KR19980020710A - 간세포 보호활성을 가지는 약학적 제제 및 그 제조방법 - Google Patents

간세포 보호활성을 가지는 약학적 제제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 삼백초를 알코올, 물 또는 이들의 혼합물로 추출하고 건조시켜서 제조된 엑기스 또는 이 엑기스로부터 단리된 화합물 A를 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 약학적 제조방법으로 제조된 약학제 제제에 관한 것이며, 이 약학적 제제는 탁월한 간세포 보호활성을 가진다.

Description

간세포 보호활성을 가지는 약학적 제제 및 그 제조방법
제1도는 갈락토사민-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GPT에 대한 화합물 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 효과를 나타낸 그래프,
제2도는 갈락토사민-독성유도 일차 배양한 랫트 간세포에서의 SDH에 대한 효과를 나타낸 그래프,
제3도는 CCl4-독성유도 일치배양한 랫트의 간세포에서 GPT 및 SDH에 대한 화합물 (Ⅰ)의 효과를 나타낸 그래프,
제4도는 CCl4-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GPT 및 SDH에 대한 화합물 (Ⅱ)의 효과를 나타낸 그래프,
제5도는 CCl4-독성유도 일차 배양한 랫트의 간세포에서 GST에 대한 화합물 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 효과를 나타낸 그래프,
제6도는 CCl4-독유도 일차 배양한 랫트의 간세포에서 GSH에 대한 화합물 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 효과를 나타낸 그래프,
제7도는 CCl4-독성유도 일차 배양한 랫트의 간세포에서 GSSG에 대한 화합물 (Ⅰ) 및 (Ⅱ)의 효과를 나타낸 그래프.
제8도는 CCl4또는 GaIN-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GST에 대한 삼백초 엑기스의 각 분획의 효과를 나타낸 그래프.
제9도는 CCl4또는 GaIN-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GSP에 대한 삼백초 엑기스의 물층 분획의 효과를 나타낸 그래프.
제10도는 CCl4또는 GaIN-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GPT에 대한 삼백초 엑기스의 HP2 분획의 효과를 나타낸 그래프,
제11도는 CCl4또는 GaIN-독성유도 일차배양한 랫트의 간세포에서 GPT에 대한 삼백초의 V분획을 다시 분획한 분획의 효과를 나타낸 그래프,
제12도는 화합물 (Ⅰ)의 FAB MS 스펙트럼을 나타낸 그래프,
제13도는 화합물 (Ⅰ)의 IR 스펙트럼(KBr),
제14도는 화합물(Ⅰ)의 UV 스펙트럼,
제15도는 화합물 (Ⅰ)의1H-NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d6),
제16도는 화합물 (Ⅰ)의13C-NMR 스펙트럼(100-MHz, DMSO-d6),
제17도는 화합물 (Ⅰ)의 FAB MS 스펙트럼,
제18도는 화합물 (Ⅱ)의 IR 스펙트럼(KBr),
제19도는 화합물 (Ⅱ)의 UV 스펙트럼,
제20도는 화합물 (Ⅱ)의1H-NMR 스펙트럼(300 MHz, DMSO-d6)
제21도는 화합물 (Ⅱ)의13C-NMR 스펙트럼(100 MHz, DMSO-d6).
본 발명은 간세포 보호활성을 가지는 약학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
한국인은 간염 및 간 경화증을 비롯한 각종 간장 질환의 발병율이 매우 높아 치료효과가 우수한 새로운 간장 질환 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 새로운 간장 질환 치료제의 개발은 여러 각도에서 시도될 수 있겠으나 천연물에서부터 찾는 방법이 지름길이라고 생각된다. 이는 이미 한약이나 민간약의 형태로 천연물을 질병 치료에 수 천년동안 사용하여 왔기 때문이다.
천연물에서부터 간장 보호 활성을 갖는 성분을 추적, 분리하기 위하여서는 적절한 검색방법의 확립이 우선 요구된다. 이에 본 연구에서는 간장 보호 활성을 갖는 물질의 검색법으로 일차배양한 랫트의 간세포를 대표적인 간독성 유발 물질로 알려진 CCl4나 D-갈락토사민(D-galactosammne)으로 처리하여 인위적으로 독성을 유발시킨 후 시료를 투여하여 간세포 독성의 유발을 차단시키거나 회복시키는 물질을 찾는 방식을 택하였다. 일차 배양한 간세포계는 생체와 동일한 세포 구성을 가지며 간의 주요한 기능인 약물의 대사능을 그대로 보유하므로 실험동물을 대체하여 연구에 응용할 수 있는 장점을 가지고 있다[Itokawa, H., Mortita, H., Katow, I., Takeya, K., Cavalheiro, A., J., Oliveora, R. C. B., Ishige, M. and Motidome, M.(1988) Planta Medica, 27,311].
간세포 독성 유발 물질로 사용한 갈락토사민(galactosamine)은 간세포에서의 단백질과 RNA 생합성을 억제함으로써 궁극적으로 간세포의 괴사를 초래하며 그 증상이 viruls 감염에 의한 간염과 유사하다[Keppler, D., Lesch, R., Reutter, W., and Decker, K.(1986)Exp. Mol.Pathol., 9, 279; Keppler, D. and Decker, K. (1969) Eur. J. Biochem., 10, 219; Mofty, E. I., Scrutton, M. C., Serroi, A., Nicolini, C. and Farber, J. L.(1975) Am. J. Pathol., 79, 579; Bachmann, W., Harms, E., Hassels, B., Jenninger, H. and Reulter, W.(1977) Biochem. J., 166, 455]. 또한 CCl4는 프리래디칼(free radical)을 형성하여 간세포막 지질의 과산화를 일으킴으로써 간세포의 괴사를 초래한다[Mourelle, M., Amezcua, J. L. and Hongn, E.(1987) Prostaglandins, 33, 869; Azri, S., Mata, H. P., Reid, L, L., Gandolfi, A. J. and Brendel, K. (1992) Toxicol. Appl. Pharmacolol., 112, 81; Mary, O. A. Doull, J. and Klassen C. D. (1991) Casarett Doull's Toxicology; Cehenry, R., George, M. and Krishna, G.(1981) Toxicol. Appl. Pharmcol., 60, 241].
본 연구에서는 갈락토사민(galactosamine)나 CCl4각각으로 독성을 유발시킨 일차 배양한 랫트의 간세포계를 이용하여 천연물의 간세포 보호 활성 유무를 검색한 결과 삼백초가 유의성 있는 간세포 보호 활성을 나타냄을 확인하였다. 삼백초(Saururus chinensis)는 삼백초과(Saururuceae)에 속하는 다년생 초본으로 腫氣의 제거, 黃疸, 脚氣, 淋疾 및 梅毒 등의 치료에 민간에서 사용되어 왔다[中國本草圖錄, 中國本草圖錄 編輯委員會, 대만상무 인서관].
본 발명자들은 삼백초를 추출하여 얻어진 엑기스에 대하여 간세포활성의 여부를 검사한 결과 삼백초의 추출액은 간세포보호 활성을 가지는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 삼백초의 추출물을 유효성분으로 함유하는 간세포 보호활성을 가지는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 또한 이 삼백초 추출물을 더욱 분획하고 실제로 간세포 보호 활성을 가지는 유효 화합물을 단리하여 구조를 규명하였다.
따라서 본 발명의 또다른 목적은 이 단리된 유효화합물을 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 삼백초에서부터 간세포 보호 활성을 가지는 물질을 추적, 분리하고 분리된 성분은 UV, IR,1H-NMR,13C-NMR 및 MS 등의 기기분석을 통하여 그 구조를 규명하였다. 또한 분리한 성분에 대하여 간세포 보호 활성의 작용기전도 밝혔다.
본 발명에서 활성물질로 사용되는 물질은 다음의 스킴 Ⅰ 및 Ⅱ로 나타낸 공정도에 의하여 추출한다.
스킴 Ⅰ:
스킴 Ⅱ
*EFAW:초산에틸:개미산:초산:물
다음에 실시예 및 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
삼백초 엑기스의 제조:
삼백초(건조중량 9kg)을 80% 메탄올로 열탕 추출하고 그 추출액을 감압농축시켜서 삼백초의 총 메탄올추출 엑기스 900g을 얻었다.
[실시예 2]
삼백초(건조중량 9kg)을 70%에탄올로 열탕추출하고 그 추출액을 감압 농축시켜서 삼백초의 에탄올 추출엑기스 920mg을 얻었다.
[실시예 3]
삼백초(건조중량 9kg)을 물로 열시 추출하고 그 추출액을 감압농축시켜서 삼백초의 총 물추출액 950g을 얻었다.
[실시예 4]
1. 삼백초의 추출 및 화합물(compounds) Ⅰ, Ⅱ의 분리:
삼백초(건조중량 9kg)를 80% MeOH로 열탕 추출하고 그 추출액을 감압 농축하여 삼백초의 총 MeOH 엑기스를 얻은 후 스킴(scheme) Ⅰ과 같이 극성을 변화시키면서 분획하였다. 이 중 수층을 DIAOIN HP-20 수지를 충진시킨 칼럼(column)에 가한 후, H2O MeOH:H2O(1:1) 및 MeOH 3개의 전개용매를 순서대로 용출시켜 얻은 각각의 분획을 HP1, HP2 및 HP3이라 명명하였다(Scheme Ⅰ). 이 중 분획 HP2(16.3g)를 전개용매 CHCl3:MeOH(3:1, v/v)에서부터 점점 극성을 높여가면서 그래디언트 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(gradient silica gel column chromatography(6×150cm)를 실시하여 9개의 분획(Ⅰ-Ⅸ)을 얻었다. 분획 Ⅴ(9.5g)를 초산에틸:개미산:초산:물(ethyl acetate:formic acid:acetic acid:H2O)(100:2:2:5)의 혼합용매로 실리카겔 칼럼크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하여 9개의 소분획(ⅰ-ⅸ)으로 나누었다. 소분획 ⅲ(600mg)을 세파덱스 LH-20 칼럼크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography) 및 High performance liquid chromatigraphy(HPLC)를 실시하여 화합물(compound) Ⅰ(100mg) 및 Ⅱ(18mg)를 분리하였다. Sephadex LH-20 column chromatography는 MeOH를 유출용매로 사용하였으며, HPLC의 경우 μ-BondapakTMC18reverse phase column(7.8×300mm, 10μm)에 0.5% 초산:아세토니트릴(0.5% acetic acid:acetonitrile)(3:1, v/v)의 전개용매를 3ml/min의 유출속도로 사용하였고, UV detector(350nm)로 검색하였다(Scheme Ⅱ).
이러한 방법으로 얻은 각 분획 및 화합물은 동결 건조한 후, 완충액에 녹이거나, 녹지 않는 경우 디메틸설폭사이트(dimethyl sulfoxide)(DMSO)를 최종농도 0.1% 이하가 되도록 첨가하여 시료를 제조하였다.
2. 이화학적 분석
화합물(Compounds) Ⅰ 및 Ⅱ의 UV, IR1H-NMR,13C-NMR 및 FAB-MS 등의 스펙트럼 데이타(spectral data)를 분석하여 그 화학 구조를 결정하였다. 그 결과는 후에 설명하였다.
이 분석에 의하여 본원발명에서 본 발명의 화합물은 다음의 구조식 화합물 Ⅰ은 쿠에르세틴-3-O-β-D- 클루쿠로노피라조사이드 및 쿠에르세틴-3-β-O-글루쿠로노피라조실 메틸에스테르임이 밝혀졌다.
이들 화합물은 다음의 일반구조식 (A)로 나타낸다.
화합물 Ⅰ
쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드
(Quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranoside)
화합물 Ⅱ
쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노실 메틸에스테르
(Quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester)
[실험예 1:]
랫트의 간세포배양은 다음의 문헌에 기재된 방법으로 행한다.[Berry, M. N. and Freind, D. S. (1969) J. Cell Biol., 43, 5006; Crisp. D. M. and Pogson, C. I. (1972) Biochem., 126, 1009; and Kleiman, H. K., Mcgroodwin, E. B., Rennard, S. and Hartin, G. R. )1979) Anal. Biochem., 94, 308].
랫트를 우레탄(urethane)(1g/kg body weight)으로 마취시킨 다음 70% 에탄올로 복부를 소득한 후 개복하였다. 간문맥에 20 게이지 카데타(gauge catheter)를 삽관하고 15ml/min의 속도로 HBSS 150ml를 관류시키면서 하대 정맥을 잘라 혈액을 제거하였다. 흉강을 열어 하대 정맥에 18 게이지 카데타(gauge catheter)를 삽관한 다음 하대 정맥을 묶은 후 소화 용액을 재순환시켰다. 재순환은 37℃에서 CO2(5%)와 O2(95%)의 혼합기체를 공급해주면서 HBSS 95ml과 콜라게네이즈(collagenase)(final conc. 0.05%)로 구성된 소화용액으로 10분간 수행하였다. 간세포가 분리되면 간을 몸체에서 적출하여 비이커에 옮긴 다음 HBSS 60ml을 가한후 간막을 가위로 찢어서 간세포를 유리시킨 후 렌즈 페이퍼(lens paper)를 사용하여 여과하였다. 여과액은 50xg에서 2분간 원심분리한 다음 상등액을 버리고 다시 배양액으로 같은 조건에서 원심 분리한 후 간세포 현탁액을 얻었다. 간세포 현탁액은 5×105cells/ml의 농도로 콜라겐(collagen)이 도포된 배양 용기에 이식하였다. 배양액은 웨이머스 MB 752/ℓ배지(Waymouth's MB 752/ℓ medium), 10% 페탈 카프 시럼(fetal calf serum), 2.0mg/ml 보빈 시럼 알부민(bovine serum albumin(fraction V), 10-6M 덱사메타손(dexamethasone), 10-7M 인슈린(insulin), 5.32×10-2M L-serine, 4.07×10-2M NaHCO3, 10,000IU/100ml 페니실린(penicillin), 10,000μg/100ml 스트렙토마이신(streptomycin)과 50μg/100ml 암포테리신(amphotericin) B로 구성된 배양액을 사용하였다. 일정한 습도를 유지하는 37℃ 배양기에서 공기(95%)와 CO2(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다.
2. D-칼락토사민(D-galactosamine)에 의한 간세포 독성 유도:
이 방법은 Kiso, Y., Tohkin, M. and Hikino, H. (1983) J. Nat. Prod., 46, 841에 기재된 방법으로 행한다.
간세포를 배양한지 1.5시간이 지난 후 배양액을 1.5mM 갈락토사민(galactosamine)을 함유한 배양액으로 갈아준 다음 다시 14시간 동안 배양하여 간세포 독성을 유도하였다.
3. CCl4에 간세포 독성 유도:
이 방법은 Kiso, Y., Tohkin, M. and Hikino, H. (1983) Planta Medica, 49, 222에 기재된 방법으로 행한다.
간세포를 24시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 10mM CCl4를 함유한 배양액으로 갈아준 다음 1.5시간 동안 더 배양하여 간세포 독성을 유도하였다.
4. 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미네이스(Glutamate pyruvate transaminase)(GPT) 측정:
이 방법은 Reitman, s. and Frankel, S. (1957) Am. J. Cli. Patholol., 28, 56.에 기재된 방법으로 행한다.
세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 GPT의 활성을 라이트만-프랑켈(Reitman-Frankel)의 방법을 이용하여 측정하였다.
5. 솔비톨 데하이드로지네아스(Sorbitol dehydrogenase) 활성 측정:
이 방법은 Gerlach, U.(q965) Sorbitol dehydrogenase, In:Bergmeyer, H. U., eds, Method in Enzymology. NY.:Elsevier. pp 761-767에 기재된 방법으로 행한다.
세포 독성이 유도된 간세포의 배양액을 취하여 게르라하(Gerlach)의 방법을 약간 수정한 방법으로 솔비톨 데하이드로지네이스(sorbitol dehydrogenase)의 활성을 측정하였다. 650μl 0.2M 트리에탄올아민 HCl 완충액(trieth anolamine HCl buffer)(pH7.4), 50μl의 NADH(23.3mg/4ml 탈이온수(deionized water))를 가하여 상온에서 30분간 방치하였다. 곧이어 300μl 4.0M 과당(fructose)을 첨가한 후 잘 섞은 다음 365nm에서 UV흡광도 변화를 측정하였다. 1분간의 흡광도 변화를 측정하여 SDH 단위(units)로 나타내었다.
6. 포스트 미토콘드리알 수퍼난트(Post mitochondrial supernatant)의 제조:
간세포를 배양한 후 배양용기의 배양액을 제거하고 3ml의 66mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)를 가하여 세포현탁액을 준비하였다. 이렇게 준비한 세포 현탁액을 15초간 균질화시킨 후 원심분리(12500g, 15min)하여 상등액을 Post mitochon drial supernatant로 이용하였다.
7. 글루타치온-S-트란스페레이스(Glutathione-s-transferase) 활성 측정:
이 방법은 Habig, W. H., Pabst, M. J. and Jakoby, W. B. (1974) J. Biol. Chem., 249, 7130에 기재된 방법으로 행한다.
간세포내의 글루타치온-S-트란스페레이스(glutathione-S-transferase)의 활성은 하비히(Habig) 등의 방법을 이용하여 측정하였다. 포스트 미토콘드리알 수퍼난트(Post mitochondrial supernatant을 GST활성 측정을 위한 검액으로 사용하였다. 50μl 굴루타치온(Glutathione)(30mM), 50μl 1-클로로-2,4-디니트로벤젠(1-chloro-2,4-dinitrobenzene)(30mM) 및 500μl 포타슘 포스페이트 완충액(potassium phosp hate buffer)가 담긴 시험관 600μl(포스트 미토콘드리알 수퍼난트(post-mitochondrial supernatant)를 가하여 잘 혼합한 후 즉시 340nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 즉 흡광도가 직선상으로 증가하는 부분을 5분간 측정하는데 이때 mg 단백질이 매분당 생성하는 생성물의 양이 활성을 나타내는 것으로 환산하였다.
8. 토탈 글루타치온(Total glutathione)(GSH 및 GSSG)의 함량 측정:
이 방법은 다음에 기재된 문헌방법으로 행한다[Prasada, R. S. K. and Harihara, M. M.(1991) Biochemical methods of studying hepatoxicity. In:Robert, G. M., Steadman, D. H. and Richard, J. B., eds. Hepatoxicology. Florida:CRC Press. pp 241-325].
0.3mM NADPH 700μl와 6mM DTNB 100μl를 포함하는 시험관에 포스트 미토콘드리알 수퍼난트(post mitochondrial supernatant) 200μl를 가한 후 30℃로 유지되는 항온조에 방치하였다. 여기에 50 units GSH 리덕테이스(reductase)/ml 용액 10μl 가하여 반응을 개시한 후 412nm에서 2분간 15초의 간격으로 흡광도의 증가를 측정하였다.
9. 글루타치온(Gluathione)(Oxidized form, GSSG)의 함량 측정:
이 방법도 8항에 기재된 방법으로 행한다.
포스트미토콘드리알 수퍼난트(Post mitochondrial supernatant) 100μl당 2μ실시예 의 2-비닐피리딘(2-vinylpyridine)을 가하고 1분간 격렬하게 반응시킨다. 25℃에서 60분 방지하여 GSH의 유도체가 형성된 GSH의 함량을 측정하는 방법으로 남아있는 GSSG의 양을 측정하였다.
10. GSSG reductase의 활성 측정:
이 방법은 Carberg, I. and Mannervik, B. (1975) J. Biol Chem., 250, 5475에 기재된 방법으로 행한다.
인산염완충액(Phosphate buffer) 600μl, 100mM GSSG 100μl, 1mM NADPH 100μl를 포함하는 시험관에 포스트 미토콘드리알 수퍼난트(post mitochondriral supernatant) 200μl를 가한 후 340nm에서 2분간 흡광도의 변화를 측정하였다.
[실험예 2:]
급성독성 실험
경구투여:ICR 마우스(25±5g)를 10마리씩 5군으로 나누어 화합물 Ⅰ과 Ⅱ를 각각 1, 5, 25, 125, 625mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성 여부를 관찰하였다.
복강투여:ICR 마우스(25±5g)를 10마리씩 4군으로 나누어 화합물 Ⅰ과 Ⅱ를 각각 0.2, 2, 20, 200mg/kg의 용량을 경구투여한 후 24시간 후 독성 여부를 관찰하였다.
통계처리
통계적 유의성의 검토는 대조치로부터의 변동을 아노바 테스트(ANOVA test)로 하였다. p값이 5% 미만일 때 유의성이 있다고 판정하였다.
3. 삼백초로부터 간세포 보호 활성을 갖는 성분의 분리
간세포 보호 활성을 나타낸 삼백초를 스킴(scheme) 1과 같이 분획하여 n-헥산, CH2Cl2, n-부탄올 및 물 분획을 얻었다. 이 분획들 중에서 어느 분획이 간세포 보호 활성을 나타내는지 알아보기 위하여 D-갈락토사민(D-galactosamine)과 CCl4각각으로 독성을 유발시킨 일차배양 랫트의 간세포에 각각의 분획물을 100μg/ml의 농도로 투여하였을 때 분획이 유의성 있는 간세포 보호 활성을 나타내었다. 즉 간세포 손상으로 인하여 배양액중으로 유리되는 GPT 값을 유의성있게 감소시켰다. 간세포 보호 활성을 나타낸 물분획을 DIAOIN HP-20 resin을 이용하여, H2O, MeOH:H2O(1:1) 및 MeOH 3개의 전개용매로 용출시켜, HP1, HP2 및 HP3 등의 분획을 얻었고 이들 분획들의 간세포 보호 활성을 알아본 결과 HP2가 갈락토사민(galactosamine) 및 사염화탄소로 유발된 독성에 대하여 각각 60% 및 45%의 간세포 보호 효과를 나타내었다.
이에 D-갈락토사민(D-galactosamine) 및 CCl4로 유발된 간세포 독성을 유의성있게 회복시킨 분획 HP2를 선택하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 실시하여 9개의 소분획(Ⅰ-Ⅸ)으로 나누었다. 이를 소분획(Ⅰ-Ⅸ)의 간세포 보호 활성을 검색한 결과 소분획 Ⅴ에서 유의성있는 간세포 보호 활성을 나타내었다.
간세포 보호 활성을 나타낸 소분획 Ⅴ를 초산에틸:개미산:초산:물(ethyl acetate:formic acid:acetic acid:water)(10:2:2:5)를 전개용매로 이소크래틱 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(isocratic silica gel chromatography)를 수행하여 9개의 소분획(ⅰ-ⅸ)을 얻었다. 이들 소분획의 활서을 측정한 결과 소분획 ⅲ이 사염화탄소 및 갈락토사민(galactosamine)으로 유발시킨 독성에 대하여 각각 85% 및 67%의 유의성있는 활성을 나타내었다.
소분획 ⅲ(600mg)을 다시 메탄올을 유출용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography)를 실시한 후 high performance liquid chroamtography(HPLC)를 실시하여 화합물 Ⅰ(100mg) 및 Ⅱ(18mg)를 분리하였다.
4. Compound Ⅰ의 구조 결정
황색침상결정(form MeOH)
m.p. 193-195℃
UV λmax(MeOH)nm:258, 358
UV λmax(MeOH+NaOMe)nm:270, 404
UV λmax(MeOH+AlCl3)nm:262, 426
UV λmax(MeOH+AlCl3+HCl)nm:266, 420
UV λmax(MeOH+NaOAc)nm:264, 382
UV λmax(MeOH+NaOAc+H3BO3)nm:262, 378
IR νmax(KBr)cm-1:3320(phenolic OH), 1660(α, β-unsaturated ketone), 1620, 1570
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6):δ 3.20-3.63(sugar protons), 5.54(1H,d,J=7.2Hz, 1-H),
6.25(1H,d,J=2.1Hz-6-H), 6.45(1H,d,J=2.1Hz, 8-H), 6.88(1H,d,J=8.4Hz,5'-H), 7.59(1H,
d,J=3Hz,2'-H), 7.64(1H,dd,J=3, 8.4Hz,6'-H), 12.57(1H,s,5-OH)
13C-NMR(100MHz,DMOS-d6):71.40(C-4), 73.83(C-2), 75.83(C-3), 75.94(C-5)
93.62(C-8), 98.80(C-6), 101.25(C-1), 103.87(C-10), 115.23(C-5'), 116.23(C-2')
120.82(C-1'), 121.61(C-6'), 133.16(C-3), 144.92(C-3'), 148.62(C-4'), 156.28(C-2),
156.34(C-9), 161.18(C-5), 164.25(C-7), 170.01(C-6), 177.22(C-4)
Positive FAB MS m/z:479([M+H], 15.0), 303(4.9).
이상의 spectral data를 근거로 화합물 Ⅰ를 쿠에르세틴-3-O-베타-d글루쿠로노피라노사이드(quercetin-3-O-β-D- glucuronopyranoside)로 추정하였으며 문헌치[Gerhardt, G., Sinnwell, V. and Kraus, L. J. (1989) PlantaMedical) 55, 520]와 비교하여 동정하였다.
5. Compound Ⅱ의 구조 결정
Yellowish needle from MeOH
m.p. 214℃
UV λmax(MeOH)nm:258, 358
UV λmax(MeOH+NaOMe)nm:270, 408
UV λmax(MeOH+AlCl3)nm:270, 418
UV λmax(MeOH+AlCl3+HCl)nm:268, 396
UV λmax(MeOH+NaOAc)nm:270, 406
UV λmax(MeOH+NaOAc+H3BO3)nm:262, 374
IR νmax(KBr)cm-1:3320(phenolic OH), 1660(α, β-unsaturated ketone), 1570
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6):δ 3.20-3.63(sugar protons), 5.54(1H,d,J=7.2Hz, 1-H),
6.23(1H,j,J=2.1Hz-6-H), 6.43(1H,d,J=2.1Hz, 8-H), 6.88(1H,d,J=8.4Hz,5'-H), 7.54(1H,
d,J=3Hz,2'-H), 7.62(1H,dd,J=3, 8.4Hz,6'-H), 12.54(1H,s,5-OH)
13C-NMR(100MHz,DMOS-d6):71.62(C-4), 72.39(C-2), 73.97(C-3), 75.83(C-5)
3.97(C-8), 99.14(C-6), 101.53(C-1), 104.00(C-10), 115.41(C-5'), 116.24(C-2')
121.07(C-1'), 121.95(C-6'), 133.28(C-3), 145.15(C-3'), 148.89(C-4'), 156.56(C-2),
156.69(C-9), 161.36(C-5), 164.82(C-7), 169.23(C-6), 177.28(C-4)
Positive FAB MS m/z:493([M+H], 5.3), 303(8.6).
이상의 spectral data를 근거로 compound Ⅱ를 quercetin-3-O-β-D-glucuronopyranoside methyl ester로 추정하였으며 문헌치[Gerhardt, G. Sinnwell, V. and Kraus, L. J. (1989)Planta Medica 55, 520]와 비교하여 동정하였다.
이들 데이타에 대한 각각의 스펙트럼은 제12도 내지 21도에서와 같다.
6. 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 간세포 보호 활성
삼백초 추출물 엑기스 화합물(compounds) Ⅰ 및 Ⅱ의 간세포 보호활성을 알아보기 위하여 사염화탄소 및 갈락토사민(galactosamine) 각각으로 독성을 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 간세포에 삼백초 추출물 엑기스의 각 획분을 각각 10μg, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 각각 2μM에서부터 200μM까지 농도를 증가시켜 투여한 후 그 효과를 측정하였다.
간세포 독성이나 보호 활성은 간세포에 존재하는 여러 효소들을 측정함으로써 판단하였다. 그루타믹 피루빅트랜스페라제(Glutamic pyruvic transaminase(GPT)) 및 솔비톨 데하이드로가나제(gorbitol dehydrogenase(SDH))등은 다른 장기보다 간세포에 선택적으로 존재하는 효소들로 간세포에 독성이 유발되면 세포막의 손상으로 인하여 간세포내에서 배양액중으로 유리되는 효소의 양이 증가하므로 간세포 독성 및 그 보호효과를 측정하는 데 많이 이용되고 있다.
또한 간세포가 손상되면 세포내의 대사효소들이 감소되므로 독성으로 인하여 감소된 이들 효소들을 증가시키는 물질은 일단 간세포 보호 활성을 갖는 것으로 추정할 수 있으므로 이들 효소의 양을 간세포 활성의 지표로 삼고 있다.
본 연구에서는 배양액 중으로 유리되는 GPT, SDH 및 간세포내에 존재하는 여러 효소들 즉, 해독작용에 관여하는 글루타치온-S-트랜스페라제(glutathioe-S-transferase), 자유기 생성의 억제 및 생성된 자유기의 제거에 관여하는 글루타치온 리덕타제(glutathione reductase)의 활성을 측정하고 자유기로 인한 글루타치온(glutathione)의 양 등을 측정하여 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 간세포 보호 효과를 판단하였다.
7. 갈락토사민(Galactosamine)으로 유발시킨 독성에 대한 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 간세포 보호효과:
1) 보호 효과:
GPT 및 SDH는 간세포에서 배양액 중으로 유리되는 효소로 간세포가 독성을 입으면 간세포 막이 손상되어 배양액 중으로 유리되는 효소의 양이 증가하게 되며 따라서 배양액 중의 효소의 양을 감소시키는 물질은 간세포 보호 활성을 갖는다고 판단할 수 있다.
삼백초 추출물 엑기스의 농도를 각각 100μg/ml, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 농도를 각각 2μM에서부터 200μM까지 증가시켜 갈락토사민(galactosamine)으로 독성을 유발시킨 일차배양한 랫트의 간세포에 투여하였을 때 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ는 2μM에서부터 200μM까지 농도의존적으로 배양액 중으로 유리되는 GPT 및 SDH의 활성을 감소시켰으며 200μM의 농도에서 가장 높은 간세포 보호 활성을 나타내었다. 독성을 입히지 않은 정상상태의 GPT 또는 SDH의 값을 100%로 하고 갈락토사민(galactosamine)으로 독성을 입히고 삼백초 추출물 분획, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 투여하지 않은 경우의 GPT 또는 SDH의 값을 0%로 하여 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 독성 회복 효과를 상대적으로 보호(protection)(%)으로 나타내었을 때 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ 모두 200μM의 농도에서 가장 높은 간세포 보호 활성을 나타내어 배양액 중으로 유리되는 GPT 및 SDH를 화합물 Ⅰ은 정상상태 때의 65% 및 97% 수준으로, 화합물 Ⅱ는 정상상태의 75%, 91% 수준으로 유지시키는 독성 회복 효과를 나타내었다(Figs. 1 and 2).
2) 사염화탄소로 유발시킨 독성에 대한 삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 간세포 보호
효과:
(1) 배양액중으로 유리되는 GPT 및 SDH에 대한 효과:
삼백초 추출물 엑기스 100μg/ml, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ을 각각 100, 200μM의 농도로 사염화탄소로 독성을 유발시킨 일차배양한 랫트의 간세포에 투여하여 그 효과를 알아보았다. 독성을 입히지 않은 정상상태 GPT 또는 SDH의 값을 100%로 하고 사염화탄소로 독성을 입히고 삼백초추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 투여하지 않은 경우의 GPT 또는 SDH의 값을 0%로 하여 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 독성 차단 효과를 상대적인 보호(protection)(%)으로 나타내었을 때 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ 모두 200μM의 농도에서 가장 높은 간세포 보호 활성을 나타내어 배양액 중으로 유리되는 GPT 및 SDH를 화합물 Ⅰ은 정상상태 9의 79% 및 76% 수준으로, 화합물 Ⅱ는 정상상태 때의 83%, 84% 수준으로 유지시키는 독성 회복 효과를 나타내었다(Figs. 3 and 4).
(2) 간세포 내에 존재하는 글루타치온-S-트랜스페라제(Glutathione-S-transferase)에 대한 영향
GST는 간의 세포질에 주로 존재하는 가용성 단백질로 생체내 이물질의 대사와 배설에 중요한 역할을 하는 효소이다[Musukawa, T. and Iwat, H. (1986) Biochem. Pharmacol., 35, 435; Peter, C. S. and David, L. V. (1980) J. Boil. Chem., 255, 4740; and Boyer, T. D., Vessey, D. A., Holcomb, C. and Saley, N.(1984) Biochem. J., 217, 179] GST의 작용은 크게 촉매(catalysis)와 결합(binding)으로 나뉜다. 촉매기능은 대사에 관여하는 것으로 GST는 생체내 글로타치온(glutathion)(GSH)의 SH 관능기와 친전자기(electrophile)과의 콘주게이션(conjugation)을 촉매하여 수용성을 증가시키며 이렇게 수용성이 증가된 GSH-conjugate는 그대로 배설되거나 머캅튜릭 산(mercapturic acid)로까지 한단계 더 대사되어 배설된다. 또다른 기능으로 GST는 GSH와 내인성, 외인성 물질을 결합시킨다. GST는 용해도가 낮은 소수성(hydrophobic)인 물질과 GSH를 결합시켜 용해도를 증가시킴으로써 생체내 저장과 세포내 이동, 그리고 체외로의 배설을 가능하게 한다. 빌리루빈(Bilirubin)은 그 대표적인 물질로 GSH와 결합함으로써 용해도가 증가되어 생체내에서 결정으로 석출되지 않고 존재하게 되며, 체외로의 배설도 GSH와 결합한 것이 담즙으로 이동하면서 배설된다. 담즙산(Bile acid)는 GST의 작용을 억제하며 따라서 콜레스타시트(cholestasis)의 경우 친전자기(electrophile)의 독성은 더욱 증가된다[Donald, A. V. and David, Z. (1981) Biochem. J., 197, 321]. 이처럼 GST는 독성물질을 대사하여 무독화시키는 효소로 GST 활성의 증가는 생체내 해독작용 능력의 증가를 의미하므로 GST 활성을 증가시키는 물질은 간보호 효과가 있다고 판단할 수 있다. 사염화탄소로 독성을 유발시킨 간세포의 경우 GST의 활성은 현저하게 감소하여 정상 간세포의 30% 수준까지 저하되었다. 이렇게 저하된 GST의 활성은 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 각각 100, 200μM의 농도로 투여하였을 때 그 활성이 증가되었으며 200μM의 농도에서 더욱 뛰어난 활성을 나타내었다. 즉, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ는 200μM의 농도에서 사염화탄소에 의하여 감소된 GST의 양을 각각 정상상태 때 GST 활성의 69%, 89% 수준까지 유지시킴을 알 수 있었다(Fig. 5).
(3) 간세포내에 존재하는 GSH에 대한 영향:
GSH는 L-감마-글루타민-L-시스테이닐-글라이신(L-γ-glutamyl-L-cyteinyl-glycine)으로 구성되어 있으며 2GSH↔GSSG로 평형을 이루고 있다. 그러나 GSSG의 양은 GSH양의 약 1-3%에 지나지 않으며 대부분 GSH 형태로 존재한다.
GSH의 cytosolic pool의 85%는 헤파토셀룰라(hepatocellular) GSH이며 미토콘드리알(mitochondrial) GSH가 15%를 이루고 있어 간세포내의 GSH의 역할은 매우 중요하다. GSH는 산화성 스트레스(oxidative stress)를 받으면 GSSG로 변하며, GSH가 고갈되면 지질과산화가 진행된다. 따라서 GSH의 감소는 산화성 스트레스(oxidative stress)의 지표가 된다[richard, O. R., Eric, A. G. and Robert, S. B. (1991) Free radical damage and lipid peroxidation. In: Robert. G. M., Steadman, D. H. ad Rochard, J. B., des. Hepatoxicology. Florida, CRC Press. pp 401-436]. 사염화탄소로 독성을 유발시킨 간세포의 경우 ·CCl3으로 인하여 간세포내의 GSH는 현저히 감소하였다. 그러나 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 각각 100, 200μM의 농도로 투여한 경우 감소되었던 GSH의 양이 회복되었으며 200μM의 온도에서 각각 정상상태 때의 GSH의 양이 46%, 52%까지 회복시켰다(Fig. 6).
(4) 간세포내에 존재하는 GSSG reductase에 대한 영향:
위에서 언급하였듯이 GSH의 감소 즉, GSSG의 증가는 산화성 스트레스(oxidative stress)를 의미하며 GSH가 고가되면 저질과산화가 진행됨로 GSH의 양을 유지시키는 것은 매우 중요하다. 산화되어 생성된 GSSG는 정상상태에서 다시 GSH로 환원되는데 이 때 관여하는 것이 GSSG 리닥타제(reductase)이다. GSSG reductase는 NADPH-의존성(dependet)이며 GSSG를 GSH로 바꾸어 생체내 GSH의 양을 유지시키는 역할을 한다. 따라서 GSSG reductae의 감소는 GSSG를 GSH로 환원시키지 못함을 의미하며 결국 GSH의 감소를 유발한다[RICHARD, O, R., Eric, A. G. and Robert, S. B. (1991) Free radical damage and lipid peroxidation. In: Rpbert, G. M., Steadman, D. H. and Richard, J. B., eds. Hepatoxicology. Florida, CRC Press. pp 401-436]. 사염화탄소로 독성을 유발시킨 경우 간세포내의 GSSG reductase의 활성은 현저히 감소하였다. 감소된 GSSG reductase의 활성은 화합물 Ⅰ을 투여하였을 때는 큰 변화가 없었으나 화합물 Ⅱ를 투여하였을 때에는 그 활성이 증가하여 200μM의 농도에서 정상상태 때의 활성의 66% 수준까지 유지시켰다(Fig. 7).
(5) 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ의 급성독성 여부:
삼백초 추출물 엑기스, 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ를 경구 또는 복강으로 투여하여 급성 독성 여부를 관찰한 결과 실험기간내내 화합물 Ⅰ 및 Ⅱ 모두 사망예가 한마리도 없었으며 따라서 급성 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
8. 결론:
삼백초의 알콜 또는 물로 추출한 엑기스 및 이 엑기스로부터 단리된 화합물인 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드(Quercetin-3-O-β-D-glucurono pyranoside)와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르(quercetin-3-O-β-D-glucurono-pyranoside methyl ester)는 갈락토사민(galactosamine) 및 사염화탄소로 유발시킨 간독성에 대하여 독성 회복 및 차단 효과가 있음을 확인하였다. 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르의 간세포 보호 효과를 비교하였을 경우 거의 비슷한 효과를 나타내었으나 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르가 조금 더 뛰어난 활성을 나타내었으며 갈락토사민(galactosamine) 및 사염화탄소로 유발시킨 각각의 독성에 대하여 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 글루쿠로토피라노사이드 메틸에스테르 모두 200μM의 농도에서 가장 뛰어난 활성을 나타내었다. 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르의 간세포 보호 효과의 작용기전을 살펴보면 사염화탄소로 유발시킨 간독성의 경우 항산화효과보다는 해독작용에서 더욱 탁월하였다. 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르의 이러한 간세포 보호 효과를 이미 간장질환 치료제로 사용되고 있는 실릴마린(silymarin)의 주요 활성성분인 실릴빈(silybin)과 비교하였을 경우 실릴빈은 1000μM에서 가장 뛰어난 활성을 나타내었으며 따라서 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드와 쿠에르세틴-3-O-β-D-글루쿠로노피라노사이드 메틸에스테르는 실릴빈이 활성을 나타낸 농도의 1/5에 해당하는 낮은 농도에서 동등한 활성을 나타내었다.
이상에서 상세히 설명한 바와 같이 삼백초의 알코올 또는 물로 추출한 엑기스 및 이 엑기스로부터 단리된 화합물(A)는 탁월한 간세포 보호활성을 가진다.
따라서 삼백초 엑기스 및 이 엑기스로부터 단리된 화합물(A)는 간세포의 보호 및 치료제로 사용될 수 있다.
본 발명의 삼백초 엑기스는 일일 100mg 내지 5000mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다.
본 발명의 삼백초 엑기스에서 단리된 화합물 A는 일일 1mg 내지 500mg을 1 내지 3회 투여할 수 있다.
본 발명의 삼백초 엑기스 및 화합물 A는 통상으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제, 예를 들면 주사제, 액제, 시럽제, 정제, 캡슐제 등으로 제제화하여 약학적 제제를 제조할 수 있다.
[제조실시예]
다음에 제제실시예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
[제제실시예 1]
삼백초 엑기스 100mg
주사용 멸균증류수 적량
pH조절제적량
삼백초 엑기스를 주사용 증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH 약 7.6로 조절한 다음 전체를 2ml로 한 후 2ml 용량의 앰플에 충진하고 멸균하여 주사제를 제조한다.
[제제실시예 2]
화합물 Ⅰ2mg
주사용 멸균증류수적량
pH 조절제적량
화합물 Ⅰ을 주사용 멸균증류수에 용해하고 pH 조절제로 pH약 7.2로 조절되고 전체를 2ml로 한다음 2ml 용량의 앰플에 충진하여 주사제를 제조한다.
[제제실시예 3]
삼백초 엑기스200mg
유당100mg
전분100mg
스테아린산 마그네슘적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
[제제실시예 4]
화합물 Ⅱ100mg
유당100mg
전분50mg
스테아린산 마그네슘적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
[제조실시예 5]
삼백초 엑기스 100mg
유당50mg
전분50mg
탈크2mg
스테아린산마스네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제로 제조한다.
[제제실시예 6]
화합물 Ⅰ5mg
유당100mg
전분93mg
탈클2mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제로 제조한다.
[제제실시예 7]
삼백초 엑기스 1000mg
설탕20g
이성화당20g
레몬향적량
정제수를 가하여 전체 100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제좡법에 따라 혼합하고 100ml의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.
[제제실시예 8]
화합물 Ⅰ100mg
설탕20g
이성화당20g
레몬향적량
정제수를 가하여 전체100ml
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 100ml의 갈색병에 충진하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

Claims (2)

  1. 삼백초를 알코올, 물 또는 이들의 혼합물로 추출하고 건조시켜서 제조된 엑기스 또는 이 엑기스로부터 단리된 화합물 A를 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 제제의 제조방법으로 제제화시켜서 제조된 간세포의 보호활성 효과의 약학적 제제.
  2. 삼백초를 알코올, 물 또는 이들의 혼합물로 추출하고 건조시켜서 제조된 엑기스 또는 이 엑기스로부터 단리된 화합물 A를 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합하고 통상의 약학적 제제의 제조방법으로 제제화시켜서 간세포 보호활성을 가지는 약학적 제제를 제조하는 방법.
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KR20200012306A (ko) * 2018-07-26 2020-02-05 경희대학교 산학협력단 잣잎, 삼백초 및 구기자의 복합 추출물을 함유하는 간 질환 예방 및 치료용 약학 조성물

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