KR102684334B1 - Combination preparation for treating or preventing steatohepatitis, lipidosis, or fibrosis - Google Patents
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Abstract
본 개시는 2가지 유효 성분을 포함하는, 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료 또는 예방용 약학 제제에 관한 것이다. 즉, 본 개시는 복합 제제에 관한 것이다. 본 개시는 또한 병용 요법에 관한 것이다. 본 개시는 2가지 유효 성분을 병용하여 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료 또는 예방 효과를 시너지적으로 높일 수 있다는 점에 기초한다.The present disclosure relates to a pharmaceutical formulation for the treatment or prevention of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis, comprising two active ingredients. That is, the present disclosure relates to combination preparations. The present disclosure also relates to combination therapy. The present disclosure is based on the fact that the combined use of two active ingredients can synergistically increase the treatment or prevention effect of steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis.
Description
본 개시는 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료 또는 예방에 효과적인 약학 제제에 관한 것으로, 2가지 활성 성분을 포함하여 약리 효과가 향상된 복합 제제에 관한 것이다. 즉, 본 개시는 병용 요법(combination therapy)에 관한 것이다.The present disclosure relates to a pharmaceutical formulation effective for the treatment or prevention of steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis, and to a combination formulation containing two active ingredients with improved pharmacological effects. That is, the present disclosure relates to combination therapy.
비알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis)은 단순 지방증과 달리 팽창성 변성 (ballooning degeneration) 및 세포 사멸, 염증성 침윤 등의 병리학적 소견을 보이며, 경우에 따라 콜라겐 축적 등의 섬유화 소견을 보일 수도 있다. 단순 지방증이 느린 조직학적 진행을 보임에 반해 비알코올성 지방간염은 보다 빠른 조직학적 진행을 보이며 간경변으로 진행할 수 있음은 잘 알려져 있으며, 지방간으로 판명 받은 사람들 중 약 5-10%가 지방간염으로 판명된다 (Metabolism Clinical and Experimental 65 (2016) 1038-1048). Nonalcoholic steatohepatitis, unlike simple steatosis, shows pathological findings such as ballooning degeneration, cell death, and inflammatory infiltration, and in some cases, may show fibrosis such as collagen accumulation. It is well known that while simple steatosis shows slow histological progression, non-alcoholic steatohepatitis shows faster histological progression and can progress to cirrhosis. Approximately 5-10% of people diagnosed with fatty liver are diagnosed with steatohepatitis. (Metabolism Clinical and Experimental 65 (2016) 1038-1048).
현재 이러한 지방간염을 치료하기 위해 시판되고 있는 치료제는 없다. 치료제의 부재로 인해 복부비만, 고지혈증, 당뇨 등 다른 대사증후군 치료제들, 예를 들어, 인슐린 저항성 개선 약제, 항산화제(예를 들어, 비타민 C, E), 이상지질혈증치료제, 간장보호제 등이 사용되고 있으나, 이들은 비알코올성 지방간염의 직접적인 치료제라고 보기는 어렵다. Currently, there are no commercially available treatments to treat steatohepatitis. Due to the absence of a treatment, other treatments for metabolic syndrome such as abdominal obesity, hyperlipidemia, and diabetes, such as drugs to improve insulin resistance, antioxidants (e.g., vitamins C and E), drugs for dyslipidemia, and liver protectors, are being used. However, it is difficult to consider these as direct treatments for non-alcoholic steatohepatitis.
지방증은 지방간염과 구별되는 지질 대사 이상에 따른 병을 통틀어 이르는 용어이다. 주로, 뇌, 간, 비장 따위에 지질이 쌓여 치매, 운동 장애, 경련 따위를 일으킨다.Steatosis is a term that refers to diseases caused by abnormalities in lipid metabolism, which are distinct from steatohepatitis. Mainly, lipids accumulate in the brain, liver, and spleen, causing dementia, movement disorders, and convulsions.
한편, 조직 손상에 대한 세포 외 매트릭스 성분의 축적은 조직 복구에 필수적인 생리학적 과정이다. 불행히도, 손상(injury)을 악화시키는 만성 손상은 섬유아세포(fibroblast) 및 근섬유아세포(myofibroblast)에 의한 세포 외 매트릭스 성분의 과잉 생산을 유발한다. 이는 섬유질 결합 조직의 과도한 축적을 야기하고, 경우에 따라 이는 섬유증으로 알려진 병리학적 상태에 이르게 된다. Meanwhile, accumulation of extracellular matrix components in response to tissue damage is an essential physiological process for tissue repair. Unfortunately, chronic injury that exacerbates the injury causes overproduction of extracellular matrix components by fibroblasts and myofibroblasts. This causes excessive accumulation of fibrous connective tissue, which in some cases leads to a pathological condition known as fibrosis.
섬유증은 심장, 간, 폐, 골격근, 신장, 혈관 및 심장과 같은 다양한 기관에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 섬유증은 골격근 조직 (이영양성 근육 질환), 심장 및 혈관 조직 (심근 경색), 간 조직 (비알콜성 지방간 질환/간경변), 폐 조직 (특발성 폐 섬유증) 및 신장 조직 (만성 신장 질환/신장 섬유증)에서 나타날 수 있다.Fibrosis can affect various organs, such as the heart, liver, lungs, skeletal muscles, kidneys, blood vessels, and heart. For example, fibrosis occurs in skeletal muscle tissue (dystrophic muscle disease), heart and vascular tissue (myocardial infarction), liver tissue (non-alcoholic fatty liver disease/cirrhosis), lung tissue (idiopathic pulmonary fibrosis), and kidney tissue (chronic kidney disease). /renal fibrosis).
예를 들어, 신장 섬유증은 과잉 기질 합성(excess matrix synthesis), 수축 등을 포함하는 다양한 기전으로 인해 발생할 수 있다. Soma Meran 등은 신장 섬유증에 있어 섬유아세포와 근섬유아세포 관련 기전에 대해 설명하고 있다 ("Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis" Int J Exp Pathol. 2011 Jun; 92(3): 158-167.). For example, renal fibrosis can occur due to a variety of mechanisms, including excessive matrix synthesis, contractility, etc. Soma Meran et al. explain the mechanisms related to fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis ("Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis" Int J Exp Pathol. 2011 Jun; 92(3): 158-167.).
간 섬유증은 대부분의 만성 간 질환에서 발생하는 콜라겐을 포함한 세포 외 기질 단백질의 과도한 축적을 말한다. 간 섬유화에 관여하는 대표적인 세포는 간성상세포 (Hepatic stellate cell: HSC), 쿠퍼 세포 (Kupffer cell), 내피 세포 (Endothelial cell) 등이다. 간성상세포는 세포외 기질을 생산하는 주 생산원으로 활성화되면 근섬유아세포 유사형태 (myofibroblast-like phenotype)로 바뀌면서 세포증식의 증가, 교원질 (collagen type I and III)을 포함한 각종 세포외 기질의 생성 증가, 세포 수축성의 증가 등이 있게 된다. Liver fibrosis refers to the excessive accumulation of extracellular matrix proteins, including collagen, that occurs in most chronic liver diseases. Representative cells involved in liver fibrosis include hepatic stellate cells (HSC), Kupffer cells, and endothelial cells. Hepatic stellate cells are the main source of extracellular matrix production, and when activated, they change to a myofibroblast-like phenotype, resulting in increased cell proliferation and increased production of various extracellular matrixes, including collagen (collagen types I and III). , there is an increase in cell contractility, etc.
세포외 기질(extracellular matrix: ECM)의 과다한 축적으로 정의되는 조직 섬유화는 다양한 원인에 의한 폐 질환에서도 관찰되는 공통적인 병리소견이다. 폐 섬유증에서는 폐 섬유아세포(lung fibroblast)가 근 섬유아세포 표현형으로 변화되고, 근섬유아세포의 표현은 폐 섬유화가 진행되는 부위에서 상향조절되고 지속적으로 표현된다. Tissue fibrosis, defined as excessive accumulation of extracellular matrix (ECM), is a common pathological finding observed in lung diseases caused by various causes. In pulmonary fibrosis, lung fibroblasts change to a myofibroblast phenotype, and the expression of myofibroblasts is upregulated and continuously expressed in areas where lung fibrosis is progressing.
한편, 2가지 약물을 조합하여 투여하는 병용 요법(combination therapy)의 경우 그 효과를 예측하기가 실질적으로 불가능하다. 예를 들어, 많은 경우에 있어 2가지 약물의 병용 투여 시 1가지 약물을 증량해 단독 투여하는 경우보다 그 효과가 높아지지 않는다. 다만, 이러한 병용 투여로 각 약물의 투여 용량을 낮출 수 있는 등 여러 측면의 장점이 있어 복합 제제에 대한 연구는 절실히 필요한 상황이다.Meanwhile, in the case of combination therapy, in which two drugs are administered in combination, it is practically impossible to predict the effect. For example, in many cases, when two drugs are administered together, the effect is not higher than when one drug is administered alone in increased doses. However, such combination administration has several advantages, such as lowering the dosage of each drug, so research on combination preparations is urgently needed.
본 개시가 해결하고자 하는 과제는 2가지 이상의 유효 성분을 사용하여 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 개선 또는 예방 효과가 더욱 높아진 약학 제제를 제공하는 것이다. The problem that the present disclosure aims to solve is to provide a pharmaceutical formulation with a further enhanced effect of treating, improving, or preventing steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis by using two or more active ingredients.
즉, 본 개시가 해결하고자 하는 과제는 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 개선 또는 예방용 복합 제제를 제공하는 것이다. That is, the problem to be solved by the present disclosure is to provide a combination preparation for treating, improving or preventing steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis.
본 개시가 해결하고자 하는 다른 과제는 2가지 이상의 유효 성분의 치료적으로 유효한 양을 동시에 또는 순차적으로 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공하는 것이다.Another problem that the present disclosure aims to solve is the treatment, improvement or prevention of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis, which involves administering a therapeutically effective amount of two or more active ingredients simultaneously or sequentially to an individual in need of treatment. It provides a method.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 개시는 유효 성분으로 (i) 하기 화학식 1의 pyrimidine-4-carboxamide 화합물 및 (ii) 하기 화학식 2로 표시되는 페노피브릭 산(fenofibric acid), 이의 프로드럭 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는, 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료 또는 예방용 약학 제제를 제공한다.In order to solve the above problem, the present disclosure includes (i) a pyrimidine-4-carboxamide compound of Formula 1 below and (ii) fenofibric acid, a prodrug thereof, or a prodrug thereof of Formula 2 below as active ingredients. Provided is a pharmaceutical preparation for the treatment or prevention of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis, which is characterized in that it contains a pharmaceutically acceptable salt.
[화학식 1][Formula 1]
[화학식 2][Formula 2]
상기 화학식 1의 화합물은 비알콜성 지방간염 등의 예방 및 치료 용도로 개발된 화합물이다 (대한민국 등록특허 제10-2177304호 참조). 페노피브릭 산(fenofibric acid), 이의 프로드럭(예를 들어, 이소프로필 에스테르 형태의 프로드럭인 페노피브레이트 (Fenofibrate)) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(예를 들어, 콜린 염(choline salt))은 PPAR-alpha의 활성제로서, 아포지질단백질 CIII의 기능을 억제하고 아포지질단백질 AI의 기능을 증가시켜 TG와 LDL 수치를 낮추고 HDL 수치를 증가시키는 고지혈증 및/또는 이상지질혈증 치료제로 알려져 있다. The compound of Formula 1 is a compound developed for the prevention and treatment of non-alcoholic steatohepatitis (see Korean Patent No. 10-2177304). Fenofibric acid, a prodrug thereof (e.g., Fenofibrate, a prodrug in isopropyl ester form), or a pharmaceutically acceptable salt thereof (e.g., choline salt) is an activator of PPAR-alpha, and is known as a treatment for hyperlipidemia and/or dyslipidemia that lowers TG and LDL levels and increases HDL levels by suppressing the function of apolipoprotein CIII and increasing the function of apolipoprotein AI.
본 발명자들은 (i) 상기 화학식 1의 화합물 및 (ii) 페노피브릭 산, 이의 프로드럭, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염(이하, '페노피브레이트계 약물'로 명명함)을 병용할 경우 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 예방 또는 개선에 있어 효과가 현저히 상승한다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors have found that when (i) the compound of Formula 1 and (ii) fenofibric acid, a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof (hereinafter referred to as 'fenofibrate-based drug') are used together, steatohepatitis , the present invention was completed by confirming that the effect in treating, preventing or improving steatosis and/or fibrosis is significantly increased.
본 개시는 또한 상기 화학식 1의 화합물의 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양 및 페노피브레이트계 약물의 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양을 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 개선 또는 예방이 필요한 개체에게 동시에, 연속하여, 또는 순차적으로 투여하는 것을 특징으로 하는, 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증 치료, 개선 또는 예방 방법을 제공한다. 상기 개체는 포유동물을 포함하며, 바람직하게 인간이다. 즉, 본 개시는 본 개시에 따른 복합 제제 또는 병용 요법의 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료, 개선 또는 예방의 의학적 용도를 제공한다.The present disclosure also provides a therapeutically or prophylactically effective amount of the compound of Formula 1 and a therapeutically or prophylactically effective amount of the fenofibrate-based drug for treatment, improvement or prevention of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis. A method for treating, improving or preventing steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis is provided, which is characterized in that it is administered to a subject simultaneously, sequentially or sequentially. The subject includes a mammal and is preferably a human. That is, the present disclosure provides medical use of the complex preparation or combination therapy according to the present disclosure for the treatment, improvement or prevention of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis.
일 양태에 있어, 본 개시에 따른 복합 제제 또는 병용 요법이 치료, 개선 또는 예방하고자 하는 의약 용도는 지방간염이다. 바람직하게, 지방간염은 비알콜성 지방간염이다. 더욱 바람직하게, 지방간염은 간 섬유화가 수반된 비알콜성 지방간염이다.In one aspect, the medicinal use that the combination preparation or combination therapy according to the present disclosure is intended to treat, improve or prevent is steatohepatitis. Preferably, the steatohepatitis is non-alcoholic steatohepatitis. More preferably, the steatohepatitis is non-alcoholic steatohepatitis accompanied by liver fibrosis.
다른 양태에 있어, 본 개시에 따른 복합 제제 또는 병용 요법이 치료, 개선 또는 예방하고자 하는 의약 용도는 지방증이다. In another embodiment, the medicinal use that the combination preparation or combination therapy according to the present disclosure is intended to treat, improve or prevent is steatosis.
또 다른 양태에 있어, 본 개시에 따른 복합 제제 또는 병용 요법이 치료, 개선 또는 예방하고자 하는 의약 용도는 섬유증이다. 바람직하게, 섬유증은 심장, 간, 폐, 골격근, 신장, 혈관, 또는 심장 섬유증이다. 더욱 바람직하게, 섬유증은 간 또는 폐 섬유증이다.In another embodiment, the medical use that the combination preparation or combination therapy according to the present disclosure is intended to treat, improve or prevent is fibrosis. Preferably, the fibrosis is cardiac, liver, lung, skeletal muscle, renal, vascular, or cardiac fibrosis. More preferably, the fibrosis is liver or pulmonary fibrosis.
본 명세서에서 사용된 "치료"는 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 근절, 제거, 또는 통제를 포함하고, 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 확장을 최소화하거나 지연시키는 것이다.As used herein, “treatment” includes eradicating, eliminating, or controlling steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis, and minimizing or delaying the expansion of steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis.
본 명세서에서 사용된 "예방(prevention)"은 환자에 있어 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 재발 방지, 확장 또는 발병의 예방을 포함한다.As used herein, “prevention” includes preventing the recurrence, expansion or development of steatohepatitis, steatosis and/or fibrosis in a patient.
상기 화학식 1의 화합물은 국제특허출원 공개공보 WO2011-139107에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.The compound of Formula 1 can be prepared by the method disclosed in International Patent Application Publication WO2011-139107.
본 명세서에 있어, "페노피브레이트계 약물"은 페노피브릭 산(fenofibric acid), 이의 프로드럭(prodrug) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 의미이다. As used herein, “fenofibrate-based drug” includes fenofibric acid, a prodrug thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
만약 어떠한 화합물(프로드럭)이 체내에서 분리되어 페노피브릭 산을 생성하게 된다면, 그러한 화합물 또한 상기 페노피브레이트계 약물에 포함된다. 이러한 프로드럭의 예들은, 생가수분해될수 있는(biohydrolyzable) 아미드, 생가수분해될수 있는 에스테르, 생가수분해될수 있는 카르바메이트(carbamates), 생가수분해될수 있는 탄산염, 생가수분해될수 있는 우레이드(ureides), 그리고 생가수분해될수 있는 인산염 유사체들 같은 생가수분해될수 있는 부분을 포함하는, 생가수분해되어 본 발명의 화합물을 생성하는 화합물들을 포함하나, 이러한 구체적 태양에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 페노피브릭 산의 프로드럭은 카르복실릭 산의 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬 에스테르이다. 카르복실릭 에스테르는 분자에 존재하는 카르복실릭 산 일부분을 에스테르화 함으로서 통상적으로 형성된다. 더욱 바람직하게, 페노피브릭 산의 프로드럭은 이소프로필 에스테르 프로드럭인 페보피브레이트이다. If a compound (prodrug) is isolated in the body and produces fenofibric acid, such compound is also included in the fenofibrate-based drug. Examples of such prodrugs include biohydrolyzable amides, biohydrolyzable esters, biohydrolyzable carbamates, biohydrolyzable carbonates, and biohydrolyzable ureides. (ureides), and compounds that contain biohydrolyzable moieties, such as biohydrolyzable phosphate analogs, that biohydrolyze to produce the compounds of the invention, but are not limited to this specific embodiment. Preferably, the prodrug of fenofibric acid is a lower alkyl ester of carboxylic acid having 1 to 4 carbon atoms. Carboxylic esters are usually formed by esterifying a portion of the carboxylic acid present in the molecule. More preferably, the prodrug of fenofibric acid is febofibrate, an isopropyl ester prodrug.
페노피브릭 산의 약학적으로 허용 가능한 염으로는 비교적 비독성 염기로 제조된 염들을 포함한다. 염기(base) 부가 염들은 충분한 양의 원하는 염기, 순수한 또는 적당한 비활성(inert) 용매로 그러한 화합물들의 중성 형태를 접촉하여 얻을 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가 염의 예들은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아미노 또는 마그네슘 염 또는 유사한 염을 포함한다. 바람직하게, 페노피브릭 산의 약학적으로 허용 가능한 염은 콜린 염, 에탄올아민 염, 디에탄올아민 염, 피페라진 염, 칼슘 염, 또는 트로메타민(tromethamine) 염이다. 더욱 바람직하게는, 페노피브릭 산의 약학적으로 허용 가능한 염은 콜린 염이다. Pharmaceutically acceptable salts of fenofibric acid include salts prepared with relatively non-toxic bases. Base addition salts can be obtained by contacting the neutral form of such compounds with a sufficient amount of the desired base, neat or with a suitable inert solvent. Examples of pharmaceutically acceptable base addition salts include sodium, potassium, calcium, ammonium, organic amino or magnesium salts or similar salts. Preferably, the pharmaceutically acceptable salt of fenofibric acid is the choline salt, ethanolamine salt, diethanolamine salt, piperazine salt, calcium salt, or tromethamine salt. More preferably, the pharmaceutically acceptable salt of fenofibric acid is the choline salt.
본 명세서에서 사용된 용어인 "화학식 1(의) 화합물" 또는 "페노피브레이트계 약물"은 각 화합물들뿐만 아니라, 이들의 클라드레이트(clathrates), 수화물, 용매화물, 또는 다형체(결정다형)를 포함하는 의미이다. As used herein, the term “compound of Formula 1” or “fenofibrate-based drug” includes not only each compound, but also their clathrates, hydrates, solvates, or polymorphs. It means:
본 명세서에서 사용될 경우, 용어 "결정다형(polymorph)"은 본 발명의 화합물의 고체 결정 형태 또는 그것의 복합체를 의미한다. 같은 화합물의 다른 결정다형은 다른 물리적, 화학적 그리고/또는 스펙트럼적 특성을 보인다. 물리적 특성 측면의 차이점으로는 안정성(예를 들어, 열 또는 빛 안정성), 압축성과 밀도(제제화 및 생산물 제조에 중요함), 그리고 용해율(생물학적 이용률에 영향을 줄 수 있음)을 포함하나, 이에 한정되지 아니한다. 안정성에서 차이는 화학반응성 변화들(예를 들어, 또 다른 다형으로 구성되었을 때보다 하나의 다형으로 구성되었을 때 더 빠르게 변색이 되는 것 같은 차별적 산화) 또는 기계적인 특징들(예를 들어 동역학적으로 선호된 다형체로서 저장된 정제 파편들이 열역학 적으로 더 안정된 다형으로 변환) 또는 둘 다(하나의 다형의 정제는 높은 습도에서 더 분해에 예민)를 야기한다. 결정다형의 다른 물리적 성질들은 그들의 가공에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 한 결정다형은 또 다른 결정다형에 비하여, 예를 들어, 그것의 형태 또는 입자의 크기 분포에 기인하여 용매화합물을 형성할 가능성이 많을 수 있거나, 여과 또는 세척이 더 어려울 수 있다.As used herein, the term “polymorph” refers to a solid crystal form of a compound of the invention or a complex thereof. Different polymorphs of the same compound exhibit different physical, chemical and/or spectral properties. Differences in terms of physical properties include, but are not limited to, stability (e.g., thermal or light stability), compressibility and density (important in formulation and product manufacturing), and dissolution rate (which may affect bioavailability). It doesn't work. Differences in stability may be due to changes in chemical reactivity (e.g. differential oxidation, such as faster discoloration in one polymorph than in another polymorph) or in mechanical properties (e.g. kinetically storage of tablet fragments as the preferred polymorph converts to the thermodynamically more stable polyform) or both (tablets of one polyform are more susceptible to degradation at high humidity). Other physical properties of polymorphs can affect their processing. For example, one polymorph may be more likely to form solvates or may be more difficult to filter or wash than another polymorph, for example, due to its shape or particle size distribution.
본 명세서에서 사용된 용어 "용매 화합물"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 용매를 포함하는 본 발명의 화합물을 의미한다. 바람직한 용매들은 휘발성이고, 비독성이며, 인간에게 극소량 투여될 수 있다.As used herein, the term “solvent compound” refers to a compound of the invention comprising a stoichiometric or non-stoichiometric amount of solvent bound by non-covalent intermolecular forces. Preferred solvents are volatile, non-toxic, and can be administered in trace amounts to humans.
본 명세서에서 사용된 용어 "수화물(hydrate)"은 비공유 분자간의 힘에 의해 결합된 화학량론적 또는 비-화학량론적인 양의 물을 포함하는 본 발명의 화합물을 의미한다. As used herein, the term “hydrate” refers to a compound of the invention that contains a stoichiometric or non-stoichiometric amount of water bound by non-covalent intermolecular forces.
본 명세서에서 사용된 용어 "클라드레이트(clathrate)"은 게스트 분자(예를 들어, 용매 또는 물)를 가두어 놓은 공간(예를 들어, 채널(channel))을 포함한 결정 격자의 형태의 본 발명의 화합물을 의미한다. As used herein, the term “clathrate” refers to a compound of the present invention in the form of a crystal lattice containing spaces (e.g., channels) that confine guest molecules (e.g., solvent or water). means.
본 발명의 각각의 화합물들(화학식 1의 화합물 및 페노피브레이트계 약물)은 임의의 적합한 경로에 의하여 이러한 경로에 적당한 약학 조성물의 형태, 그리고 의도된 치료를 위하여 효과적인 투여량으로 투여될 수 있다. 효과적인 투여량은 단일 또는 분할 투여로 일반적으로 각각 약 0.01 내지 약 50 mg/체중kg/일이고, 바람직하게는 각각 약 0.05 내지 약 20 mg/kg/일이다. 나이, 종, 및 치료될 질병 또는 상태(condition)에 따라 이 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 적합할 수 있다. 다른 경우에는, 여전히 더 큰 투여량이 해로운 부작용없이 사용될 수 있다. 더 큰 투여량은 하루 동안 투여를 위하여, 여러 작은 투여량으로 분할될 수 있다. 적절한 투여량을 결정하기 위한 방법들이 본 발명이 속한 분야에 잘 알려져 있다.Each of the compounds of the present invention (compound of Formula 1 and fenofibrate-based drug) can be administered by any suitable route, in the form of a pharmaceutical composition suitable for such route, and in an effective dosage for the intended treatment. Effective dosages are generally from about 0.01 to about 50 mg/kg of body weight/day, respectively, and preferably from about 0.05 to about 20 mg/kg/day of each, in single or divided doses. Depending on age, species, and disease or condition being treated, dosage levels below the lower end of this range may be appropriate. In other cases, still larger doses can be used without harmful side effects. Larger doses may be divided into several smaller doses for administration throughout the day. Methods for determining appropriate dosages are well known in the art.
본 명세서에서 사용된 “대략”, 또는 “약”은 해당 수치를 기준으로 ±20%, 바람직하게는 ±10%의 변동 폭을 가짐을 의미한다. As used herein, “approximately” or “about” means a range of variation of ±20%, preferably ±10%, based on the corresponding value.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 제1 약효 성분인 화학식 1의 화합물 및 제2 약효 성분인 페노피브레이트계 약물은 동시에(동일한 제형 또는 분리된 제형으로) 또는 연속적으로 투여될 수 있다. As described above, the compound of Formula 1, which is the first medicinal ingredient of the present invention, and the fenofibrate-based drug, which is the second medicinal ingredient, can be administered simultaneously (in the same dosage form or in separate dosage forms) or sequentially.
일 양태에서, 2가지 약효 성분들 중 하나는 다중 투여(multiple doses)로 주어지거나, 또는 둘 다 다중 투여(multiple doses)로 주어질 수 있다. 만약 동시가 아니라면, 다중 투여(multiple doses) 사이의 시기는 0주 초과 내지 20주 미만에서 임의로 달라질 수 있다.In one aspect, one of the two drug substances may be given in multiple doses, or both may be given in multiple doses. If not simultaneous, the timing between multiple doses can vary anywhere from more than 0 weeks to less than 20 weeks.
또한, 병용 방법, 조성물 및 제형은 단지 두 가지 제제의 사용에 한정되지 않고, 다중 치료 조합도 구상된다. 병적인 상태(condition)를 치료, 예방, 또는 개선하기 위한 투여 요법(dosage regimen)은 다양한 요소에 따라 임의로 변경될 수 있다. 이들 요소는 개체의 나이, 체중, 성(性), 식이(diet), 및 의학적 상태(condition)뿐만 아니라, 개체가 앓고 있는 장애(disorder)를 포함한다. Additionally, combination methods, compositions and formulations are not limited to the use of just two agents; multiple treatment combinations are also envisioned. Dosage regimen for treating, preventing, or ameliorating a pathological condition may vary depending on various factors. These factors include the individual's age, weight, sex, diet, and medical condition, as well as any disorders the individual suffers from.
본 명세서에 개시된 병용 치료를 구성하는 약학적 제제는 임의로 결합된 제형 또는 주로 동시투여를 위한 분리된 제형이다. 병용 치료를 구성하는 약학적 제제는 또한 두 단계 투여를 필요로 하는 요법에 의하여 투여되는 제제 중 어느 하나로 순차적으로 투여될 수 있다. 두 단계 투여 요법은 활성제의 순차적인 투여 또는 분리된 활성제의 이격 투여를 필요로 할 수 있다. 다중 투여 단계 사이의 시간 주기는 역가(potency), 용해도, 생물학적 이용가능성(bioavailability), 혈장 반감기 및 약학적 제제의 동역학적 프로필(kinetic profile)과 같은 각각의 약학적 제제의 특성에 따라 몇 분에서 수 시간까지 이른다. 표적 분자 농도의 일중 변화(Circadian variation)는 최적의 투여 간격을 결정하는데 사용된다.The pharmaceutical agents that make up the combination treatment disclosed herein are optionally in combined formulations or in separate formulations primarily for simultaneous administration. The pharmaceutical agents that make up the combination treatment can also be administered sequentially as either of the agents administered by a regimen requiring two-step administration. A two-step dosing regimen may require sequential administration of the active agent or spaced administration of separate active agents. The time period between multiple administration steps can range from several minutes to several minutes depending on the properties of each pharmaceutical agent such as potency, solubility, bioavailability, plasma half-life and kinetic profile of the pharmaceutical agent. It can last up to several hours. Circadian variation in target molecule concentration is used to determine the optimal dosing interval.
본 개시에 따른 2가지 유효 성분들이 하기 1가지 제제에 함께 포함될 수 있으며, 또는 2가지 유효 성분들이 각각 분리된 제제에 포함되어 함께 복용될 수도 있다. 즉, 본 개시의 일 양태는 화학식 1의 화합물, 페노피브레이트계 약물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 약학 제제를 제공한다. 본 개시의 다른 양태는 화학식 1의 화합물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 제1 약학 제제 및 페노피브레이트계 약물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 제2 약학 제제를 포함하는 키트를 제공한다. The two active ingredients according to the present disclosure may be included together in one preparation below, or the two active ingredients may be contained in separate preparations and taken together. That is, one aspect of the present disclosure provides a pharmaceutical formulation containing the compound of Formula 1, a fenofibrate-based drug, and a pharmaceutically acceptable carrier or additive. Another aspect of the present disclosure includes a first pharmaceutical formulation comprising a compound of Formula 1, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, and a second pharmaceutical formulation comprising a fenofibrate-based drug, and a pharmaceutically acceptable carrier or excipient. We provide a kit that does this.
용어 "약학적으로 허용 가능한"은 약학적 제제로 사용하기에 적합한 것을 의미하며, 일반적으로 이러한 사용을 위하여 안전한 것으로 간주되며, 이러한 사용을 위하여 국가의 관리 기관에 의하여 공식적으로 승인되거나 한국 약전 또는 미국 약전의 명단에 있는 것을 의미한다.The term “pharmaceutically acceptable” means suitable for use as a pharmaceutical preparation, generally considered safe for such use, and officially approved for such use by a national governing body or approved by the Korean Pharmacopoeia or the United States. This means that it is listed in the Pharmacopoeia.
상기 설명된 질병 또는 상태(condition)의 치료를 위하여, 본 명세서에서 설명된 화학식 1의 화합물 및/또는 페노피브레이트계 약물은 다음과 같이 투여될 수 있다.For the treatment of the diseases or conditions described above, the compounds of Formula 1 and/or fenofibrate-based drugs described herein may be administered as follows.
구강 투여(Oral administration)Oral administration
본 발명의 화합물(들)은 구강으로 투여될 수 있으며, 구강은 연하(swallowing)를 포함하는 개념이다. 구강 투여에 의하여 본 발명의 화합물(들)이 위장관(gastrointestinal tract)에 들어가거나, 예를 들어, 구강(buccal) 또는 설하(sublingual) 투여와 같이, 입으로부터 혈류로 직접적으로 흡수될 수 있다. The compound(s) of the present invention can be administered orally, which includes swallowing. By oral administration, the compound(s) of the invention may enter the gastrointestinal tract or be absorbed directly from the mouth into the bloodstream, for example, by buccal or sublingual administration.
구강 투여를 위한 적합한 조성물은 고형상, 액상, 겔(gel), 또는 파우더 형상일 수 있으며, 정제(tablet), 로젠지(lozenge), 캡슐(capsule), 과립제, 산제 등의 제형을 가질 수 있다. Compositions suitable for oral administration may be in the form of solid, liquid, gel, or powder, and may have dosage forms such as tablets, lozenges, capsules, granules, and powders. .
구강 투여를 위한 조성물은 선택적으로 장용 코팅(enteric coating)될 수 있으며, 장용 코팅을 통하여 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 구강 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된(modified) 방출 패턴을 가진 제형일 수 있다. Compositions for oral administration may optionally be enteric coated and may exhibit delayed or sustained release through the enteric coating. That is, the composition for oral administration according to the present invention may be in a formulation with an immediate or modified release pattern.
액체 제형은 용액, 시럽 및 현탁액을 포함할 수 있으며, 이러한 액상 조성물은 연질 또는 경질 캡슐 내에 함유된 형태일 수 있다. 이러한 제형은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 셀룰로오스, 또는 오일(oil)을 포함할 수 있다. 상기 제형은 또한 하나 이상의 유화제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다.Liquid dosage forms may include solutions, syrups, and suspensions, and these liquid compositions may be contained in soft or hard capsules. These formulations may include pharmaceutically acceptable carriers such as water, ethanol, polyethylene glycol, cellulose, or oil. The formulation may also include one or more emulsifying agents and/or suspending agents.
정제(tablet) 제형에서, 활성 성분인 약물의 양은 정제 총 중량 대비 약 0.05 중량% 내지 약 95 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 50 중량%로 존재할 수 있다. 또한, 정제는 약 0.5 중량% 내지 약 35 중량%, 더욱 일반적으로 제형의 약 2 중량% 내지 약 25 중량%를 포함하는 붕해제를 함유할 수 있다. 붕해제의 예로는 유당, 전분, 소디움스타치글리콜레이트, 크로스포비돈, 크로스카멜로스소디움(croscarmellose sodium), 말토덱스트린 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In tablet formulations, the amount of drug as the active ingredient may be from about 0.05% to about 95% by weight relative to the total weight of the tablet, and more typically from about 2% to about 50% by weight of the formulation. Additionally, the tablets may contain a disintegrant comprising from about 0.5% to about 35% by weight, more typically from about 2% to about 25% by weight of the dosage form. Examples of disintegrants include, but are not limited to, lactose, starch, sodium starch glycolate, crospovidone, croscarmellose sodium, maltodextrin, or mixtures thereof.
정제로 제조하기 위해 포함되는 적합한 활택제는 약 0.1 중량% 내지 약 5 중량% 양으로 존재할 수 있고, 탈크(talc), 이산화규소, 스테아린산, 칼슘, 아연 또는 마그네슘 스테아레이트, 소듐 스테아릴 푸마레이트 등이 활택제로 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다. Suitable lubricants included for preparation into tablets may be present in amounts of about 0.1% to about 5% by weight and include talc, silicon dioxide, stearic acid, calcium, zinc or magnesium stearate, sodium stearyl fumarate, etc. These lubricants can be used, but the present invention is not limited to these types of additives.
정제로 제조하기 위한 결합제(binder)로는 젤라틴, 폴리에틸렌글리콜, 당(sugar), 검(gum), 녹말(starch), 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등이 사용될 수 있으며, 정제로 제조하기 위한 적합한 희석제로는 만니톨, 자일리톨, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 녹말(starch), 미결정셀룰로오스 등이 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 첨가제들의 종류에 한정되는 것은 아니다. As binders for manufacturing tablets, gelatin, polyethylene glycol, sugar, gum, starch, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, etc. can be used. Suitable diluents for manufacturing tablets include mannitol, xylitol, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, starch, microcrystalline cellulose, etc., but the present invention is not limited to the types of these additives. .
선택적으로 정제에 포함될 수 있는 가용화제는 정제 총 중량 대비 약 0.1 중량% 내지 약 3 중량% 양이 사용될 수 있고, 예를 들어, 폴리소르베이트, 소디움 라우릴설페이트, 소디움 도데실설페이트, 프로필렌 카보네이트, 디에틸렌글리콜모노에틸에테르, 디메틸이소소르비드, 폴리옥시에틸렌글리콜화된 천연 또는 수소화 피마자유, HCORTM(Nikkol), 올레일에스테르, 젤루시어(GelucireTM), 카프릴릭/카프릴산 모노/디글리세리드, 소르비탄지방산에스테르, 솔루톨HSTM 등이 본 발명에 따른 약학 조성물에 사용될 수 있으나, 본 발명은 이러한 가용화제의 구체적 종류에 한정되는 것은 아니다.The solubilizing agent that may optionally be included in the tablet may be used in an amount of about 0.1% by weight to about 3% by weight based on the total weight of the tablet, and includes, for example, polysorbate, sodium lauryl sulfate, sodium dodecyl sulfate, propylene carbonate, Diethylene glycol monoethyl ether, dimethyl isosorbide, polyoxyethylene glycolated natural or hydrogenated castor oil, HCOR TM (Nikkol), oleyl ester, Gelucire TM , caprylic/caprylic acid mono/ Diglycerides, sorbitan fatty acid esters, Solutol HS TM , etc. may be used in the pharmaceutical composition according to the present invention, but the present invention is not limited to the specific types of these solubilizers.
비경구 투여(Parenteral Administration)Parenteral Administration
본 발명의 화합물(들)은 혈류, 근육, 또는 내장 내로 직접 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위한 적합한 방법은 정맥내(intravenous), 근육내(intra-muscular), 피하 동맥내(subcutaneous intraarterial), 복강내(intraperitoneal), 척추강내(intrathecal), 두개내(intracranial) 주사 등을 포함한다. 비경구 투여를 위한 적합한 장치는 (바늘 및 바늘 없는 주사기를 포함하는) 주사기(injector) 및 주입 방법(infusion method)을 포함한다.Compound(s) of the invention may be administered directly into the bloodstream, muscles, or intestines. Suitable methods for parenteral administration include intravenous, intra-muscular, subcutaneous intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, and intracranial injection. Includes. Suitable devices for parenteral administration include injectors (including needles and needleless syringes) and infusion methods.
비경구 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다. Compositions for parenteral administration may be in formulations with an immediate or modified release pattern, which may be a delayed or sustained release pattern.
대부분의 비경구 제형은 액상 조성물이며, 이러한 액상 조성물은 본 발명에 따른 약효 성분, 염, 완충제, 등장화제 등을 포함하는 수용액이다.Most parenteral dosage forms are liquid compositions, and these liquid compositions are aqueous solutions containing medicinal ingredients, salts, buffers, isotonic agents, etc. according to the present invention.
비경구 제형은 또한 건조된 형태(예를 들어, 동결 건조) 또는 멸균 비-수용액으로서 제조될 수 있다. 이들 제형은 멸균수(sterile water)와 같은 적합한 비히클(vehicle)과 함께 사용될 수 있다. 용해도 증강제(solubility-enhancing agents) 또한 비경구 용액의 제조에 사용될 수 있다.Parenteral formulations can also be prepared in dried form (e.g., lyophilized) or as sterile non-aqueous solutions. These formulations can be used with a suitable vehicle such as sterile water. Solubility-enhancing agents may also be used in the preparation of parenteral solutions.
국소 투여(Topical Administration)Topical Administration
본 발명의 화합물(들)은 피부 또는 경피로 국소적으로 투여될 수 있다. 이 국소 투여를 위한 제형은 로션, 용액, 크림, 젤, 하이드로젤, 연고, 폼(foam), 임플란트(implant), 패치 등을 포함한다. 국소 투여 제형을 위한 약학적으로 허용 가능한 담체는 물, 알코올, 미네랄 오일, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜 등을 포함할 수 있다. 국소 투여는 또한 전기천공법(electroporation), 이온도입법(iontophoresis), 음파영동(phonophoresis) 등에 의하여 수행될 수 있다.The compound(s) of the invention may be administered topically, dermally or transdermally. Formulations for topical administration include lotions, solutions, creams, gels, hydrogels, ointments, foams, implants, patches, and the like. Pharmaceutically acceptable carriers for topical administration formulations may include water, alcohol, mineral oil, glycerin, polyethylene glycol, etc. Topical administration can also be accomplished by electroporation, iontophoresis, phonophoresis, etc.
국소 투여를 위한 조성물은 즉시 또는 변형된 방출 패턴을 가진 제형일 수 있으며, 변형된 방출 패턴은 지연된(delayed) 또는 지속된(sustained) 방출 패턴일 수 있다.Compositions for topical administration may be formulated with an immediate or modified release pattern, which may be a delayed or sustained release pattern.
본 발명은 2가지 약효 성분을 함께 투여함으로써 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증에 대해 더 우수한 치료 또는 예방 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 약효 성분의 조합은 지방간염, 지방증 및/또는 섬유증의 치료 또는 예방에 있어 시너지적으로 현저히 높아진 치료 효과를 가진다.The present invention can exhibit better treatment or prevention effects on steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis by administering two medicinal ingredients together. The combination of medicinal ingredients according to the present invention has a synergistically significantly increased therapeutic effect in the treatment or prevention of steatohepatitis, steatosis, and/or fibrosis.
하기 도면들에 있어, 데이터는 평균±SEM으로 기재되었다. 통계 처리는 two way ANOVA (Dunnett's test)를 이용하거나 (도 1), one way ANOVA (Dunnett's test)를 이용하였다 (도 2 내지 15). 시험군은 다음과 같았다.
G1: Normal control (lean chow)
G2: Vehicle control (AMLN diet control)
G3: Positive control (Obeticholic acid) 30 mg/kg/day
G4: Fenofibrate 40 mg/kg/day + 화학식 1 화합물 10 mg/kg/day
G5: 화학식 1 화합물 3 mg/kg/day
G6: 화학식 1 화합물 10 mg/kg/day
G7: 화학식 1 화합물 20 mg/kg/day.
도 1은 비알콜성 지방간염 질환 모델에서 12주의 시험 물질 투여 기간 동안 각 그룹의 체중 변화를 나타낸 것이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/**/*: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.001/p<0.01/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음
도 2는 각 그룹의 체중 대비 간 무게의 비율을 나타낸 것이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. **/*: G2 대비 각각 p<0.01/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 3은 혈장 내 TG (Triglyceride) 측정 결과이다. ###: G1 대비 p<0.001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***: G2 대비 p<0.0001/p<0.001 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 4는 혈장 내 TC (Total cholesterol) 측정 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/*: G2 대비 p<0.0001/p<0.001/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 5는 공복 혈당 수치 측정 결과이다. ***: G2 대비 p<0.001 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 6은 혈장 내 ALT (Alanine transaminase) 측정 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/**/*: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.001/p<0.01/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 7은 혈장 내 AST (Aspartate transaminase) 측정 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ***/**/*: G2 대비 각각 p<0.001/p<0.01/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 8은 혈장 내 HDL (High-density lipoprotein) 측정 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/**: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.01 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 9는 혈장 내 LDL (Low-density lipoprotein) 측정 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/**: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.001/p<0.01 수준에서 유의한 차이가 있음
도 10은 Oil-Red-O 염색을 이용하여 간 조직 내 지방 축적 정도를 측정한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/*: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.001/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 11은 H&E 염색을 이용하여 Steatosis, Lobular inflammation, Hepatocyte ballooning의 3가지 기준에 따라 NAS (NAFLD activity score) 수치를 측정한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/**: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.01 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 12는 Sirius red 염색을 이용하여 간 조직 내 콜라겐 침착 정도를 측정한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ***/**: G2 대비 각각 p<0.001/p<0.01 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 13은 면역조직화학적 염색을 이용하여 간 조직 내 섬유아세포의 비중을 측정한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/**/*: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.01/p<0.05 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 14은 간 조직 내 TIMP-1 유전자의 발현을 분석한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ****/***/**: G2 대비 각각 p<0.0001/p<0.001/p<0.01 수준에서 유의한 차이가 있음.
도 15은 간 조직 내 Collagen type 1 유전자의 발현을 분석한 결과이다. ####: G1 대비 p<0.0001 수준에서 유의한 차이가 있음. ***: G2 대비 p<0.001 수준에서 유의한 차이가 있음.In the figures below, data are presented as mean ± SEM. Statistical processing was performed using two way ANOVA (Dunnett's test) (Figure 1) or one way ANOVA (Dunnett's test) (Figures 2 to 15). The test group was as follows.
G1: Normal control (lean chow)
G2: Vehicle control (AMLN diet control)
G3: Positive control (Obeticholic acid) 30 mg/kg/day
G4: Fenofibrate 40 mg/kg/day + Formula 1 compound 10 mg/kg/day
G5: Formula 1 compound 3 mg/kg/day
G6: Formula 1 compound 10 mg/kg/day
G7: Formula 1 compound 20 mg/kg/day.
Figure 1 shows the change in body weight of each group during the 12-week test substance administration period in the non-alcoholic steatohepatitis disease model. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/**/*: There is a significant difference at the p<0.0001/p<0.001/p<0.01/p<0.05 level compared to G2, respectively.
Figure 2 shows the ratio of liver weight to body weight in each group. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. **/*: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.01/p<0.05 level, respectively.
Figure 3 shows the results of TG (Triglyceride) measurement in plasma. ###: Significant difference compared to G1 at p<0.001 level. ****/***: There is a significant difference at the p<0.0001/p<0.001 level compared to G2.
Figure 4 shows the results of measuring TC (Total cholesterol) in plasma. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/*: There is a significant difference at the p<0.0001/p<0.001/p<0.05 level compared to G2.
Figure 5 shows the results of fasting blood sugar level measurement. ***: Significant difference compared to G2 at p<0.001 level.
Figure 6 shows the measurement results of ALT (Alanine transaminase) in plasma. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/**/*: There is a significant difference at the p<0.0001/p<0.001/p<0.01/p<0.05 level compared to G2, respectively.
Figure 7 shows the measurement results of AST (Aspartate transaminase) in plasma. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ***/**/*: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.001/p<0.01/p<0.05 level, respectively.
Figure 8 shows the results of measuring HDL (high-density lipoprotein) in plasma. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/**: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.0001/p<0.01 level, respectively.
Figure 9 shows the measurement results of LDL (low-density lipoprotein) in plasma. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/**: There is a significant difference at the p<0.0001/p<0.001/p<0.01 level compared to G2, respectively.
Figure 10 shows the results of measuring the degree of fat accumulation in liver tissue using Oil-Red-O staining. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/*: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.0001/p<0.001/p<0.05 level, respectively.
Figure 11 shows the results of measuring NAS (NAFLD activity score) levels according to three criteria: Steatosis, Lobular inflammation, and Hepatocyte ballooning using H&E staining. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/**: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.0001/p<0.01 level, respectively.
Figure 12 shows the results of measuring the degree of collagen deposition in liver tissue using Sirius red staining. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ***/**: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.001/p<0.01 level, respectively.
Figure 13 shows the results of measuring the specific gravity of fibroblasts in liver tissue using immunohistochemical staining. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/**/*: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.0001/p<0.01/p<0.05 level, respectively.
Figure 14 shows the results of analyzing the expression of the TIMP-1 gene in liver tissue. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ****/***/**: There is a significant difference compared to G2 at the p<0.0001/p<0.001/p<0.01 level, respectively.
Figure 15 shows the results of analyzing the expression of Collagen type 1 gene in liver tissue. ####: Significant difference compared to G1 at p<0.0001 level. ***: Significant difference compared to G2 at p<0.001 level.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, to aid understanding of the present invention, it will be described in detail through examples. However, the embodiments according to the present invention may be modified into various other forms, and the scope of the present invention should not be construed as being limited to the following embodiments. Embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those with average knowledge in the field to which the present invention pertains.
실시예 1. 비알콜성 지방간염 치료 모델에서 질환 유발 및 투여Example 1. Disease induction and administration in non-alcoholic steatohepatitis treatment model
비알콜성 지방간염 동물 모델인 AMLN(Amylin Liver NASH) 모델을 이용하였다. 생후 5~6 주가 지난 수컷 C57BL/6N mouse를 이용하여 AMLN diet를 30주간 공급하였다. 이후 12 주간은 AMLN diet를 지속하며 시험 물질을 경구 투여하였다. 동일 그룹 내 5마리의 동물을 함께 사육하였고 신체표시법을 사용하여 식별하였다.The AMLN (Amylin Liver NASH) model, a non-alcoholic steatohepatitis animal model, was used. Male C57BL/6N mice, 5 to 6 weeks old, were fed AMLN diet for 30 weeks. Afterwards, the AMLN diet was continued for 12 weeks and the test substance was administered orally. Five animals in the same group were housed together and identified using body marking.
혈액생화학적 검사 및 체중 측정 후 ALT, AST, Glucose 및 체중 수준에 따라 무작위법으로 분배하였다. [정상사료 급여군 10 마리(G1), AMLN diet 급여군 60 마리(G2-G7)]After blood biochemical tests and body weight measurements, patients were randomly distributed according to ALT, AST, glucose, and body weight levels. [10 animals in the normal feed group (G1), 60 animals in the AMLN diet group (G2-G7)]
AMLN diet로 30 주에 걸쳐 유발된 비알콜성 지방간염 C57BL/6N mouse 모델에 시험 물질을 12주 반복 투여하였을 때 나타나는 개선 효과를 평가하였다. 시험 물질을 12주 동안 1일 1회 투여하였다. 병용 물질은 혈중 콜레스테롤과 중성 지방을 감소시키는 지질 저하제인 페노피브레이트(Fenofibrate)를 사용하였다. 양성 대조군으로는 비알콜성 지방간염을 적응증으로 현재 임상 3상을 진행 중인 오베티콜린산(Obeticholic acid)을 사용하였다.The improvement effect seen when the test substance was repeatedly administered for 12 weeks to the non-alcoholic steatohepatitis C57BL/6N mouse model induced by the AMLN diet over 30 weeks was evaluated. The test substance was administered once a day for 12 weeks. The concomitant substance was fenofibrate, a lipid-lowering agent that reduces blood cholesterol and triglycerides. Obeticholic acid, which is currently in phase 3 clinical trials for non-alcoholic steatohepatitis, was used as a positive control.
시험 물질(화학식 1의 화합물), 병용 물질(Fenofibrate), 및 양성 대조 물질(Obeticholic acid)은 적량을 칭량한 후 1중량% Tween 80이 첨가된 0.5 중량% methylcellulose 수용액에 희석하여 투여하였다. 경구 투여 시 동물의 체중을 측정하여 시험 물질의 투여 용량을 결정하였다.The test substance (compound of Formula 1), combination substance (Fenofibrate), and positive control substance (Obeticholic acid) were weighed in appropriate amounts and then diluted in 0.5% by weight methylcellulose aqueous solution to which 1% by weight Tween 80 was added and administered. During oral administration, the body weight of the animal was measured to determine the administered dose of the test substance.
각 그룹의 물질 투여 용량 및 빈도는 아래와 같았다.The dose and frequency of substance administration for each group were as follows.
G1: 정상사료 급여군G1: Normal feed feeding group
G2: AMLN diet 급여군G2: AMLN diet group
G3: AMLN diet 급여군, 오베티콜린산 30 mg/kg/dayG3: AMLN diet group, obeticholic acid 30 mg/kg/day
G4: AMLN diet 급여군, 페노피브레이트 40 mg/kg/day + 화학식 1 화합물 10 mg/kg/dayG4: AMLN diet group, fenofibrate 40 mg/kg/day + Formula 1 compound 10 mg/kg/day
G5: AMLN diet 급여군, 화학식 1 화합물 3 mg/kg/dayG5: AMLN diet group, Formula 1 compound 3 mg/kg/day
G6: AMLN diet 급여군, 화학식 1 화합물 10 mg/kg/dayG6: AMLN diet group, Formula 1 compound 10 mg/kg/day
G7: AMLN diet 급여군, 화학식 1 화합물 20 mg/kg/dayG7: AMLN diet group, Formula 1 compound 20 mg/kg/day
실시예 2. 비알콜성 지방간염 치료 모델에서의 관찰 및 검사 항목Example 2. Observation and test items in non-alcoholic steatohepatitis treatment model
(1) 체중 측정(1) Weight measurement
투여 개시일 이후 12주 동안 1일 1회 측정하였다.Measurements were taken once a day for 12 weeks after the start of administration.
(2) 혈액생화학적 검사(2) Blood biochemical test
부검일에 4시간 동안 금식 후 시험 물질을 투여하고 1시간 후 채혈하였다. 분리한 혈청으로 Erba EM360 clinical chemistry analyzer를 이용하여 아래 항목을 검사하였다.On the day of autopsy, the test substance was administered after fasting for 4 hours, and blood was collected 1 hour later. The following items were tested with the separated serum using an Erba EM360 clinical chemistry analyzer.
검사 항목: TG (Triglyceride), TC (Total cholesterol), Glucose, ALT (Alanine transaminase), AST (Aspartate transaminase), HDL (Higy-density lipoprotein), LDL (Low-density lipoprotein)Test items: TG (Triglyceride), TC (Total cholesterol), Glucose, ALT (Alanine transaminase), AST (Aspartate transaminase), HDL (High-density lipoprotein), LDL (Low-density lipoprotein)
(3) 부검(3) Autopsy
부검일에 Pimonidazole을 30 mg/ml의 농도로 saline에 희석한 후 60 mg/kg의 투여량으로 정맥 내 투여하였다. 투여 90분 후에 동물을 안락사시켰다. 각 부검시점에 동물을 ether로 흡입마취하였다. 마취가 확인되면 개복하여 후대정맥에서 주사기를 이용하여 채혈을 실시하였다. 그 후, 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈하여 치사시켰다. 혈액은 clot activator가 들어 있는 vacutainer tube에 주입하였고 약 15분간 실온에 방치하여 응고시켰다. 그 후 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 분석 전까지 -70℃ 이하로 설정되어 있는 Deep freezer에 보관하였으며, 혈액생화학적 검사에 사용하였다.On the day of autopsy, pimonidazole was diluted in saline at a concentration of 30 mg/ml and administered intravenously at a dose of 60 mg/kg. Animals were euthanized 90 minutes after administration. At each necropsy time, animals were anesthetized by inhalation of ether. Once anesthesia was confirmed, the patient was laparotomized and blood was collected from the posterior vena cava using a syringe. Afterwards, the abdominal aorta and posterior vena cava were cut and blood was exsanguinated to kill the patient. Blood was injected into a vacutainer tube containing clot activator and left at room temperature for about 15 minutes to coagulate. Afterwards, the serum was separated by centrifugation at 3,000 rpm for 10 minutes. Serum was stored in a deep freezer set at -70°C or lower until analysis and used for blood biochemical tests.
부검 시 간은 적출하여 중량을 측정하였고, 간의 좌엽 중 일부는 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였다. 나머지 간의 좌엽은 Oil-Red-O 염색을 진행하였다. 간의 우엽 중 일부는 액체 질소를 이용하여 급속 냉동 후 초저온 냉동고에 보관하였고, 나머지 간의 우엽은 RNA Later에서 보관하였다.At the time of autopsy, the liver was removed and weighed, and part of the left lobe of the liver was fixed in 10% neutral buffered formalin solution. The remaining left lobe of the liver was stained with Oil-Red-O. Some of the right lobe of the liver was quickly frozen using liquid nitrogen and stored in an ultra-low temperature freezer, and the remaining right lobe of the liver was stored in RNA Later.
(4) 조직병리학적 검사(4) Histopathological examination
고정된 조직은 삭정, 탈수, 파라핀 포매, 박절 등 일반적인 조직처리 과정을 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체로 제작하였다. 그 후 Oil-Red-O, Hematoxylin & Eosin (H&E), 및 Sirius red 염색을 실시하였다.The fixed tissue was prepared as a specimen for histopathological examination after going through general tissue processing procedures such as trimming, dehydration, paraffin embedding, and sectioning. Afterwards, Oil-Red-O, Hematoxylin & Eosin (H&E), and Sirius red staining were performed.
(5) 유전자 발현 분석(5) Gene expression analysis
RNA Later에 보관해둔 간 조직으로 TaqMan probe를 이용하여 QRT-PCR을 통해 아래 항목의 유전자 발현을 분석하였다.The gene expression of the following items was analyzed through QRT-PCR using liver tissue stored in RNA Later using a TaqMan probe.
분석 항목: TIMP-1, Collagen type 1Analysis item: TIMP-1, Collagen type 1
(7) 통계학적 분석(7) Statistical analysis
본 실험의 결과에 대하여 자료의 정규성을 가정하였고, 모수적인 다중비교 (parametric multiple comparison procedures) 또는 비모수적인 다중비교 (non-parametric multiple comparison procedures)를 이용하여 분석하였다. The results of this experiment were assumed to be normal and analyzed using parametric multiple comparison procedures or non-parametric multiple comparison procedures.
모수적 일원분산분석 (One-way ANOVA) 결과가 유의하였을 경우, Dunnett’s multiple comparison test를 이용하여 사후검정을 실시하였다. 비모수적 Kruskal-Wallis’H-test 분석 결과가 유의하였을 경우, Dunn’s multiple comparison test를 이용하여 사후검정을 실시하였다.If the parametric one-way ANOVA result was significant, a post hoc test was performed using Dunnett’s multiple comparison test. If the nonparametric Kruskal-Wallis’ H-test analysis result was significant, a post-hoc test was performed using Dunn’s multiple comparison test.
통계학적 분석은 GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 이용하여 실시하였으며, p값이 0.05 미만일 경우, 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.Statistical analysis was performed using GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA), and if the p value was less than 0.05, it was judged to be statistically significant.
실시예 3. 비알콜성 지방간염 치료 모델에서의 시험 결과Example 3. Test results in non-alcoholic steatohepatitis treatment model
(1) 체중 측정(1) Weight measurement
도 1은 비알콜성 지방간염 질환 모델에서 12주의 시험 물질 투여 기간 동안 각 그룹의 체중 변화를 나타낸 것이다. 체중 측정 결과, AMLN diet 대조군 (G2)의 체중 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3 mg/kg 단독 투여군 (G5)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의한 체중 감소를 나타내었다.Figure 1 shows the change in body weight of each group during the 12-week test substance administration period in the non-alcoholic steatohepatitis disease model. As a result of body weight measurement, the body weight level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher than that of the normal control group (G1) (p<0.0001). The combination administration group (G4) and the Formula 1 compound 3 mg/kg single administration group (G5) showed significant weight loss compared to the AMLN diet control group (G2).
(2) 간 무게/체중 비율(2) Liver weight/body weight ratio
도 2는 각 그룹의 체중 대비 간 무게의 비율을 나타낸 것이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 간 무게/체중 비율은 정상 대조군 (G1)에 비해 42% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 18, 20, 20% 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.01). 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 18 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.05).Figure 2 shows the ratio of liver weight to body weight in each group. The liver weight/body weight ratio of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 42% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the group administered alone compound 3, 10, and 20 mg/kg of Formula 1 (G5-G7), there was a significant decrease of about 18, 20, and 20%, respectively, compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.01). The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 18% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.05).
(3) 혈액생화학적 검사(3) Blood biochemical test
혈액생화학적 검사 결과, 12주 동안의 시험 물질 투여 이후 AMLN diet 대조군 (G2)의 TG, TC, ALT, AST, HDL 및 LDL 수준은 정상 대조군 (G1) 대비 유의하게 높았다. 병용 투여군 (G4)에서 TG, TC, Glucose, ALT, AST, HDL 및 LDL 수준이 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였고, 화학식 1 화합물 단독 투여군 (G5-G7)에서 TG, TC, ALT, AST 및 LDL 수준이 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다. 양성 대조군 (G3)에서 TG, TC, ALT, AST, HDL 및 LDL 수준이 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다. As a result of the blood biochemical test, after administration of the test substance for 12 weeks, the TG, TC, ALT, AST, HDL, and LDL levels of the AMLN diet control group (G2) were significantly higher than those of the normal control group (G1). In the combination administration group (G4), TG, TC, Glucose, ALT, AST, HDL, and LDL levels were significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2), and in the Formula 1 compound alone administration group (G5-G7), TG, TC, ALT, AST and LDL levels were significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2). In the positive control group (G3), TG, TC, ALT, AST, HDL, and LDL levels were significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2).
그 결과를 종합하여 도 3 내지 도 9에 나타내었다.The results are summarized and shown in Figures 3 to 9.
도 3은 TG (Triglyceride) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 TG 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 47% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 56 (p<0.0001), 34 (p<0.001), 39 (p<0.0001), 37 (p<0.001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 45% 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.0001).Figure 3 shows the TG (Triglyceride) measurement results. The TG level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 47% compared to the normal control group (G1) (p<0.001). In the combination administration group (G4) and the Formula 1 compound 3, 10, and 20 mg/kg single administration group (G5-G7), the number of deaths was 56 (p<0.0001), 34 (p<0.001), and 39 (p), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). <0.0001), showing a significant decrease of about 37 (p<0.001)%. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 45% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.0001).
도 4는 TC (Total cholesterol) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 TC 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 193% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 56 (p<0.0001), 24 (p<0.05), 35 (p<0.001), 39 (p<0.0001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 57 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.0001).Figure 4 shows the results of TC (Total cholesterol) measurement. The TC level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 193% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combination administration group (G4) and the Formula 1 compound 3, 10, and 20 mg/kg single administration group (G5-G7), the number of deaths was 56 (p<0.0001), 24 (p<0.05), and 35 (p), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). <0.001), showing a significant decrease of about 39 (p<0.0001)%. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 57% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.0001).
도 5는 공복 혈당 수치 측정 결과이다. 병용 투여군 (G4)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 42 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.001).Figure 5 shows the results of fasting blood sugar level measurement. The combined administration group (G4) showed a significant decrease of approximately 42% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.001).
도 6은 ALT (Alanine transaminase) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 ALT 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 866 % 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 77 (p<0.0001), 38 (p<0.05), 53 (p<0.001), 59 (p<0.0001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 47 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.01).Figure 6 shows the ALT (Alanine transaminase) measurement results. The ALT level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 866% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combination administration group (G4) and the Formula 1 compound 3, 10, and 20 mg/kg single administration group (G5-G7), compared to the AMLN diet control group (G2), 77 (p<0.0001), 38 (p<0.05), and 53 (p), respectively. <0.001), showing a significant decrease of about 59 (p<0.0001)%. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 47% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.01).
도 7은 AST (Aspartate transaminase) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 AST 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 267% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 20 mg/kg 단독 투여군 (G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 60 (p<0.001), 36 (p<0.05) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 48 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.01).Figure 7 shows the results of AST (Aspartate transaminase) measurement. The AST level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 267% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). The combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 20 mg/kg single administration group (G7) showed a significant decrease of about 60 (p<0.001) and 36 (p<0.05)%, respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 48% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.01).
도 8은 HDL (High-density lipoprotein) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 HDL 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 163% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 48 (p<0.0001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 29 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.01).Figure 8 shows HDL (high-density lipoprotein) measurement results. The HDL level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 163% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). The combined administration group (G4) showed a significant decrease of approximately 48 (p<0.0001)% compared to the AMLN diet control group (G2). The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 29% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.01).
도 9는 LDL (Low-density lipoprotein) 측정 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 LDL 수준은 정상 대조군 (G1)에 비해 177 % 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G6-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 51 (p<0.0001), 31 (p<0.01), 35 (p<0.001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 58 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.0001).Figure 9 shows the results of LDL (low-density lipoprotein) measurement. The LDL level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 177% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 10 and 20 mg/kg single administration group (G6-G7), the number of deaths was 51 (p<0.0001), 31 (p<0.01), and 35 (p<0.001), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). ) showed a significant decrease of about %. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 58% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.0001).
(4) 조직병리학적 검사(4) Histopathological examination
조직병리학적 검사 결과, 12주 동안의 시험 물질 투여 이후 AMLN diet 대조군 (G2)의 Steatosis 수치, NAS (NAFLD activity score) 수치, 콜라겐 침착 정도 및 섬유아세포 염색 정도는 정상 대조군 (G1) 대비 유의하게 높았다. 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 단독 투여군 (G5-G7)에서 Steatosis 수치, NAS 수치, 콜라겐 침착 정도 및 섬유아세포 염색 정도가 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다. 양성 대조군 (G3)에서 Steatosis 수치 및 NAS 수치가 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다.As a result of histopathological examination, after administration of the test substance for 12 weeks, the Steatosis level, NAS (NAFLD activity score) level, collagen deposition level, and fibroblast staining level of the AMLN diet control group (G2) were significantly higher than those of the normal control group (G1). . Steatosis levels, NAS levels, collagen deposition levels, and fibroblast staining levels in the combination treatment group (G4) and the Formula 1 compound alone treatment group (G5-G7) were significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2). Steatosis and NAS levels in the positive control group (G3) were significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2).
그 결과를 종합하여 도 10 내지 도 13에 나타내었다.The results are summarized and shown in Figures 10 to 13.
도 10은 Oil-Red-O 염색을 이용하여 간 조직 내 지방 축적 정도를 측정한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 Steatosis score는 정상 대조군 (G1)에 비해 400% 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 57 (p<0.0001), 20 (p<0.05), 47 (p<0.0001), 43 (p<0.0001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 33 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.001).Figure 10 shows the results of measuring the degree of fat accumulation in liver tissue using Oil-Red-O staining. The Steatosis score of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 400% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 3, 10, and 20 mg/kg single administration group (G5-G7), the number of deaths was 57 (p<0.0001), 20 (p<0.05), and 47 (p), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). <0.0001), showing a significant decrease of about 43 (p<0.0001)%. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 33% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.001).
도 11은 H&E 염색을 이용하여 Steatosis, Lobular inflammation, Hepatocyte ballooning의 3가지 기준에 따라 NAS (NAFLD activity score) 수치를 측정한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 NAS 수치는 정상 대조군 (G1)에 비해 88 % 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G6-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 47 (p<0.0001), 20 (p<0.01), 33 (p<0.0001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 27 % 정도 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.0001).Figure 11 shows the results of measuring NAS (NAFLD activity score) levels according to three criteria: Steatosis, Lobular inflammation, and Hepatocyte ballooning using H&E staining. The NAS level of the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 88% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 10 and 20 mg/kg single administration group (G6-G7), the number of deaths was 47 (p<0.0001), 20 (p<0.01), and 33 (p<0.0001), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). ) showed a significant decrease of about %. The positive control group (G3) showed a significant decrease of approximately 27% compared to the AMLN diet control group (G2) (p<0.0001).
도 12는 Sirius red 염색을 이용하여 간 조직 내 콜라겐 침착 정도를 측정한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)의 콜라겐 침착 정도는 정상 대조군 (G1)에 비해 398 % 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 20 mg/kg 단독 투여군 (G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 71 (p<0.0001), 59 (p<0.001) % 정도 유의한 감소를 나타내었다.Figure 12 shows the results of measuring the degree of collagen deposition in liver tissue using Sirius red staining. The degree of collagen deposition in the AMLN diet control group (G2) was found to be significantly higher by 398% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). The combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 20 mg/kg single administration group (G7) showed a significant decrease of about 71 (p<0.0001) and 59 (p<0.001)%, respectively, compared to the AMLN diet control group (G2).
도 13은 면역조직화학적 염색을 이용하여 간 조직 내 섬유아세포의 비중을 측정한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)에서 섬유아세포의 표식인 ER-TR7의 염색 정도는 정상 대조군 (G1)에 비해 76 % 정도 유의하게 높은 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 3, 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G5-G7)에서 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 각각 55 (p<0.0001), 34 (p<0.05), 33 (p<0.05), 43 (p<0.01) % 정도 유의한 감소를 나타내었다.Figure 13 shows the results of measuring the specific gravity of fibroblasts in liver tissue using immunohistochemical staining. In the AMLN diet control group (G2), the staining level of ER-TR7, a marker of fibroblasts, was significantly higher by 76% compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 3, 10, and 20 mg/kg single administration group (G5-G7), the number of deaths was 55 (p<0.0001), 34 (p<0.05), and 33 (p), respectively, compared to the AMLN diet control group (G2). <0.05), showing a significant decrease of about 43 (p<0.01)%.
(5) 유전자 발현 분석(5) Gene expression analysis
QRT-PCR을 이용하여 비알콜성 지방간염 질환 모델의 간 조직에서 유전자 발현을 분석한 결과, 12 주 동안의 시험 물질 투여 이후 AMLN diet 대조군 (G2)의 TIMP-1 및 Collagen type 1 유전자 발현은 정상 대조군 (G1) 대비 유의하게 높았다. 병용 투여군 (G4)에서 TIMP-1 및 Collagen type 1 유전자 발현이 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다. 화학식 1 화합물 단독 투여군 (G5-G7)에서 TIMP-1 유전자 발현이 AMLN diet 대조군 (G2) 대비 유의하게 감소하였다. 양성 대조군 (G3)에서 TIMP-1 유전자 발현이 AMLN diet (G2) 대비 유의하게 감소하였다.As a result of analyzing gene expression in liver tissue of a non-alcoholic steatohepatitis disease model using QRT-PCR, TIMP-1 and Collagen type 1 gene expression in the AMLN diet control group (G2) was normal after administration of test substances for 12 weeks. It was significantly higher than the control group (G1). In the combination treatment group (G4), TIMP-1 and Collagen type 1 gene expression was significantly decreased compared to the AMLN diet control group (G2). TIMP-1 gene expression was significantly decreased in the group administered with Formula 1 compound alone (G5-G7) compared to the AMLN diet control group (G2). In the positive control group (G3), TIMP-1 gene expression was significantly decreased compared to the AMLN diet (G2).
이러한 TIMP-1은 폐 섬유증을 포함하는 다양한 섬유증에 연관된 것으로 알려져 있다 (Matrix Biology, Volumes 44-46, May-July 2015, Pages 247-254; Int J Immunopathol Pharmacol Jul-Sep 2006, 19(3), 471-487).TIMP-1 is known to be involved in various fibrosis, including pulmonary fibrosis (Matrix Biology, Volumes 44-46, May-July 2015, Pages 247-254; Int J Immunopathol Pharmacol Jul-Sep 2006, 19(3), 471-487).
그 결과를 종합하여 도 14 내지 도 15에 나타내었다.The results are summarized and shown in Figures 14 and 15.
도 14은 TIMP-1 유전자의 발현을 분석한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)에서 TIMP-1 유전자의 발현은 정상 대조군 (G1) 대비 30.8 배 정도 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)과 화학식 1 화합물 10, 20 mg/kg 단독 투여군 (G6-G7)에서 정상 대조군 (G1) 대비 각각 4.6 (p<0.0001), 8.1 (p<0.001), 7.8 (p<0.001) 배 수준으로 AMLN diet 대조군 (G2)에 비해 유의한 감소를 나타내었다. 양성 대조군 (G3)에서 정상 대조군 (G1) 대비 12.2 배 수준으로 AMLN diet 대조군 (G2)에 비해 유의한 감소를 나타내었다 (p<0.01).Figure 14 shows the results of analyzing the expression of the TIMP-1 gene. In the AMLN diet control group (G2), the expression of the TIMP-1 gene was found to be significantly increased by 30.8 times compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). In the combined administration group (G4) and the Formula 1 compound 10 and 20 mg/kg single administration group (G6-G7), the mean values were 4.6 (p<0.0001), 8.1 (p<0.001), and 7.8 (p<0.001), respectively, compared to the normal control group (G1). It showed a significant decrease compared to the AMLN diet control group (G2) at a fold level. The positive control group (G3) showed a significant decrease compared to the AMLN diet control group (G2) at a level of 12.2 times that of the normal control group (G1) (p<0.01).
도 15은 Collagen type 1 유전자의 발현을 분석한 결과이다. AMLN diet 대조군 (G2)에서 Collagen type 1 유전자의 발현은 정상 대조군 (G1) 대비 7.9 배 정도 유의하게 증가하는 것으로 나타났다 (p<0.0001). 병용 투여군 (G4)에서 정상 대조군 (G1) 대비 1.5 (p<0.001) 배 수준으로 AMLN diet 대조군 (G2)에 비해 유의한 감소를 나타내었다.Figure 15 shows the results of analyzing the expression of Collagen type 1 gene. In the AMLN diet control group (G2), the expression of Collagen type 1 gene was significantly increased by 7.9 times compared to the normal control group (G1) (p<0.0001). The combined administration group (G4) showed a significant decrease compared to the AMLN diet control group (G2) at a level of 1.5 (p<0.001) times that of the normal control group (G1).
(6) 종합 의견(6) Comprehensive opinion
본 시험 조건 하에서 AMLN (Amylin liver NASH) diet로 유발된 비알콜성 지방간염 C57BL/6N mouse 모델에 시험 물질을 12주간 반복 투여하였을 때, 페노피브레이트와 화학식 1 화합물의 병용 투여군에서 화학식 1 화합물 단독 투여군 대비 혈장 내 TG, TC, Glucose, ALT, AST, HDL 및 LDL 수준이 통계학적으로 유의한 감소 양상이 관찰되었다. 또한, 조직병리학적 검사 결과 간 조직 내 지방 축적 정도, 콜라겐 침착 정도, 섬유아세포 비중 및 NAS 수치의 유의한 감소가 관찰되었고, 유전자 발현 분석 결과 TIMP-1 및 Collagen type 1 유전자 발현이 유의하게 감소하는 것으로 관찰되었다.When the test substance was administered repeatedly for 12 weeks to the C57BL/6N mouse model of non-alcoholic steatohepatitis induced by the AMLN (Amylin liver NASH) diet under the test conditions, the group administered in combination with fenofibrate and the compound of Formula 1 was compared to the group administered with the compound of Formula 1 alone. A statistically significant decrease in plasma levels of TG, TC, Glucose, ALT, AST, HDL and LDL was observed. In addition, as a result of histopathological examination, a significant decrease in the degree of fat accumulation, degree of collagen deposition, fibroblast proportion, and NAS level in liver tissue was observed, and gene expression analysis showed a significant decrease in TIMP-1 and Collagen type 1 gene expression. It was observed that
Claims (4)
[화학식 1]
Treatment or prevention of steatohepatitis, hepatic steatosis, or liver fibrosis, characterized in that it contains (i) a compound of Formula 1 and (ii) fenofibric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as active ingredients. For pharmaceutical preparations.
[Formula 1]
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|---|---|---|---|
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ID=
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| US20190247343A1 (en) * | 2016-04-15 | 2019-08-15 | Gencod | Use of fenofibric acid in the treatment of hepatic diseases |
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
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| KR102177304B1 (en) * | 2018-07-23 | 2020-11-10 | 제이투에이치바이오텍 (주) | Pharmaceutical composition for prevention or treatment of non-alcoholic steatohepatitis |
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