KR102672567B1 - SNP marker composition for discriminating Cyperaceae plant 'Carex mollicula' and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사초과 식물 '애기흰사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 SNP 마커는 사초과 식물인 애기흰사초를 정확하게 판별할 수 있으므로, 사초과 식물의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The present invention relates to a SNP marker composition and its use for identifying the Cyperaceae plant 'White Cypress'. The SNP marker of the present invention can accurately identify the Cyperaceae plant 'White Cypress', thereby protecting the varieties of Cyperaceae plants and seeds. It may be useful in establishing a management system.
Description
본 발명은 사초과 식물 '애기흰사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a SNP marker composition and its use for identifying the Cyperaceae plant 'Baby Cypress'.
사초과(Cyperaceae)의 애기흰사초(Carex mollicula)는 숲 가장자리 축축한 곳에서 자라는 여러해살이풀로, 한국(함남, 전북, 전남, 제주), 중국, 일본, 대만 등에 분포한다. 길게 뻗는 땅속줄기가 있으며 높이는 15~30 cm이다. 잎은 줄기와 비슷하거나 길고, 뚜렷한 세 개의 맥이 있으며, 아래쪽의 잎집은 연한 갈색이다. 꽃차례의 꽃싸개잎은 잎 모양이고 잎집은 없다. 꽃은 5~6월에 피는데 가장 위의 이삭에는 수꽃만 달리고, 그 아래에 모여 달리는 여러 개의 이삭은 암꽃으로만 구성되며, 암꽃의 인편은 끝이 뾰족하거나 짧은 꼬리처럼 된다. 씨방을 둘러싼 과낭에는 5~6개의 맥이 있고 털은 없다. 개찌버리사초와 비교하여 암꽃이삭에 대가 없고 줄기 끝에 이삭들이 모여 달리며, 골사초와는 과낭의 부리가 길고, 이삭이 원기둥 모양이라는 점으로 구별된다. Carex mollicula , a member of the Cyperaceae family, is a perennial plant that grows in moist places at the edge of forests and is distributed in Korea (Hamnam, Jeonbuk, Jeonnam, Jeju), China, Japan, and Taiwan. It has a long underground stem and is 15 to 30 cm tall. The leaves are similar to or longer than stems, have three distinct veins, and the lower leaf sheath is light brown. The inflorescence's inflorescence leaves are leaf-shaped and have no leaf sheath. Flowers bloom from May to June, and the top ear has only male flowers, and the several ears clustered below it consist of only female flowers, and the scales of the female flowers have sharp ends or resemble short tails. The fruit sac surrounding the ovary has 5 to 6 veins and is hairless. Compared to Gaejjibeori Sedge, the female flower spikes do not have stems and the ears grow together at the end of the stem. It is distinguished from Bone Sedge in that the beak of the fruit capsule is long and the ears are cylindrical.
사초과는 속씨식물군의 외떡잎식물군 중 벼목(Poales)에 속하는 식물군으로, 북반구와 남반구의 온대를 중심으로 널리 분포하고 있으며, 세계적으로 약 109속 5,500종이 보고되어 있다. 우리나라에는 300여 분류군이 있다고 알려져 있으며, 린네(Linne)에 의해 고랭이속(Scirpus sp.), 방동사니속(Cyperus sp.) 및 사초속(Carex sp.)으로 정리되었던 사초과 식물은 후대 학자들에 의해 속 단위로 많은 분류가 이루어졌다. Cyperaceae is a plant group belonging to the Poales family of monocots of the angiosperm group. It is widely distributed in temperate regions of the northern and southern hemispheres, and about 109 genera and 5,500 species have been reported worldwide. It is known that there are over 300 taxa in Korea, and the Cyperaceae plants, which were organized by Linne into the genus Scirpus sp., Cyperus sp., and Carex sp., were recognized by later scholars. Many classifications have been made at the genus level.
사초과는 벼과(Poaceae) 식물들과 함께 잡초로 취급되는 식물이지만 식물진화의 역사에 있어서 매우 큰 종 다양성을 가지는 발달된 식물군들 중 하나이고, 초지 생태계를 이루는 주요 식물군이다. 사초과와 벼과는 잎, 줄기 등의 형태가 비슷하고, 종을 분류하는 가장 중요한 형질인 열매가 익는 기간이 2~3주로 짧은 데다 열매가 익으면 떨어져서 잎만 남기 때문에 정확한 동정이 어렵다. 사초과는 의약용, 식용 등으로 다양하게 이용되고 있음에도 불구하고 세계적으로 체계적인 연구가 미비한 실정이다. 따라서 사초과 식물을 생물자원으로서 활용하기 위해서는 분류학적 실체를 밝히고 특성을 규명하는 일이 시급하다. Cyperaceae is a plant that is treated as a weed along with plants of the Poaceae family, but it is one of the developed plant groups with very large species diversity in the history of plant evolution, and is a major plant group that makes up the grassland ecosystem. Cyperaceae and Poaceae have similar shapes of leaves, stems, etc., and the ripening period of the fruit, which is the most important characteristic in classifying the species, is only 2 to 3 weeks, and when the fruit ripens, it falls off, leaving only the leaves, making accurate identification difficult. Although Cyperaceae is widely used for medicinal and edible purposes, there is a lack of systematic research worldwide. Therefore, in order to utilize Cyperaceae plants as biological resources, it is urgent to reveal their taxonomic identity and identify their characteristics.
한편, 한국등록특허 제2086854호에는 '사초과 식물 추출물을 함유하는 항산화 또는 항염용 화장료 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 사초과 식물 '애기흰사초'를 판별하기 위한 SNP 마커 조성물 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.Meanwhile, Korean Patent No. 2086854 discloses an 'antioxidant or anti-inflammatory cosmetic composition containing extracts of Cyperaceae plants', but the SNP marker composition for identifying the Cyperaceae plant 'White Cypress' of the present invention and its use are not discussed. Nothing has been written down.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기흰사초(Carex mollicula)의 엽록체 게놈 서열을 조립한 후 애괭이사초(Carex laevissima)의 참조 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1)과 비교하여 psbA 유전자에서 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커를 발굴하였다. 또한, 상기 SNP 마커에 기반한 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트를 제작하여, 애기흰사초를 포함한 사초과 식물 10종을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 본 발명의 KASP 프라이머 세트가 애기흰사초를 정확하게 구별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present invention was derived from the above needs, and the present inventors assembled the chloroplast genome sequence of Carex mollicula and then assembled the reference chloroplast genome sequence of Carex laevissima (GenBank accession No. MZ846224. Compared to 1), a SNP (single nucleotide polymorphism) marker was discovered in the psbA gene. In addition, a KASP (Kompetitive allele specific PCR) primer set based on the above SNP marker was produced and PCR was performed on 10 species of Cyperaceae plants, including White Sedge. As a result, the results showed that the KASP primer set of the present invention accurately protects White Sedge. By confirming that distinction can be made, the present invention was completed.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 애기흰사초(Carex mollicula) 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.In order to solve the above problem, the present invention is a polynucleotide consisting of 8 or more consecutive nucleotides containing a SNP (single nucleotide polymorphism) base located at the 301st position in the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a complementary polynucleotide thereof. , provides a SNP marker composition for identification of baby white sedge ( Carex mollicula ).
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 애기흰사초 판별용 마이크로어레이를 제공한다.In addition, the present invention provides a microarray for discriminating Arabidopsis white sedge, comprising a polynucleotide containing the above SNP base or cDNA thereof.
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 애기흰사초 판별용 프로브를 제공한다.Additionally, the present invention provides a probe for determining Arabidopsis white sedge, comprising a polynucleotide containing the above SNP base or cDNA thereof.
또한, 본 발명은 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진, 애기흰사초 판별용 프라이머 세트를 제공한다.In addition, the present invention provides a primer set for identifying Arabidopsis white sedge, consisting of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 2 to 4 for amplifying polynucleotides containing the SNP base.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 애기흰사초 판별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides the primer set; and a reagent for performing an amplification reaction.
또한, 본 발명은 사초과(Cyperaceae) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 애기흰사초를 판별하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the steps of isolating genomic DNA from a Cyperaceae plant sample; Using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set according to the present invention to amplify the target sequence; and detecting the product of the amplification step.
본 발명의 SNP 마커는 사초과 식물인 애기흰사초를 정확하게 판별할 수 있으므로, 사초과 식물의 품종 보호와 종자 관리체계 확립에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.The SNP marker of the present invention can accurately identify White Cypress, a Cyperaceae plant, and can be usefully used to protect varieties of Cyperaceae plants and establish a seed management system.
도 1은 애기흰사초(Carex mollicula)의 엽록체 유전자 지도이다.
도 2는 본 발명의 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트(표 6)를 이용하여 사초과 식물 10종(좀목포사초, 애기반들사초, 애기흰사초, 갯청사초, 목포사초, 가지청사초, 가는흰사초, 진도사초, 양지사초, 주름청사초)에 대해 KASP 분석을 수행한 결과이다.Figure 1 is a chloroplast gene map of Carex mollicula .
Figure 2 shows the KASP (Kompetitive allele specific PCR) primer set of the present invention (Table 6) used to test 10 species of Cyperaceae plants (Sedge sedge, Sedge sedge, White sedge, Gaetcheong sedge, Mokpo sedge, Gagcheong sedge, This is the result of KASP analysis on fine white sedge, Jindo sedge, Yangji sedge, and wrinkled sedge).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열 중 301번째에 위치한 SNP(single nucleotide polymorphism) 염기를 포함하는 8개 이상의 연속된 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 애기흰사초(Carex mollicula) 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.In order to achieve the purpose of the present invention, the present invention provides a polynucleotide consisting of 8 or more consecutive nucleotides containing a SNP (single nucleotide polymorphism) base located at position 301 in the base sequence of SEQ ID NO: 1, or a complementary polynucleotide thereof. It provides a SNP marker composition for discrimination of baby white sedge ( Carex mollicula ), including:
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 연속된 뉴클레오티드는 8 내지 100개의 연속된 뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the contiguous nucleotides may be 8 to 100 contiguous nucleotides, but are not limited thereto.
본 명세서에서, 용어 '뉴클레오티드'는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드이며, 특별하게 다르게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.In this specification, the term 'nucleotide' refers to a deoxyribonucleotide or ribonucleotide that exists in single-stranded or double-stranded form, and includes analogs of natural nucleotides unless specifically stated otherwise.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 SNP 위치 염기는 서열번호 1의 염기서열에서 301번째로, 다형성 염기 정보는 표 5의 SNP 염기서열 정보에서 [/]로 표시하였으며, 본 발명의 서열번호 1의 염기서열은 표 5의 사선(/) 앞에 위치한 염기를 포함하는 서열을 의미한다.In the SNP marker composition according to one embodiment of the present invention, the SNP position base is 301st in the base sequence of SEQ ID NO: 1, and the polymorphic base information is indicated as [/] in the SNP sequence information in Table 5. The base sequence of SEQ ID No. 1 of the invention refers to a sequence containing the base located before the slash (/) in Table 5.
본 발명의 일 구현 예에 따른 SNP 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 1의 염기서열은 사초과 식물 유래 psbA 유전자 서열의 일부이다.In the SNP marker composition according to one embodiment of the present invention, the base sequence of SEQ ID NO: 1 is part of the psbA gene sequence derived from Cyperaceae plants.
본 발명의 SNP 마커를 애기흰사초 판별에 사용할 수 있는 것은, 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 SNP 변이 위치인 301번째가 A 또는 G로 다르게 나타나는 것에 근거한 것이다. 상기 SNP 위치 염기에 있어서, 서열번호 1의 염기서열 중 301번째 염기가 A일 경우 애기흰사초로, 301번째 염기가 G일 경우 사초과 식물 중 애기흰사초를 제외한 좀목포사초(C. brevispicula), 애기반들사초(C. tristachya), 갯청사초(C. breviculmis var. fibrillosa), 목포사초(C. genkaiensis), 가지청사초(C. polyschoena), 가는흰사초(C. alopecuroides), 진도사초(C. taihokuensis), 양지사초(C. nervata) 또는 주름청사초(C. rugata)로 판별할 수 있다. The reason that the SNP marker of the present invention can be used to identify Arabidopsis is based on the fact that the 301st SNP mutation position in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is expressed differently as A or G. In the base at the SNP position, if the 301st base in the base sequence of SEQ ID NO. 1 is A, it is C. brevispicula, and if the 301st base is G, it is C. brevispicula , excluding C. brevispicula among Cyperaceae plants. C. tristachya , Sedge sedge ( C. breviculmis var. fibrillosa ), Mokpo sedge ( C. genkaiensis ), Branch sedge ( C. polyschoena ), White sedge ( C. alopecuroides ), Jindo sedge ( It can be identified as C. taihokuensis , C. nervata , or C. rugata .
본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치의 염기 변이체에 관한 것이나, 이러한 SNP 염기 변이가 이중 가닥의 gDNA(게놈 DNA)에서 발견되는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 따라서 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에서 SNP 위치의 염기도 상보적인 염기가 된다. 이러한 측면에서, 본 명세서에 제시된 모든 서열은, 특별한 언급이 없는 한, 게놈 DNA의 센스 가닥에 있는 서열을 기준으로 한 것이다.The present invention relates to a nucleotide variant of the SNP position in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, but when such SNP nucleotide mutation is found in double-stranded gDNA (genomic DNA), it also includes a polynucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence. It is interpreted that Therefore, the base at the SNP position in the complementary polynucleotide sequence also becomes a complementary base. In this respect, all sequences presented herein are based on sequences in the sense strand of genomic DNA, unless otherwise specified.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 애기흰사초 판별용 마이크로어레이를 제공한다.The present invention also provides a microarray for determining Arabidopsis white sedge, comprising a polynucleotide containing the SNP base or cDNA thereof.
바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리 L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.Preferably, the polynucleotide may be immobilized on a substrate coated with an active group of amino-silane, poly L-lysine, or aldehyde, but is not limited thereto. Additionally, preferably, the substrate may be a silicon wafer, glass, quartz, metal, or plastic, but is not limited thereto. Methods for immobilizing the polynucleotide on a substrate include micropipetting using a piezoelectric method, a method using a pin-shaped spotter, etc.
본 명세서에서, 용어 '기판'은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건 하에 마커가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스), 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용하거나 고정하기 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2기, SH기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 비오틴, 합텐(hapten) 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.As used herein, the term 'substrate' refers to any substrate that possesses hybridization properties and to which a marker can be attached under conditions that the background level of hybridization is kept low. Typically, the substrate may be a microtiter plate, membrane (eg, nylon or nitrocellulose), microspheres (beads), or a chip. Before application to or immobilization on a membrane, nucleic acid probes can be modified to facilitate immobilization or improve hybridization efficiency. The modifications may include homopolymer tailing, coupling with different reactive functional groups such as aliphatic groups, NH 2 groups, SH groups and carboxyl groups, or coupling with biotin, haptens or proteins. .
본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.The microarray according to the present invention can be prepared by conventional methods known to those skilled in the art using the polynucleotide according to the present invention or its complementary polynucleotide, the polypeptide encoded by it, or its cDNA.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 cDNA를 포함하는, 애기흰사초 판별용 프로브를 제공한다.The present invention also provides a probe for determining Arabidopsis white sedge, comprising a polynucleotide containing the SNP base or cDNA thereof.
본 명세서에서, 용어 '프로브'는 혼성화 프로브로서, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 바람직하게는 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일 가닥, 더 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term 'probe' refers to a hybridization probe, which refers to a linear oligomer having a natural or modified monomer or linkage containing deoxyribonucleotides and ribonucleotides capable of sequence-specific binding to the complementary strand of a nucleic acid. . The probe of the present invention is an allele-specific probe, in which a polymorphic site is present among nucleic acid fragments derived from two members of the same species, and hybridizes to the DNA fragment derived from one member, but does not hybridize to the fragment derived from the other member. . Preferably, the probe may be single stranded for maximum efficiency in hybridization, more preferably a deoxyribonucleotide, but is not limited thereto.
본 명세서에서, 용어 '혼성화(hybridization)'는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.As used herein, the term 'hybridization' refers to complementary single-stranded nucleic acids forming double-stranded nucleic acids. Hybridization can occur between two nucleic acid strands that are either completely matched or substantially matched with some mismatches. Complementarity for hybridization may vary depending on hybridization conditions, especially temperature.
본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 SNP 뉴클레오티드인 서열번호 1의 301번째 위치의 뉴클레오티드를 포함하는 8 내지 100 개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 프로브의 3'-말단 또는 5'-말단은 상기 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3'-말단 또는 5'-말단에 SNP 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 당업계에 통상적으로 알려진 내용을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 하며, 온도, 이온 세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.As a probe used in the present invention, a sequence that is perfectly complementary to the polynucleotide containing the SNP may be used, but a substantially complementary sequence may be used to the extent that it does not interfere with specific hybridization. It could be. Preferably, the probe used in the present invention contains a sequence capable of hybridizing to a sequence containing 8 to 100 consecutive nucleotides including the nucleotide at position 301 of SEQ ID NO: 1, which is a SNP nucleotide. More preferably, the 3'-end or 5'-end of the probe has a base complementary to the SNP base. In general, since the stability of the duplex formed by hybridization tends to be determined by the match of the terminal sequences, the terminal portion of the probe having a base complementary to the SNP base at the 3'-end or 5'-end Without hybridization, these duplexes can disassemble under stringent conditions. Suitable conditions for hybridization can be determined by referring to information commonly known in the art. The stringent conditions used for hybridization must be sufficiently stringent to ensure hybridization to only one of the alleles, and can be determined by controlling temperature, ionic strength (buffer concentration), and the presence of compounds such as organic solvents. These stringent conditions may vary depending on the sequence being hybridized.
본 발명은 또한, 상기 SNP 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하기 위한 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머로 이루어진, 애기흰사초 판별용 프라이머 세트를 제공한다.The present invention also provides a primer set for identifying Arabidopsis white sedge, consisting of oligonucleotide primers of SEQ ID NOs: 2 to 4 for amplifying polynucleotides containing the SNP base.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1로 표시되는 염기서열 중 301번째 SNP 변이 위치를 확인할 수 있는 KASP(Kompetitive allele specific PCR) 프라이머 세트일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In one embodiment of the present invention, the primer set may be a KASP (Kompetitive allele specific PCR) primer set capable of confirming the 301st SNP mutation position in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
본 명세서에서, 용어 'KASP'는 PCR(polymerase chain reaction) 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전자형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.In this specification, the term 'KASP' is one of the PCR (polymerase chain reaction)-based analysis methods, which is a homogenous and fluorescence-based genotyping analysis technology. KASP is a technology based on fluorescence resonance energy transfer for allele-specific oligo extension and signal generation.
본 발명의 KASP 프라이머 세트는 서열번호 3개의 올리고뉴클레오티드가 하나의 프라이머 세트를 이루며, 2개의 정방향 프라이머와 1개의 역방향 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트에 있어서 서열번호 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드는 순서대로 FAM이 결합된 정방향 프라이머, HEX가 결합된 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성되어 있으며, 구체적으로 정방향 프라이머의 5' 말단에는 FAM 또는 HEX 형광물질이 부착되어 있고 3' 말단에는 SNP 염기가 결합되어 있으며, 공통의 역방향 프라이머 1개로 구성되어 있다.The KASP primer set of the present invention consists of three oligonucleotides with SEQ ID NO: 3 oligonucleotides forming one primer set, and consists of two forward primers and one reverse primer. In the primer set of the present invention, the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 2 to 4 are composed of a forward primer to which FAM is bound, a forward primer to which HEX is bound, and a reverse primer, in that order. Specifically, at the 5' end of the forward primer, FAM or HEX fluorescent material is attached, a SNP base is attached to the 3' end, and it consists of one common reverse primer.
상기 프라이머 세트는 각 프라이머 세트의 서열 길이에 따라 서열번호 2 내지 4의 서열 내의 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 2의 프라이머(24개의 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 2의 서열 내의 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 2 내지 4의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. The primer set may include oligonucleotides consisting of segments of 21 or more, 22 or more, 23 or more, 24 or more, 25 or more consecutive nucleotides in the sequence of SEQ ID NOs. 2 to 4, depending on the sequence length of each primer set. You can. For example, the primer (24 oligonucleotides) of SEQ ID NO: 2 may include an oligonucleotide consisting of a segment of 21 or more, 22 or more, or 23 or more consecutive nucleotides within the sequence of SEQ ID NO: 2. In addition, the primer may also include sequences in which the base sequences of SEQ ID NOs: 2 to 4 are added, deleted, or substituted.
본 명세서에서, 용어 '프라이머'는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 혀용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.As used herein, the term 'primer' refers to a single-stranded oligonucleotide sequence complementary to the nucleic acid strand to be copied, and can serve as a starting point for the synthesis of a primer extension product. The length and sequence of the primers should be used to initiate synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primer will depend on the complexity of the DNA or RNA target desired as well as the conditions under which the primer is used, such as temperature and ionic strength.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, HRP (horse radish peroxidase), 알칼리 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 비오틴) 등이 있다.In the present specification, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioate, alkylphosphorothioate, or peptide nucleic acid, or May contain an intercalating agent. Additionally, primers may incorporate additional features that do not change the basic nature of the primer serving as the starting point for DNA synthesis. The primer nucleic acid sequence of the present invention may, if necessary, contain a label detectable directly or indirectly by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical means. Examples of labels include enzymes (e.g., HRP (horse radish peroxidase), alkaline phosphatase), radioactive isotopes (e.g., 32 P), fluorescent molecules, chemical groups (e.g., biotin), etc. there is.
프라이머의 적합한 길이는 사용하고자하는 프라이머의 특성에 의해 결정된다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.The appropriate length of the primer is determined by the characteristics of the primer to be used. Primers do not have to be exactly complementary to the sequence of the template, but must be complementary enough to form a hybrid-complex with the template.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는, 애기흰사초 판별용 키트를 제공한다.The present invention also provides the primer set; and a reagent for performing an amplification reaction.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 바와 같다.In the kit of the present invention, the primer set is as described above.
본 발명의 키트에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the kit of the present invention, reagents for performing the amplification reaction may include, but are not limited to, DNA polymerase, dNTPs, and buffer.
본 발명의 애기흰사초 판별용 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.The kit for determining Baby's White Sedge of the present invention may additionally include a user guide that describes optimal reaction performance conditions. The guide is a printed material that explains how to use the kit, for example, how to prepare PCR buffer, and the suggested reaction conditions. Instructions include information leaflets in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit. Additionally, the guide includes information disclosed or provided through electronic media such as the Internet.
본 발명은 또한,The present invention also,
사초과(Cyperaceae) 식물 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; Isolating genomic DNA from a Cyperaceae plant sample;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 Using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set of the present invention to amplify the target sequence; and
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 애기흰사초를 판별하는 방법을 제공한다.It provides a method for identifying Baby's White Sedge, including the step of detecting a product of the amplification step.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트는 전술한 것과 같다.In the method according to one embodiment of the present invention, the primer set is the same as described above.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 사초과 식물은 좀목포사초(Carex brevispicula), 애기반들사초(C. tristachya), 애기흰사초(C. mollicula), 갯청사초(C. breviculmis var. fibrillosa), 목포사초(C. genkaiensis), 가지청사초(C. polyschoena), 가는흰사초(C. alopecuroides), 진도사초(C. taihokuensis), 양지사초(C. nervata) 또는 주름청사초(C. rugata)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the Cyperaceae plants include Carex brevispicula , C. tristachya , C. mollicula , and C. breviculmis var. fibrillosa , C. genkaiensis , C. polyschoena , C. alopecuroides , Jindo sedge ( C. taihokuensis ), C. nervata , or wrinkled sedge (. C. rugata ), but is not limited thereto.
본 발명의 방법은 사초과 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 사초과 식물 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용 가능한 키트를 이용할 수도 있다.The method of the present invention includes the step of isolating genomic DNA from a Cyperaceae plant sample. The method of isolating genomic DNA from the Cyperaceae plant sample can be done using a method known in the art, for example, the CTAB method or the Wizard prep kit (Promega). The target sequence can be amplified by using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using a primer set according to an embodiment of the present invention. Methods for amplifying target nucleic acids include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction, nucleic acid sequence-based amplification, transcription-based amplification system, There are strand displacement amplification or amplification via Qβ replicase or any other suitable method for amplifying nucleic acid molecules known in the art. Among these, PCR is a method of amplifying a target nucleic acid from a primer pair that specifically binds to the target nucleic acid using polymerase. These PCR methods are well known in the art, and commercially available kits can also be used.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 사초과 식물의 시료는 식물체의 종자, 잎, 열매, 뿌리 또는 줄기 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the sample of the Cyperaceae plant may be a plant seed, leaf, fruit, root, or stem, but is not limited thereto.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 표지 물질은 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5' 말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 하기 표 6에 기재된 바와 같다.In the method according to one embodiment of the present invention, the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance. The labeling material may be a fluorescent, phosphorescent, or radioactive material, but is not limited thereto. Preferably, the labeling substance may be FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 or Cy5. When amplifying a target sequence and performing PCR by labeling the 5' end of the primer with the labeling material, the target sequence can be labeled with a detectable fluorescent labeling material. The oligonucleotide primer sets used to amplify the target sequence are listed in Table 6 below.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 애기흰사초를 판별하는 방법은 상기 증폭 단계의 산물을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 증폭 단계의 산물의 분석은 SNP 유전형 분석(single nucleotide polymorphism genotyping) 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 HRM(High resolution melting) 분석 또는 염기서열 결정(sequencing)을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the method according to one embodiment of the present invention, the method for identifying Baby's White Sedge includes analyzing the product of the amplification step, and the analysis of the product of the amplification step is performed by SNP genotyping (single nucleotide polymorphism genotyping). Any method may be used, preferably through HRM (high resolution melting) analysis or sequencing, but is not limited thereto.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples. However, the following examples only illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
재료 및 방법Materials and Methods
1. 식물재료 및 DNA 추출1. Plant material and DNA extraction
국립백두대간수목원에서 채집 및 보유하고 있는 사초과 10종(좀목포사초, 애기흰사초, 목포사초, 양지사초, 진도사초, 애기반들사초, 주름청사초, 가는흰사초, 가지청사초, 갯청사초)의 종자를 대상으로 APrepTM Total DNA 키트(APBIO, 한국)를 사용하여 게노믹 DNA를 추출하였다. 구체적으로, 단백질 분해효소 K(100 ㎍/㎖) 20 ㎕와 RNase(10 mg/㎕) 4 ㎕를 포함하는 DNA 추출용 버퍼 200 ㎕를 소량의 종자 시료에 첨가한 후 비드 비팅하여 분쇄하였다. 그 다음, 65℃로 조정된 항온 용기에서 10분 동안 배양하고, 반응액을 약 13,000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 상등액을 수득한 후 상등액을 새로운 1.5 ㎖ 마이크로 튜브로 옮겼다. 동량의 100% 에탄올을 첨가하고, 반응액을 스핀 컬럼(spin colume)에 넣어 원심분리한 후 세척 버퍼를 사용하여 2회 세척하였다. 새로운 튜브로 옮긴 스핀 컬럼에 30 ㎕의 멸균된 3차 증류수를 넣어 DNA를 추출하였다. 10 species of Cyperaceae collected and held at the National Baekdudaegan Arboretum (Sedge sedge, White sedge, Mokpo sedge, Yangji sedge, Jindo sedge, White sedge, Wrinkled sedge, Fine white sedge, Branched sedge, and Gaetcheong sedge ) Genomic DNA was extracted from the seeds using the APrep TM Total DNA kit (APBIO, Korea). Specifically, 200 μl of DNA extraction buffer containing 20 μl of proteinase K (100 μg/ml) and 4 μl of RNase (10 mg/μl) was added to a small amount of seed sample and pulverized by bead beating. Next, the culture was incubated for 10 minutes in a constant temperature container adjusted to 65°C, the reaction solution was centrifuged at about 13,000 rpm for 1 minute to obtain a supernatant, and the supernatant was transferred to a new 1.5 ml micro tube. An equal amount of 100% ethanol was added, the reaction solution was placed in a spin column, centrifuged, and washed twice using a washing buffer. DNA was extracted by adding 30 μl of sterilized triple distilled water to the spin column, which was transferred to a new tube.
2. 전장유전체(Whole genome sequencing) 분석을 위한 라이브러리 제작 및 데이터 생산2. Library production and data production for whole genome sequencing analysis
상기 추출한 게노믹 DNA는 1.5% 아가로스 겔에 전기영동, nanodrop 및 Qubit을 활용하여 정량 및 품질을 확인하였다. WGS 분석을 위한 라이브러리 제작을 위한 게노믹 DNA의 권장 농도는 nanodrop 측정 기준으로 20 ng 이상/㎕, Qubit 사용 측정 기준으로 10 ng 이상/㎕, 총 부피가 30 ㎕ 이상이다. Quantification and quality of the extracted genomic DNA was confirmed using electrophoresis on a 1.5% agarose gel, nanodrop, and Qubit. The recommended concentration of genomic DNA for library production for WGS analysis is more than 20 ng/μl based on nanodrop measurement, more than 10 ng/μl based on measurement using Qubit, and more than 30 μl in total volume.
WGS 분석을 위한 라이브러리는 QIAseq FX DNA Library Kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 제조사 지침에 따라 작성하였다. 제작한 라이브러리는 TapeStation HS D1000Screen Tape(Agilent, 미국) 장비를 활용하여 라이브러리에 삽입된 주형의 크기에 대해 품질 검사를 수행하였으며, 평균 삽입된 크기는 330~365 bp였다. NovaSeq6000 장비(Illumina Inc, 미국)를 활용하여 150 bp로 양방향(2×150 bp paired-end)으로 읽어 각 사초과 샘플 마다 10 Gb의 데이터를 생산하였다. The library for WGS analysis was prepared using the QIAseq FX DNA Library Kit (Qiagen, Germany) according to the manufacturer's instructions. The produced library was quality inspected for the size of the template inserted into the library using TapeStation HS D1000Screen Tape (Agilent, USA) equipment, and the average inserted size was 330 to 365 bp. Using the NovaSeq6000 equipment (Illumina Inc, USA), 150 bp was read in both directions (2 × 150 bp paired-end), producing 10 Gb of data for each Cyperaceae sample.
3. 애기흰사초의 엽록체 게놈 어셈블리(Chloroplast genome assembly)3. Chloroplast genome assembly of Babylonian sedge
Short reads의 전처리 과정(sequence pre-processing)은 PCR duplicate reads를 제거하고, Trimmomatic(v. 0.39)(Anthony M. Bolger et al., Bioinformatics, 2014, 30(15), 2114-2120)으로 어댑터 서열을 제거한 후 수행하였다. SLIDINGWINDOW, LEADING, TRAILING 옵션을 이용하여 트리밍(trimming) 및 QC(quality control)를 다음과 같은 조건에 따라 수행하였다. 1) window size=4, mean quality≥15; 2) LEADING, TRAILING≥3; 3) minimum length of reads≥36 bp.Sequence pre-processing of short reads removes PCR duplicate reads and adapter sequences with Trimmomatic (v. 0.39) (Anthony M. Bolger et al ., Bioinformatics, 2014, 30(15), 2114-2120). This was performed after removing. Trimming and QC (quality control) were performed using the SLIDINGWINDOW, LEADING, and TRAILING options according to the following conditions. 1) window size=4, mean quality≥15; 2) LEADING, TRAILING≥3; 3) minimum length of reads≥36 bp.
엽록체 게놈 어셈블리는 현재 어셈블리 툴(assembly tool) 중에서 정확도가 높다고 평가받는 Getorganelle 프로그램을 사용하여 참조 유전체 서열없이 1차 어셈플리를 진행하였고, WGS 분석 과정에서 생성된 긴 콘티그(contig)를 NCBI에 BLAST하였을 때 정확도가 높은 NCBI GenBank NC_072263.1의 사초과 엽록체 유전체(Carex breviculmis chloroplast, complete genome)를 엽록체 유전체 어셈블을 위한 참조 유전체로 선정하였다. 참조 유전체를 이용하여 NOVOPlasty 프로그램(https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty), Fast-Plast 프로그램(https://github.com/mrmckain/Fast-Plast) 및 GetOrganelle 프로그램(https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle)을 사용하여 엽록체 게놈 어셈블리를 수행하였다. 생성된 여러 콘티그 조각들은 참조 유전체를 기준으로 조합하여 하나의 콘티그 서열로 작성하였으며, 참조 유전체 서열을 참조하여 GeSeq 프로그램(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html)을 통해 엽록체 유전체 서열의 유전자 부위를 결정(chloroplast genome annotation)하였다(표 1). Chloroplast genome annotation 결과는 ODGRAW tools를 이용하여 시각화하여 엽록체 게놈 맵으로 작성하였다(도 1).For chloroplast genome assembly, Getorganelle is evaluated as having high accuracy among current assembly tools. The first assembly was performed without a reference genome sequence using the program, and when the long contigs generated during the WGS analysis were BLASTed to NCBI, the Cyperaceae chloroplast genome (Carex breviculmis chloroplast) of NCBI GenBank NC_072263.1 with high accuracy was obtained. , complete genome) was selected as the reference genome for assembling the chloroplast genome. Using the reference genome, the NOVOPlasty program (https://github.com/ndierckx/NOVOPlasty), the Fast-Plast program (https://github.com/mrmckain/Fast-Plast), and GetOrganelle Chloroplast genome assembly was performed using the program (https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle). Several generated contig fragments were combined based on the reference genome to create one contig sequence, and the GeSeq program (https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html) was used with reference to the reference genome sequence. The gene region of the chloroplast genome sequence was determined through chloroplast genome annotation (Table 1). Chloroplast genome annotation results were visualized using ODGRAW tools and created as a chloroplast genome map (Figure 1).
4. WGS 분석 및 SNP 탐색4. WGS analysis and SNP exploration
4-1. 시퀀스 전처리(sequence pre-processing)4-1. Sequence pre-processing
Short reads의 전처리 과정은 PCR duplicate reads를 제거하고, Trimmomatic (v. 0.39)으로 어댑터 서열을 제거한 후 수행하였다. 전처리 조건은 상기와 동일하다.Preprocessing of short reads was performed after removing PCR duplicate reads and adapter sequences with Trimmomatic (v. 0.39). Pretreatment conditions are the same as above.
4-2. 참조 유전체 정렬(alignment to reference genome)4-2. Alignment to reference genome
전처리 과정을 통과한 cleaned reads를 BWA(0.7.17-r1188) 프로그램을 사용하여 참조 유전체 서열에 맵핑하였다. SNP 분석을 위한 참조 유전체로 애괭이사초(Carex laevissima) 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1)을 이용하였다. 맵핑 과정은 참조 유전체 서열과 시퀀싱 샘플간의 raw SNP를 탐지하기 위한 선행과정으로, BAM format의 파일을 생성하였다.Cleaned reads that passed the preprocessing process were mapped to the reference genome sequence using the BWA (0.7.17-r1188) program. The chloroplast genome sequence of Carex laevissima (GenBank accession No. MZ846224.1) was used as a reference genome for SNP analysis. The mapping process is a prerequisite for detecting raw SNPs between the reference genome sequence and sequencing samples, and a file in BAM format was created.
4-3. Raw SNP 탐지 및 공통서열(consensus sequence) 추출4-3. Raw SNP detection and consensus sequence extraction
BAM format의 파일을 DeepVariant 프로그램을 사용하여 raw SNP(In/Del)를 검출하고, 공통서열을 추출하였다. 이때, SNP(In/Del)를 탐지하는 과정 전에 SEEDERS in-house script를 이용하여 SNP validation을 거친 후에 raw SNP(In/Del)를 탐지하였다. Raw SNPs (In/Del) were detected in BAM format files using the DeepVariant program, and common sequences were extracted. At this time, before the process of detecting SNP (In/Del), raw SNP (In/Del) was detected after SNP validation using SEEDERS in-house script.
4-4. SNP 마커 후보군 확보4-4. Securing SNP marker candidates
사초과 10종(좀목포사초, 애기흰사초, 목포사초, 양지사초, 진도사초, 애기반들사초, 주름청사초, 가는흰사초, 가지청사초, 갯청사초)을 대상으로 한 WGS 분석을 통해 확보한 유전체 분석 결과로부터, 사초과 10종을 구별할 수 있는 마커 후보군인 SNP marker set 1에서 12가지 조합에 해당하는 37좌 변이를 확보하였고(표 2), SNP marker set 2에서 17가지 조합에 해당하는 1,168좌 변이를 확보하였다(표 3).Secured through WGS analysis of 10 species of Cyperaceae (Sedge sedge, White sedge, Mokpo sedge, Yangji sedge, Jindo sedge, Trifolium sedge, Wrinkled sedge, Slender white sedge, Branched sedge, and Gaetcheong sedge) From the results of one genome analysis, 37 locus mutations corresponding to 12 combinations were obtained in SNP marker set 1, which is a marker candidate that can distinguish 10 species of Cyperaceae (Table 2), and 17 combinations in SNP marker set 2. 1,168 locus mutations were obtained (Table 3).
4-5. 애기흰사초 판별을 위한 SNP 마커 선별4-5. SNP marker selection for identification of baby white sedge
SNP marker set 1 및 SNP marker set 2에 포함된 총 29개의 후보 SNP 마커 중, 사초과에서만 증폭되고, 사초과 10종을 각각 구별할 수 있는 마커들을 선별하였다. 상기 SNP 마커 중에서 애기흰사초를 특이적으로 구별할 수 있는 SNP 마커를 최종 선별하였으며, 최종 선별된 SNP 마커는 참조 엽록체 게놈 서열(GenBank accession No. MZ846224.1) 기준 psbA 유전자에 위치한다. 본 발명의 애기흰사초 특이적 SNP 마커 정보, SNP 주변부 서열(flanking sequence) 정보 및 SNP에 기반하여 제작된 KASP 프라이머 세트 정보는 각각 표 4 내지 표 6에 나타내었다.Among a total of 29 candidate SNP markers included in SNP marker set 1 and SNP marker set 2, markers that were amplified only in Cyperaceae and could distinguish each of 10 species of Cyperaceae were selected. Among the SNP markers, SNP markers that can specifically distinguish Arabidopsis were finally selected, and the final selected SNP marker is located in the psbA gene based on the reference chloroplast genome sequence (GenBank accession No. MZ846224.1). The baby white sedge-specific SNP marker information, SNP flanking sequence information, and KASP primer set information produced based on the SNP of the present invention are shown in Tables 4 to 6, respectively.
- SNP G: 참조 유전체 및 그 외 사초과 식물- SNP A: White sedge
- SNP G: Reference genome and other Cyperaceae plants
밑줄 및 굵은 글씨: SNP 위치 염기Underlined and bold: SNP location base
밑줄: SNP 위치 염기Underline: SNP location base
5. KASP 분석5. KASP analysis
주형 DNA 5 ㎕, KASP-TF V4.0 2X Master Mix/Standard ROX 5 ㎕ 및 KASP Assay mix(KASP 프라이머 세트 혼합) 0.14 ㎕가 혼합된 반응액을 이용하여 PCR 반응 및 분석을 진행하였다. 유전자 증폭 조건은 LGC Biosearch Technologies에서 제공하는 'Guide to running KASP genotyping on the ABI 7900 instrument'와 동일하게 진행하였으며, 증폭 조건은 61~55℃ touchdown protocol을 사용하였다. PCR reaction and analysis were performed using a reaction solution containing 5 μl of template DNA, 5 μl of KASP-TF V4.0 2X Master Mix/Standard ROX, and 0.14 μl of KASP Assay mix (KASP primer set mix). Gene amplification conditions were the same as those in the 'Guide to running KASP genotyping on the ABI 7900 instrument' provided by LGC Biosearch Technologies, and the 61-55℃ touchdown protocol was used for amplification conditions.
하기 표 7과 같이, 94℃에서 15분 동안 Hot-start activation한 후, 94℃에서 20초, 61~55℃ touchdown으로 10 cycles 증폭하고, 94℃에서 20초, 55℃에서 60초를 26 cycles 반복한 후, 30℃에서 60초를 1 cycle하였다. 음성대조군에는 증류수를 처리하였으며, 각 샘플은 3~4반복으로 실험하였다. 증폭량이 적을 경우에는 recycle을 진행하였으며, 하기 표 8과 같이 94℃에서 20초, 57℃에서 60초를 3 cycles 반복한 후, 30℃에서 60초를 1 cycle하였다.As shown in Table 7 below, after hot-start activation at 94°C for 15 minutes, amplification was performed for 10 cycles at 94°C for 20 seconds and 61-55°C touchdown, followed by 26 cycles of 94°C for 20 seconds and 55°C for 60 seconds. After repeating, one cycle was performed for 60 seconds at 30°C. The negative control group was treated with distilled water, and each sample was tested 3 to 4 times. When the amount of amplification was small, recycling was performed. As shown in Table 8 below, 3 cycles of 20 seconds at 94°C and 60 seconds at 57°C were repeated, followed by one cycle of 60 seconds at 30°C.
Hot-start activation<Stage 1>
Hot-start activation
94℃
94℃
15분
15 minutes
1
One
Touchdown<Stage 2>
Touchdown
(61℃ decreasing 0.6℃ per cycle to activate a final annealing/extension temperature of 55℃)61℃
(61℃ decreasing 0.6℃ per cycle to activate a final annealing/extension temperature of 55℃)
Amplification<Stage 3>
Amplification
(Read stage for qPCR instruments only)<Optional Stage 4>
(Read stage for qPCR instruments only)
Amplification<Stage 1>
Amplification
(Read stage for qPCR instruments only)<Optional Stage 4>
(Read stage for qPCR instruments only)
(any temperature below 40℃ is suitable for the read stage)30℃
(any temperature below 40℃ is suitable for the read stage)
실시예 1. 애기흰사초 판별을 위한 본 발명의 KASP 프라이머 세트의 검증Example 1. Verification of the KASP primer set of the present invention for identification of White Sedge.
본 발명의 KASP 프라이머 세트(표 6)를 사초과 식물 10종(좀목포사초, 애기반들사초, 애기흰사초, 갯청사초, 목포사초, 가지청사초, 가는흰사초, 진도사초, 양지사초, 주름청사초)에 적용하여 KASP 분석을 수행하였다. The KASP primer set of the present invention (Table 6) was applied to 10 types of Cyperaceae plants (Sedge sedge, White sedge, White sedge, Gaetcheong sedge, Mokpo sedge, Branch sedge, Fine white sedge, Jindo sedge, Yangji sedge, Wrinkle sedge KASP analysis was performed by applying it to Cheongsacho).
그 결과, 애기흰사초는 형광물질 HEX로 인해 y축에 가깝게 나타났고, 그 외 사초과 식물 9종은 형광물질 FAM으로 인해 x축에 가깝게 나타났다(도 2). 이를 통해, 본 발명의 SNP 마커 및 이에 기반하여 제작된 KASP 프라이머 세트는 다양한 사초과 식물 중에서 애기흰사초만을 정확하게 구별할 수 있음을 알 수 있다.As a result, white sedge appeared close to the y-axis due to the fluorescent substance HEX, and the other 9 species of Cyperaceae plants appeared close to the x-axis due to the fluorescent substance FAM (Figure 2). Through this, it can be seen that the SNP marker of the present invention and the KASP primer set produced based on it can accurately distinguish only white sedge among various Cyperaceae plants.
Claims (7)
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제5항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 애기흰사초를 판별하는 방법.Isolating genomic DNA from a Cyperaceae plant sample;
Using the isolated genomic DNA as a template and performing an amplification reaction using the primer set of claim 5 to amplify the target sequence; and
Detecting the product of the amplification step; A method for identifying Baby's White Sedge.
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| KR20230100949A (en) * | 2021-12-29 | 2023-07-06 | 주식회사 한국인삼공사 | Genetic Marker Having Single Nucleotide Polymorphism For Distinguishing Varieties Of Peony |
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2023
- 2023-11-02 KR KR1020230149777A patent/KR102672567B1/en active IP Right Grant
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