KR19980049575A - Novel pyrrolidine derivatives with anticancer effects, their salts and their solvates and their preparation - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물, 그들의 제조방법 그리고 이를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제 또는 유전자 관련 연구에 사용하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel pyrrolidine derivative represented by the following formula (I), a salt thereof and a solvate thereof, a process for their preparation, and a pharmaceutical composition containing the same as an anticancer drug or gene related research.
(상기 화학식 1 에서 R1, X, X', Y 및 n 은 명세서에서 정의한 바와 같다.)Wherein R 1 , X, X ', Y and n are as defined in the specification.
본 발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염은 수용성 용매에 잘 녹고, 체내에서 안정하여 항암제로 유용하게 사용될 수 있고, 이에 더하여 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬 수 있어 유전자 치료 등에도 유용하게 이용될 수 있다.The pyrrolidine derivatives of the present invention and their salts are well soluble in a water-soluble solvent and can be used as an anticancer agent in a stable manner in the body and can be used in combination with oligonucleotides, peptide analogues and cholesterol that bind locally to nucleic acids And can be used for gene therapy and the like.
Description
본 발명은 하기 화학식 1 의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물, 그들의 제조방법 그리고 이를 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제 또는 유전자 관련 연구에 사용하는 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a novel pyrrolidine derivative represented by the following formula (I), a salt thereof and a solvate thereof, a process for their preparation, and a pharmaceutical composition containing the same as an anticancer drug or gene related research.
화학식 1Formula 1
상기 화학식에서,In the above formulas,
R1은 C1- C10의 알킬기, C3- C7의 시클로알킬기, C3- C6의 알케닐기, 페닐기이고,R 1 is a C 1 - C 10 alkyl group, a C 3 - C 7 cycloalkyl group, a C 3 - C 6 alkenyl group,
X 및 X'은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고,X and X 'are each a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkylthio group, a silyloxy group,
Y 는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고,Y is a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a halogen group, a carbonyl group,
n 은 1 - 10 이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.n is 1 - 10 and is the linker length when other materials are bonded.
더욱 상세하게는, 본 발명의 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염은 수용성 용매에 잘 녹고, 체내에서 안정하여 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬 수 있어 유전자 치료 등에 유용하게 이용될 수 있다.More specifically, the novel pyrrolizine derivatives and salts thereof of the present invention are excellent in anticancer effects that are well tolerated in a water-soluble solvent and are stable in the body, as well as oligonucleotides, peptide analogues and cholesterol that bind locally to nucleic acids And can be usefully used for gene therapy and the like.
일반적으로 암의 치료에 사용되는 많은 항암제들은 세포내에 존재하는 핵산과 반응할 수 있는 기능 구조(functional group)를 포함하므로 항암 작용을 나타내게 된다. 구체적으로, 항암제로 널리 사용되는 시스플라틴, 마이토마이신 및 사이클로포스파마이드 등은 다른 구조적 특징과 함께 핵산과 반응하는 기능 구조들을 포함하여 그들의 항암 효과를 나타내게 된다.In general, many anticancer drugs used for the treatment of cancer include a functional group capable of reacting with a nucleic acid present in the cell, thereby exhibiting anticancer activity. Specifically, cisplatin, mitomycin, and cyclophosphamide, which are widely used as anticancer agents, exhibit their anticancer effects including functional structures that react with nucleic acids in addition to other structural features.
또한, 자연에서 추출된 화합물들인 마이토마이신 C (mitomycin C) 와 피롤리지딘 알칼로이드(pyrrolizidine alkaloids)의 경우를 비교하여 보면 상기 기능 구조의 독특한 특징을 관찰할 수 있다. 상기 마이토마이신 C 와 피롤리지딘 알칼로이드는 세포내에서 활성화(activation)되는 경우, 상호 유사한 피롤 구조 (pyrrole substructure)를 가지게 되지만 (Carter, S. K. and Crooke, S. T., Mytomycin C, Current Status and New Development, Academic Press, New York, 1978; Woo, J. S. et al., J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 3407), 마이토마이신 C 의 경우는 탁월한 항암제로 사용될 수 있는 반면에 피롤리지딘 알칼로이드는 잡초 속에 존재하는 독성 물질로 작용하여 전세계적으로 가축들을 중독시키는 주요 원인이 되고 있다.In addition, a unique feature of the above-mentioned functional structure can be observed by comparing mitomycin C and pyrrolizidine alkaloids, which are extracted from nature. The mitomycin C and pyrrolizidine alkaloids have similar pyrrole substructures when activated in cells (Carter, SK and Crooke, ST, Mytomycin C, Current Status and New Development, 1993, 115, 3407). In the case of mitomycin C, it can be used as an excellent anticancer drug, while pyrrolizidine alkaloids Is a toxic substance present in weeds and is a major cause of poisoning livestock around the world.
이와 같이 상기 마이토마이신 C 와 피롤리지딘 알칼로이드가 세포내에서 다른 작용을 나타내는 것은 이들 화합물의 반응성이 다르기 때문이다. 구체적으로, 피롤리지딘 알칼로이드에서 유래한 피롤 대사산물 (pyrrole metabolite)들은 핵산과 반응할 수 있는 기능 구조를 가지고 있으나, 그 반응성이 너무 크고 독성이 강하여 항암제로서 사용되는데 적합하지 않다 (반응식 1 참조). 반면, 상기와 유사한 핵산과 반응할 수 있는 기능 구조를 가지는 마이토마이신 C 는 그 반응성이 적당하여 피롤 대사산물이 세포의 핵에 도달할 수 있어 핵산(DNA)과 직접적으로 반응할 수 있다 (반응식 2 참조).Thus, the fact that the mitomycin C and the pyrrolizidine alkaloid have different activities in the cells is because the reactivity of these compounds is different. Specifically, pyrrole metabolites derived from pyrrolidine alkaloids have a functional structure capable of reacting with nucleic acids, but their reactivity is so large that they are not suitable for use as anticancer drugs due to their high toxicity (see Scheme 1) . On the other hand, mitomycin C, which has a functional structure capable of reacting with a nucleic acid similar to the above, is suitable for its reactivity so that the pyrrole metabolite can reach the nucleus of the cell and directly react with the nucleic acid (DNA) 2).
[반응식 1][Reaction Scheme 1]
[반응식 2][Reaction Scheme 2]
하지만, 마이토마이신 C 가 좋은 항암제로 사용되기 위하여 몇 가지 문제점이 해결되어야 한다. 구체적으로 마이토마이신 C 는 소량만이 자연에 존재하여 보통의 천연 물질과 마찬가지로 추출될 수 있는 양이 제한되고, 유기적으로 합성하는 것도 용이하지 않으므로 이를 대량으로 공급하는 것이 어렵다. 또한, 마이토마이신 C 는 핵산과 반응하기 위하여 세포내에 존재하는 환원효소를 필요로 하는데, 일반적으로 상기 환원효소의 세포내 농도는 그리 높지 않아 항암 효과가 감소하게 된다.However, several problems must be solved in order for mythomaicin C to be used as a good anticancer drug. Specifically, only a small amount of mitomycin C exists in nature, so that it can not be extracted in a large amount because it is not easy to synthesize organically. In addition, mitomycin C requires a reductase present in the cell to react with nucleic acid. In general, the intracellular concentration of the reductase is not so high, so that the anticancer effect is reduced.
1976년 미국 뉴욕 대학의 앤더슨과 코리는 자연에서 추출된 상기 마이토마이신 C 및 피롤리지딘 알칼로이드를 모델로 사용하여 용이하게 합성할 수 있으면서 핵산에 대한 반응성이 마이토마이신 C 와 유사하여 항암 효과가 탁월한 새로운 피롤리진 화합물 (pyrrolizine compounds, 화학식 2 참조)을 성공적으로 합성하였다 (Anderson, W. K. and Corey, P. F., Journal of Medicinal Chemistry, 1976, 20, 812).In 1976, Anderson and Corey of the University of New York in the United States synthesized mitomycin C and pyrrolizidine alkaloids, which are extracted from nature, as a model, and their reactivity to nucleic acid is similar to that of mitomycin C, (Anderson, WK and Corey, PF, Journal of Medicinal Chemistry, 1976, 20, 812) were successfully synthesized with the novel pyrrolizine compounds.
[화학식 2](2)
이들은 피롤리지딘 알칼로이드의 피롤 대사산물의 반응성을 느리게 조절하기 위하여, 구조적으로 피롤 환 구조 (pyrrole ring system)의 전자 밀도를 조절할 수 있는 치환기 R2및 핵산과 반응하여 치환되는 부위인 에스터 그룹 (R3COO-)을 고려하여 다양하게 치환시켰다. 이 때, 치환기 R2은 메틸기, 트리플루오르메틸기, 페닐기, 4-클로로페닐기, 4-플루오르페닐기, 4-메톡시페닐기, 3,4-디클로로페닐기 등이며, 치환기 R3은 메틸기, NHCH3, NHC2H5, NH-n-C4H9, NH-이소프로필기, NH-시클로헥실기 등이다.In order to control the reactivity of the pyrrole metabolites of pyrrolidine alkaloids slowly, they include a substituent R 2 that is structurally capable of controlling the electron density of the pyrrole ring system and an ester group (R 3 COO-). At this time, the R 2 substituent is a methyl group, a trifluoro methyl group, a phenyl group, a 4-chlorophenyl group, a 4-fluoro phenyl, 4-methoxy-phenyl, 3,4-dichlorophenyl group, etc., the substituent R 3 is a methyl group, NHCH 3, NHC 2 H 5 , NH-nC 4 H 9 , NH-isopropyl group, NH-cyclohexyl group and the like.
상기와 같이 치환기 R2및 치환기 R3을 다양하게 조합하여 화합물들을 제조한 결과, 이들 중에서 치환기 R2가 전자를 끌어당기는 그룹 (electron -withdrawing group)인 경우보다 전자를 밀어주는 그룹(electron-donating group)인 경우가 더욱 항암 효과가 탁월하고, 에스터 방출 그룹(ester leaving group) R3이 아세테이트(CH3)인 경우보다 카바메이트(NHCH3)인 경우가 더 안정하여 그의 항암 효과가 보다 우수하게 나타난다. 다시 말하자면, 전자를 끌어당기는 그룹 R2는 피롤 환 구조의 전자 밀도를 낮추므로 피롤 환 내의 여분의 전자 (질소내 반응에 관여하지 않는 전자)가 반응하는 것을 막아 그의 반응성을 감소시키고, 에스터 방출 그룹으로 사용한 안정한 카바메이트는 상기 화합물들이 피롤리지딘 알칼로이드의 피롤 대사산물보다 상당히 안정된 반응성을 갖게 한다.As a result of preparing the compounds by various combinations of the substituent R 2 and the substituent R 3 as described above, the substituent R 2 is more effective than the electron-donating group (electron-donating group) group) is more excellent in anticancer effect and carbamate (NHCH 3 ) is more stable in the ester leaving group R 3 than acetate (CH 3 ), and its anticancer effect is more excellent appear. In other words, the electron attracting group R 2 lowers the electron density of the pyrrole ring structure, thereby preventing the extra electrons (electrons not involved in the nitrogen reaction) in the pyrrole ring from reacting to reduce its reactivity, The stable carbamates used have a significantly more stable reactivity than the pyrrole metabolites of the pyrrolizidine alkaloids.
상기 과정을 통해, 앤더슨과 코리는 대표적인 화합물로서 R2은 3,4-디클로로페닐기이고 R3은 NH-이소프로필기인 2,3-디하이드로-5-(3',4'-디클로로페닐)-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스(이소프로필카바메이트) 및 그의 유도체를 제조하여 그들이 백혈병을 치료하는데 탁월한 효과 (antileukimic activity)를 나타냄을 확인하였다. 하지만 이들 화합물은 수용성 용매에서 용해도가 좋지 않고 에스터 방출 그룹이 세포내 물질인 물, 글루타치온 및 그외 뉴클레오파일 등으로 치환되는 경우 항암 효과를 상실하게 되므로 항암제로서 사용되는데 많은 어려운 점이 있었다. 따라서 지금까지 이들 화합물은 그의 항암 효과가 탁월함에 비하여 항암제로서는 널리 사용되지 못하였다.Through the above process, Anderson and Corey R 2 is 3,4-dichlorophenyl group and R 3 is an isopropyl group NH- 2,3-dihydro-5- (3 ', 4'-dichlorophenyl) as a representative compound 6,7-bis (hydroxymethyl) -1H-pyrrolidinebis (isopropylcarbamate) and its derivatives have been found to show antileukimic activity in treating leukemia. However, these compounds have a poor solubility in water-soluble solvents, and when the ester-releasing group is replaced with water, glutathione and other nucleophiles, which are intracellular substances, the anticancer effect is lost and thus it is difficult to use them as anticancer drugs. Therefore, up to now, these compounds have excellent anticancer effects, but they have not been widely used as anticancer drugs.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 극복하는 새로운 항암제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 수용성 용매에 잘 녹고 상기 세포내 물질에 대해 안정하며 세포 핵내의 핵산(DNA)과 결합하여 우수한 항암 효과를 나타내는 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하였다. 본 발명의 화합물은 생물학적으로 중요한 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과도 결합시킬 수 있어 유전자 치료 등을 포함한 유전자 관련 연구에 용이하게 이용될 수 있다.Accordingly, the present inventors have made efforts to develop a novel anticancer agent that overcomes the above problems. As a result, they have found that a novel pyrrolidine derivative which is well soluble in a water-soluble solvent, stable to the intracellular substance, Derivatives and salts thereof. The compounds of the present invention can bind to biologically important substances such as oligonucleotides, peptide analogues and cholesterol, and can be easily used for gene related research including gene therapy and the like.
본 발명은 항암 효과가 있는 화학식 1 의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물을 제공함에 그 목적이 있다.It is an object of the present invention to provide a novel pyrrolidine derivative of the formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof, which have an anticancer effect.
화학식 1Formula 1
상기 화학식에서,In the above formulas,
R1은 C1- C10의 알킬기, C3- C7의 시클로알킬기, C3- C6의 알케닐기, 페닐기이고,R 1 is a C 1 - C 10 alkyl group, a C 3 - C 7 cycloalkyl group, a C 3 - C 6 alkenyl group,
X 및 X' 은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고,X and X 'are each a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkylthio group, a silyloxy group,
Y 는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고,Y is a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a halogen group, a carbonyl group,
n 은 1 - 10 이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.n is 1 - 10 and is the linker length when other materials are bonded.
구체적으로, 본 발명은 상기 화학식에서 R1이 C1- C3직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 각각 하이드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 메틸치오기, 에틸치오기, 트리메틸실릴옥시기 또는 t-부틸디메틸실릴옥시기, Y 는 하이드록시기, 머캅토기 또는 아미노기 그리고 n 은 1 - 6 인 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그들의 용매 화합물을 제공한다.Specifically, the present invention provides a compound represented by the formula: wherein R 1 is a C 1 -C 3 straight chain alkyl group, X and X 'each represent a hydroxyl group, a methoxy group, an ethoxy group, a methylthio group, an ethylthio group, a trimethylsilyloxy group, t-butyldimethylsilyloxy group, Y is a hydroxyl group, a mercapto group or an amino group, and n is 1-6, a pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof.
보다 구체적으로, 본 발명은 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.More specifically, the present invention provides a pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof.
또한, 본 발명은 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof.
또한, 본 발명은 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.In addition, the present invention provides a pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof.
또한, 본 발명은 R1이 C1 - C3 직쇄 알킬기이고, X 는 트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이며, Y 는 하이드록시기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기인 피롤리진 유도체, 그의 약학적으로 허용되는 염 및 그의 용매 화합물을 제공한다.In the present invention, pyrrolidine derivatives wherein R 1 is a C1-C3 linear alkyl group, X is a trityl group or a 4,4'-dimethoxytrityl group, Y is a hydroxyl group, a chloro group, a bromo group or an iodo group, A pharmaceutically acceptable salt thereof and a solvate thereof.
또한, 본 발명은 상기 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하는 방법을 제공함에 그 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a novel pyrrolidine derivative and a salt thereof.
또한, 본 발명은 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4' -(에틸옥시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)β-시아노에톡시포스파인] 및 그의 제조방법을 제공한다.The present invention also relates to a process for the preparation of 2,3-dihydro-6,7-bis (methoxymethyl) -1H-pyrrolizine-5- [4 '- (ethyloxymethylamino) phenyl] N-diisopropylamino) -cyanoethoxyphosphine] and a process for preparing the same.
상기 화합물을 이용하면 핵산 합성기에서 직접 사용하여 올리고 뉴클레오타이드와 결합시킬 수 있는 피롤리진 유도체를 제조할 수 있다.The above compounds can be used directly in a nucleic acid synthesizer to produce pyrrolidine derivatives that can be bound to oligonucleotides.
또한, 본 발명은 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물을 항암제로 사용하는 용도를 제공함에 그 목적이 있다.It is another object of the present invention to provide a use of a novel pyrrolidine derivative or its salt as a pharmaceutical composition as an anticancer agent.
또한, 본 발명의 피롤리진 유도체는 생물학적으로 중요한 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유도체 및 콜레스테롤 등과 결합시킬 수 있어 유전자 치료방법(gene therapy)을 포함한 유전자 관련 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 상기 물질을 결합시킴으로써 상기 피롤리진 유도체를 위치 특이적 핵산 알킬화제 (site-specific DNA alkylating agent)등으로 사용할 수 있다.In addition, the pyrrolidine derivative of the present invention can bind to biologically important oligonucleotides, peptide derivatives, and cholesterol, and can be used for gene related research including gene therapy. Specifically, the pyrrolidine derivative can be used as a site-specific DNA alkylating agent or the like by binding the substance that binds specifically to the nucleic acid.
본 발명은 세포내의 핵산과 결합하여 항암 효과를 나타낼 수 있는 화학식 1 의 새로운 피롤리진 유도체, 그의 염 및 그들의 용매 화합물을 제공한다.The present invention provides a novel pyrrolidine derivative of formula (I), a salt thereof and a solvate thereof, which can be combined with a nucleic acid in a cell to exhibit an anti-cancer effect.
[화학식 1][Chemical Formula 1]
상기 화학식 1 에서,In Formula 1,
R 은 C1- C10의 알킬기, C3- C7의 시클로알킬기, C3- C6의 알케닐기, 페닐기이고,R is a C 1 - C 10 alkyl group, a C 3 - C 7 cycloalkyl group, a C 3 - C 6 alkenyl group,
X 및 X' 은 각각 하이드록시기, 알콕시기, 알킬치오기, 실릴옥시기이고,X and X 'are each a hydroxyl group, an alkoxy group, an alkylthio group, a silyloxy group,
Y 는 하이드록시기, 머캅토기, 아미노기, 할로겐기, 카보닐기이고,Y is a hydroxyl group, a mercapto group, an amino group, a halogen group, a carbonyl group,
n 은 1 - 10 이며 다른 물질이 결합하는 경우의 링커 길이이다.n is 1 - 10 and is the linker length when other materials are bonded.
상기 화학식 1 에서 R1,X 및 X' 에 포함된 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄 알킬기이고, 여기에는 에틸기, 프로필기, 프로프-2-일기, 부틸기, 부트-2-일기, 2-메틸 프로프-2-일기, 펜틸기, 펜트-3-일기 또는 헥실기 등이 포함된다. 또한 알케닐기는 프로페닐기를 포함하고, 시클로알킬기는 시클로프로필기, 시클로펜틸기 또는 시클로헥실기를 포함한다.The alkyl group contained in R 1, X and X 'in the above formula (1) is a straight chain or branched chain alkyl group, and examples thereof include an ethyl group, a propyl group, a prop-2-yl group, a butyl group, 2-yl group, pentyl group, pent-3-yl group or hexyl group. The alkenyl group also includes a propenyl group, and the cycloalkyl group includes a cyclopropyl group, a cyclopentyl group, or a cyclohexyl group.
또한, 상기 화학식 1 에서 X 및 X' 에 포함된 알콕시기(OR4)는 R4가 R1과 같거나 페닐-C1-3알킬, 4,4'- 디메톡시트리페닐-메틸 또는 그 유사 그룹이고, 알킬치오기(SR5)는 R5가 상기 R1과 같으며, 실릴옥시기(OSiR6R7R8)는 R6, R7, R8은 서로 같거나 다른 알킬기로서 상기 R1과 같다. 이 때, 페닐-C1-3알킬기는 벤질기, 펜에틸기 또는 3-페닐프로필기를 포함한다.The alkoxy group (OR 4 ) included in X and X 'in the above formula (1) is a compound wherein R 4 is the same as R 1 , or phenyl-C 1-3 alkyl, 4,4'-dimethoxytriphenyl- group, and the alkyl value import (SR 5), R was 5 is the same as the R 1, silyloxy (OSiR 6 R 7 R 8), R 6, R 7, R 8 are the same or a different alkyl group wherein R 1 . Here, the phenyl-C 1-3 alkyl group includes a benzyl group, a phenethyl group or a 3-phenylpropyl group.
또한, 상기 화학식 1 에서 Y 에 포함된 카보닐기는 카보닐클로라이드 또는 메틸에스터기를 포함한다.In addition, the carbonyl group contained in Y in the above formula (1) includes a carbonyl chloride group or a methyl ester group.
바람직하게는 R1이 C1- C3직쇄 알킬기이고, X 및 X'는 각각 하이드록시기, 메톡시기, 에톡시기, 메틸치오기, 에틸치오기, 트리메틸실릴옥시기 또는 t-부틸디메틸실릴옥시기, Y 는 하이드록시기, 머캅토기 또는 아미노기 그리고 n 은 1 - 6 인 경우인데, 이 때 가장 바람직한 활성을 나타낸다.Preferably, R 1 is a C 1 -C 3 straight chain alkyl group, and X and X 'are each a hydroxyl group, a methoxy group, an ethoxy group, a methylthio group, an ethylthio group, a trimethylsilyloxy group, or t-butyldimethylsilyloxy Y is a hydroxyl group, a mercapto group or an amino group, and n is 1 to 6, and exhibits the most preferable activity.
또한, 바람직하게는 R1이 C1- C3직쇄 알킬기이고, X 및 X' 는 트리틸기 또는 4,4'-디메톡시트리틸기이며, Y 는 하이드록시기, 클로로기, 브로모기 또는 요오드기인 경우이다.Preferably, R 1 is a C 1 -C 3 straight chain alkyl group, X and X 'are trityl groups or 4,4'-dimethoxytrityl groups, Y is a hydroxyl group, a chloro group, a bromo group or an iodine group .
특히, 본 발명에서 바람직한 화합물은 하기 화학식 3 의 화합물, 그의 염 및 그들의 용매 화합물이다.In particular, preferred compounds in the present invention are compounds of the general formula (3), salts thereof and solvates thereof.
[화학식 3](3)
상기 화학식 3 에서 R9은 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이고, R10는 수소, 메틸기, 에틸기 또는 프로필기이며 n 은 1 - 6 인 경우이다.In the above formula (3), R 9 is a methyl group, an ethyl group or a propyl group, R 10 is hydrogen, a methyl group, an ethyl group or a propyl group, and n is 1-6.
구체적으로, 본 발명의 화합물 중 바람직한 화합물들을 나열하면 다음과 같다.Specifically, preferred compounds among the compounds of the present invention are listed as follows.
2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(DMTr -O-메틸)-1H-피롤리진 및 그들의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.(DMTr-O-methyl) -lH-pyrrolizines and their salts and their solvates < RTI ID = 0.0 > to be.
또한, 본 발명의 화합물 중 특히 바람직한 화합물은 하기 화학식 4 의 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.Particularly preferred compounds of the present invention are those of the following formula (4) and salts thereof and solvates thereof.
[화학식 4][Chemical Formula 4]
본 발명의 화합물은 수용성 용매에서 잘 녹으면서 물에 의해 에스터기가 분해되지 않아 핵산과 효과적으로 반응할 수 있다. 비록 하이드록시기가 에스터기 보다 상당히 반응성이 적은 방출 그룹이지만 피롤 환 구조의 전자를 밀어주는 능력을 가진 아민기로 인하여 반응성이 증가하므로 전체적인 반응성은 기존의 2,3-디하이드로-5-(3',4'-디클로로페닐)-6,7-비스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진 비스(이소프로필카바메이트) 및 그의 유도체 (IPP) 화합물과 유사하다. 따라서 본 발명의 화학식 4 의 화합물은 탁월한 항암 효과를 나타내게 된다.The compound of the present invention can be effectively dissolved in a water-soluble solvent and effectively react with nucleic acids without degrading the ester group by water. Although the release group of the hydroxy group is significantly less reactive than the ester group, the reactivity is increased due to the amine group having the ability to push electrons of the pyrrole ring structure, so that the overall reactivity is lower than that of the conventional 2,3-dihydro-5- (3 ' (4-dichlorophenyl) -6,7-bis (hydroxymethyl) -1H-pyrrolizine bis (isopropyl carbamate) and derivatives thereof (IPP). Therefore, the compound of Chemical Formula 4 of the present invention exhibits excellent anticancer effect.
본 발명의 또 다른 바람직한 화합물은 하기 화학식 5 의 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.Another preferred compound of the present invention is of the formula (5) and salts thereof and solvates thereof.
[화학식 5][Chemical Formula 5]
상기 화학식 5 의 화합물은 상기 화학식 4 의 화합물 중 하이드록시기가 메톡시기로 치환되어 전체적인 반응성이 낮아진 화합물이다. 상기 메톡시기는 하이드록시기 보다 반응성이 적은 방출 그룹으로 염기성 조건에서는 반응성이 거의 없고 약산성인 조건에서는 서서히 반응성을 보이는 것으로 보고되어 있다. 따라서 이는 핵산의 골격을 이루는 인산기가 약산성인 것을 고려하면 세포내의 다른 물질과는 반응하지 않고 오직 핵산에 도달한 경우에만 반응성을 나타내는 특성을 지니게 된다.The compound of formula (5) is a compound in which the hydroxy group of the compound of formula (4) is substituted with a methoxy group to lower the overall reactivity. The methoxy group is a group which is less reactive than a hydroxyl group. It has been reported that the methoxy group shows little reactivity under basic conditions and gradually reacts under weak acid conditions. Therefore, considering that the phosphate group forming the backbone of the nucleic acid is weakly acidic, it does not react with other substances in the cell but has a characteristic of reactivity only when it reaches the nucleic acid.
특히, 상기 화학식 5 의 화합물은 다른 생물학적으로 중요한 물질과 결합할 수 있는 하이드록시기를 기능 구조로 가지고 있다.In particular, the compound of formula (5) has a functional group having a hydroxy group capable of binding with other biologically important substances.
또한, 본 발명의 가장 바람직한 화합물은 및 그의 염 그리고 그들의 용매 화합물이다.In addition, the most preferred compounds of the invention are and their salts and their solvates.
본 발명은 화학식 1 의 새로운 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조하는 방법을 제공한다.The present invention provides a novel pyrrolizine derivative of formula (I) and a salt thereof.
구체적으로, 본 발명은Specifically, the present invention provides
1) 앤더슨과 코리의 방법으로 제조한 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻고,1) The coupling reaction of N- (4-fluorobenzoyl) proline with a secondary amine compound having a hydroxy group prepared by the method of Anderson and Corey is performed to obtain a compound having an amino group introduced at the 4-
2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트를 반응시켜 6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻고,2) reacting it with acetic anhydride and dimethylacetylenedicarboxylate to obtain a pyrrolidine compound in which the 6,7-position is appropriately substituted,
3) 다시 이를 환원하는 과정을 통하여 본 발명의 목적 화합물인 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조한다. 한편, 상기의 목적 화합물은 치환기를 변환시켜 같은 골격 구조를 가지는 다른 화합물로 변환시킬 수 있다.3) The pyrrolidine derivative of the present invention and a salt thereof are prepared through reduction of the pyrrolidine derivative. On the other hand, the desired compound can be converted into another compound having the same skeleton structure by converting the substituent.
따라서 상기 과정에 더하여, 무수산을 가하여 다른 목적 화합물인 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조한다. 또한 상기 화합물의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시켜 또 다른 목적 화합물인 피롤리진 유도체 및 그의 염을 제조한다.Therefore, in addition to the above process, an anhydrous acid is added to produce another target compound, pyrrolidine derivative, and a salt thereof. In addition, a nucleophile is reacted with the ester-releasing group of the compound to produce another target compound, pyrrolidine derivative, and a salt thereof.
보다 구체적으로, 본 발명은 화학식 1 의 새로운 피롤리진 유도체를 제조하기 위하여,More specifically, the present invention relates to a process for preparing a novel pyrrolidine derivative of formula (I)
1) 화학식 6 의 화합물인 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 화학식 7 의 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행함으로써 4-위치에 아미노기가 도입된 화학식 8 의 화합물을 제조한다 (반응식 3 참조).1) A compound represented by the formula (8) wherein an amino group is introduced at the 4-position is prepared by carrying out a coupling reaction with N- (4-fluorobenzoyl) proline of the formula (6) with a secondary amine compound having a hydroxy group (See Scheme 3).
화학식 7 의 화합물은 n-메틸에탄올아민 및 N-메틸부탄올아민 등을 포함하고, 이 때 R11과 n 은 상기에서 정의한 바와 같다. 상기 반응에 사용되는 용매로는 디메틸설포옥사이드(DMSO)가 가장 바람직하고, 이 때, 반드시 K2CO3를 첨가하여야 한다. 또한, 반응 온도는 80 - 100℃가 바람직하고, 반응 시간은 7 - 10일 정도가 바람직하며. 특히 아르곤 존재 하에서 상기 반응을 수행하는 것이 바람직하다.The compound of formula (7) includes n-methyl ethanolamine, N-methyl butanol amine and the like, wherein R 11 and n are as defined above. As the solvent used in the reaction, dimethylsulfoxide (DMSO) is most preferable, and K 2 CO 3 must be added. The reaction temperature is preferably 80 to 100 ° C., and the reaction time is preferably 7 to 10 days. It is particularly preferred to carry out the reaction in the presence of argon.
상기 반응을 이용하여 피롤리진 화합물에 다양한 링커 및 기능기(functional group)를 도입할 수 있다.Various linkers and functional groups can be introduced into the pyrrolidine compound using the above reaction.
[반응식 3][Reaction Scheme 3]
2) 다음, 화학식 8 의 화합물을 무수 아세트산과 디메틸아세틸렌디카복실레이트(dimethyl acetylenedicarboxylate, DMAD)를 반응시켜 화학식 9 의 화합물을 제조한다 (반응식 4 참조).2) Next, the compound of formula (8) is reacted with acetic anhydride and dimethyl acetylenedicarboxylate (DMAD) to prepare a compound of formula (9) (see Scheme 4).
[반응식 4][Reaction Scheme 4]
본 발명은 화학식 8 의 화합물을 먼저 약 60℃에서 무수 아세트산을 사용하여 녹이고 이를 다시 실온에서 식힌 다음 디메틸아세틸렌디카복시레이트와 서서히 반응시키는 1,3-디폴라어디션(1,3-dipolar addition) 방법으로 화학식 9 의 화합물을 제조한다. 이는 앤더슨과 코리의 방법인 무수 아세트산과 디메틸아세틸렌디카복실레이트를 동시에 반응시키는 방법과는 차이가 있다.The present invention relates to a process for the preparation of 1,3-dipolar addition which first dissolves the compound of formula 8 at about 60 < 0 > C using acetic anhydride, which is cooled again at room temperature and then slowly reacted with dimethylacetylene dicarboxylate, To prepare a compound of formula (9). This is different from the method of Anderson and Corey's method of reacting acetic anhydride and dimethylacetylene dicarboxylate simultaneously.
3) 다음, 화학식 9 의 화합물을 환원시켜 화학식 10 의 화합물을 제조한다 (반응식 5 참조).3) Next, the compound of formula (9) is reduced to prepare a compound of formula (10) (see Scheme 5).
이 때 사용되는 환원제는 리튬 알루미늄하이드라이드(LiAlH4)와 같은 적당한 반응성을 가지는 촉매가 바람직하다.The reducing agent used herein is preferably a catalyst having suitable reactivity such as lithium aluminum hydride (LiAlH 4 ).
[반응식 5][Reaction Scheme 5]
4) 화학식 10 의 화합물과 무수산(acid anhydride)을 반응시켜 화학식 11 의 화합물을 제조한다 (반응식 6 참조).4) The compound of formula (10) is reacted with an acid anhydride to prepare a compound of formula (11) (see Scheme 6).
바람직하게는 화학식 10 의 화합물에서 R11이 메틸기이고 n 은 2 인 경우인 화학식 4 의 화합물을 무수 아세트산과 반응시켜 화학식 11 에서 R11과 R12가 메틸기이고 n 이 2 인 화합물을 제조할 수 있다. 상기 화학식 7 의 화합물은 반응성이 매우 커서 보관이 용이하지 않으므로 이를 합성한 다음 즉시 다음 반응에 사용해야 한다.Preferably, in the compound of formula (10), a compound of formula (4) wherein R 11 is methyl group and n is 2 is reacted with acetic anhydride to produce a compound wherein R 11 and R 12 are methyl groups and n is 2 in formula . Since the compound of formula (7) is highly reactive and is not easy to store, it should be immediately used in the next reaction after synthesis.
[반응식 6][Reaction Scheme 6]
5) 화학식 11 의 화합물에 존재하는 에스터 방출 그룹과 뉴클레오파일을 반응시켜 화학식 12 의 화합물 및 그의 유도체를 제조한다 (반응식 7 참조).5) Reaction of an ester-releasing group present in the compound of formula 11 with a nucleophile to produce a compound of formula 12 and its derivatives (see Scheme 7).
상기에서 R11은 메틸기, 에틸기 및 프로필기이고, R12는 일반 알킬기이다. 뉴클레오파일 RS-는 알킬설파이드 이온으로 CH3CH2S-, HOCH2CH2S-등을 나타내며, RO-는 알콕사이드 이온으로 메톡사이드, 에톡사이드를 나타낸다.In the above, R 11 is a methyl group, an ethyl group and a propyl group, and R 12 is a general alkyl group. The nucleophile RS - represents an alkylsulfide ion such as CH 3 CH 2 S - , HOCH 2 CH 2 S - , and RO - represents an alkoxide ion, methoxide or ethoxide.
구체적으로, 화학식 5 의 화합물은 R12과 R13이 메틸기이고 n 이 2 인 화학식 11 의 화합물을 뉴클레오파일인 메톡사이드 등과 반응시켜 제조된다. 이 때 피롤리진 환에 붙어있는 2개의 에스터기는 방출 그룹으로 메톡사이드로 치환되고 링커에 있는 에스터기는 용해되어 하이드록시기로 전환된다.Specifically, the compound of formula (5) is prepared by reacting a compound of formula (11) wherein R 12 and R 13 are methyl groups and n is 2 with a nucleophile such as methoxide. In which the two ester groups attached to the pyrrolidine ring are replaced by methoxide as the leaving group and the ester group in the linker is dissolved and converted to the hydroxy group.
또한, 본 발명은 핵산 합성기에서 직접 올리고 뉴클레오타이드와 결합할 수 있는 화학식 6의 화합물인 및 그의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a compound of formula (VI) capable of binding oligonucleotides directly in a nucleic acid synthesizer, and a process for producing the same.
구체적으로 본 발명은,More specifically,
1) 앤더슨과 코리의 방법으로 제조한 N-(4-플루오르벤조일)프롤린을 하이드록시기를 가진 2차 아민 화합물과 커플링 반응을 수행하여 4-위치에 아미노기가 도입된 화합물을 얻고,1) The coupling reaction of N- (4-fluorobenzoyl) proline with a secondary amine compound having a hydroxy group prepared by the method of Anderson and Corey is performed to obtain a compound having an amino group introduced at the 4-
2) 이를 무수 아세트산 및 디메틸아세틸렌디카복실레이트(DMAD)를 반응시켜 6,7-위치가 적절히 치환된 피롤리진 화합물을 얻고,2) reacting it with acetic anhydride and dimethylacetylenedicarboxylate (DMAD) to obtain a pyrrolidine compound in which the 6,7-position is appropriately substituted,
3) 다시 이를 환원시키고,3) Reduce it again,
4) 이를 무수산으로 반응시킨 다음 이의 에스터 방출 그룹에 뉴클레오파일을 반응시키고,4) reacting it with anhydrous acid, reacting the ester-releasing group with a nucleophile,
5) 이에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 등을 반응시키는 과정을 통하여 본 발명의 제조한다.5) followed by reaction with 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoamidite or the like to prepare the present invention.
구체적으로, 본 발명은 상기 화학식 5의 화합물에 2-시아노에틸 N,N-디이소프로필클로로포스포아미다이트 등을 반응시켜 핵산 합성기의 합성의 마지막 단계에서 이를 올리고 디옥시 뉴클레오타이드 등의 5'-말단에 결합시킬 수 있는 상기 화합물을 제조한다.Specifically, the present invention relates to a method for preparing a nucleic acid synthesizer by reacting the compound of Chemical Formula 5 with 2-cyanoethyl N, N-diisopropylchlorophosphoamidite or the like, &Apos; ' -terminus. ≪ / RTI >
이외에 핵산 등에 결합할 수 있는 콜레스테롤 또는 단백질 유사체 등도 본 발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염에 결합시킬 수 있다.In addition, cholesterol or protein analogs capable of binding to nucleic acids and the like can also be bound to the pyrrolidine derivatives of the present invention and salts thereof.
또한, 본 발명의 화합물들이 나타내는 항암 효과를 여러 종류의 암세포를 사용하여 조사한다.In addition, the anti-cancer effect of the compounds of the present invention is examined using various kinds of cancer cells.
구체적으로 본 발명의 화합물인 및 그의 염 그리고 그의 용매 화합물이 나타내는 항암 효과를 표준 세포에 대한 암세포의 성장 정도를 측정하여 확인한다 (표 1 참조).Specifically, the anti-cancer effect of the compound of the present invention and its salt and its solvent compound is confirmed by measuring the degree of growth of cancer cells against standard cells (see Table 1).
이외에도, 본 발명의 화합물은 핵산과 위치 특이적으로 결합하는 리간드인 올리고 뉴클레오타이드, 단백질 유사체 또는 콜레스테롤 등을 이에 결합시킴으로써 유전자와 관련된 연구에 유용하게 이용될 수 있다. 구체적으로 상기 화합물은 유전자 치료 방법(gene therapy), 안티센서(antisensor), 안티진(antigene) 및 위치 특이적 유전자 억제(site-specific gene blocking) 등에 이용될 수 있다.In addition, the compounds of the present invention can be usefully used in researches related to genes by binding oligonucleotides, protein analogues or cholesterol, which are ligands that bind locally with nucleic acids. Specifically, the compounds can be used for gene therapy, antisensor, antigene, and site-specific gene blocking.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.The following examples illustrate the present invention in detail and are not intended to limit the scope of the present invention.
실시예 1 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비 스(하이드록시메틸)-1H-피롤리진의 제조Example 1 Preparation of 2,3-dihydro-5- [4 '- (? - hydroxyethylmethylamino) phenyl] -6,7-bis (hydroxymethyl) -1H-pyrrolidine
(단계 1) N-(4-플루오르벤조일)프롤린의 제조(Step 1) Preparation of N- (4-fluorobenzoyl) proline
800mL의 증류수에 50g(0.43mol)의 l-프롤린, 7mg의 티몰프탈레인과 170g의 Na2CO3를 가한 용액을 실온에서 진한 수산화나트륨 수용액으로 처리하여 용액이 파란색이 될 때까지 반응시켰다. 섞인 반응 용액을 얼음같이 찬 물에 식히고 에테르에 녹인 4-플루오르벤조일클로라이드(60ml, 81g, 0.51mmol, F.W. : 158.56, d : 1.342)를 조금씩 가하고, 이 때 진한 수산화나트륨 용액을 가하여 파란색을 유지시켰다. 이 반응 혼합액을 상기의 과정이 끝난 후 에테르(2 × 250mL)로 추출한 다음 실온에서 30분간 더 교반하였다. 진한 염산으로 수층을 pH 1 까지 산성화시키고 에틸아세테이트(4 × 400mL)로 추출하였다. 혼합된 에틸아세테이트 용액은 소금물(brine, 300mL)로 세척한 다음 무수황산나트륨으로 건조시키고 진공에서 농축시켰다. 그 잔류물을 뜨거운 에틸아세테이트 (300mL)에 녹여, 그 용액을 빠르게 교반하면서 헥산을 천천히 가하였다. 이를 실온에서 식힌 다음 침전물을 유리 필터에 모으면 흰 가루 상태의 목적 화합물이 80g 얻어졌다. 남은 모액을 다시 상기와 유사한 과정으로 처리하여 목적 화합물 15g을 추가로 얻을 수 있었다(수율 93%).A solution of 50 g (0.43 mol) of 1-proline, 7 mg of thymolphthalein and 170 g of Na 2 CO 3 in 800 mL of distilled water was treated with a concentrated aqueous solution of sodium hydroxide at room temperature until the solution became blue. The reaction mixture was cooled in ice-cold water and 4-fluorobenzoyl chloride (60 ml, 81 g, 0.51 mmol, FW: 158.56, d: 1.342) dissolved in ether was added little by little, . The reaction mixture was extracted with ether (2 x 250 mL) and stirred at room temperature for 30 minutes. The aqueous layer was acidified with concentrated hydrochloric acid to pH 1 and extracted with ethyl acetate (4 x 400 mL). The combined ethyl acetate solution was washed with brine (300 mL), dried over anhydrous sodium sulfate and concentrated in vacuo. The residue was dissolved in hot ethyl acetate (300 mL), and hexane was slowly added while the solution was stirred rapidly. After cooling at room temperature, the precipitate was collected on a glass filter to obtain 80 g of the target compound in the form of a white powder. The remaining mother liquor was treated again in the same manner as above to obtain 15 g of the target compound (yield: 93%).
융점 : 168 - 170℃Melting point: 168 - 170 캜
C12H12NO3F 에 대한 원소 분석치 - 실측치(%); C : 60.4, H : 5.3, N : 5.8Elemental analysis for C 12 H 12 NO 3 F - found (%); C: 60.4, H: 5.3, N: 5.8
이론치(%); C : 60.7, H : 5.1, N : 5.9Theoretical value (%); C: 60.7, H: 5.1, N: 5.9
(단계 2) N-[4-(N-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염 제조(Step 2) Preparation of potassium salt of N- [4- (N-methylhydroxyethylamino) benzoyl] proline
상기 단계 1에서 얻은 14g의 N-(4-플루오르벤조일)프롤린(59mmol), 8.3g 무수 탄산칼륨, 24mL 무수 DMSO 에 녹은 12mL N-메틸에탄올아민을 아르곤 존재 하에서 95℃로 10일간 반응시켰다. RP-HPLC 분석을 수행하여 반응물 중에 매우 적은 양의 N-(4-플루오르벤조일)프롤린이 남아있음을 확인하였다. 녹지 않은 염은 필터로 걸러 충분량의 CH2Cl2로 씻은 다음 이를 진공에서 농축시켰다. 그 잔류물을 50mL 뜨거운 CH2Cl2에 녹이고 녹지 않은 불순물을 필터로 걸러 제거한다. 거른 용액을 진공에서 농축하여 그 잔류물을 50mL 에테르에 현탁한 다음 에테르를 감압하에 증발시켜 제거함으로써 N-(4-플루오르벤조일)프롤린이 소량 포함된 17g N-[4-(N-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염을 흰 거품 형태로 얻었다. 본 화합물은 0.1M 트리에틸암모니움 아세테이트 완충용액 (pH 7.5)에 녹인 30% CH3CN 용액에서 측정한 최대 자외선 흡수량이 290nm 파장에서 관찰되었다. 이 화합물은 다음 반응을 위하여 정제하지 않고 사용하였다.14 ml of N- (4-fluorobenzoyl) proline (59 mmol) obtained in the above Step 1, 8.3 g of anhydrous potassium carbonate and 12 ml of N-methylethanolamine dissolved in 24 ml of anhydrous DMSO were reacted at 95 ° C for 10 days in the presence of argon. RP-HPLC analysis was performed to confirm that very small amounts of N- (4-fluorobenzoyl) proline remained in the reaction. The insoluble salt was filtered off and washed with a sufficient amount of CH 2 Cl 2 and then concentrated in vacuo. The residue is dissolved in 50 mL of hot CH 2 Cl 2 and the undissolved impurities are filtered off. The filtrate was concentrated in vacuo and the residue was suspended in 50 mL of ether and the ether was removed by evaporation under reduced pressure to give 17 g of N- (4- (N-methylhydroxypyridine) Ethylamino) benzoyl] proline in the form of a white foam. The maximum absorption of ultraviolet light of this compound was measured at a wavelength of 290 nm in a 30% CH 3 CN solution dissolved in 0.1 M triethylammonium acetate buffer solution (pH 7.5). This compound was used without purification for the next reaction.
(단계 3) 디메틸-2,3-디하이드로-5-[4'-(N-메틸아세톡시에틸아미노)페닐]-1H-피롤 리진-6,7-디카복실레이트의 제조(Step 3) Preparation of dimethyl-2,3-dihydro-5- [4 '- (N-methylacetoxyethylamino) phenyl] -1H-pyrrolizine-6,7-dicarboxylate
10.15g N-[4-(n-메틸하이드록시에틸아미노)벤조일]프롤린의 칼륨염을 따뜻한 35mL 무수 아세트산에 녹여 이를 실온에서 식힌 후 17mL 디메틸 아세틸렌디카복실레이트를 가하였다. 이를 이산화탄소의 생성을 조사할 수 있는 환류 응축기(reflux condenser) 및 가스 버블러가 장착된 플라스크에 넣어 천천히 120℃로 가열하면서 섞었다. 온도가 120℃로 올라가면서 이산화탄소가 매우 빠른 속도로 증가하였고,. 기체 발생률이 실질적으로 감소한 다음에도 1시간 정도 온도를 계속 유지시켰다. 반응 혼합액은 진공에서 농축되었고 그 잔류물은 5mL CH2Cl2에 녹여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로 정제하였다. 이 때 전개용매로는 헥산 : 에틸아세테이트의 비율이 3 : 1 인 혼합용매를 사용하였다. 순수한 산물을 포함하는 분획을 합하여 농축하여 목적 화합물인 디메틸 7g 을 흰 고체로 얻었다. 이를 분석하기 위하여 뜨거운 메탄올로 재결정하였다.10.15 g Potassium salt of N- [4- (n-methylhydroxyethylamino) benzoyl] proline was dissolved in warm 35 mL of anhydrous acetic acid, which was cooled at room temperature and 17 mL of dimethylacetylene dicarboxylate was added. The mixture was placed in a flask equipped with a reflux condenser and a gas bubbler capable of examining the production of carbon dioxide, and slowly mixed while being heated to 120 ° C. As the temperature increased to 120 ℃, carbon dioxide increased very rapidly. After the gas generation rate was substantially reduced, the temperature was maintained for about 1 hour. The reaction mixture was concentrated in vacuo and the residue was dissolved in 5 mL CH 2 Cl 2 and purified by silica gel column chromatography. As a developing solvent, a mixed solvent of hexane: ethyl acetate in a ratio of 3: 1 was used. The fractions containing the pure product were combined and concentrated to obtain 7 g of the target compound, dimethyl, as a white solid. To analyze this, it was recrystallized with hot methanol.
융점 : 109 - 110℃Melting point: 109 - 110 캜
1H NMR (CDCl3) δ 2.03(s, 3H, CH3C=O), 2.49(p, 2H, C2), 3.01(s, 3H, CH3N), 3.11(t, 2H, C1), 3.62(t, 2H, Cα), 3.75(s, 3H, OCH3), 3.80(s, 3H, OCH3), 3.93(t, 2H, C3), 4.28(t, 2H, Cβ), 6.73(d, 2H, 페닐), 7.29(d, 2H, 페닐) 1 H NMR (CDCl 3) δ 2.03 (s, 3H, CH 3 C = O), 2.49 (p, 2H, C2), 3.01 (s, 3H, CH 3 N), 3.11 (t, 2H, C1), 3.62 (t, 2H, Cα) , 3.75 (s, 3H, OCH 3), 3.80 (s, 3H, OCH 3), 3.93 (t, 2H, C3), 4.28 (t, 2H, Cβ), 6.73 (d , 2H, phenyl), 7.29 (d, 2H, phenyl)
(단계 4) 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7-비스(하 이드록시메틸)-1H-피롤리진의 제조(Step 4) Preparation of 2,3-dihydro-5- [4 '- (? - hydroxyethylmethylamino) phenyl] -6,7-bis (hydoxymethyl) -1H-pyrrolidine
2g 리튬 알루미늄하이드라이드를 건조 에테르에 현탁시켜 건조 CH2Cl2에 단계 3에서 얻은 화합물인 2,3-디하이드로-5-[4'-(N-메틸아세톡시에틸아미노)페닐] -1H-피롤리진-6,7-디카복실레이트 5g 을 녹인 용액을 한 방울씩 가한 다음 30분 동안 가열하였다. 이를 다시 25℃로 식히고 과량의 하이드라이드는 수분 에테르와 수분을 차례로 가하여 그의 염이 하얗게 될 때까지 분해시켰다. 이렇게 얻은 반응물을 유리로 걸러 뜨거운 CH2Cl2로 여러 번 씻었다. 혼합된 유기층은 진공에서 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피 (7 : 2: 0.5 : 0.5 EtOAc-헥산-Et3N-MeOH)를 수행하였다. 이렇게 얻은 순수한 화합물을 포함한 분획을 혼합하여 농축하고 그 결과 목적 화합물인 3g 을 옅은 노란 색의 고체로 얻었다.2 g Lithium aluminum hydride was suspended in dry ether and added to a dry CH 2 Cl 2 solution of the compound obtained in Step 3, 2,3-dihydro-5- [4 '- (N-methylacetoxyethylamino) Pyrrolidine-6,7-dicarboxylate was added dropwise, followed by heating for 30 minutes. It was cooled to 25 ° C again and the excess hydride was added in turn to water ether and water to dissolve the salt until it became whitish. The reaction product thus obtained was filtered through glass and washed several times with hot CH 2 Cl 2 . The combined organic layers were concentrated in vacuo and subjected to silica gel column chromatography (7: 2: 0.5: 0.5 EtOAc-hexane-Et 3 N-MeOH). The fractions containing the pure compound thus obtained were mixed and concentrated to obtain 3 g of the aimed compound as a pale yellow solid.
1H NMR (CDCl3) δ 2.46(t, 2H, C2), 2.88(t, 2H, C1), 3.01(s, 3H, CH3-N), 3.51(t, 2H, Cα), 3.81(t, 2H, cβ), 3.89(t, 2H, C3), 4.57(s, 2H, C6'), 4.59(s, 2H, C7'), 6.81(d, 2H, bb'), 7.23(d, 2H, aa') 1 H NMR (CDCl 3) δ 2.46 (t, 2H, C2), 2.88 (t, 2H, C1), 3.01 (s, 3H, CH 3 -N), 3.51 (t, 2H, Cα), 3.81 (t 2H), 6.81 (d, 2H, bb), 7.23 (d, 2H, C3), 4.57 (s, 2H, C6 '), , aa ')
실시예 2 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7- 비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진의 제조Example 2 Preparation of 2,3-dihydro-5- [4 '- (? - hydroxyethylmethylamino) phenyl] -6,7-bis (methoxymethyl) -1H-pyrrolidine
상기 실시예 1에서 얻은 화합물인 460mg, 2.8mL 무수 트리에틸아민 및 무수 CH2Cl2에 녹은 10mg 4-디메틸아미노피리딘 용액을 25℃에서 1mL 무수 아세트산과 함께 반응시켰다. 1시간이 경과한 다음 그 반응 혼합액을 20mL 무수 메탄올과 반응시키고 5mL로 농축시켰다. 그 농축된 용액을 1M 메톡시나트륨 (Na+MeO-)과 20mL 메탄올로 반응시키고 25℃에서 방치하였다. 이를 진공에서 농축하여 2ml CH2Cl2에 현탁시킨 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 200mg 의 목적 화합물을 노란 고체로 얻었다.A solution of 10 mg of 4-dimethylaminopyridine dissolved in 460 mg of the compound obtained in Example 1, 2.8 mL of anhydrous triethylamine and anhydrous CH 2 Cl 2 was reacted with 1 mL of anhydrous acetic acid at 25 ° C. After 1 hour, the reaction mixture was reacted with 20 mL of anhydrous methanol and concentrated to 5 mL. The concentrated solution 1M methoxy sodium (Na + MeO -) and reacted with 20mL of methanol was allowed to stand at 25 ℃. This was concentrated in vacuo, suspended in 2 ml CH 2 Cl 2 , and subjected to silica gel column chromatography to obtain 200 mg of the target compound as a yellow solid.
1H NMR (CDCl3) δ 2.42(p, 2H, C2), 2.84(t, 2H, C1), 2.99(s, 3H, CH3-N), 3.30(s, 6H, 2XCH3O), 3.48(t, 2H, Cα), 3.71(t, 2H, Cβ), 3.88(t, 2H, C3), 4.24(s, 2H, C6'), 4.47(s, 2H, C7'), 6.78(d, 2H, bb'), 7.20(d, 2H, aa') 1 H NMR (CDCl 3) δ 2.42 (p, 2H, C2), 2.84 (t, 2H, C1), 2.99 (s, 3H, CH 3 -N), 3.30 (s, 6H, 2XCH 3 O), 3.48 2H), 3.71 (t, 2H, Cp), 3.88 (t, 2H, C3), 4.24 2H, bb '), 7.20 (d, 2H, a ' a)
실시예 3 2,3-디하이드로-5-[4'-(β-하이드록시에틸메틸아미노)페닐]-6,7- 비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진의 제조Example 3 Preparation of 2,3-dihydro-5- [4 '- (? - hydroxyethylmethylamino) phenyl] -6,7-bis (methoxymethyl) -1H-pyrrolidine
상기 실시예 1에서 얻은 화합물인 1g, 5mL 무수 트리에틸아민 및 무수 CH2Cl2에 녹은 15mg 4-디메틸아미노피리딘 용액을 25℃에서 2mL 무수 아세트산과 함께 반응시켰다. 1시간이 경과한 다음 그 반응 혼합액을 40mL 무수 에탄올과 섞은 다음 10mL로 농축시켰다. 그 농축된 용액을 40mL 무수 에탄올에 녹은 2g 에톡시나트륨 (Na+EtO-)과 반응시키고 25℃에서 12시간 동안 방치하였다. 이를 진공에서 농축하여 5mL CH2Cl2에 현탁시킨 다음 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행하여 600mg 의 목적 화합물을 하얀 고체로 얻었다.A solution of 15 g of 4-dimethylaminopyridine dissolved in 1 g of the compound obtained in Example 1, 5 mL of anhydrous triethylamine and anhydrous CH 2 Cl 2 was reacted at 25 ° C. with 2 mL of acetic anhydride. After 1 hour, the reaction mixture was mixed with 40 mL of anhydrous ethanol and then concentrated to 10 mL. The concentrated solution was reacted with 2 g of ethoxysodium (Na + EtO < - >) dissolved in 40 mL of anhydrous ethanol and left at 25 DEG C for 12 hours. This was concentrated in vacuo, suspended in 5 mL of CH 2 Cl 2 , and subjected to silica gel column chromatography to obtain 600 mg of the target compound as a white solid.
융점 : 52 - 53℃Melting point: 52 - 53 캜
1H NMR (DMSO-d6) δ 1.10(tof d, 6H, 2XCH3CH2O), 1.94(s, 3H, CH3C=O), 2.37(p, 2H, C2), 2.76(t, 2H, C1), 2.93(s, 3H, CH3-N), 3.40(q of d, 4H, 2XCH3CH2O), 3.60(t, 2H, Cα), 3.88(t, 2H, C3), 4.16(s, 2H, C6'), 4.18(t, 2H, Cβ), 4.28(s, 2H, C7'), 6.76(d, 2H, bb'), 7.25(d, 2H, aa') 1 H NMR (DMSO-d6) δ 1.10 (tof d, 6H, 2XCH 3 CH 2 O), 1.94 (s, 3H, CH 3 C = O), 2.37 (p, 2H, C2), 2.76 (t, 2H (T, 2H, C 3), 3.88 (t, 2H, C 3 ), 2.93 (s, 3H, CH 3 -N), 3.40 (q of d, 4H, 2XCH 3 CH 2 O) (s, 2H, C6 '), 4.18 (t, 2H, Cp), 4.28 (s, 2H, C7'), 6.76
LRMS : m/e 415(M++ 1), 414(M+), 369, 325, 282LRMS: m / e 415 (M + + 1), 414 (M + ), 369, 325, 282
실시예 4 2,3-디하이드로-6,7-비스(메톡시메틸)-1H-피롤리진-5-[4'-(에틸옥 시메틸아미노)페닐]-O-[(N,N-디이소프로필아미노)-β-시아노에톡 시포스파인의 제조Example 4 Synthesis of 2,3-dihydro-6,7-bis (methoxymethyl) -1 H-pyrrolizine-5- [4'- (ethyloxymethylamino) phenyl] -O - [ -Diisopropylamino) -? - cyanoethoxyspospane
실시예 2에서 얻은 화합물인 100mg 과 5mL 무수 CH2Cl2에 녹인 0.2ml 무수 디이소프로필에틸아민 용액에 0.1ml 2-시아노에틸 N,N'-디이소프로필클로로포스포아미다이트를 아르곤 존재 하에서 반응시켰다. 1시간 경과한 다음 이 반응 혼합액을 25℃ 에서 2ml로 농축하여 실리카겔 컬럼 크로마토그라피를 수행한 결과, 목적 화합물인 90mg 을 옅은 노란 색의 오일 형태로 얻었다.To a solution of 100 mg of the compound obtained in Example 2 and 0.2 ml of anhydrous diisopropylethylamine dissolved in 5 ml of anhydrous CH 2 Cl 2 , 0.1 ml of 2-cyanoethyl N, N'-diisopropylchlorophosphoamidite was added with argon Lt; / RTI > After 1 hour, the reaction mixture was concentrated to 2 ml at 25 ° C and subjected to silica gel column chromatography to obtain 90 mg of the target compound as a pale yellow oil.
1H NMR (CDCl3) δ 1.1∼1.2 (m, 12H, 2X(CH3)2CH-), 2.42(p, 2H, C2), 2.57(t, 2H, -CH2CN), 2.87(t, 2H, C1), 3.02(s, 3H, CH3-N), 3.36(s, 6H, 2X-OCH3), 3.5∼3.7(m), 3.75(m, 2H, CH(CH3)2), 3.89(t, 2H, C3), 4.26(s, 2H, C6'), 4.39(s, 2H, C7'), 6.74(d, 2H, bb'), 7.27(d, 2H, aa') 1 H NMR (CDCl 3) δ 1.1~1.2 (m, 12H, 2X (CH 3) 2 CH-), 2.42 (p, 2H, C2), 2.57 (t, 2H, -CH 2 CN), 2.87 (t , 2H, C1), 3.02 ( s, 3H, CH 3 -N), 3.36 (s, 6H, 2X-OCH 3), 3.5~3.7 (m), 3.75 (m, 2H, CH (CH 3) 2) 2H), 3.79 (s, 2H, C7 '), 6.74 (d, 2H,
LRMS 질량 스펙트럼 : m/e 545(M++1), 544(M+), 326, 313, 295, 265, 250, 237LRMS Mass spectrum: m / e 545 (M + +1), 544 (M + ), 326, 313, 295, 265, 250, 237
FAB 질량 스펙트럼 : m/e 597 (M++ 1 + p-니트로벤질알코올 - N,N-디이소프 로필아민), 596, 560, 461FAB mass spectrum: m / e 597 (M + + 1 + p-nitrobenzyl alcohol-N, N-diisopropylphosphine), 596, 560, 461
실시예 5 항암 효과 측정Example 5 Anti-cancer effect measurement
본 발명의 화합물인 및 그의 염들이 나타내는 항암 효과를 여러 종류의 암세포를 사용하여 조사하였다.The anti-cancer effect of the compound of the present invention and its salts was investigated using various kinds of cancer cells.
본 발명은 암 세포주로 A549, SKOV-3, HCT-15, XF-498, SKMEL-2 를 이용하는데, 10% 소태아 혈청이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였고 1주일에 1-2회씩 계대 배양하였다. 세포들을 부착면으로 부터 분리시키기 위하여는 0.25% 트립신 및 3mM CDTA를 인산 완충용액에 녹여 사용하였다. 각 세포를 96-웰 플레이트(Nunc사 제품)의 각 웰에 5 × 103- 2 × 104개씩 가하고, 각종 화합물은 소량의 DMSO 에 녹여 상기 배지로 희석하여 사용하는데, 이 때 최종 DMSO 농도는 0.5% 이하가 되도록 하였다. 상기 화합물 용액을 200μl 씩 세포가 들어있는 각 웰에 가한 다음 48시간 동안 배양하는데, 화합물을 가하는 시점에서 플레이트를 하나 따로 모았다 (time zero plate). 이들 플레이트를 SRB 방법에 준하여 TCA 로 세포를 고정한 다음 SRB 용액으로 염색하고 이에 1% 아세트산을 가하여 세포를 세척하였다. 다음 10mM 트리스 완충용액을 사용하여 염색액을 용출시키고 520nm 에서 흡광도를 측정하였다.The present invention is cultured in A549, SKOV-3, HCT- 15, XF-498, for using the SKMEL-2, 10% bovine 37 ℃ by fetal calf serum is used a RPMI 1640 medium containing, 5% CO 2 in cancer cell lines And subcultured 1-2 times a week. To separate the cells from the adhered surface, 0.25% trypsin and 3 mM CDTA were dissolved in phosphate buffer. Each cell was added to each well of a 96-well plate (manufactured by Nunc) in an amount of 5 × 10 3 -2 × 10 4 , and the various compounds were dissolved in a small amount of DMSO and diluted with the above-mentioned medium. The final DMSO concentration was 0.5% or less. 200 μl of the compound solution was added to each well containing the cells, followed by incubation for 48 hours. At the time of addition of the compound, one plate was collected (time zero plate). These plates were fixed with TCA according to the SRB method, stained with SRB solution, and washed with 1% acetic acid. The dye solution was then eluted with 10 mM Tris buffer and the absorbance at 520 nm was measured.
그 결과, 표준 세포에 대한 암세포의 성장 정도를 측정하여 표 1 에 나타냈다.As a result, the degree of growth of cancer cells relative to the standard cells was measured and shown in Table 1.
본 발명의 피롤리진 유도체 및 그의 염은 세포 내에 존재하는 핵산과 효과적으로 반응하여 세포의 성장을 억제하므로 탁월한 항암 효과를 나타내게 된다. 또한 기존의 피롤리진 화합물과는 달리 수용성 용매에서 용해도가 크고 반응성이 적당하여 세포내에서 핵산 이외의 물질과 결합하지 않으므로 우수한 항암제로서 기대되는 바가 크다.The pyrrolidine derivative of the present invention and its salt react effectively with the nucleic acid present in the cell to inhibit the growth of the cell, thus exhibiting an excellent anticancer effect. Unlike conventional pyrrolidine compounds, it is highly expected to be an excellent anticancer drug because it has high solubility in a water-soluble solvent and is suitable for reactivity and does not bind to a substance other than nucleic acid in a cell.
구체적으로, 본 발명의 및 화합물을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 안정하면서 항암제로서 그 효능도 매우 탁월하다.Specifically, the pharmaceutical composition of the present invention and the compound of the present invention as an active ingredient is very stable as an anticancer agent and has excellent efficacy.
또한, 본 발명의 피롤리진 화합물은 생물학적으로 중요하고 핵산과 위치 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 올리고 뉴클레오타이드, 펩타이드 유사체 및 콜레스테롤 등과 용이하게 결합될 수 있어 유전자와 관련된 연구 등에 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로 이는 위치 특이적 핵산 알킬화제 등으로 개발되어 유전자 치료방법, 안티센서 및 안티진(antigene)에 응용될 수 있다.In addition, the pyrrolidine compound of the present invention is biologically important and can be easily combined with oligonucleotides, peptide analogues and cholesterol, which are substances capable of binding site-specifically with nucleic acids, . Specifically, it is developed as a site-specific nucleic acid alkylating agent and can be applied to a gene therapy method, an anti-sensor, and an antigene.
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