KR19980067709A - 경구투여용 백신제형 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체내에서 일정기간 동안 항원성을 유지할 수 있는 경구투여용 백신제형에 관한 것으로, 항원을 수용성 고분자 및 계면활성제와 혼합하여 분무건조한 미세입자를 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 분산시켜 분무건조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 본 발명의 경구투여용 백신제형은, 체내온도인 37℃에서 6 개월 이상 항원성이 유지될 수 있다.

Description

경구투여용 백신제형 및 이의 제조방법

본 발명은 체내에서 일정기간 동안 항원성을 유지할 수 있는 경구용 백신제형에 관한 것으로, 항원, 수용성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 미세입자를 생분해성 고분자로 코팅하여 체내온도인 37℃에서 6 개월 이상 항원가를 유지할 수 있도록 제조한 경구투여용 백신제형을 제공하기 위한 것이다.

질병은 발병 후 치료하는 것보다 사전에 예방하는 것이 더욱 효과적임은 말할 필요가 없다. 따라서, 오래전부터 질병의 예방을 위한 백신 연구가 계속되어 왔으며, 현재 여러 종류의 백신이 상업화되어 있고 실제로 많은 효과가 얻어지고 있다. 특히, 경구투여용 백신은 항체형성중 면역 글로불린 A(IgA)를 발생시키므로 점막(mucosal) 감염에 대해 효과적일 뿐 아니라, 투여하기 쉽고 부작용이 없어서 전문인력의 도움없이도 접종이 가능하며 주사기에 의한 감염이나 2차 감염이 발생하지 않는다는 장점이 있어서 오래전부터 연구되어 왔다. 또한 비경구투여용 백신일 경우, 백신제조에 드는 실제 비용은 총백신 가격의 12% 정도일 뿐이고, 나머지는 운반비, 보관비, 그리고 주사투여를 할 수 있는 전문인력의 양성에 필요한 비용이라는 점을 고려한다면 경구투여용 백신의 장점은 더욱더 두드러진다(Immunobiology, 184, 113(1992)).

그러나, 단백질인 항원을 경구투여할 경우 위산 또는 분해효소에 의해 항원이 분해된다는 문제가 있어, 최근에는 항원의 안전성을 향상시키기 위한 새로운 전달체계를 완성한 바 있다(Novel delivery system for oral vaccines, 2(1994)). 경구투여용 백신의 새로운 전달체계는 크게 두가지로 구분되는데, 생분해성 고분자 물질내에 항원을 포함시킨 미세입자와, 항원을 사포닌 또는 Quil A와 같은 보조제(adjuvant)와 혼합시킨 면역 자극 복합체(Immune stimulating complexes)가 있다(Nature, 308, 457(1984)). 이중에서도 특히 생분해성 고분자 물질내에 항원을 포함시킨 미세입자를 제조하는 방법에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있는데, 생분해성 고분자 물질로는 체내에서 분해가능한 락타이드-글리콜라이드 공중합체(poly(lactide-co-glycolide: PLGA) 또는 알부민과 같은 단백질이 사용된다(Vaccine, 6, 33-38(1986)). 알부민은 고분자화된 알부민 자체가 면역반응을 일으킬 수 있다는 문제점으로 인해 그 적용이 제한되고 있지만, PLGA는 체내에서 물과 접촉하여 락트산과 글리콜산으로 완전히 가수분해되므로 생체에 안전하다고 알려져 있다(Pham. Res., 8, 713(1991); J. Controlled Rel., 16, 15(1991)). 최근에는 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 및 오브알부민(Ovalbumin)을 PLGA로 코팅하는 연구가 진행되고 있으며, PLGA로 코팅하지 않고 경구투여한 경우보다 좋은 결과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Biol. Pharm. Bull., 17(9), 1272(1994); J. Infect. Dis., 167, 84(1993)).

항원을 포함하는 미세입자를 제조할 때, 항원을 생분해성 고분자로 코팅하는 동안 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 의해 항원이 항원성을 잃게 되는 일이 발생할 수 있는데, 특히 항원의 표면이 소수성일 경우에는 그 정도가 더욱 심하다(Vaccine, 14(7), 675(1996)). 또한 경구투여용 백신은 체내에서 위액 등에 의한 항원가의 손실이 크며 특히 37℃인 체내에서 수개월 동안 체류하므로 온도에 따른 안정성을 확보할 필요가 있다(Biochemica et Biophisic Acta., 1119, 225(1995); The Journal of Immunology, 120(1), Jan, (1978)). 그리고 경구투여용 백신이 생분해성 고분자로 코팅될 경우에는 입자의 크기도 중요한 조건인데, 이는 페이어스 패취(Peyer's patch)를 통해서 흡수되는데 있어서 입자의 크기가 흡수율을 결정하기 때문이다(Infect. Immun., 59, 2978(1991); Biol. Pharm. Bull, 17(9), 1272(1994)).

본 발명자들은 경구투여용 백신에 있어서 이러한 문제점과 중요성을 인식하여 체내온도 즉, 37℃에서 6 개월 이상 항원가를 유지할 수 있는 미세입자를 제조하기 위해 계속 연구하던 중, 항원을 수용성 고분자 및 계면 활성제와 혼합하여 분무건조시켜 항원을 포함하는 일차입자를 제조하고 이를 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 분산시킨 액을 분무건조함으로써, 생분해성 고분자로 코팅된 10㎛ 이하의 입자크기를 갖는 경구투여용 백신제형을 제조하는데 성공하였다.

본 발명의 목적은 체내온도에서 일정기간 동안 항원성을 유지하고 경구투여시 흡수가 되는 백신제형 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 항원, 수용성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 미세입자를 생분해성 고분자로 코팅한 입경 10㎛ 이하의 크기를 갖는 입자를 포함하는 경구투여용 백신제형을 제공한다.

또한 본 발명에서는 항원을 수용성 고분자 및 계면활성제와 혼합하여 분무건조한 미세입자를 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 분산시켜 분무건조하는 단계를 포함하는 경구투여용 백신제형의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다.

먼저 항원, 예를 들어 B형 간염 항원을 인산염 완충용액에 넣고 수용성 고분자와 계면활성제를 가한 다음 분무건조하여, 바람직하게는 입경 0.1 내지 7㎛의 일차코팅된 미세입자를 제조한다. 이와 같이 제조된 일차 미세입자는 후속공정에서 생분해성 고분자를 코팅하기 위해 사용되는 유기용매로부터 항원성이 유지될 뿐 아니라, 체내온도, 즉, 37℃에서 일정기간(6 개월 이상) 동안 항원성이 유지된다.

이어서, 생분해성 고분자를 유기용매에 용해시키고, 여기에 상기 제조한 일차 미세입자를 분산시킨 후, 분산액을 분무건조함으로써 생분해성 고분자로 이차코팅된 입경 10㎛ 이하의 크기를 갖는 최종입자를 제조할 수 있다.

본 발명의 경구투여용 백신제형으로 적용할 수 있는 항원은 디프테리아(Diphtheria), 백일해(Pertussis), 파상풍(Tetanus), 콜레라(Cholera), 인체 면역 결핍 바이러스(HIV), 수두(Chickenpox), 홍역(Measles), 간염(Hepatitis), 광견병(Rabies), 말라리아(Malaria) 또는 인플루엔자(Influenza)에 백신으로 사용되는 항원으로서 약독화(attenuated), 죽은(killed), 그리고 유전자 재조합 항원이 사용가능하다. 이들 항원은 그자체이거나, 또는 앨럼, 뮤라밀 디펩티드(Muramyl Dipeptide)와 이의 유도체 또는 이들의 혼합물과 같은 보조제, 또는 염화나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨 또는 이들의 혼합물인 무기염과 혼합될 수 있다.

본 발명의 경구투여용 백신제형에 사용되는 수용성 고분자는 항원에 대하여 1 내지 50배 중량의 양을 사용하는 것이 바람직하며, 당류, 단백질, 아미노산 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 당류로는 셀룰로즈(예: 하이드록시프로필셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 소디움 카복시메틸셀룰로즈), 글루코즈, 크실로즈, 갈락토즈, 푸럭토즈, 락토즈, 말토즈, 사카로즈, 알기네이트, 덱스트란 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있고, 단백질로는 젤라틴, 알부민 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있고, 그리고 아미노산으로는 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 이들의 염 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.

또한 본 발명의 경구용 백신제형에서 계면활성제는 항원에 대해 0.1 내지 10배 중량의 양을 사용하는 것이 바람직하며, 에틸렌계 친수성 계면활성제가 바람직한데, 특히 트윈 80, 트윈 20이 바람직하다.

생분해성 고분자 입자는 일차 미세입자의 중량에 대해 1 내지 100배의 양으로 사용하는 것이 바람직하고, 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 리코라이드와 락타이드의 공중합체, 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 락타이드와 카프로락톤의 공중합체, 폴리에스테르아마이드, 폴리오르토에스테르, 폴리베타하이드록시부티르산, 폴리안하이드라이드 또는 이들의 혼합물을 예로 들 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀더 구체적으로 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실 시 예 1 : 일차 미세입자 제조

유전자 재조합 B형 간염 항원(LG화학 의약품사업부)을 10mM 인산염 완충용액에 500㎍/㎖의 농도로 넣은 다음, 소디움 카르복시메틸셀룰로즈 또는 하이드록시 프로필셀룰로즈를 5㎎/㎖로 가하고, 트윈 80을 항원의 0.6배로 첨가하였다. 이와 같이 제조된 용액을 분무 건조기(Buchi 191)에 3㎖/분의 유량으로 공급함으로써 일차 미세입자를 제조하였다. 질소의 분사유량 600ℓ/분, 공기의 유입온도 80℃일 때 생성된 일차 미세입자의 평균 입자경은 2.5㎛이었다.

효 과 시 험 예 1 : 유기용매로부터 항원성 보호효과

실시예 1에서 제조된 항원 단백질을 포함하는 일차 미세입자에 있어서, 유기용매로부터 항원성 보호효과를 확인하기 위해, 일차 미세입자를 아세토니트릴 또는 에틸아세테이트에 분산시키고 자석식 교반기(magnetic stirrer)를 이용하여 혼합한 다음 여과하여 분리 건조시켜서 유기용매를 제거하였다. 이어서 건조된 일차 미세입자를 10mM 인산염 완충용액에 완전히 용해시키고 오자임(AUZYME) 키트(Abott사, 미국)를 이용하여 항원가를 측정하였다. 이 때 저온(4℃) 보관중인 B형 간염 항원을 표준항원으로 하고, 수용성 고분자와 계면활성제를 혼합하지 않고 항원 만을 분무건조시켜 제조한 일차입자의 항원가도 동일한 방법으로 측정하여 상기 제조된 본 발명의 일차 미세입자의 항원가와 비교하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

시료	유기용매	항원가(%)
B형 간염 표준 항원		100
항원만 분무건조시킨 일차입자	아세토니트릴에틸아세테이트	3221
항원+소디움 카르복시 메틸셀룰로즈+트윈 80으로 이루어진 일차 미세입자	아세토니트릴에틸아세테이트	9899

이와 같이 본 발명에 의해 제조된 일차 미세입자에 포함된 항원은 유기용매의 접촉으로부터 보호되어 항원가가 유지되는 것을 알 수 있다.

효 과 시 험 예 2 : 시간에 따른 항원성 유지효과

실시예 1에서 제조된 일차 미세입자의 시간에 따른 항원성 유지효과를 확인하기 위해, 일차 미세입자를 바이알(vial)에 소량씩 넣고 37℃ 및 25℃에서 각각 6 개월 동안 보관하였다. 여기에 10mM 인산염 완충용액을 가하여 백신을 완전히 용해시킨 다음, 오자임 키트를 이용하여 상기 효과 시험예 1과 동일한 방법으로 항원가를 측정하였다. 한편, 로리 등의 방법(Lowry, O. H., et al., Protein measurement with the folin phenol reagent, J. Biol. Chem., 193, 265-275(1951))에 따라 B형 간염 백신의 농도를 50㎍/㎖로 맞춘 액상제제를 제조한 후, 37℃에서 항원가의 변화를 측정하여 본 발명의 방법에 따라 제조된 일차 미세입자의 항원가와 비교하였다. 이 때 저온(4℃) 보관중인 B형 간염 항원을 표준 항원으로 하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

시료	보관온도(℃)	시간에 따른 항원가의 변화
		1 개월	2 개월	3 개월	6 개월
일차 미세입자	37	1.1	1.0	1.02	1.0
	25	1.05	1.1	1.01	1.02
표준항원	4	1.1	1.1	1.1	1.05
액상제제	37	0.82	0.53	0.41	0.25

이와 같이 본 발명에 따라 제조된 일차 미세입자는 체내온도인 37℃에서 6 개월 이상 항원가가 유지됨을 알 수 있다.

실 시 예 2 : 최종입자 제조

생분해성 고분자인 락타이드-글리콜라이드 공중합체(poly(lactide-co-gly colide): PLGA)(75/25)를 유기용매인 에틸아세테이트에 1% 농도로 용해시키고, 여기에 실시예 1에서 분무건조된 일차 미세입자를 2㎎/㎖로 분산시킨 후 3㎖/분의 유량으로 분무 건조기에 공급함으로써 PLGA로 이차코팅된 최종입자를 제조하였다. 이 때 질소의 분사유량은 600ℓ/분이고, 공기의 유입온도는 60℃로 하였다. 제조된 최종입자의 평균 입경은 3.5㎛이고, PLGA/일차 미세입자의 무게비는 5였으며, 로리 등의 방법에 의한 항원량은 8㎍단백질량/㎎입자였다.

효 과 시 험 예 3

실시예 2에서 얻은 최종입자를 군당 10 마리인 Balb/c마우스 1마리당 50㎍의 단백질량으로 0.5㎖씩 주사용액(0.02 중량% 트윈 80이 용해된 인산염 완충용액)에 분산시켜 존대를 이용하여 마우스의 위에 직접 투여하였다. 초기투여 후 보름 및 한달이 지난 다음, 동일한 방법으로 다시 마우스의 위에 동량을 직접 투여하였다. 초기투여 후 3 개월째에 채혈하여 형성된 항체의 농도(mIU/㎖)와 항체 생성율을 측정하였다.

한편, 인산염 완충용액에 B형 간염 항원 만을 용해시킨 항원 벌크도 상기 동일한 방법으로 마우스에 투여한 후, 형성된 항체의 농도(mIU/㎖)와 항체 생성율을 측정하여 본 발명의 최종 미세입자 제형과 비교하였다. 그 결과는 항체생성율(%)과 마우스에 생성된 항체농도의 기하학적 평균값(Geometric mean titer: GMT)로 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

시료	항체 생성율	GMT
본 발명의 최종 미세입자 제형	100%	20
항원벌크	0%	4

본 발명에 따라 항원을 수용성 고분자 및 계면활성제와 혼합하여 분무건조한 미세입자를 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 분산시킨 후 분무건조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 경구투여용 백신제형은 제조공정중 항원가를 유지하며 경구투여후 체내온도인 37℃에서 6 개월 이상 항원성이 유지될 수 있으며, 경구흡수되어 항체를 형성할 수 있다. 따라서 본 발명은 기존의 주사제형의 단점을 제거하여 접종이 편리하고 적은 비용으로 예방접종을 가능하게 하는 잇점이 있다.

Claims (18)

1. 항원, 수용성 고분자 및 계면활성제를 포함하는 미세입자를 생분해성 고분자로 코팅한 입경 10㎛ 이하의 크기를 갖는 입자를 포함하는 경구투여용 백신제형.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 항원이 디프테리아(Diphtheria), 백일해(Pertussis), 파상풍(Tetanus), 콜레라(Cholera), 인체 면역 결핍 바이러스(HIV), 수두(Chickenpox), 홍역(Measles), 간염(Hepatitis), 광견병(Rabies), 말라리아(Malaria) 또는 인플루엔자(Influenza) 백신으로 사용되는 항원임을 특징으로 하는 백신제형.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 항원이 보조제 또는 무기염을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신제형.
4. 제 3 항에 있어서,

   상기 보조제가 앨럼, 뮤라밀 디펩티드(Muramyl Dipeptide), 이의 유도체 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
5. 제 3 항에 있어서,

   상기 무기염이 염화나트륨, 인산나트륨, 인산칼륨 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 수용성 고분자가 항원에 대해 1 내지 50배의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신제형.
7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서,

   상기 수용성 고분자가 당류, 단백질, 아미노산 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
8. 제 7 항에 있어서,

   상기 당류가 셀룰로즈, 글루코즈, 크실로즈, 갈락토즈, 푸럭토즈, 락토즈, 말토즈, 사카로즈, 알기네이트, 덱스트란 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
9. 제 8 항에 있어서,

   상기 셀룰로즈가 하이드록시프로필셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 소디움 카복시메틸셀룰로즈 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
10. 제 7 항에 있어서,

    상기 단백질이 젤라틴, 알부민 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
11. 제 7 항에 있어서,

    상기 아미노산이 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 이들의 염 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
12. 제 1 항에 있어서,

    상기 계면활성제가 항원에 대해 0.1 내지 10배의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 백신제형.
13. 제 1 항 또는 제 12 항에 있어서,

    상기 계면활성제가 에틸렌계 친수성 계면활성제임을 특징으로 하는 백신제형.
14. 제 13 항에 있어서,

    상기 에틸렌계 친수성 계면활성제가 트윈 80 또는 트윈 20임을 특징으로 하는 백신제형.
15. 제 1 항에 있어서,

    상기 생분해성 고분자가 상기 미세입자에 대해 1 내지 100배 중량의 양으로 코팅되는 것을 특징으로 하는 백신제형.
16. 제 1 항에 있어서,

    상기 생분해성 고분자가 폴리글리콜라이드, 폴리락타이드, 리코라이드와 락타이드의 공중합체, 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 락타이드와 카프로락톤의 공중합체, 폴리에스테르아마이드, 폴리오르토에스테르, 폴리베타하이드록시부티르산, 폴리안하이드라이드 또는 이들의 혼합물임을 특징으로 하는 백신제형.
17. 제 1 항에 있어서,

    상기 미세입자가 입경 0.1 내지 7㎛의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 백신제형.
18. 항원을 수용성 고분자 및 계면활성제와 혼합하여 분무건조한 미세입자를 생분해성 고분자가 용해된 유기용매에 분산시켜 분무건조하여 입경 10㎛ 이하의 크기를 갖는 입자를 제조하는 단계를 포함하는 경구투여용 백신제형의 제조방법.