KR102671159B1 - 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석에 의한 종양 전이성 예측 및 종양 전이 저해제 스크리닝 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석을 이용하여 종양 세포의 전이성 여부를 판단하는 방법으로서 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법 및 종양 전이 저해제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 생체내와 유사한 3차원 환경에서 종양 세포를 배양하여 종양 모델을 형성하고 편구 형성 여부 및 편구의 원형도 및 볼록도를 측정함으로써 종양 세포의 전이 가능성을 예측하고, 새로운 종양 전이 저해제를 개발하기 위한 선별 과정에서 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석을 이용하여 종양 세포의 전이성 여부를 판단하는 방법으로서 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법 및 종양 전이 저해제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
전이(Metastasis)는 초기의 암 또는 종양 발생 부위에서 암세포 또는 종양 세포가 떨어져 나와 다른 곳으로 퍼져나가는 현상을 말한다. 암이 최초로 생긴 1차 종양 또는 원발성 종양(primary tumor)에서 종양 세포가 전이되어 새로운 종양을 형성하면 2차 종양 또는 전이성 종양이라고 하며, 원발성 종양과 유사한 성질을 나타낸다. 종양 세포는 전이를 위해 상피(epithelial)에서 중간엽(mesenchymal) 또는 중간엽에서 상피로 이행(transition)하며, 전이 기능을 가진 종양 세포는 주변 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 분해하며 침윤할 수 있는 구조를 갖추고 기저막을 뚫고 혈관 또는 림프관으로 들어가 이동하게 된다. 암환자의 종양 조직 1 g에서 매일 약 3 ~ 4x109개의 종양 세포가 떨어져 나와 혈관으로 들어가는데, 대부분의 종양 세포는 제거되지만 일부는 살아남아 순환 종양 세포(circulating tumor cell, CTC)가 되고 암 전이를 유발한다. 암에 있어서 전이가 진행되면 치유의 가능성은 많이 줄어들게 되므로, 암 전이가 진행되기 전에 종양 세포의 전이 가능성을 확인하고 적절한 치료 방법이 제시되어야 한다.
종양 전이성을 진단하기 위해서는 일반적으로 유전자 분석이나 단백질 분석에 기반하여 종양 세포의 유형을 분석할 수 있도록 충분한 양의 시료를 제공할 수 있는 고형 조직 생검이 사용된다. 그러나 유전자 분석 및 단백질 분석은 소요되는 시간 및 노동력이 많으며, 대형 장비나 기술에 의존적이다. 이를 보완하기 위해, 혈액, 땀, 침, 소변 등 체액을 이용한 액체 생검 기반의 종양 세포 분석법을 개발하려는 시도가 있었다. 액체 생검은 혈액 내 소량 존재하는 순환 종양 세포 (< 100/mL)를 분리하고 분석하는데 초점이 맞춰져 있으나, 종양 세포의 전이 특성을 검증하기 위한 추가 분석 기술이 필요하다.
한편, 암 치료에는 전통적으로 항암제를 이용한 화학요법이 널리 이용되고 있다. 항암제 개발을 위해서는 약물 후보들을 선별하고 그들의 효과를 비교 및 검증하는 전임상 실험(preclinical study)이 필수적으로 수행된다. 전임상 실험에서는 인체의 환경과 가까운 실험실 조건에서 수행되는 세포 배양이나 환자들의 체내 환경과 유사한 조직 모델링, 인간화된 동물모델 시스템 등이 사용된다. 현재까지는 세포의 형성, 기능 및 병리적 특성을 이해하는데 2차원적인 세포 배양법이나 동물 모델에 의존해왔으나, 생체를 이루는 조직 및 기관은 3차원 구조이므로 2차원적 세포 배양법에 의한 세포 형태, 세포와 세포 또는 세포와 기질 간의 상호작용을 연구하는데 한계가 있으며, 동물 모델은 인간과 유전학적으로 차이가 있어 예상치 못한 인체내 암과 약물 간의 치료반응으로 인해 부적절한 결과가 초래될 수 있다. 이러한 2차원 세포 배양법과 동물 모델의 한계를 보완하기 위해서는 3차원 세포 배양법이 적용될 수 있다. 3차원 세포 배양법은 생체내 환경과 유사하게 세포 형태 및 신호전달을 유도하며, 다량의 실험을 동시에 수행할 있고, 실시간으로 세포 형태의 변화를 관찰할 수 있다는 이점이 있다.
최근에는 전이성을 가지는 종양 세포의 조기 검출 및 약물 반응성 분석을 위해 3차원 세포 배양법을 이용하려는 시도가 있었으나, 아직 시작 단계로 여전히 많은 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석에 의한 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석에 의한 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 a) 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에 함유된 종양 세포를 3차원 배양하는 단계; 및 c) 상기 3차원 배양된 종양 세포의 편구 형성 여부, 원형도 및 볼록도를 측정하는 단계를 포함하는 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 "종양(tumor)"은 생체내 세포가 자율성을 가지고 계속 진행되는 세포 분열에 의해 과잉 발육 또는 증식하는 것을 의미하며, 발육 상태에 따라 양성 종양과 악성 종양으로 구분될 수 있다. 양성 종양은 지방이나 신경세포 등이 과도하게 증식하여 덩어리가 된 것으로 커지는 속도가 느리며 일정 크기 이상 자라지 않는 반면, 악성 종양은 암(cancer)으로서 자라는 속도가 매우 빠르며 주변 조직에 침윤되고 전이 특성을 가진다. 본 발명에서의 종양은 암과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 종양이 최초 발생한 부위를 중심으로 주위에 연속적을 퍼지는 것을 원발성, 주로 혈관 또는 림프관을 통해 최초 종양 발생 부위로부터 떨어진 자리에 옮겨 발육하는 것을 전이성 종양이라 한다.
본 발명에서 사용된 "전이(metastasis)"는 암 또는 종양이 최초 발생 부위에서 다른 부위로 이동하여 정착 및 증식하는 상태를 의미한다. 암에 있어서 전이가 진행되면 치유의 가능성은 많이 줄어들게 되므로, 전이가 진행되기 전에 종양 세포의 전이 가능성을 확인하는 것이 중요하다.
본 발명에서 사용된 "종양 전이성 예측"은 암환자 또는 암이 의심되는 환자의 종양 상태, 즉 전이성 종양 또는 비전이성 종양으로 판단하는 것을 의미한다.
상기 a) 단계는 피험자, 즉 종양 전이성 여부에 대한 검사가 필요한 개체를 대상으로 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 피험자는 전이성 암 또는 전이 발생 가능한 암을 가진 환자인 것일 수 있다.
상기 암은 유방암, 간암, 위암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생물학적 시료는 암세포 또는 종양 세포를 포함하는 생체 유래 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 당업계에 공지된 생검 방법에 따라 채취된 체액 또는 조직이라면 제한 없이 이용 가능하다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 땀, 침, 소변 및 종양 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 생물학적 시료는 종양 세포 외에 다른 세포 (예컨대, 정상 세포, 혈액 세포, 면역세포)와 혼재된 상태일 수 있으며, 사용자에 따라 다른 세포를 제거한 후 종양 모델 형성에 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 생물학적 시료가 혈액인 경우, 피콜(Ficoll)을 사용하여 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 제거한 후 사용하였다.
상기 b) 단계는 종양 세포를 3차원 배양하여 종양 모델을 형성하는 과정이다.
상기 종양 세포는 종양 조직에서 직접 채취되거나, 또는 종양 조직에서 떨어져 나와 체액 속을 떠돌아다니는 순환 종양 세포일 수 있다.
상기 3차원 배양은 배양접시에서 이루어지는 2차원 단층배양과 달리, 생체외에서 세포가 모든 방향으로 성장할 수 있도록 생리학적 및 물리학적으로 생체내 환경 (예컨대, 세포-세포 또는 세포-기질 상호작용, 영양분 수송)과 유사한 입체 공간에서 배양하는 것으로, 세포의 생존능력과 기능성이 향상될 수 있다. 일반적으로 3차원적으로 배양된 세포는 응집하여 세포집합체를 이루며, 세포집합체가 구(球)모양으로 만들어진 경우 편구(spheroid)라 한다.
상기 편구는 다세포 배열(multicellular arrangement)을 가지는 3차원 구조로서 E-카드헤린, 밀착연접단백질, 세포외 기질 분비 또는 저스트라분비 신호(juxtacrine signaling)와 같은 고유한 특성을 나타낸다 (Canel et al., J Cell Sci. 2013. 126 (2): 393-401). 이러한 편구는 높은 세포 패킹 밀도(cell packing density), 세포-세포 밀착 결합 및 불멸성 때문에 산소가 부족하여 나타나는 중심부와 혈관망으로부터 영양분 및 가스 교환이 이루어져 세포가 생존하는 층으로 구분된다.
이러한 3차원 배양은 당업계에 공지된 3차원 배양기법을 제한 없이 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 3차원 배양은 현적배양, 표면유착방지처리 마이크로웰 플레이트, 미세제작구조틀, 회전 생물반응기, 표면조절 배양기, 스캐폴드, 외력 및 스페로이드 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하는 것일 수 있다.
상기 현적배양(haning-drop culture)은 세포액 방울(drop)이 배양 접시 위에 위치한 배양판에 매달린 채로 방울 내부의 세포들이 중력에 의해 아래에 응집하여 조직을 형성하게 되는 원리이다. 이 기법은 종양 모델의 크기, 종양 모델 내 세포수와 세포구성을 균일하게 조절할 수 있는 장점이 있어 종양 침습이나 세포간 상호작용에 대한 연구에 적용 가능하다.
상기 표면유착방지처리 마이크로웰 플레이트(microwell plate with non-adhesive surface) 및 미세제작구조틀(microfabricated microstructure)은 가장 단순하면서 용이한 방법으로, 세포가 플레이트 표면에 유착되지 않도록 하단에 내부처리된 마이크로웰을 사용하여 세포액을 배양하는 방법이다. 이러한 방법들은 현적배양과 같이 다양한 연구분야에 적용되고 있으며, 세포액 내 세포 농도 및 마이크로웰 크기를 조절하여 다양한 크기로 제작 가능하다.
상기 회전 생물반응기(rotary bioreactor)는 내부에 유착방지가 처리된 회전 플라스크(spinner flask) 또는 롤러 보틀(roller bottle)을 이용하여 대량으로 스페로이드를 제작할 수 있는 방법으로, 정적인 배양법에 비해 동적으로 회전하는 배양용기 안에서 만들어지는 종양 모델은 상대적으로 균일한 모양을 가지며 동시에 대량으로 제작 가능하다.
상기 표면조절 배양기(surface modified substrate)는 양전하를 띠는 물질, 온도반응성 물질 등 기능화된 표면재료들이 처리된 배양용기를 이용하여 세포를 2차원적 단층구조에서 3차원 구체모양으로 형성하게 한다.
상기 스캐폴드(scaffold)는 우레탄폼(urethane foam)과 같은 다공질 물질로 제작한 스캐폴드를 이용하여 세포들의 자가 응집을 물리적으로 지지하는 방법이다.
상기 외력(external force)은 저속 원심분리, 유전영동(dielectrophoresis), 자성(magnetic field) 및 초음파를 이용한 트랩((ultrasound standing wave trap)과 같은 다양한 외부의 힘을 이용하여 세포응집력을 향상시킬 수 있으며 세포 응집이 용이하지 않은 가혹한 조건에서도 사용될 수 있다.
상기 스페로이드 칩(spheroid on a chip)은 마이크로웰(microwell) 또는 마이크로채널(microchannel)을 포함하는 칩(chip)을 이용하여 수천 개의 편구를 동시에 배양할 수 있으며, 주로 약물 스크리닝에 이용된다.
상기 배양 조건은 배양 방법 또는 세포수, 세포 형태 등에 따라 배양 온도 및 기간이 적절하게 조절될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 종양 세포를 간편하고 용이하게 3차원 배양하여 형성된 종양 모델의 형태를 관찰할 수 있도록 스페로이드 칩으로서 액적 기반 미세유체 시스템(droplet-based microfluidic system)을 사용하여 24시간 배양하였다. 여기서 생성된 액적은 직경이 50 내지 450 μm일 수 있다.
상기 액적 기반 미세유체 시스템은 칩 내부로 유상 용액(oil phase) 및 액상 용액(aqueous phase)이 각각 유입될 수 있는 2개의 유입구(inlet)와 액적을 방출하는 하나의 유출구(outlet)를 가지며, 유상 용액을 위한 유입구와 액상 용액을 위한 유입구가 교차하는 지점 (droplet junction)에서 유상 용액이 수상 용액의 흐름과 수직한 방향으로 유입되어 수상 용액의 흐름을 끊음으로써 세포 액적이 형성된다. 이러한 세포 액적 내 세포는 3차원 배양되어 응집된 형태 (예컨대, 편구 또는 세포집합체)의 종양 모델이 되며, 이후 원심분리에 의해 세포 액적으로부터 종양 모델을 분리 및 회수할 수 있다.
상기 c) 단계는 종양의 전이성을 판단하기 위해 3차원 배양된 종양 세포를 형태학적으로 분석하는 과정이다.
상기 3차원 배양된 종양 세포는 종양 세포의 특성에 따라 세포집합체 또는 편구 형태의 종양 모델을 형성한다. 전이성 종양 세포는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)의 특성을 지니며 세포집합체를 형성하는 반면, 비전이성 종양 세포는 상피세포(epithelial cell)의 특성을 지니며 3차원 형태의 편구를 형성한다. 이러한 종양 모델의 직경 또는 둘레를 통해 산출된 원형도 및 볼록도는 종양 모델을 구성하는 세포의 치밀한 정도를 나타내어 세포 형태를 구분할 수 있다. 상기 원형도(circularity)는 편구의 형성을 측정하는 척도로서 단단하게 결합된 고형 종양 편구의 형성 정도를 나타내며, 상기 볼록도(convexity)는 편구의 매끄러운 표면을 측정하는 척도로서 수평과 수직 길이에 비례한 편구의 형성 정도를 나타낸다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계의 원형도는 하기 수학식 1에 의해 산출되는 값인 것일 수 있다.
[수학식 1]
상기 수학식 1에서, 둘레(perimeter)는 종양 모델의 테두리 또는 가장자리에 대한 길이를 의미하며, 면적(area)은 종양 모델의 2D 이미지 넓이를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계의 볼록도는 하기 수학식 2에 의해 산출되는 값인 것일 수 있다.
[수학식 2]
상기 수학식 2에서, 둘레(perimeter)는 종양 모델의 테두리 또는 가장자리에 대한 길이를 의미하며, 볼록포(convexity hull)는 편구의 2D 이미지에서 모든 영역을 포함하는 가장 작은 볼록 집합을 의미한다.
상기 수학식 1 및 2에 의해 산출된 값이 각각 1에 가까운 경우 종양 모델이 편구를 형성한 것이며, 반대로 각각 1에서 멀어질 경우 종양 모델이 세포집합체를 형성한 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계에서, 상기 종양 세포가 세포집합체를 형성하고, 상기 세포집합체의 원형도 및 볼록도가 각각 0.7 이하인 경우 전이성 종양으로 판단할 수 있다.
상기 세포집합체의 원형도 및 볼록도는 각각 0.7 이하, 보다 구체적으로 0.1 내지 0.7인 경우 전이성 종양이라 할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계에서, 상기 종양 세포가 편구를 형성하고, 상기 편구의 원형도 및 볼록도가 각각 0.7을 초과한 경우 비전이성 종양으로 판단할 수 있다.
상기 편구의 원형도 및 볼록도는 각각 0.7 초과, 보다 구체적으로 0.7, 초과 내지 1 이하인 경우 비전이성 종양이라 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 4종의 유방암 세포를 액적 기반 미세유체 시스템을 이용하여 3차원 배양한 결과, BT-474 및 MCF-7는 종양 편구를 형성하며 원형도/볼록도가 각각 0.906/0.937 및 0.865/0.898로, 모두 상피 상태에 가까운 종양인 반면, SK-BR-3 및 MDA-MB-231는 구형의 편구 대신 경계가 불균일한 세포집합체를 형성하며 원형도/볼록도가 각각 0.564/0.459 및 0.655/0.603으로 모두 중간엽 상태에 가까운 종양이었다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 혈액에서와 같이 종양 세포가 백혈구와 혼재된 상태인 경우에는 종양 세포의 분리 없이 3차원 배양을 통해 종양 세포의 형태 (예컨대, 세포집합체 또는 편구)를 관찰하고 종양의 전이성 여부를 확인하였다.
이러한 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법은 3차원적인 세포 배양을 통해 종양 세포의 형태를 분석함으로써 쉽고 직관적으로 종양의 전이성을 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 i) 종양 세포를 3차원 배양하는 단계; ii) 상기 3차원 배양된 종양 세포에 피검물질을 처리하는 단계; 및 iii) 상기 피검물질이 처리된 종양 세포의 편구 형성 여부, 원형도 및 볼록도를 측정하여 종양 전이성을 저해하는 피검물질을 선별하는 단계를 포함하는 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다.
여기서 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 i) 단계는 종양 모델을 형성하기 위해 종양 세포를 3차원 배양하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 종양 세포는 세포주 또는 생물학적 시료에서 유래된 것일 수 있다.
상기 세포주는 생체 밖에서 계속적으로 배양이 가능한 세포 집단을 의미하며, 당업계에 공지된 전이성 암 또는 전이 발생 가능한 암 세포주라면 제한 없이 이용 가능하다.
상기 생물학적 시료는 전이성 암 또는 전이 발생 가능한 암을 가진 환자에서 수득된 것으로, 당업계에 공지된 생검 방법에 따라 채취된 체액 또는 조직이라면 제한 없이 이용 가능하다. 상기 생물학적 시료의 일례로는 종양 세포를 포함하는 조직 또는 체액일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 i) 단계의 3차원 배양은 현적배양, 표면유착방지처리 마이크로웰 플레이트, 미세제작구조틀, 회전 생물반응기, 표면조절 배양기, 스캐폴드, 외력 및 스페로이드 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하는 것일 수 있다.
상기 ii) 단계는 3차원 배양된 종양 세포, 즉 종양 편구를 이용하여 피검물질의 종양 전이 억제 활성을 검사하는 과정이다.
상기 3차원 배양된 종양 세포는 전이성을 가지는 세포에서 유래되어 세포집합체 형태의 종양 모델을 형성한다.
상기 피검물질은 종양 세포의 전이를 억제하는 활성이 있는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 물질로서 종양 전이성을 억제하는 효능을 나타낼 가능성이 있거나 나타낼 것으로 기대되는 물질일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ii) 단계의 피검물질은 화합물, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 피검물질은 천연물에서 유래되거나 인공적으로 합성된 것일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
이러한 피검물질의 처리 조건은 종양 세포수 또는 피검물질의 성질, 시험 및 평가 목적 등에 따라 처리 시기 또는 처리 횟수가 적절하게 조절될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
상기 iii) 단계는 피검물질의 종양 전이 억제 여부를 판단하기 위해 3차원 배양된 종양 세포를 형태학적으로 분석하는 과정이다.
상기 피검물질이 처리된 3차원 배양된 종양 세포는 피검물질의 활성에 따라 세포집합체 형태를 유지하거나 편구를 형성할 수 있으며, 원형도 및 볼록도 또한 변화될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 iii) 단계의 원형도는 하기 수학식 1에 의해 산출되는 값인 것일 수 있다.
[수학식 1]
상기 수학식 1에서, 둘레(perimeter)는 종양 모델의 테두리 또는 가장자리에 대한 길이를 의미하며, 면적(area)은 종양 모델의 2D 이미지 넓이를 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 iii) 단계의 볼록도는 하기 수학식 2에 의해 산출되는 값인 것일 수 있다.
[수학식 2]
상기 수학식 2에서, 둘레(perimeter)는 종양 모델의 테두리 또는 가장자리에 대한 길이를 의미하며, 볼록포(convexity hull)는 편구의 2D 이미지에서 모든 영역을 포함하는 가장 작은 볼록 집합을 의미한다.
상기 수학식 1 및 2에 의해 산출된 값이 각각 1에 가까운 경우 피검물질이 종양 세포의 전이를 억제하는 활성이 있는 것을 의미하여 이러한 피검물질을 종양 전이 저해를 위한 약물로 간주할 수 있다. 반면, 수학식 1 및 2에 의해 산출된 값이 각각 1에서 멀어질 경우 피검물질이 종양 세포의 전이를 억제하는 활성이 없는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 iii) 단계에서, 상기 피검물질이 처리된 종양 세포가 편구를 형성하고 상기 편구의 원형도 및 볼록도가 0.7 초과인 경우 피검물질을 종양 전이 전해제로 판단할 수 있다.
상기 편구의 원형도 및 볼록도는 각각 0.7 초과, 보다 구체적으로 0.7, 초과 내지 1 이하인 경우 피검물질이 전이성 종양의 전이를 억제하는 것으로 볼 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 iii) 단계에서, 상기 피검물질이 처리된 종양 세포가 세포집합체를 유지하고 상기 세포집합체의 원형도 및 볼록도가 0.7 이하인 경우 피검물질이 종양 전이 저해제가 아닌 것으로 판단할 수 있다.
상기 세포집합체의 원형도 및 볼록도는 각각 0.7 이하, 보다 구체적으로 0.1 내지 0.7인 경우 피검물질이 전이성 종양의 전이를 억제하는 못하는 것으로 볼 수 있다.
이러한 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법은 3차원적인 세포 배양을 통해 종양 세포의 형태를 분석함으로써 쉽고 직관적으로 종양의 전이성 변화를 관찰하여 종양 전이 저해제를 선별할 수 있다.
본 발명에서는 생체내와 유사한 3차원 환경에서 종양 세포를 배양하여 종양 모델을 형성하고 편구 형성 여부 및 편구의 원형도 및 볼록도를 측정함으로써 종양 세포의 전이 가능성을 예측하고, 새로운 종양 전이 저해제를 개발하기 위한 선별 과정에서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 3차원 종양 모델 제조 장치에 관한 것으로, (a)는 액적 기반 미세유체 시스템을 이용한 3차원 종양 모델 제조 장치이며, (b)는 액적이 형성되는 과정을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 세포의 형태학적 특성을 나타낸 것으로, (a)는 상피 종양 세포와 중간엽 종양 세포의 차이를 개략적으로 도시한 도면이고, (b)는 동일한 기원의 암종에서 유래된 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 2차원 형태이고, (c)는 유방 종양 세포 (MCF-7)를 액적에서 24시간 배양한 이미지와 액적에서 방출된 종양 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유방 종양 모델에 관한 것으로, (a)는 액적에서 24시간 배양한 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 종양 모델 및 이로부터 방출된 시료이며, (b)는 종양 편구에 특이적인 바이오마커의 발현을 분석하기 위한 면역형광 분석 결과이며 (청색: 콜라겐 유형 IV, 녹색: E-카드헤린 및 적색: ZO-1), (c)는 종양 편구의 형태학적 분석을 위한 형태 및 경계 선택을 보여주며, (d) 및 (e)는 각각 4종의 유방 종양 모델의 원형도 및 볼록도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈구 혼합 유방 종양 모델에 관한 것으로, (a)는 액적에서 24시간 배양한 백혈구 (Jurkat 세포)와 혼합된 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 종양 모델 및 이로부터 방출된 시료이며, (b)는 종양 편구에 특이적인 바이오마커의 발현을 분석하기 위한 면역형광 분석 결과이며 (청색: 콜라겐 유형 IV, 녹색: E-카드헤린 및 적색: ZO-1), (c)는 백혈구와 혼합된 유방 종양 세포의 종양 모델에 대한 면역형광으로 염색된 초기, 배양 및 방출 이미지이며 (녹색: BT-474 및 적색: Jurkat 세포), (d) 및 (e)는 백혈구와 혼합된 유방 종양 모델의 원형도 및 볼록도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 종양 세포의 형태학적 특성을 나타낸 것으로, (a)는 상피 종양 세포와 중간엽 종양 세포의 차이를 개략적으로 도시한 도면이고, (b)는 동일한 기원의 암종에서 유래된 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 2차원 형태이고, (c)는 유방 종양 세포 (MCF-7)를 액적에서 24시간 배양한 이미지와 액적에서 방출된 종양 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 유방 종양 모델에 관한 것으로, (a)는 액적에서 24시간 배양한 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 종양 모델 및 이로부터 방출된 시료이며, (b)는 종양 편구에 특이적인 바이오마커의 발현을 분석하기 위한 면역형광 분석 결과이며 (청색: 콜라겐 유형 IV, 녹색: E-카드헤린 및 적색: ZO-1), (c)는 종양 편구의 형태학적 분석을 위한 형태 및 경계 선택을 보여주며, (d) 및 (e)는 각각 4종의 유방 종양 모델의 원형도 및 볼록도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 백혈구 혼합 유방 종양 모델에 관한 것으로, (a)는 액적에서 24시간 배양한 백혈구 (Jurkat 세포)와 혼합된 4종의 유방 종양 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)의 종양 모델 및 이로부터 방출된 시료이며, (b)는 종양 편구에 특이적인 바이오마커의 발현을 분석하기 위한 면역형광 분석 결과이며 (청색: 콜라겐 유형 IV, 녹색: E-카드헤린 및 적색: ZO-1), (c)는 백혈구와 혼합된 유방 종양 세포의 종양 모델에 대한 면역형광으로 염색된 초기, 배양 및 방출 이미지이며 (녹색: BT-474 및 적색: Jurkat 세포), (d) 및 (e)는 백혈구와 혼합된 유방 종양 모델의 원형도 및 볼록도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 유방 종양 모델 제작
유방 종양 모델을 제작하기 위하여, 동일한 암종(carcinoma)에서 유래된 4종의 유방암 세포 (BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231)를 사용하였다. 모든 유방암 세포는 10% v/v FBS(fetal bovine serum), 페니실린(penicillin) 100 μg/mL, 스트렙토마이신(streptomycin) 100 μg/mL 및 2 mM L-글루타민(L-glutamine)이 보충된 DMEM/F12 기초 배지에서 배양되었다. 배양된 세포는 트립신(trypsin)-EDTA를 사용하여 분리되었으며, 세포에 사용된 모든 시약은 Invitrogen에서 구입하였다.
백혈구 혼합 종양 모델 형성을 위해서는 백혈구로서 Jurkat 세포를 사용하였다. Jurkat 세포는 유방 종양 세포와 동일한 배양 배지에서 배양되었다.
모든 세포들은 5% CO2 세포배양기 (MCO-18AC, Panasonic Healthcare Co., Ltd.)에서 37.5℃로 배양되었다.
액적 기반 미세유체 시스템의 제작 및 실험 조건은 이전 연구 (Kwak et al., Control. Release. 2018. 275, 201-207)를 참고하였다 (도 1). 준비된 종양 세포는 액적 기반 미세유체 시스템을 통해 액적 내 캡슐화되었다. 종양 세포를 함유한 배양 배지는 액상 용액으로 사용되었다. 액적 기반 미세유체 시스템은 액상 용액에 현탁된 종양 세포 또는 유상 용액을 주입하는 각각의 유입구를 가진다. 액적은 유동초점법(flow-focusing method)를 사용하여 미세채널 단면(cross-section)에서 형성되었다. 5% 희석 계면활성제 (Pico-Surf™, Dolomite Microfluidics)가 포함된 불소 오일(fluorinated oil) (Novec™ 7500, 3M)은 유상 용액으로 사용되어 균일한 액적을 형성하였다. 상기 계면활성제는 플루오로카본 오일(fluorocarbon oil)을 포함한 용액이었다. 액적 내 종양 세포는 3차원 종양 모델을 형성하였으며, 24시간 동안 관찰되었다. 이후, 액적 방출 시약 1H,1H,2H,2H, -perfluoro-1-octanol (Sigma-Aldrich)을 사용하여 액적을 회수한 후 원심분리하여 액적 내 종양 모델을 회수하였다.
1-2. 면역형광분석
3차원 종양 모델에서 분자 발현을 확인하기 위하여, 면역형광분석(immunofluorescence assay)을 사용하였다. 전이성 유방 종양 세포는 일반적으로 E-카드헤린, ZO-1, 콜라겐 유형 IV 등과 같은 부착 분자를 발현하지 않으며, 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)와 같은 단백질 분해효소를 분비하여 혈관 및 혈관 내로 이동하기 위해 주변 세포외 기질을 절단한다. 따라서 표적 분자로서 종양에서 분비되는 세포외 기질(ECM)과 밀착연접단백질(tight junction protein)의 발현을 확인하였다. 시약으로는 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) (Sigma-Aldrich), DPBS(Dulbecco's phosphate buffer) (Thermo Fisher Scientific) 및 BSA(bovine serum albumin) 3 mg/ml를 사용하였다. 1차 항체로는 종양 분비 세포외 기질인 콜라겐 타입 IV(collagen type IV) (Abcam, ab6586), 부착 분자(adhesion molecule)인 E-카드헤린(E-cadherin) (Abcam, ab219332) 및 밀착연접 단백질(tight junction protein)인 ZO-1 (Abcam, ab190085)를, 2차 항체로는 1차 항체에 따라 DyLight 350 Annie-Rabbit (Invitrogen, Cat. #62270), Alexa Fluor 488 Annie-Mouse (Abcam, ab6785) 및 Alexa Fluor 555 Annie-Goat (Abcam, ab6882)를 사용하였다. 면역형광 염색 과정은 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다.
1-3. 영상 분석
액적 내 종양 세포의 형태적인 변화를 지속적으로 모니터링하기 위하여, 광학 현미경 표면-세포(top-cell) 배양 시스템 (Live Cell Instrument)을 사용하였다. 라이브 이미지(live image)는 24시간 동안 10분마다 촬영하였다. 면역형광분석을 위한 종양 편구 모델의 형광 이미지는 디콘볼루션 시스템(deconvolution system) (Microvolution)이 통합된 형광 현미경 (Olympus)을 사용하여 깊이별(depth-wise)로 분석되었다. 분석 정확도를 높이기 위해 확대된 이미지 (배율 4x, 10x, 20x 및 40x)를 분석에 사용하였다.
종양 편구 모델의 직경 또는 둘레는 ImageJ software (NIH Bethesda)를 사용한 라이브 이미지 기반 측정법을 통해 하기 수학식 1의 원형도(circularity) 및 하기 수학식 2의 볼록도(convexity)로 산출되었다 (Varga et al., Sedimentary Geology. 2018. 370, 1-14). 원형도 및 볼록도는 종양 모델의 편구 형성 여부를 판단하는 기준이 된다.
[수학식 1]
[수학식 2]
상기 수학식 1 및 2에서 산출된 원형도 및 볼록도 값이 약 1일 때 종양 모델이 원형에 근접한 것으로 판단할 수 있다.
2. 결과
2-1. 유방 종양의 이질성(heterogeneity)
생체내(in vivo) 종양 세포는 전이성 종양 세포와 비전이성 종양 세포가 혼재된 이질적인 상태이다. 전이성 종양 세포는 침습하여 2차 종양을 만들 준비가 되어 있지만, 비전이성 종양 세포는 그렇지 않다. 전이성 종양 세포는 혈관내 침입하거나 혈관외 유출, 또는 혈관망을 통해 순환하기 위해 단일세포 상태를 유지하려는 경향이 있는 반면, 비전이성 종양 세포는 고형 종양 상태를 형성하는 경향이 있다. 또한, 종양 세포는 상피에서 중간엽으로, 또는 중간엽에서 상피로의 변이 과정을 통해 이질적인 상태를 전환한다 (도 2a) (Elloul et al., Clin. Exp. Metastasis. 2010. 27, 161-172; Bhatia et al., Front. Mol. Biosci. 2020. 7, 1-18).
본 실험에서 사용된 4종의 유방 종양 세포는 2차원 상태에서 현저한 형태학적 차이가 없었으나 (도 2b), 표 1을 참고하면, 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR) 및 인간 상피성장인자2(human epidermal growth factor 2, HER2)에서 차이가 있었다. 두 호르몬 수용체에 대해 음성인 종양 세포는 비교적 높은 위험을 가지고 있으며 전체 생존율(overall survival)이 낮은 것으로 알려져 있다 (Onitilo et al., Clinical Medicine & Research. 2009. 7, 1/2: 4-13). E-카드헤린(E-cadherin)은 세포-세포 부착을 촉진하여 종양 전이를 억제하는 단백질이다. 결과적으로, 두 호르몬과 E-카드헤린에 대해 음성인 종양 세포 (SKBR3 및 MDA-MB-231)는 다른 종양 세포 (BT474 및 MCF-7)에 비해 유방암 환자에 대한 더 높은 위험을 가지고 있다 (Garcia-garcia et al., PLOS ONE. 2013. 8, 10).
| 세포주 | ER | PR | HER2 | E-카드헤린 | 침습성 | 아형 |
| BT-474 | + | + | + | + | 낮음 | Luminal B |
| MCF-7 | + | + | - | + | 낮음 | Luminal A |
| SK-BR-3 | - | - | + | - | 낮음 | HER2 |
| MDA-MB-231 | - | - | - | - | 높음 | Basal |
2-2. 종양 모델 형성을 위한 액적 기반 미세유체 시스템
액적 기반 미세유체 시스템은 다양한 3차원 세포 배양 방법 중 3차원 종양 모델의 대량 제작과 정확한 함량 조절에 적합하다. 하나의 액적은 평균 250개의 세포를 포함하도록 설계되었다. 24시간 배양 후 종양 모델의 최종 직경은 평균 150 ± 14 μm (n=10, BT-474) 이었다. 제작 수율과 초기 세포 농도는 각각 N > 20,000 (15 액적/초), 1 Х 107 세포/ml이었다. 액적 기반 미세유체 시스템에서 제작된 종양 모델을 회수하여 형태학적 분석 및 분자 발현 측정을 수행하였다 (도 2c).
2-3. 종양 생검을 이용한 유방 종양 편구
생체내 고형 종양은 세포 패킹 밀도가 높기 때문에 충분한 종양 세포를 얻기 위해 종양 생검(tumor biopsy)을 실시할 수 있다. 생체내 종양은 이질적인 상태를 가지는 종양 세포, 림프구, 면역세포, 혈액세포, 섬유아세포, 지방세포, 혈관내피세포 등 다양한 유형의 세포로 구성된다. 순수 종양 세포는 FACS(fluorescence-activated cell sorter), MACS(magnetic-activated cell sorter), DACS(dielectric-activated cell sorter), HACS(hydrodynamic activated cell sorter) 또는 물리적 (예: 밀도, 변형가능성 또는 크기 변화) 여과 방법과 같이 잘 확립된 세포 분류 방법을 통해 수집될 수 있다. 수집된 종양 세포는 도 2a와 같이 상피 상태, 중간엽 상태 또는 부분적으로 이행된 상태인 종양 세포를 포함한다. 전이는 중간엽 상태의 종양 세포에 의해 발생하면 종래에는 종양 세포에 대해 면역형광분석, 유전자 분석, 단백질 분석 등 분자 분석을 실시하여 전이 가능성을 진단하였다.
본 발명에서는 쉽고 직관적인 종양 세포 상태 분석을 위하여, 종양 모델의 형태학적 분석을 수행하였다. 4종의 유방 종양 세포를 각각 액적으로 캡슐화하고 24시간 동안 배양하여 종양 모델을 형성한 후 액적으로부터 방출하여 회수하였다 (도 3a). 상피 특성을 가지는 세포는 3차원적인 편구 형태를 이루는 반면, 중간엽 또는 부분적으로 이행된 상태의 특성을 가지는 세포는 세포집합체를 형성하였다. 면역형광 분석은 종양 편구의 뚜렷한 특성을 보다 명확하게 보여주었다. 종양 편구는 콜라겐 타입 IV와 같은 특정 세포외 기질(ECM)을 분비하며, 세포간 상호작용과 밀착 결합을 위해 E-카드헤린과 밀착연접단백질 (ZO-1)을 분비하여 하나의 고형 종양을 형성하였다. 반면, 세포집합체는 부착 분자, 밀착연접단백질 또는 ECM을 분비하지 않았다 (도 3b).
2-4. 유방 종양 모델의 형태학적 분석
제작된 종양 모델은 도 3c에서와 같이 형태학적으로 분석되었다. 종양 모델의 10개 시료를 분석에 사용하여 하기 표 2와 같이 평균 원형도 및 볼록도를 산출하였다. 원형도와 볼록도 값은 종양 세포의 상피 특성에 비례한다.
| 세포주 | 원형도 | 볼록도 |
| BT-474 | 0.906 | 0.937 |
| MCF-7 | 0.865 | 0.898 |
| SK-BR-3 | 0.564 | 0.459 |
| MDA-MB-231 | 0.655 | 0.603 |
BT-474는 삼중 양성으로서 가장 상피 상태에 가까운 종양이며, MCF-7은 이중 호르몬 수용체 양성으로 상피 상태에 가까웠다. BT-474와 MCF-7의 상피 세포 부착 분자 (EpCAM) 발현 수준은 각각 1.2 Х 105와 2.2 Х 105이었다 (Prang et al., Br. J. Cancer. 2005. 92, 342-349; Hathaway et al., Breast Cancer Research. 2011. 13, R108).
SK-BR-3는 부분적으로 중간엽 상태로 이행되며, MDA-MB-231은 중간엽 상태였다. SK-BR-3와 MDA-MB-231의 EpCAM 발현 수준은 각각 1.3 Х 105, 0.017 Х 105이었다 (Prang et al., Br. J. Cancer. 2005. 92, 342-349; Hathaway et al., Breast Cancer Research. 2011. 13, R108).
이러한 결과를 종합하면, 원형도와 볼록도 값이 1에 가까운 종양 모델은 비전이성 종양이 가지는 상피 특성이 지배적인 반면, 0에 가까운 종양 모델은 전이성 종양이 가지는 중간엽 특성이 지배적이므로, 형태학적 분석을 통해 종양 세포의 전이성을 진단할 수 있다.
2-5. 액체 생검을 이용한 백혈구 혼합 유방 종양 모델
전이성 종양 세포는 혈관망을 통해 순환하므로, 순환 종양 세포(CTC)를 포함한 인간 말초 혈액 시료를 사용하여 전이성 여부를 분석할 수 있다. 그러나 혈액에는 CTC 가 매우 소량이며, 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 제거하더라도 백혈구가 우세하여 혈액을 통한 CTC 분석에는 제한이 있었다. 이러한 한계를 해결하기 위해, CTC의 전이 진단에 액적 기반 미세유체 시스템을 이용하여 백혈구 혼합 유방 종양 모델(leukocyte spiked breast tumor model)을 제작하였다. 유방 종양 세포의 각 아형과 1:1의 비율로 혼합된 Jurkat 세포를 액적에 캡슐화하여 종양 모델을 형성하였다. 액적은 24시간 동안 배양되었다가 방출되었다.
그 결과, Jurkat 세포는 부유성 세포로서 유방 종양 세포와 하나의 고형 조직을 형성하지 않고 모두 종양 편구 밖으로 배출되었다 (도 4a 및 c). 방출된 액적 시료는 면역형광으로 분석되었다. 백혈구 혼합 유방 종양 편구는 편구에 특이적인 ECM, E-카드헤린 및 밀착연접단백질을 발현하는 것으로 나타났다 (도 4b). 또한, Jurkat 세포와 혼합 배양된 BT-474, MCF-7, SK-BR-3 및 MDA-MB-231의 원형도/볼록도 값은 각각 0.869/0.905, 0.833/0.855, 0.516/0.601 및 0.465/0.537이었다 (각 n=10) (도 4d 및 e). 이러한 백혈구 혼합 유방 종양 편구의 형태학적 분석 결과는 종양 세포 단독으로 형성된 유방 종양 편구와 일치하였다. 따라서 PBMC가 제거된 인간 말초 혈액 시료를 이용한 3차원 종양 모델 형성은 형태학적 분석을 통해 종양 세포 전이를 진단하는 대체 방법이 될 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (11)
- a) 피험자로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계;
b) 상기 생물학적 시료에 함유된 종양 세포를 3차원 배양하여 세포집합체를 형성하는 단계; 및
c) 상기 3차원 배양된 종양 세포로 구성된 세포집합체의 편구 형성 여부, 원형도 및 볼록도를 측정하는 단계;
를 포함하는 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법에 있어서,
상기 c) 단계의 원형도는 하기 수학식 1에 의해 산출되는 값이고, 볼록도는 하기 수학식 2에 의해 산출되는 값이며,
상기 종양세포가 편구가 아닌 세포집합체를 형성하고, 상기 세포집합체의 원형도 및 볼록도가 각각 0.7 이하인 경우 전이성 종양으로 판단하는, 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법.
[수학식 1]
[수학식 2]
- 청구항 1에 있어서,
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 땀, 침, 소변 및 종양 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법.
- 청구항 1에 있어서,
상기 b) 단계의 3차원 배양은 현적배양, 표면유착방지처리 마이크로웰 플레이트, 미세제작구조틀, 회전 생물반응기, 표면조절 배양기, 스캐폴드, 외력 및 스페로이드 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하는 것인 종양 전이성 예측을 위한 정보 제공 방법.
- 삭제
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- i) 종양 세포를 3차원 배양하여 세포집합체를 형성하는 단계;
ii) 상기 3차원 배양된 종양 세포로 구성된 세포집합체에 피검물질을 처리하는 단계; 및
iii) 상기 피검물질이 처리된 종양 세포로 구성된 세포집합체의 편구 형성 여부, 원형도 및 볼록도를 측정하여 종양 전이성을 저해하는 피검물질을 선별하는 단계;
를 포함하는 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법에 있어서
상기 iii) 단계의 원형도는 하기 수학식 1에 의해 산출되는 값이고, 볼록도는 하기 수학식 2에 의해 산출되는 값이며,
상기 피검물질이 처리된 종양 세포가 편구인 세포집합체를 형성하고, 상기 편구의 원형도 및 볼록도가 0.7 초과인 경우 피검물질을 종양 전이 저해제로 판단하는, 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법.
[수학식 1]
[수학식 2]
- 청구항 6에 있어서,
상기 i) 단계의 종양 세포는 세포주 또는 생물학적 시료에서 유래된 것인 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 i) 단계의 3차원 배양은 현적배양, 표면유착방지처리 마이크로웰 플레이트, 미세제작구조틀, 회전 생물반응기, 표면조절 배양기, 스캐폴드, 외력 및 스페로이드 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 이용하여 배양하는 것인 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법.
- 청구항 6에 있어서,
상기 ii) 단계의 피검물질은 화합물, 아미노산, 펩티드, 단백질 및 핵산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 종양 전이 저해제의 스크리닝 방법.
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Priority Applications (1)
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| KR1020210131530A KR102671159B1 (ko) | 2021-10-05 | 2021-10-05 | 3차원 배양된 종양 세포의 형태학적 분석에 의한 종양 전이성 예측 및 종양 전이 저해제 스크리닝 방법 |
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| KR20230048741A KR20230048741A (ko) | 2023-04-12 |
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| KR101959208B1 (ko) | 2017-05-24 | 2019-03-19 | 한국기계연구원 | 액적기반 바이오칩, 이를 이용한 종양 생산방법, 및 이를 통해 생산된 종양의 전이성 판단방법 |
| KR102195212B1 (ko) | 2020-02-17 | 2020-12-28 | 주식회사 다우진유전자연구소 | 순환종양세포 검출 및 분석을 통한 유방암 진단용 키트 |
-
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