell culture or tissue later, as it removes the granules from the solution. There is no need to go through the sterilization process. Alternatively, the granules are precipitated and removed by centrifugation. The metastable solution from which the intangible calcium phosphate granules have been removed is made intangible calcium phosphate granules by heterogeneous nucleation on the charged surface while preventing the intangible calcium phosphate granules from forming in an aqueous solution at a low temperature of about 0 to 10 ° C. To form slowly. The inventors have discovered that calcium phosphate granules formed on the bottom with charge are attached to the surface and formed. The intangible calcium phosphate granules are then converted to apatite and further crystals are formed around the crystals already formed by secondary nucleation, increasing the number of crystals. The crystals formed at this time adhere to each other between the charged surface and the crystals to form a thin apatite film having a thickness of 0.5 to 1.0 µm covering the surface. That is, since the crystal formed in the present invention is formed at low temperature, it may have an unstable ionic environment with low crystallinity, small size, and high reactivity similar to bone crystal, and because the crystal is directly formed by heterogeneous nucleation on the surface to have It can be strongly attached to the surface.
[실시예]EXAMPLE
(단계 1) 인회석 결정 형성이 억제된 메타스터블 이온 용액의 준비(Step 1) Preparation of metastable ion solution in which apatite crystal formation is suppressed
Ca(NO3)2·4H2O 17.7mg을 증류수 250ml에 녹인 용액과 (NH4)2HPO440mg과 암모니아수 1㎖을 증류수 500㎖에 녹인 용액을 급속히 혼합하여 여과하고 냉동 건조시켜 합성한(C. Rey et al., Calcif. Tissue Int. 45, 157-164 (1989), C. Rey et al., Calcif. Tissue Int. 46, 157-164 (1990)) 80mg의 합성 인회석 결정과 40mg의 젤라틴(gelatin)을 0.2 M HCl 100㎖에 용해시켜 칼슘과 포스페이트를 함유한 산 이온용액(acidic ion solution)을 만든다. 산 용액을 0.2 M HCl로 15%용액이 되도록 한 후 이 회석 용액 20ml에 0.2 M 트리스[히드록시메틸]아미노메탄 25ml을 혼합하고 교반하여 pH 7.2의 Tris/HCl 완충용액을 만든다. 이때 모든 용액의 온도는 4℃를 유지한다. 이 과정에 의해 급속하게 무형 칼슘포스페이트가 형성된다. 4℃에서 10분간 방치한 후 0.22㎛ 여과 크기 필터를 사용하여 이때까지 형성된 무형 칼슘포스페이트를 제거하여 중화 이온용액(neutralized ion solution)을 얻는다. 이 중화 이온용액은 젤라틴에 의해 무형칼슘포스페이트 과립형성이 억제되므로써 칼슘과 포스페이트가 과포화된 메타스터블용액이 된다.A solution obtained by dissolving 17.7 mg of Ca (NO 3 ) 2 4H 2 O in 250 ml of distilled water and a solution of 40 mg of (NH 4 ) 2 HPO 4 and 1 ml of ammonia in 500 ml of distilled water was filtered and freeze-dried. C. Rey et al., Calcif.Tissue Int. 45, 157-164 (1989), C. Rey et al., Calcif.Tissue Int. 46, 157-164 (1990)) 80 mg of synthetic apatite crystals and 40 mg Gelatin is dissolved in 100 ml of 0.2 M HCl to prepare an acidic ion solution containing calcium and phosphate. The acid solution is made up to 15% solution with 0.2 M HCl, and then 25 ml of 0.2 M tris [hydroxymethyl] aminomethane is mixed with 20 ml of this dilute solution and stirred to form Tris / HCl buffer at pH 7.2. At this time, the temperature of all the solution is maintained at 4 ℃. This process rapidly forms intangible calcium phosphate. After leaving for 10 minutes at 4 ℃ using a 0.22㎛ filter size filter to remove the inert calcium phosphate formed to this time to obtain a neutralized ion solution (neutralized ion solution). The neutralized ion solution is a metastable solution in which calcium and phosphate are supersaturated by inhibiting the formation of intangible calcium phosphate granules by gelatin.
(단계 2) 전하를 갖는 표면위에서 인회석 결정 형성(Step 2) Apatite Crystal Formation on the Charged Surface
상기 (단계 1)에서 얻은 중화된 이온 용액을 전하를 갖는 표면을 갖는 배양접시, 금속면, 유리면, 혹은 교원질 젤 표면위에 채우거나 타이타늄과 같은 금속편인 경우는 전하를 갖지 않는 PTFP용기에 금속편과 함께 넣는다. 무형칼슘포스페이트 과립의 형성이 용액내에서 일어나지 않도록 이온 용액의 온도를 계속 4℃로 유지한다. 5일이 경과한 후 실온까지 온도를 올려 포화점 이상 함유되어 있는 자유 이온이 결정형성에 참여할 수 있도록 한다.When the neutralized ionic solution obtained in step (1) is filled on a culture plate, metal surface, glass surface, or collagen gel surface having a charged surface, or a metal piece such as titanium, together with a metal piece in a PTFP container having no charge Put it in. The temperature of the ionic solution is kept at 4 ° C. so that formation of intangible calcium phosphate granules does not occur in the solution. After 5 days, the temperature is raised to room temperature to allow free ions contained above the saturation point to participate in crystal formation.
(단계 3) 형성된 인회석 박막의 분석(Step 3) Analysis of the formed apatite thin film
본 발명의 방법에 따라 형성된 인회석박막은 투과전자현미경법으로 크기를 측정한 결과에서 길이가 약 10 내지 40nm이고 폭이 약 5 내지 20nm인 매우 작은 얇은 판모양의 결정으로 구성되었음을 알 수 있었고, X선 회절분석 결과에서는 결정도가 매우 낮은 인회석 결정이 형성되었음을 알 수 있었으며, Fourier Transformed Infrared Spectroscopy 분석 결과는 비결정성 불안정 CO3 2-, HPO4 2-, PO4 3-표면이온을 함유하는 인회석결정이 형성되었음을 보여 주었다. 이와 같은 성질은 모두 생체에서 분리해 낸 결정의 특성 (H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995))과 유사한 것이다.The apatite thin film formed according to the method of the present invention was found to be composed of very small thin plate-shaped crystals having a length of about 10 to 40 nm and a width of about 5 to 20 nm by measuring the size by transmission electron microscopy. The results of linear diffraction analysis showed that apatite crystals with very low crystallinity were formed. Fourier Transformed Infrared Spectroscopy analysis showed that apatite crystals containing amorphous labile CO 3 2- , HPO 4 2- , and PO 4 3- surface ions were obtained. Showed that it was formed. All of these properties are similar to the properties of crystals isolated from living organisms (H.-M. Kim et al., J. Bone Miner. Res. 10, 1589-1601 (1995)).
본 발명에 따라 형성된 인회석 박막 위에 섬유모세포(fibroblast) 및 골모세포(osteoblast)를 부착시켜 증식시킬 수 있다. 또한 그 위에서 파골세포(osteoclast)를 배양할 때 생체에서와 같이 인회석 박막이 용해될 수 있다. 그리고 본 발명에서 개발된 인회석 박막은 유기물질 부착능력을 갖고 있어서 생물학적으로 활성을 갖는 부착단백질(비트로넥틴(vitronectin)등)을 박막에 부착시킬 수 있었는데, 그 위에서 혈청을 첨가하지 않은 상태에서 세포를 부착시킬 수 있어 세포를 무혈청배양(serum free culture)할 수 있었다. 이상의 결과는 본 발명에서 개발된 인회석 박막층이 생체적합성을 갖고 있으며 나아가 생체환경을 잘 반영하는 인회석 결정으로 구성된 박막층임을 가리킨다.Fibroblasts and osteoblasts can be attached and propagated on the apatite thin film formed according to the present invention. In addition, when culturing osteoclasts (osteoclast) thereon, the apatite thin film can be dissolved as in a living body. In addition, the apatite thin film developed in the present invention was able to attach a biologically active adhesion protein (vitronectin, etc.) to the thin film because it has an organic material adhesion ability. The cells could be adhered to allow serum free culture. The above results indicate that the apatite thin film layer developed in the present invention is a thin film layer composed of apatite crystals having biocompatibility and further reflecting a biological environment.
지금까지 본 발명을 상기의 특정 실시예에 의해 상세히 설명 하였지만, 본 발명의 진의 또는 범위에서 벗어나지 않고 본 발명에 대한 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당 기술분야의 숙련가들에게는 자명할 것이다.Although the present invention has been described in detail by the above specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that specific changes and modifications can be made to the present invention without departing from the spirit or scope of the invention.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019970009161A KR19980073699A (en) | 1997-03-18 | 1997-03-18 | Method of forming thin layer of apatite crystals containing apatite crystals having low crystallinity |
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| KR19980073699A true KR19980073699A (en) | 1998-11-05 |
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ID=65950793
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| Country | Link |
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| KR (1) | KR19980073699A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003072496A1 (en) * | 2002-02-26 | 2003-09-04 | Hyun-Man Kim | Calcium phosphate colloids, dots, islands, thin films or granules and its preparation |
-
1997
- 1997-03-18 KR KR1019970009161A patent/KR19980073699A/en not_active Application Discontinuation
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| WO2003072496A1 (en) * | 2002-02-26 | 2003-09-04 | Hyun-Man Kim | Calcium phosphate colloids, dots, islands, thin films or granules and its preparation |
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