KR102667684B1 - Silver nanoparticle-deposited ZnO nanostructure for fluorescence enhancement of fluorescence-labelled DNA probe, method for manufacturing the same and fluorescence signal detect method therof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 형광이 표지된 유전자 프로브의 형광 신호를 증폭하는 은나노 산화아연 복합 나노구조체, 이의 제조방법 및 형광신호 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기판에 나노선을 성장시키고, 나노선에 형성된 은나노 입자 및 형광이 표지된 유전자 프로브를 포함하고, 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리가 유지되어 형광 신호가 증폭되는 은나노 산화아연 나노선에 관한 것이다. 본 발명의 은나노 산화아연 나노선은 검출감도가 향상되어 보다 정확한 진단이 가능하다.The present invention relates to a silver nano-zinc oxide composite nanostructure that amplifies the fluorescence signal of a fluorescently labeled genetic probe, a method of manufacturing the same, and a method of detecting the fluorescence signal. More specifically, it relates to growing a nanowire on a substrate and forming a nanostructure formed on the nanowire. A silver nano-zinc oxide nanowire comprising silver nanoparticles and a fluorescently labeled genetic probe, and maintaining a distance capable of amplifying the metal fluorescence signal between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe, thereby amplifying the fluorescent signal. will be. The silver nano-zinc oxide nanowire of the present invention has improved detection sensitivity, enabling more accurate diagnosis.
Description
본 발명은 형광이 표지된 유전자 프로브의 형광 신호를 증폭하는 은나노 산화아연 복합 나노구조체, 이의 제조방법 및 형광신호 검출방법에 관한 것이다.The present invention relates to a silver nano-zinc oxide composite nanostructure that amplifies the fluorescence signal of a fluorescently labeled genetic probe, a method of manufacturing the same, and a method of detecting the fluorescence signal.
형광 기반 검출은 질병 바이오마커를 검출하기 위한 바이오센서의 응용에서 중요한 기술이다. 형광 분자를 바이오센서로 사용하는 것은 단순성, 감도, 다중 분석물 검출 등 다양한 장점이 있다. 그러나 바이오센서 개발의 중요한 기준인 낮은 양자효율과 광안정성 측면에서 형광 기반 검출에는 한계가 있다.Fluorescence-based detection is an important technology in the application of biosensors to detect disease biomarkers. Using fluorescent molecules as biosensors has various advantages, including simplicity, sensitivity, and multiple analyte detection. However, fluorescence-based detection has limitations in terms of low quantum efficiency and photostability, which are important criteria for biosensor development.
형광 신호의 향상은 바이오 센서 기술의 적용에서 광범위하게 조사되었다. MEF(Metal-enhanced Fluorescent)는 금속 나노구조/나노입자(NPs)와 형광단 사이의 플라즈몬 결합에서 발생하는 현상으로 5-90nm의 최적 거리에서 양자 수율과 광안정성을 향상시킨다. 유전자 및 단백질과 같은 바이오마커를 검출하기 위한 민감한 바이오센서의 개발에서 연구되었다. 특히, 최적의 거리에서 쉽게 제어할 수 있는 2차원(2D) MEF 기질은 철저히 탐구되었지만 응용은 남아있다. 생물학적 환경의 민감도 문제로 인해 제한된다. 금속 박막, 거친 NP 증착, 정렬된 NP 어레이 나노구조, 나노임프린트 금속 패턴 어레이, 폴리머 스페이서, 유전체 스페이서 또는 하이브리드 복합 스페이서의 층별(LbL) 증착을 포함하여 2D MEF 기판을 위한 다양한 유형의 제조, 바이오 센서의 응용 프로그램에서 개발되었다. 그러나 이러한 2D MEF 기질은 수성 환경에서 대상 분자, 생물학적 프로브 및 MEF 기질 사이에서 생체 분자의 제한된 인식 및 확산으로 인해 낮은 향상 계수 및 열악한 재현성과 같은 몇 가지 제한 사항을 겪는다. 최근 MEF를 위한 3차원(3D) 기판이 연구되고 있으며, 그 장점으로는 큰 형광 향상, 민감한 감지 및 바이오마커 감지를 위한 향상된 동적 범위가 있다. 따라서 바이오센서로서 새로운 3D MEF 기판이 수성 환경에서 생체 분자와 금속 구조 간의 상호 작용을 개선하기 위하여 요구된다. Enhancement of fluorescence signals has been extensively investigated in the application of biosensor technology. Metal-enhanced fluorescence (MEF) is a phenomenon arising from plasmonic coupling between metal nanostructures/nanoparticles (NPs) and fluorophores, improving quantum yield and photostability at an optimal distance of 5-90 nm. Research has been conducted on the development of sensitive biosensors to detect biomarkers such as genes and proteins. In particular, two-dimensional (2D) MEF substrates that can be easily controlled at optimal distances have been thoroughly explored, but their applications remain. Limited due to sensitivity issues in the biological environment. Fabrication of various types of 2D MEF substrates, including layer-by-layer (LbL) deposition of metal thin films, coarse NP deposition, aligned NP array nanostructures, nanoimprinted metal patterned arrays, polymer spacers, dielectric spacers, or hybrid composite spacers, for biosensors. It was developed from an application of . However, these 2D MEF substrates suffer from several limitations, such as low enhancement coefficients and poor reproducibility due to limited recognition and diffusion of biomolecules between target molecules, biological probes and MEF substrates in an aqueous environment. Recently, three-dimensional (3D) substrates for MEFs have been explored, and their advantages include large fluorescence enhancement, sensitive detection, and improved dynamic range for biomarker detection. Therefore, new 3D MEF substrates as biosensors are required to improve the interaction between biomolecules and metal structures in an aqueous environment.
본 발명은 Ag NP의 빌딩 블록으로서 ZnO NW의 열수 합성과 ZnO NW에 AgNP의 광화학 증착의 두 단계로 Ag-ZnO 나노복합체(nanocomposite, NC)를 개발하였다. 3D MEF 기질로서 Ag-ZnO NC의 형광 향상은 각각 10, 20, 40 및 60 염기쌍(bp) 이중 가닥(ds) DNA의 존재 하에서 14.8배, 16.9배, 11.4배 및 14.2배였다. 이러한 향상은 형광단과 Ag-ZnO NC 기판 사이의 상호 작용 개선과 관련이 있을 수 있다고 제안한다. Ag-ZnO NC는 2D MEF 기판으로 사용할 때 dsDNA를 감지하기 위해 Ag 나노섬 필름(AgNIF)보다 50배 더 높은 감도를 나타냈다. 이러한 결과는 형광단이 고정화될 때 형광단과 AgNP 사이의 상호 작용뿐만 아니라 ZnO NW 가닥 내에서 형광단과 인접한 AgNP 사이의 상호 작용 및 다른 ZnO NW 가닥에서 제조된 인접한 AgNP와 형광단 사이의 기타 상호 작용을 포함하여 다양한 시나리오에서 Ag-ZnO NC와의 광범위한 상호 작용을 통해 형광단이 향상될 수 있음을 나타낸다. 당사의 Ag-ZnO NC는 수성 환경에서 DNA 검출을 위한 MEF 기반 바이오센서의 개발을 용이하게 할 수 있다.The present invention developed Ag-ZnO nanocomposite (nanocomposite, NC) in two steps: hydrothermal synthesis of ZnO NWs as a building block of Ag NPs and photochemical deposition of AgNPs on ZnO NWs. The fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs as a 3D MEF substrate was 14.8-fold, 16.9-fold, 11.4-fold, and 14.2-fold in the presence of 10, 20, 40, and 60 base pair (bp) double-stranded (ds) DNA, respectively. We suggest that this improvement may be related to the improved interaction between the fluorophore and the Ag-ZnO NC substrate. Ag-ZnO NCs showed 50 times higher sensitivity than Ag nanoisland films (AgNIF) for detecting dsDNA when used as a 2D MEF substrate. These results show not only the interaction between the fluorophore and AgNPs when the fluorophore is immobilized, but also the interaction between the fluorophore and adjacent AgNPs within the ZnO NW strand and other interactions between the fluorophore and adjacent AgNPs prepared on different ZnO NW strands. It indicates that fluorophores can be enhanced through extensive interactions with Ag-ZnO NCs in various scenarios, including: Our Ag-ZnO NCs can facilitate the development of MEF-based biosensors for DNA detection in aqueous environments.
한편, 한국등록특허 제1878404호는 금속증강형광 복합나노구조체 및 이의 제조방법, 형광물질 검출방법에 관한 것으로, 기판 표면에 제1 플라즈몬 물질과 제2 플라즈몬 물질을 열증발법으로 동시 증착하여 복수의 플라즈모닉 복합나노섬을 형성하는 금속증강형광 복합나노구조체 및 이의 제조방법, 형광검출방법에 대해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1470819호는 형광신호 증폭 기판 제조방법과 이 방법을 이용한 DNA 및 단백질 마이크로어레이칩에 관한 것으로, 홈 형태의 패턴을 갖는 나노 구조물이 형성된 스탬프 기판을 이용한 형광 신호 증폭 기판 제조 방법에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1597894호는 금속증강형광용 코어-쉘 나노 복합체에 관한 것으로, 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체, 이의 제조방법 및 금속증강형광용 탐침으로서의 용도를 개시하고 있다. Meanwhile, Korean Patent No. 1878404 relates to a metal-enhanced fluorescent composite nanostructure, its manufacturing method, and a method for detecting fluorescent substances, by simultaneously depositing a first plasmonic material and a second plasmonic material on the surface of a substrate using a thermal evaporation method to form a plurality of nanostructures. It discloses a metal-augmented fluorescent composite nanostructure that forms plasmonic composite nanoislands, a manufacturing method thereof, and a fluorescence detection method, and Korean Patent No. 1470819 discloses a method of manufacturing a fluorescent signal amplification substrate and DNA and protein microstructures using this method. Regarding an array chip, it discloses a method of manufacturing a fluorescent signal amplification substrate using a stamp substrate on which a nanostructure with a groove-shaped pattern is formed, and Korean Patent No. 1597894 relates to a core-shell nanocomposite for metal-enhanced fluorescence. Disclosed is a core-shell nanocomposite containing phosphors positioned at regular intervals in a direction perpendicular to the surface, a manufacturing method thereof, and its use as a probe for metal-enhanced fluorescence.
그러나, 본 발명의 형광이 표지된 유전자 프로브의 형광 신호를 증폭하는 은나노 산화아연 복합 나노구조체, 이의 제조방법 및 형광신호 검출방법은 개시되지 않았다. However, the silver nano-zinc oxide composite nanostructure that amplifies the fluorescence signal of the fluorescently labeled genetic probe of the present invention, its manufacturing method, and its fluorescence signal detection method have not been disclosed.
본 발명의 목적은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 산화아연 나노선을 적용하여 표면적이 넓어지는 효과를 기반으로 도입하고자 하는 생체분자를 더 많이 도입할 수 있고, 은나노입자가 형성된 산화아연 나노선을 이용함으로 인하여 형광분자와 은나노입자 간의 거리가 5 내지 95 nm일 때 금속 증강 형광에 의해 최대 100배의 형광 신호 증폭 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다. The purpose of the present invention is to solve the above problems, by applying zinc oxide nanowires, it is possible to introduce more biomolecules to be introduced based on the effect of increasing the surface area, and zinc oxide nanowires with silver nanoparticles formed. By using , the present invention was completed by confirming the fluorescent signal amplification effect of up to 100 times due to metal-enhanced fluorescence when the distance between the fluorescent molecule and the silver nanoparticle was 5 to 95 nm.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선에 형성된 은나노 입자; 형광이 표지된 유전자 프로브; 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리가 유지되어 형광 신호가 증폭되는 은나노 산화아연 나노선을 제공한다. In order to solve the above problem, the present invention includes a substrate; Nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; Provided is a silver nano-zinc oxide nanowire in which the fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe to amplify the metal fluorescence signal.
본 발명의 일 예에서, 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리는 5 내지 95 nm인 이고, 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 거리는 뉴클레오타이드가 10 내지 90개로 이루어진 유전자 프로브에 의해서 형성되는 것이며, 바람직하게 상기 유전자 프로브는 이중가닥 뉴클레오타이드 10 내지 60 염기쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. In one example of the present invention, the distance at which amplification of the metal fluorescence signal between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe is 5 to 95 nm, and the distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe is 5 to 95 nm. The distance is formed by a genetic probe consisting of 10 to 90 nucleotides, and preferably the genetic probe is selected from the group consisting of double-stranded nucleotides of 10 to 60 base pairs.
본 발명의 다른 예에서, 상기 기판은 유리, 종이, 실리카 겔, 실리콘 웨이퍼, 알루미나, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 고분자 막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이다. In another example of the present invention, the substrate is any one selected from the group consisting of glass, paper, silica gel, silicon wafer, alumina, polystyrene, polyethylene, polypropylene, and polymer membrane.
상기 나노선은 시드용액으로 0.01 M 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate) 및 0.03 M 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 포함하는 것이며, 상기 나노선은 전구체 용액으로 25 mM 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate) 및 25 mM 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine)을 포함하는 것이고, 상기 나노선은 1 내지 2 시간의 수열합성으로 형성된 것이다.The nanowire contains 0.01 M zinc acetate dihydrate and 0.03 M sodium hydroxide as a seed solution, and the nanowire contains 25 mM zinc nitrate hexahydrate (zinc) as a precursor solution. nitrate hexahydrate) and 25mM hexamethylene tetramine, and the nanowire was formed through hydrothermal synthesis for 1 to 2 hours.
상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 광화학 증착으로 이루어지는 것이고, 바람직하게 상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 0.1 내지 0.5 mM 질산은 용액을 포함하는 광화학 증착으로 형성된 것이며, 바람직하게 상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 15 내지 60분의 광화학 증착으로 형성된 것이다.The silver nanoparticles formed in the nanowire are formed by photochemical deposition. Preferably, the silver nanoparticles formed in the nanowire are formed by photochemical deposition containing 0.1 to 0.5 mM silver nitrate solution. Preferably, the silver nanoparticles formed in the nanowire are 15 It is formed by photochemical deposition for 60 minutes.
본 발명의 또 다른 예에서, 상기 유전자 프로브는 일측에 바이오틴이 결합되고 또 다른 일측에 형광이 표지된 것이고, 상기 유전자 프로브는 일측에 공유 결합이 가능한 작용기가 도입되거나 바이오틴이 결합되고 다른 일측에 형광이 표지된 것이다.In another example of the present invention, the genetic probe is biotin bound to one side and fluorescently labeled to the other side, and the genetic probe has a covalently bondable functional group introduced to one side or biotin bound to the other side and fluorescently labeled to the other side. This is marked.
또한, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선에 형성된 은나노 입자; 형광이 표지된 유전자 프로브; 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리가 유지되어 형광 신호가 증폭되는 은나노 산화아연 나노선을 이용한 형광신호 검출방법을 제공한다. In addition, the present invention relates to a substrate; Nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; A method of detecting a fluorescence signal using a silver nano-zinc oxide nanowire is provided, in which the fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe to amplify the metal fluorescence signal.
본 발명의 일 예에서, 상기 형광 신호 증폭은 바이오틴 및 형광이 표지된 유전자 프로브의 바이오틴이 스트렙트아비딘과 결합하면서 발생하는 것이다.In one example of the present invention, the fluorescence signal amplification occurs when biotin and the biotin of a fluorescently labeled genetic probe bind to streptavidin.
추가적으로, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계; (e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및 (f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 은나노 산화아연 나노선의 제조방법을 제공한다.Additionally, the present invention includes the steps of (a) preparing a nanowire seed solution; (b) preparing a nanowire precursor solution; (c) growing nanowires on a substrate; (d) forming silver nanoparticles on the nanowire; (e) introducing streptavidin; and (f) fixing the genetic probe. It provides a method for manufacturing silver nano-zinc oxide nanowires.
또한, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계; (e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및 (f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;로 제조된 은나노 산화아연 나노선을 제공한다. In addition, the present invention includes the steps of (a) preparing a nanowire seed solution; (b) preparing a nanowire precursor solution; (c) growing nanowires on a substrate; (d) forming silver nanoparticles on the nanowire; (e) introducing streptavidin; and (f) fixing the genetic probe.
본 발명은, 형광이 표지된 유전자 프로브의 형광 신호를 증폭하는 은나노 산화아연 복합 나노구조체, 이의 제조방법 및 형광신호 검출방법에 관한 것으로, 은나노입자가 형성된 산화아연 나노선을 포함하여 도입하고자 하는 생체분자를 더 많이 도입할 뿐 아니라 형광 신호 증폭 효과를 바탕으로 유전자 진단 검사에 있어 증폭 단계를 생략할 수 있어 현장 진단 검사에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a silver nano-zinc oxide composite nanostructure that amplifies the fluorescent signal of a fluorescently labeled genetic probe, a method for manufacturing the same, and a method for detecting the fluorescent signal, and includes zinc oxide nanowires formed with silver nanoparticles to be introduced into the living organism. In addition to introducing more molecules, the amplification step can be omitted in genetic diagnostic testing based on the effect of fluorescent signal amplification, making it useful for on-site diagnostic testing.
도 1은 Ag-ZnO NC에 의해 유도된 금속 강화 형광의 개략도에 관한 것으로, 다양한 시나리오에서 형광단과 Ag-ZnO NC 간의 상호 작용을 나타낸 것이다. (A) 형광단과 형광단이 고정된 AgNP 사이의 상호 작용. (B) ZnO NW 가닥 내의 형광단과 인접한 AgNP 사이의 상호 작용. (C) 형광단과 다른 ZnO NW 가닥에서 제조된 인접한 AgNP 사이의 상호 작용.
도 2는 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 합성을 나타낸 것이다. (a) Ag-ZnO NC 합성의 개략도. (b) ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 탑뷰 SEM 이미지. 0~2시간 범위의 ZnO NW의 열수 성장 시간. (c) NW 성장 1시간 또는 2시간 후 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 단면 SEM 이미지. 왼쪽, ZnO NW; 오른쪽, Ag-ZnO NC. 괄호 안의 숫자는 ZnO NW의 성장 시간을 나타낸 것이다.
도 3은 Ag-ZnO NC의 특성을 나타낸 것이다. (a) 서로 다른 열수 성장 시간에서 ZnO NW(실선) 및 Ag-ZnO NC(파선)의 UV-가시광선 흡수 스펙트럼. 괄호 안의 숫자는 ZnO NW의 성장 시간을 나타낸 것이다. (b) ZnO NW(검은색) 및 Ag-ZnO NC(빨간색)의 XRD 패턴. (c) Ag-ZnO NC의 EDS 매핑 분석. 평면도 SEM 이미지(위)와 원소 매핑 이미지(아래)는 Ag(분홍색)의 분포를 나타낸 것이다. (d) ZnO NW(검은색) 및 Ag-ZnO NC(빨간색)의 XPS 스펙트럼. (e) ZnO NW(검은색) 및 Ag-ZnO NC(빨간색)의 Ag 3d 오비탈의 고해상도 XPS 스펙트럼.
도 4는 (a) ZnO NW 및 (b) Ag-ZnO NC의 N1s 오비탈의 고해상도 XPS 스펙트럼을 나타낸 것이다. 스트렙트아비딘 코팅 전(검은색) 및 후(적색).
도 5는 Ag-ZnO NC에서 ssDNA 혼성화 프로브의 형광 신호 향상을 나타낸 것이다. (a) Ag-ZnO NCs(실선)의 UV-가시광선 흡수 스펙트럼과 FAM 표지된 DNA 혼성화 프로브의 여기(파란색 영역)/방출(녹색 영역) 스펙트럼의 비교. 괄호 안의 숫자는 ZnO NW의 성장 시간을 나타낸 것이다. (b) 형광 방출 스펙트럼 및 (c) 유리(회색), ZnO NW(청색) 및 Ag-ZnO NC(적색) 상의 FAM 표지된 ssDNA 혼성화 프로브의 형광 붕괴 곡선.
도 6은 다양한 Ag-ZnO NC 합성 조건에서 형광 표지된 ssDNA 혼성화 프로브의 형광 향상을 나타낸 것이다. (a) ZnO NW의 성장 시간이 형광 강도에 미치는 영향. 528 nm에서 표준화된 형광 강도는 ZnO NW(회색) 및 Ag-ZnO NC(녹색)의 ssDNA 혼성화 프로브에 대해 표시된다. ZnO NW는 다양한 성장 시간(0, 0.5, 1 및 2시간)에서 준비되었다. (b) AgNO3 농도 및 (c) 광화학 증착 동안의 반응 시간이 형광 강도에 미치는 영향. 형광 강도는 Ag-ZnO NC의 ssDNA 혼성화 프로브에 대해 528nm에서 표시된다. 오차 막대는 3개의 독립적인 샘플에서 얻은 형광 강도의 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 7은 FAM 표지된 DNA 혼성화 탐침과 이들의 상보적 가닥의 혼성화에 의해 생성된 이중 가닥 DNA의 15% 폴리아크릴아미드 겔 이미지를 나타낸 것이다. M, 100/25bp DNA 사다리; 1, FAM-표지된 DNA 혼성화 프로브; 2, 보완 가닥; 3, dsDNA(FAM-표지된 DNA 프로브/상보적 가닥).
도 8은 dsDNA의 검출을 나타낸 것이다. (a) ZnO NW의 성장 시간이 형광 강화에 미치는 영향. 표준화된 형광 강도는 ZnO NW(회색) 및 Ag-ZnO NC(녹색)의 dsDNA에 대해 528nm에서 표시된다. ZnO NW는 다양한 성장 시간(0, 0.5, 1 및 2시간)에서 준비되었다. 528 nm에서 표준화된 형광 강도 = (F528, 기질) / (F528, 유리). (b) dsDNA 길이가 형광 강화에 미치는 영향. 528 nm에서 표준화된 형광 강도는 ZnO NW(회색) 및 Ag-ZnO NC(녹색)의 dsDNA에 대해 표시된다. dsDNA의 길이는 10에서 60bp까지 다양했다. (c) 유리(회색), ZnO NW(파란색) 및 Ag-ZnO NC(빨간색)에 고정된 dsDNA(20bp)의 형광 붕괴 곡선. (d) 유리, ZnO NW, AgNIF 및 Ag-ZnO NC의 연속 희석에서 dsDNA(20 bp)의 형광 이미지 및 (e) 강도 플롯. 오차 막대는 3개의 독립적인 샘플에서 얻은 형광 강도의 표준 편차를 나타낸 것이다. (f) Ag-ZnO NC에서 형광 강도와 dsDNA 농도 사이의 선형 관계. dsDNA의 농도는 0에서 5 nM 범위였다.
도 9는 AgNIF의 합성을 나타낸 것이다. (a) AgNIF의 UV-vis 흡수 스펙트럼. (b) AgNIF의 탑 뷰(왼쪽) 및 횡단면 뷰(오른쪽) SEM 이미지. 합성된 AgNIF는 단층 2D 기판이다.Figure 1 is a schematic diagram of metal-enhanced fluorescence induced by Ag-ZnO NCs, showing the interaction between fluorophores and Ag-ZnO NCs in various scenarios. (A) Interaction between fluorophore and fluorophore-immobilized AgNPs. (B) Interaction between fluorophores within the ZnO NW strand and adjacent AgNPs. (C) Interaction between fluorophores and adjacent AgNPs prepared from different ZnO NW strands.
Figure 2 shows the synthesis of ZnO NW and Ag-ZnO NC. (a) Schematic diagram of Ag-ZnO NC synthesis. (b) Top-view SEM image of ZnO NW and Ag-ZnO NC. Hydrothermal growth time of ZnO NWs ranging from 0 to 2 h. (c) Cross-sectional SEM images of ZnO NWs and Ag-ZnO NCs after 1 or 2 h of NW growth. Left, ZnO NW; Right, Ag-ZnO NCs. The numbers in parentheses indicate the growth time of ZnO NWs.
Figure 3 shows the characteristics of Ag-ZnO NCs. (a) UV–vis absorption spectra of ZnO NWs (solid lines) and Ag-ZnO NCs (dashed lines) at different hydrothermal growth times. The numbers in parentheses indicate the growth time of ZnO NWs. (b) XRD patterns of ZnO NWs (black) and Ag-ZnO NCs (red). (c) EDS mapping analysis of Ag-ZnO NCs. Top view SEM image (top) and elemental mapping image (bottom) show the distribution of Ag (pink). (d) XPS spectra of ZnO NWs (black) and Ag-ZnO NCs (red). (e) High-resolution XPS spectra of Ag 3d orbitals in ZnO NWs (black) and Ag-ZnO NCs (red).
Figure 4 shows high-resolution XPS spectra of the N1s orbital of (a) ZnO NW and (b) Ag-ZnO NC. Before (black) and after (red) streptavidin coating.
Figure 5 shows the fluorescence signal enhancement of the ssDNA hybridization probe on Ag-ZnO NCs. (a) Comparison of the UV-vis absorption spectra of Ag-ZnO NCs (solid line) with the excitation (blue region)/emission (green region) spectra of the FAM-labeled DNA hybridization probe. The numbers in parentheses indicate the growth time of ZnO NWs. (b) Fluorescence emission spectra and (c) fluorescence decay curves of FAM-labeled ssDNA hybridization probes on glass (grey), ZnO NWs (blue), and Ag-ZnO NCs (red).
Figure 6 shows the fluorescence enhancement of fluorescently labeled ssDNA hybridization probes under various Ag-ZnO NC synthesis conditions. (a) Effect of growth time of ZnO NWs on fluorescence intensity. Normalized fluorescence intensity at 528 nm is shown for ssDNA hybridization probes of ZnO NWs (gray) and Ag-ZnO NCs (green). ZnO NWs were prepared at various growth times (0, 0.5, 1, and 2 h). Effect of (b) AgNO 3 concentration and (c) reaction time during photochemical deposition on fluorescence intensity. Fluorescence intensity is shown at 528 nm for the ssDNA hybridization probe on Ag-ZnO NCs. Error bars represent the standard deviation of fluorescence intensity from three independent samples.
Figure 7 shows a 15% polyacrylamide gel image of double-stranded DNA produced by hybridization of FAM-labeled DNA hybridization probes and their complementary strands. M, 100/25bp DNA ladder; 1, FAM-labeled DNA hybridization probe; 2, complementary strand; 3, dsDNA (FAM-labeled DNA probe/complementary strand).
Figure 8 shows detection of dsDNA. (a) Effect of growth time of ZnO NWs on fluorescence enhancement. Normalized fluorescence intensities are shown at 528 nm for dsDNA of ZnO NWs (gray) and Ag-ZnO NCs (green). ZnO NWs were prepared at various growth times (0, 0.5, 1, and 2 h). Normalized fluorescence intensity at 528 nm = (F 528, substrate ) / (F 528, glass ). (b) Effect of dsDNA length on fluorescence enhancement. Normalized fluorescence intensity at 528 nm is shown for dsDNA of ZnO NWs (gray) and Ag-ZnO NCs (green). The length of dsDNA varied from 10 to 60 bp. (c) Fluorescence decay curves of dsDNA (20 bp) immobilized on glass (grey), ZnO NWs (blue), and Ag-ZnO NCs (red). (d) Fluorescence image and (e) intensity plot of dsDNA (20 bp) in serial dilutions of glass, ZnO NW, AgNIF, and Ag-ZnO NC. Error bars represent the standard deviation of fluorescence intensity from three independent samples. (f) Linear relationship between fluorescence intensity and dsDNA concentration in Ag-ZnO NCs. The concentration of dsDNA ranged from 0 to 5 nM.
Figure 9 shows the synthesis of AgNIF. (a) UV-vis absorption spectrum of AgNIF. (b) Top view (left) and cross-section view (right) SEM images of AgNIF. The synthesized AgNIF is a single-layer 2D substrate.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. In addition, in the following description, many specific details, such as specific components, are shown, but this is provided to facilitate a more general understanding of the present invention, and it is known in the art that the present invention can be practiced without these specific details. It will be self-evident to those who have the knowledge. Additionally, in describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description will be omitted.
본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선에 형성된 은나노 입자; 형광이 표지된 유전자 프로브; 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리가 유지되어 형광 신호가 증폭되는 은나노 산화아연 나노선을 제공한다. The present invention relates to a substrate; Nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; Provided is a silver nano-zinc oxide nanowire in which the fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe to amplify the metal fluorescence signal.
도 1 및 도 2는 본 발명의 은나노 산화아연 나노선의 모식도로서, 기판 상에 성장된 나노선, 나노선 위에 형성된 은나노 입자, 은나노 입자 상에 형성된 스트렙트아비딘 및 형광이 표지된 유전자 프로브를 포함하는 구성일 수 있다.1 and 2 are schematic diagrams of the silver nano-zinc oxide nanowire of the present invention, which includes a nanowire grown on a substrate, silver nanoparticles formed on the nanowire, streptavidin formed on the silver nanoparticle, and a fluorescently labeled genetic probe. It may be a configuration.
본 발명의 일 예에서, 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리는 5 내지 95 nm인 이고, 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 거리는 뉴클레오타이드가 10 내지 90개로 이루어진 유전자 프로브에 의해서 형성되는 것이며, 바람직하게 상기 유전자 프로브는 이중가닥 뉴클레오타이드 10 내지 60 염기쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 것이다. In one example of the present invention, the distance at which amplification of the metal fluorescence signal between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe is 5 to 95 nm, and the distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe is 5 to 95 nm. The distance is formed by a genetic probe consisting of 10 to 90 nucleotides, and preferably the genetic probe is selected from the group consisting of double-stranded nucleotides of 10 to 60 base pairs.
본 발명에서, 상기 기판은 유리, 종이, 실리카 겔, 실리콘 웨이퍼, 알루미나, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 고분자 막으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, the substrate is any one selected from the group consisting of glass, paper, silica gel, silicon wafer, alumina, polystyrene, polyethylene, polypropylene, and polymer membrane, but is not limited thereto.
본 발명에서, 산화아연은 극성표면이 매우 안정하여 여러 나노 구조를 형성하기 용이하다. 상기 기판에 나노선을 성장시킬 경우 프로브의 고정화를 위한 넓은 표면적을 제공하므로 DNA 결합을 위한 기질로 효율적이다. 반면, 나노선 대신 0차원 나노입자를 이용할 경우 나노입자의 넓은 크기 분포와 기판상의 불균일한 분포로 인해 신호의 정확한 증강 효과나 재현성 구현에 어려움이 있을 수 있다. In the present invention, zinc oxide has a very stable polar surface, making it easy to form various nanostructures. When nanowires are grown on the substrate, it provides a large surface area for immobilization of probes, making it an efficient substrate for DNA binding. On the other hand, if zero-dimensional nanoparticles are used instead of nanowires, there may be difficulties in implementing accurate signal enhancement effects or reproducibility due to the wide size distribution of the nanoparticles and uneven distribution on the substrate.
상기 산화아연 시드층을 형성하기 위한 시드용액은 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 0.01 M 아연 아세테이트 디하이드레이트(zinc acetate dihydrate) 및 0.03 M 소듐 하이드록사이드(sodium hydroxide)를 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. The seed solution for forming the zinc oxide seed layer may include zinc acetate dihydrate, preferably 0.01 M zinc acetate dihydrate and 0.03 M sodium hydroxide. hydroxide), but is not limited thereto.
상기 나노선은 해당 분야에 알려진 합성법과 이에 따른 적절한 시간을 선택하여 합성할 수 있고, 바람직하게 1 내지 2 시간의 수열합성으로 형성된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.The nanowire can be synthesized by selecting a synthesis method known in the field and an appropriate time, and is preferably formed by hydrothermal synthesis for 1 to 2 hours, but is not limited thereto.
또한, 유전자 프로브는 해당 분야에 알려진 모든 수단을 사용할 수 있으나, 일측에 바이오틴이 결합되고 또 다른 일측에 형광이 표지된 것이고, 바람직하게 상기 유전자 프로브는 일측에 공유 결합이 가능한 작용기가 도입되거나 바이오틴이 결합되고 다른 일측에 형광이 표지된 것이다. 형광 표지자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있다. In addition, all means known in the art can be used as a genetic probe, but one side is bound to biotin and the other side is fluorescently labeled. Preferably, the genetic probe has a covalently bondable functional group introduced to one side or biotin is added to one side. It is combined and the other side is labeled with fluorescence. Examples of fluorescent markers include FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red, etc.
상기 아연 전구체용액은 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate) 및 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine)을 포함할 수 있다. 상기 헥사메틸렌테트라민은 아연 전구체가 산화아연으로 전환될 때 기재상에서 특정 면 방향(1차원 방향)으로 성장할 수 있도록 하는 것으로, 나노선의 형태학적 특징에 영향을 주는 바, 구체적으로 특정 결정면의 성장을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 즉, 아연전구체가 산화물로 전환되고 나노선의 1차원적 구조로 성장하도록 측 방향의 성장을 억제하는 역할을 한다. 이때, 상기 헥사메틸렌테트라민은 환원제의 기능을 한다. 바람직하게는 나노선의 전구체 용액으로 25 mM 아연 니트레이트 헥사하이드레이트(zinc nitrate hexahydrate) 및 25 mM 헥사메틸렌테트라민(hexamethylene tetramine)을 포함하는 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. The zinc precursor solution may include zinc nitrate hexahydrate and hexamethylene tetramine. The hexamethylenetetramine allows growth in a specific plane direction (one-dimensional direction) on the substrate when the zinc precursor is converted to zinc oxide, and affects the morphological characteristics of the nanowire, specifically, the growth of a specific crystal plane. It plays a role in promoting or suppressing. In other words, it serves to suppress lateral growth so that the zinc precursor is converted to oxide and grows into a one-dimensional nanowire structure. At this time, the hexamethylenetetramine functions as a reducing agent. Preferably, the nanowire precursor solution includes 25mM zinc nitrate hexahydrate and 25mM hexamethylene tetramine, but is not limited thereto.
상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 해당 분야에 알려진 다양한 방법으로 제조할 수 있고, 바람직하게 상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 광화학 증착으로 이루어지는 것이고, 바람직하게 상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 0.1 내지 0.5 mM 질산은 용액을 포함하는 광화학 증착으로 형성된 것이며, 바람직하게 상기 나노선에 형성된 은나노 입자는 15 내지 60분의 광화학 증착으로 형성된 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.Silver nanoparticles formed in the nanowire can be manufactured by various methods known in the art. Preferably, the silver nanoparticles formed in the nanowire are made by photochemical deposition, and the silver nanoparticles formed in the nanowire are preferably 0.1 to 0.5mM. It is formed by photochemical deposition containing a silver nitrate solution, and preferably, the silver nanoparticles formed in the nanowire are formed by photochemical deposition for 15 to 60 minutes, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 기판; 상기 기판 상에 성장된 나노선; 및 상기 나노선에 형성된 은나노 입자; 형광이 표지된 유전자 프로브; 상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리가 유지되어 형광 신호가 증폭되는 은나노 산화아연 나노선을 이용한 형광신호 검출방법을 제공한다. In addition, the present invention relates to a substrate; Nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; A method of detecting a fluorescence signal using a silver nano-zinc oxide nanowire is provided, in which the fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe to amplify the metal fluorescence signal.
은나노 산화아연 나노선 복합구조체, 특히 은나노 입자의 특성에 따라 금속 형광 신호 증폭이 가능한 형광 파장대가 있다. 본 발명의 형광 신호는 녹색 파장대로 Exitation 380 내지 540 nm이고, Emission 440 내지 560 nm에서 측정될 수 있고, 바람직하게는 Exitation 485이고, Emission 528 nm에서 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Depending on the characteristics of the silver nano-zinc oxide nanowire composite structure, especially the silver nano particles, there is a fluorescence wavelength range in which metal fluorescence signal amplification is possible. The fluorescent signal of the present invention can be measured in the green wavelength range at Exitation 380 to 540 nm and Emission 440 to 560 nm, preferably at Exitation 485 and Emission 528 nm, but is not limited thereto.
본 발명의 일 예에서, 상기 형광 신호 증폭은 바이오틴 및 형광이 표지된 유전자 프로브의 바이오틴이 스트렙트아비딘과 결합하면서 발생하는 것이다.In one example of the present invention, the fluorescence signal amplification occurs when biotin and the biotin of a fluorescently labeled genetic probe bind to streptavidin.
추가적으로, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계; (e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및 (f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 은나노 산화아연 나노선의 제조방법을 제공한다.Additionally, the present invention includes the steps of (a) preparing a nanowire seed solution; (b) preparing a nanowire precursor solution; (c) growing nanowires on a substrate; (d) forming silver nanoparticles on the nanowire; (e) introducing streptavidin; and (f) fixing the genetic probe. It provides a method for manufacturing silver nano-zinc oxide nanowires.
또한, 본 발명은 (a) 나노선 시드용액을 제조하는 단계; (b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계; (c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계; (d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계; (e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및 (f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;로 제조된 은나노 산화아연 나노선을 제공한다. In addition, the present invention includes the steps of (a) preparing a nanowire seed solution; (b) preparing a nanowire precursor solution; (c) growing nanowires on a substrate; (d) forming silver nanoparticles on the nanowire; (e) introducing streptavidin; and (f) fixing the genetic probe.
상기 나노선의 직경은 20 내지 100 nm인 것이 바람직하다. The diameter of the nanowire is preferably 20 to 100 nm.
상기 (c)단계에서, 나노선은 수열합성법을 이용하여 성장시킬 수 있으며, 상기 (c)단계는 i) 상기 아연 시드용액을 기판에 도포하여 시드층을 형성하는 단계; 및 ii) 상기 시드층을 아래로 향하게 하여 기판을 상기 아연 전구체용액에 담근 후 95℃에서 반응시키는 단계;를 포함한다. 이때 산화아연 시드층과 아연 전구체용액의 반응시간을 조절하여 나노선의 길이를 조정할 수 있고, 약 500 nm/hr로 길이로 성장한다.In step (c), nanowires can be grown using hydrothermal synthesis, and step (c) includes i) applying the zinc seed solution to a substrate to form a seed layer; and ii) immersing the substrate in the zinc precursor solution with the seed layer facing down and then reacting at 95°C. At this time, the length of the nanowire can be adjusted by adjusting the reaction time between the zinc oxide seed layer and the zinc precursor solution, and it grows to a length of about 500 nm/hr.
상기 (d) 단계의 은나노 입자는 50 내지 300 nm의 크기로 형성될 수 있고, 은용액(0.4 mM AgNO3 in 25 % ethyl alcohol)의 농도 및 증착 시간을 조절하여 은나노 입자의 크기를 조절할 수 있다. The silver nanoparticles in step (d) can be formed in a size of 50 to 300 nm, and the size of the silver nanoparticles can be adjusted by adjusting the concentration and deposition time of the silver solution (0.4 mM AgNO 3 in 25% ethyl alcohol). .
상기 (e) 단계는 산화아연과 히스티딘 간의 결합력을 이용해 표면처리 없이 산화하연 나노선에 히스티딘 아미노산들로 표지된 단백질 구체적으로 히스티딘이 N 말단 또는 C 말단에 표지된 스트렙트아비딘을 사용할 수 있다.In step (e), a protein labeled with histidine amino acids can be used on zinc oxide nanowires without surface treatment by utilizing the binding force between zinc oxide and histidine. Specifically, streptavidin with histidine labeled at the N-terminus or C-terminus can be used.
상기 (f) 단계는 바이오틴 및 형광이 표지된 유전자 프로브의 바이오틴이 상기 스트렙트아비딘과 결합하면서 발생하는 형광 신호 증폭을 위한 것이다. Step (f) is for amplifying the fluorescence signal generated when biotin and the biotin of the fluorescently labeled gene probe bind to the streptavidin.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear with reference to the embodiments described in detail below. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms, and the present embodiments are merely intended to ensure that the disclosure of the present invention is complete and to include common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the invention is only defined by the scope of the claims.
<실시예 1> 재료<Example 1> Materials
Zinc acetate dihydrate (≥98%), sodium hydroxide (≥98%), zinc nitrate hexahydrate (98%), hexamethylenetetramine (≥99%), silver nitrate (≥99.0%), butylamine (≥99.5%) 및 메탄올(≥98%)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입했다. 에틸알코올(무수물, 99.9%)은 삼천화학(대한민국 평택)에서 입수하였다. 스트렙트아비딘은 Abcam(Cambridge, UK)에서 구입했다. DNA 혼성화 프로브는 SFC 프로브(대한민국 청주)에 의해 합성되었으며 서열은 표 1에 나열되어 있다. 인산완충액(PBS; 10X) 및 0.5% Tween 20을 함유하는 10X tris-buffered saline은 각각 Bio-Rad(Hercules, CA, USA) 및 Biosolution Co., Ltd.(대한민국 서울)에서 구입하였다. 이 연구에 사용된 모든 화학 물질은 추가 정제 없이 분석 등급이었다. Cascada III. I 정수 시스템(PALL Co., NY, USA)에서 얻은 탈이온수(DI)는 모든 실험에 걸쳐 사용되었다.Zinc acetate dihydrate (≥98%), sodium hydroxide (≥98%), zinc nitrate hexahydrate (98%), hexamethylenetetramine (≥99%), silver nitrate (≥99.0%), butylamine (≥99.5%) and methanol (≥99.5%). 98%) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ethyl alcohol (anhydrous, 99.9%) was obtained from Samcheon Chemical (Pyeongtaek, Korea). Streptavidin was purchased from Abcam (Cambridge, UK). DNA hybridization probes were synthesized by SFC Probes (Cheongju, Korea) and the sequences are listed in Table 1. Phosphate buffer (PBS; 10X) and 10X tris-buffered saline containing 0.5% Tween 20 were purchased from Bio-Rad (Hercules, CA, USA) and Biosolution Co., Ltd. (Seoul, Korea), respectively. All chemicals used in this study were analytical grade without further purification. Cascada III. Deionized (DI) water obtained from I Water Purification Systems (PALL Co., NY, USA) was used throughout all experiments.
<실시예 2> ZnO 나노선(nonowire, NW)의 열수성장<Example 2> Hydrothermal growth of ZnO nanowire (NW)
1. 시드용액 제조1. Preparation of seed solution
ZnO 시드용액은 습식화학법으로 합성하였다. 구체적으로 0.01 M zinc acetate dihydrate와 0.03 M sodium hydroxide 용액을 메탄올에 60℃에서 교반하면서 녹인 후, 계속 저어주는 상태에서 zinc acetate dihydrate 125 mL까지 수산화나트륨 용액 65mL를 천천히 적가하였다. 혼합 용액을 60℃에서 용액이 초기 부피의 절반으로 줄어들 때까지 교반하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 얻어진 ZnO 시드용액은 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.ZnO seed solution was synthesized by wet chemistry method. Specifically, 0.01 M zinc acetate dihydrate and 0.03 M sodium hydroxide solution were dissolved in methanol at 60°C while stirring, and then 65 mL of sodium hydroxide solution was slowly added dropwise until 125 mL of zinc acetate dihydrate was stirred. The mixed solution was stirred at 60°C until the solution was reduced to half of its initial volume and incubated at room temperature for 1 hour. The obtained ZnO seed solution was stored at 4°C until use.
2. ZnO NW 제조2. ZnO NW fabrication
시드용액을 유리 슬라이드 위에 드롭 캐스팅하고 에탄올과 탈이온수로 세척한 후 N2 가스로 건조시켰다. 시드용액의 드롭 캐스팅을 3회 반복한 후 시드코팅된 유리 슬라이드를 15분 동안 150℃에서 가열했다. ZnO NW 합성을 위한 전구체 용액은 질산아연 6수화물과 헥사메틸렌테트라민을 모두 25mM로 혼합하고 실온에서 10분 동안 교반하여 준비했다. 열수 성장을 위해 전구체 용액을 대류 오븐에서 0.5~2시간 동안 95℃에서 배양했다. 성장된 ZnO 나노선 기판을 DI water로 완전히 세척하고 N2 가스로 건조시켰다.The seed solution was drop-cast on a glass slide, washed with ethanol and deionized water, and dried with N 2 gas. After repeating drop casting of the seed solution three times, the seed-coated glass slide was heated at 150°C for 15 minutes. The precursor solution for ZnO NW synthesis was prepared by mixing zinc nitrate hexahydrate and hexamethylenetetramine at 25mM and stirring for 10 minutes at room temperature. For hydrothermal growth, the precursor solution was incubated at 95°C for 0.5–2 h in a convection oven. The grown ZnO nanowire substrate was thoroughly washed with DI water and dried with N 2 gas.
<실시예 3> ZnO NW에 은나노입자 광화학 증착<Example 3> Photochemical deposition of silver nanoparticles on ZnO NW
Ag-ZnO 복합체(nanocomposite, NC)는 단순 광화학 증착 방법을 사용하여 합성되었다. 질산은은 0.4 mM의 최종 농도에서 25% 에틸 알코올에 용해되었다. 준비된 ZnO NW를 질산은 용액에 담그고 UV-A 램프(365 nm)에서 4.77 mW/cm2의 강도로 15분 동안 조사하여 ZnO NW 표면의 Ag+를 환원시켰다. 조사 후, Ag-ZnO NC를 탈이온수로 헹구고 N2 가스 하에서 건조시켰다. Ag-ZnO NCs를 질산은 용액에 다시 담그어 위의 절차를 0에서 3회 반복했다(최종 조사 시간은 15~60분 범위).Ag-ZnO composite (nanocomposite, NC) was synthesized using a simple photochemical deposition method. Silver nitrate was dissolved in 25% ethyl alcohol at a final concentration of 0.4 mM. The prepared ZnO NW was immersed in a silver nitrate solution and irradiated under a UV-A lamp (365 nm) at an intensity of 4.77 mW/cm 2 for 15 minutes to reduce Ag + on the surface of the ZnO NW. After irradiation, the Ag-ZnO NCs were rinsed with deionized water and dried under N 2 gas. The Ag-ZnO NCs were re-immersed in the silver nitrate solution and the above procedure was repeated 0 to 3 times (the final irradiation time ranged from 15 to 60 min).
<실시예 4> ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 특성<Example 4> Characteristics of ZnO NW and Ag-ZnO NC
ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 UV-visible 흡수 스펙트럼은 UV-1800 UV-vis spectrophotometer(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 획득했다. 나노 구조의 형태는 10kV 및 20k 배율에서 가속 전압을 사용하는 전계 방출 주사 전자 현미경(FE-SEM)(S-4800 장비, Hitachi, Tokyo, Japan)에 의해 특성화되었다. 측면 SEM 이미지는 50k 배율에서 5kV 전자빔 하에서 SU8230 초고해상도(UHR) FE-SEM 기기(Hitachi)를 사용하여 얻었다. 원소 분포 매핑 이미지는 10kV의 가속 전압에서 SU8230 UHR FE-SEM 장비를 사용하여 획득했다. X선 광전자 분광법(XPS) 분석은 K-Alpha+ XPS 시스템(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)을 사용하여 수행되었다. ZnO NW와 Ag-ZnO NC의 결정상을 조사하기 위해 SmartLab 9kW(Rigaku Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 45 kV 및 200 mA에서 X-선 회절(XRD) 분석을 수행하였다. 2θ에서 Cu Kα 방사선(λ = 1.54056 Å)은 20°에서 80° 범위였다.UV-visible absorption spectra of ZnO NWs and Ag-ZnO NCs were acquired using a UV-1800 UV-vis spectrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). The morphology of the nanostructures was characterized by field emission scanning electron microscopy (FE-SEM) (S-4800 instrument, Hitachi, Tokyo, Japan) using accelerating voltages at 10 kV and 20 k magnification. Lateral SEM images were obtained using a SU8230 ultrahigh resolution (UHR) FE-SEM instrument (Hitachi) under a 5 kV electron beam at 50 k magnification. Elemental distribution mapping images were acquired using a SU8230 UHR FE-SEM instrument at an acceleration voltage of 10 kV. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis was performed using the K-Alpha + XPS system (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). To investigate the crystalline phases of ZnO NW and Ag-ZnO NC, X-ray diffraction (XRD) analysis was performed at 45 kV and 200 mA using SmartLab 9kW (Rigaku Co., Tokyo, Japan). Cu Kα radiation (λ = 1.54056 Å) in 2θ ranged from 20° to 80°.
<실시예 5> 형광단-표지 DNA 프로브 검출<Example 5> Detection of fluorophore-labeled DNA probes
1. 단일가닥 DNA(ssDNA) 검출1. Single-stranded DNA (ssDNA) detection
ZnO 및 Ag 표면에 ssDNA 혼성화 프로브를 고정하기 위해 기질을 희석된 streptavidin 용액(2000:1, 1X PBS)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양했다. 1X Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20(TBS-T)으로 세 번 세척한 후 streptavidin으로 코팅된 기질을 N2 가스 하에서 건조하고 사용할 때까지 4℃에서 보관했다. 1X PBS에 희석된 ssDNA 혼성화 프로브의 분취량(20 μL)을 스트렙트아비딘 코팅 표면에 분산시켰다. 실온에서 1시간 배양 후, 위의 기질을 1X TBS-T로 3회 헹구어 잔류 DNA 혼성화 탐침을 제거하였다. 형광 강도는 Synergy H1 하이브리드 다중 모드 판독기(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 485 nm에서 여기되어 528 nm에서 측정되었다. DNA 혼성화 프로브의 형광 강도는 기질의 배경 신호를 제외한 값으로 표시된다(F528, DNA-F528, Blank).To immobilize ssDNA hybridization probes on ZnO and Ag surfaces, the substrates were incubated with diluted streptavidin solution (2000:1, 1X PBS) for 1 h at room temperature. After washing three times with 1X Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20 (TBS-T), the streptavidin-coated substrate was dried under N 2 gas and stored at 4°C until use. An aliquot (20 μL) of ssDNA hybridization probe diluted in 1X PBS was dispersed on a streptavidin-coated surface. After incubating for 1 hour at room temperature, the above substrate was rinsed three times with 1X TBS-T to remove residual DNA hybridization probe. Fluorescence intensity was measured at 528 nm with excitation at 485 nm using a Synergy H1 hybrid multimode reader (Agilent, Santa Clara, CA, USA). The fluorescence intensity of the DNA hybridization probe is expressed as the value excluding the background signal of the substrate (F 528 , DNA-F 528 , Blank).
2. 이중가닥 DNA(dsDNA) 검출2. Detection of double-stranded DNA (dsDNA)
다양한 길이의 dsDNA를 생성하기 위해 DNA 혼성화 프로브를 상응하는 상보 가닥과 함께 95℃에서 5분, 37℃에서 30분 동안 배양했다. dsDNA 고정화 기질의 형광 이미지는 Azure Sapphire 생체분자 이미저(Azure Biosystems, Dublin, CA, USA)로 얻었고, 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 분석했다.To generate dsDNA of various lengths, DNA hybridization probes were incubated with the corresponding complementary strands for 5 min at 95°C and 30 min at 37°C. Fluorescence images of dsDNA immobilized substrates were obtained with an Azure Sapphire biomolecular imager (Azure Biosystems, Dublin, CA, USA), and fluorescence intensity was analyzed with ImageJ software.
<실시예 6> 기판에서 ssDNA 및 dsDNA의 형광 수명 분석<Example 6> Fluorescence lifetime analysis of ssDNA and dsDNA on substrate
여러 기판에서 준비된 ssDNA 및 dsDNA의 시간 분해 형광 감쇠는 Fluorolog 3 spectrofluorometer (Horiba Scientific, Kyoto, Japan)에서 여기 소스로 467nm 펄스 레이저 다이오드를 사용하여 λem = 520nm에서의 형광 감쇠 피크를 10,000개 누적하여 결정되었다. 형광 수명은 각각 ssDNA 및 dsDNA의 존재 하에서 삼중 및 사중 지수 감쇠 모델에 피팅하여 시간-분해 형광 감쇠 곡선으로부터 분석되었다.Time-resolved fluorescence decay of ssDNA and dsDNA prepared on different substrates was determined by accumulating 10,000 fluorescence decay peaks at λ em = 520 nm using a 467 nm pulsed laser diode as the excitation source in a Fluorolog 3 spectrofluorometer (Horiba Scientific, Kyoto, Japan). It has been done. Fluorescence lifetimes were analyzed from time-resolved fluorescence decay curves by fitting triple and quadruple exponential decay models in the presence of ssDNA and dsDNA, respectively.
<실시예 7> Ag 나노섬 필름의 합성<Example 7> Synthesis of Ag nanoisland film
질산은 및 부틸아민 용액은 최종 농도 2mM이 되도록 무수 에틸 알코올에 용해시켜 준비했다. 유리 슬라이드를 질산은과 부틸아민 용액의 1:1 혼합물에 담그고 55℃에서 배양하였다. 40분 후, 준비된 Ag 나노섬 필름을 DI water로 세척하고 N2 가스 하에서 건조시켰다.Silver nitrate and butylamine solutions were prepared by dissolving them in anhydrous ethyl alcohol to a final concentration of 2mM. Glass slides were immersed in a 1:1 mixture of silver nitrate and butylamine solution and incubated at 55°C. After 40 minutes, the prepared Ag nanoisland film was washed with DI water and dried under N 2 gas.
<실시예 8> 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동<Example 8> Polyacrylamide gel electrophoresis
혼성화된 dsDNA 생성물은 1X TBE 완충액에서 수행된 15% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 검증되었다. 120V에서 45분 동안 실행한 후 폴리아크릴아미드 겔을 GelRed(Biotium, Hayward, CA, USA)로 염색하고 Azure 280 이미징 시스템(Azure Biosystems, Dublin, CA, USA)을 사용하여 시각화했다.Hybridized dsDNA products were verified by 15% polyacrylamide gel electrophoresis performed in 1X TBE buffer. After running at 120 V for 45 min, polyacrylamide gels were stained with GelRed (Biotium, Hayward, CA, USA) and visualized using an Azure 280 imaging system (Azure Biosystems, Dublin, CA, USA).
<실험예 1> Ag-ZnO NC 디자인<Experimental Example 1> Ag-ZnO NC design
3D MEF 기판은 본 발명에서 형광체와 3D 금속 나노구조 사이의 상호작용을 개선하기 위해 ZnO NW의 열수 합성과 AgNP의 광화학적 증착을 통해 설계 및 구성되었다. ZnO NW 어레이의 다양한 특성은 바이오센서 분야에서 널리 연구되어 왔다. 따라서 AgNP 제작에 적합한 3D 템플릿을 제공한다. 형광단과 금속 표면 사이의 상호 작용은 다양한 시나리오에서 발생할 수 있다(도 1). 최적의 거리에서 형광단은 고정된 AgNP와 상호 작용할 수 있다(도 1a). 최적이 아닌 거리에서 금속 표면에서 너무 가깝거나 너무 멀어지면 형광 신호가 소멸되거나 향상되지 않을 수 있다. 유리에 증착된 AgNP와 같은 2D MEF 기판의 MEF 효과는 주로 이러한 현상을 통해 발생한다. 그러나 AgNP가 3D 환경에 위치한 Ag-ZnO NC에서는 형광단이 ZnO NW 가닥 내의 인접한 AgNP로부터의 적합한 거리에 위치할 수 있다(도 1b). 다른 NW 가닥에서 제작된 AgNP도 형광단과 상호 작용할 수 있다(도 1c). 따라서 Ag-ZnO NC는 DNA 검출을 위한 최적의 거리에서 상호 작용을 통해 감도를 높이는 데 기여할 수 있다.In the present invention, the 3D MEF substrate was designed and constructed through hydrothermal synthesis of ZnO NWs and photochemical deposition of AgNPs to improve the interaction between phosphors and 3D metal nanostructures. The various properties of ZnO NW arrays have been widely studied in the biosensor field. Therefore, it provides a 3D template suitable for AgNP production. Interactions between fluorophores and metal surfaces can occur in a variety of scenarios (Figure 1). At the optimal distance, the fluorophore can interact with the immobilized AgNPs (Figure 1a). At suboptimal distances, too close or too far from the metal surface, the fluorescence signal may be extinguished or not enhanced. The MEF effect of 2D MEF substrates, such as AgNPs deposited on glass, mainly occurs through this phenomenon. However, in Ag-ZnO NCs where AgNPs are located in a 3D environment, the fluorophore can be located at a suitable distance from the adjacent AgNPs within the ZnO NW strand (Figure 1b). AgNPs fabricated from different NW strands can also interact with the fluorophore (Figure 1c). Therefore, Ag-ZnO NCs can contribute to increasing sensitivity through interaction at the optimal distance for DNA detection.
<실험예 2> Ag-ZnO NC 구조의 제조 및 특성<Experimental Example 2> Manufacturing and characteristics of Ag-ZnO NC structure
Ag-ZnO NC는 ZnO NW의 열수 성장과 AgNP의 부위별 광화학 증착을 통해 준비되었다. ZnO NW에 대한 AgNP 증착의 개략도는 세 단계로 구성된다(도 2a). 먼저 유리 위에 드롭캐스팅법으로 ZnO 시드층을 형성하였다. 다음으로, ZnO NW는 95℃에서 ZnO 시드층으로부터 성장되었다. 성장 시간(0-2 h)을 조정하여 ZnO NW의 길이를 조정했다. 마지막 단계에서 ZnO가 UV 광 노출 하에서 전자-정공 쌍을 생성하기 때문에 AgNP가 광화학적 환원을 통해 NW 표면에 증착되었다.Ag-ZnO NCs were prepared through hydrothermal growth of ZnO NWs and site-specific photochemical deposition of AgNPs. The schematic diagram of AgNP deposition on ZnO NWs consists of three steps (Figure 2a). First, a ZnO seed layer was formed on glass by drop casting. Next, ZnO NWs were grown from the ZnO seed layer at 95°C. The length of ZnO NWs was adjusted by adjusting the growth time (0–2 h). In the last step, AgNPs were deposited on the NW surface through photochemical reduction because ZnO generates electron-hole pairs under UV light exposure.
ZnO NW 성장 시간에 의존하는 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 형태를 FE-SEM으로 분석했다(도 2b 및 c). ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 괄호 안의 숫자는 ZnO NW 성장 시간을 나타낸다. ZnO NW는 성장 기간을 연장하여 길어졌고, 1시간 동안 성장한 후 시드 레이어를 완전히 덮었다(ZnO NW(1))(도 2b). 단면 SEM 이미지에서 볼 수 있듯이 1시간과 2시간 동안 합성된 ZnO NW의 길이는 각각 149 및 723 nm였다(도 2c). AgNO3 수용액에 침지하여 UV를 조사한 후 직경 50~200 nm의 AgNP가 ZnO NW의 표면을 장식하였다. AgNP는 ZnO NW의 성장 지속 시간이 1시간일 때(Ag-ZnO NC(1)) 전체 NW 표면에서 제조되는 반면, ZnO NW가 2시간 동안 합성되었을 때(Ag-ZnO NC(2)) 대부분 NW의 끝에 증착되었다. NW의 높이가 ≥723 nm일 때 입사광과 Ag+ 이온이 바닥에 접근할 수 없기 때문에 ZnO NW에 Tip-grafted AgNP가 형성될 수 있다.The morphologies of ZnO NWs and Ag-ZnO NCs depending on the ZnO NW growth time were analyzed by FE-SEM (Figures 2b and c). The numbers in parentheses for ZnO NW and Ag-ZnO NC indicate the ZnO NW growth time. The ZnO NWs were elongated by extending the growth period, and completely covered the seed layer after growing for 1 h (ZnO NW(1)) (Figure 2b). As shown in the cross-sectional SEM image, the lengths of ZnO NWs synthesized for 1 and 2 hours were 149 and 723 nm, respectively (Figure 2c). After immersion in AgNO 3 aqueous solution and UV irradiation, AgNPs with a diameter of 50 to 200 nm decorated the surface of ZnO NW. AgNPs were prepared on the entire NW surface when the growth duration of ZnO NWs was 1 h (Ag-ZnO NC(1)), whereas when ZnO NWs were synthesized for 2 h (Ag-ZnO NC(2)) most of the NWs was deposited at the end of When the height of the NW is ≥723 nm, tip-grafted AgNPs can be formed on the ZnO NW because the incident light and Ag + ions cannot approach the bottom.
Ag-ZnO NC의 특성을 조사하기 위해 UV-visible 흡수 스펙트럼, XPS 스펙트럼 및 EDS 매핑 분석을 수행했다. Ag-ZnO NC 및 ZnO NW의 UV-visible 흡수 스펙트럼을 분석했다(도 3a). ZnO NW의 강한 흡수는 400 nm 미만의 파장에서만 관찰되었다. ZnO NW의 피크 강도는 성장 시간에 따라(0, 0.5, 1 및 2h) 향상되었다. 대조적으로, Ag-ZnO NC은 가시광선 파장 범위에서 넓은 흡수 스펙트럼이 관찰되었다. 이 결과는 Ag-ZnO NC의 AgNP가 50~200 nm 범위의 크기 분포를 가짐을 보여주는 도 2b의 SEM 이미지로 확인되었다.UV-visible absorption spectrum, XPS spectrum, and EDS mapping analysis were performed to investigate the properties of Ag-ZnO NCs. The UV-visible absorption spectra of Ag-ZnO NCs and ZnO NWs were analyzed (Figure 3a). Strong absorption of ZnO NWs was observed only at wavelengths below 400 nm. The peak intensity of ZnO NWs improved with growth time (0, 0.5, 1, and 2 h). In contrast, Ag-ZnO NCs had a broad absorption spectrum in the visible wavelength range. This result was confirmed by the SEM image in Figure 2b, which shows that AgNPs in Ag-ZnO NCs have a size distribution in the range of 50 to 200 nm.
ZnO NW 표면에서 합성된 AgNP를 분석하기 위해 XRD, EDS mapping, XPS 분석을 수행하였다. ZnO NW와 Ag-ZnO NC 모두의 XRD 패턴은 ZnO의 육방정 울츠광 구조의 회절 피크를 나타냈다(2θ = 31.77°, 34.41°, 36.26°, 47.55°, 56.62°, 62.87° 및 68.01°는 각각 (100), (002), (101), (102), (110), (103) 및 (112) 결정면을 나타냄)(도 3b). 금속성 Ag (111), (200), (220) 및 (311) 결정면의 특징적인 회절 피크는 Ag-ZnO NCs에서만 2θ = 38.11°, 44.30°, 64.44° 및 77.40°에 나타난다. Ag2O와 같은 불순물의 특징적인 회절 피크는 ZnO NW 또는 Ag-ZnO NC에서 관찰되지 않았다. Ag-ZnO NC에서 Ag 원소의 분포는 EDS 매핑 이미지 분석을 수행하여 추가로 명확해졌다(도 3c). XPS 스펙트럼을 조사하여 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 화학적 상태를 조사했다(도 3d 및 e). Zn, O 및 C를 나타내는 피크는 두 기판의 전체 XPS 스펙트럼에서 얻었다. Ag-ZnO NC 기판에서 367.7 및 373.7 eV에 위치한 두 개의 별개의 Ag 3d5/2 및 Ag 3d3/2 피크가 측정되었다. 이 두 피크의 결합 에너지는 순수한 AgNP(374.2 및 368.2 eV)의 결합 에너지보다 훨씬 낮아 AgNP와 ZnO NW 사이에 강한 상호 작용이 있음을 시사한다. ZnO의 페르미 에너지 준위가 Ag보다 낮다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 Ag의 전자는 ZnO로 전달될 수 있다. Ag+의 결합 에너지는 Ag0보다 훨씬 낮기 때문에 Ag 3d5/2 및 Ag 3d3/2에 해당하는 피크가 더 낮은 결합 에너지 수준으로 이동한다. 이 결과는 도 2a에 표시된 프로세스에 따라 ZnO NW에서 AgNP의 제조를 확인했다.XRD, EDS mapping, and XPS analysis were performed to analyze AgNPs synthesized on the ZnO NW surface. The XRD patterns of both ZnO NWs and Ag-ZnO NCs revealed diffraction peaks of the hexagonal wurtzite structure of ZnO (2θ = 31.77°, 34.41°, 36.26°, 47.55°, 56.62°, 62.87° and 68.01°, respectively ( 100), (002), (101), (102), (110), (103), and (112) representing crystal planes) (Figure 3b). The characteristic diffraction peaks of metallic Ag (111), (200), (220), and (311) crystal planes appear at 2θ = 38.11°, 44.30°, 64.44°, and 77.40° only in Ag-ZnO NCs. Characteristic diffraction peaks of impurities such as Ag 2 O were not observed in ZnO NWs or Ag-ZnO NCs. The distribution of Ag elements in Ag-ZnO NCs was further clarified by performing EDS mapping image analysis (Figure 3c). The chemical states of ZnO NW and Ag-ZnO NC were investigated by examining XPS spectra (Figure 3d and e). Peaks representing Zn, O and C were obtained from the full XPS spectra of both substrates. Two distinct Ag 3d 5/2 and Ag 3d 3/2 peaks located at 367.7 and 373.7 eV were measured on the Ag-ZnO NC substrate. The binding energies of these two peaks are much lower than those of pure AgNPs (374.2 and 368.2 eV), suggesting that there is a strong interaction between AgNPs and ZnO NWs. It is well known that the Fermi energy level of ZnO is lower than that of Ag. Therefore, electrons from Ag can be transferred to ZnO. Because the binding energy of Ag + is much lower than that of Ag 0 , the peaks corresponding to Ag 3d 5/2 and Ag 3d 3/2 shift to lower binding energy levels. This result confirmed the fabrication of AgNPs on ZnO NWs according to the process shown in Figure 2a.
<실험예 3> Ag-ZnO NC에서 형광단으로 표지된 DNA 프로브의 형광 향상<Experimental Example 3> Fluorescence enhancement of fluorophore-labeled DNA probes in Ag-ZnO NCs
Ag-ZnO NC의 특성을 입증한 후, 형광단 표지된 ssDNA 혼성화 프로브를 리포터로 사용하여 Ag-ZnO NC에 대한 형광 증강 효과를 조사하였다. 기판에 ssDNA 혼성화 프로브를 고정하기 위해 ssDNA의 비표지 말단을 비오틴 잔기로 변형했다. 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC는 스트렙트아비딘으로 코팅되어 ssDNA 혼성화 프로브가 스트렙트아비딘-비오틴 상호작용을 통해 기판에 고정될 수 있다. 코팅 단계 후 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC에 스트렙트아비딘의 존재는 N1s 오비탈에 대한 고해상도 XPS 스펙트럼 데이터를 분석하여 확인되었다(도 4).After demonstrating the properties of Ag-ZnO NCs, the fluorescence enhancement effect on Ag-ZnO NCs was investigated using a fluorophore-labeled ssDNA hybridization probe as a reporter. To immobilize the ssDNA hybridization probe on the substrate, the unlabeled end of ssDNA was modified with a biotin residue. Glass, ZnO NWs, and Ag-ZnO NCs were coated with streptavidin so that the ssDNA hybridization probe could be immobilized on the substrate through streptavidin-biotin interactions. The presence of streptavidin in ZnO NWs and Ag-ZnO NCs after the coating step was confirmed by analyzing high-resolution XPS spectral data for the N1s orbital (Figure 4).
다음으로, 상기 기판에 대한 형광 강도를 측정하기 전에, Ag-ZnO NC의 UV-가시광 흡수 스펙트럼을 플루오레세인(FAM) 형광단의 여기/방출 스펙트럼과 비교하였다. Ag-ZnO NC는 350~700nm 범위의 넓은 흡수 스펙트럼을 가지며 성장 시간에 따라 강도가 증가한다(도 5a). Ag-ZnO NC(0) 및 Ag-ZnO NC(0.5)에서는 AgNP에 해당하는 흡수 스펙트럼이 관찰되지 않았다. 짧은 ZnO NW에서 Ag-ZnO NC의 이러한 약한 강도는 ZnO NW 표면에 AgNP가 충분히 형성되지 않았기 때문에 발생할 수 있다. 1시간과 2시간 동안 성장한 ZnO NW(Ag-ZnO NC(1) 및 Ag-ZnO NC(2))에서 AgNP가 형성된 후 UV 스펙트럼의 강화된 강도가 관찰되었다. Ag-ZnO NC의 흡수 스펙트럼은 FAM의 여기/방출 피크와 중첩되었다. 이러한 결과는 ZnO NW가 1시간과 2시간 동안 합성되었을 때 MEF 현상의 메커니즘 중 하나인 Ag-ZnO NC와 FAM 사이의 강력한 플라즈몬 결합 효과를 의미한다(도 5a). FAM 표지된 ssDNA 혼성화 프로브를 사용하여 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC에 대한 형광 강도를 측정했다(도 5b). ZnO NW의 형광 강도는 유리의 형광 강도와 다르지 않았다. 그러나 Ag-ZnO NC의 형광 강도는 극적으로 향상되었다. 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC에서 ssDNA 혼성화 프로브의 형광 수명 분석도 MEF 현상을 통해 Ag-ZnO NC에서 형광 향상을 입증하기 위해 수행되었다(도 5c 및 표 2). 형광단이 금속 나노구조와 상호작용하면 금속 나노구조가 형광단의 방사 붕괴 속도를 수정하기 때문에 형광단의 형광 수명이 감소한다. 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 평균 수명은 각각 13.03, 12.65 및 10.79ns였다.Next, before measuring the fluorescence intensity for the substrate, the UV-visible absorption spectrum of Ag-ZnO NCs was compared with the excitation/emission spectrum of fluorescein (FAM) fluorophore. Ag-ZnO NCs have a broad absorption spectrum ranging from 350 to 700 nm, and the intensity increases with growth time (Figure 5a). Absorption spectra corresponding to AgNPs were not observed in Ag-ZnO NC(0) and Ag-ZnO NC(0.5). This weak strength of Ag-ZnO NCs in short ZnO NWs may be caused by insufficient formation of AgNPs on the ZnO NW surface. Enhanced intensity of the UV spectrum was observed after the formation of AgNPs in ZnO NWs (Ag-ZnO NC(1) and Ag-ZnO NC(2)) grown for 1 and 2 h. The absorption spectrum of Ag-ZnO NCs overlapped with the excitation/emission peaks of FAM. These results imply a strong plasmonic coupling effect between Ag-ZnO NCs and FAM, which is one of the mechanisms of the MEF phenomenon, when ZnO NWs were synthesized for 1 and 2 h (Figure 5a). The fluorescence intensity for glass, ZnO NWs, and Ag-ZnO NCs was measured using a FAM-labeled ssDNA hybridization probe (Figure 5b). The fluorescence intensity of ZnO NW was not different from that of glass. However, the fluorescence intensity of Ag-ZnO NCs was dramatically improved. Fluorescence lifetime analysis of ssDNA hybridization probes on glass, ZnO NWs, and Ag-ZnO NCs was also performed to demonstrate fluorescence enhancement on Ag-ZnO NCs through the MEF phenomenon ( Figure 5 c and Table 2). When a fluorophore interacts with a metal nanostructure, the fluorescence lifetime of the fluorophore decreases because the metal nanostructure modifies the radiative decay rate of the fluorophore. The average lifetimes of glass, ZnO NW, and Ag-ZnO NC were 13.03, 12.65, and 10.79 ns, respectively.
a ssDNA 혼성화 프로브의 형광 수명은 삼중 지수 붕괴 모델에 피팅하여 시간 분해 형광 붕괴 곡선(도 5c)에서 분석되었다. a The fluorescence lifetime of the ssDNA hybridization probe was analyzed from the time-resolved fluorescence decay curve (Fig. 5c) by fitting a triple exponential decay model.
MEF 효과는 금속 나노구조체의 특성에 영향을 받기 때문에 나노물질의 합성 조건을 최적화해야 한다. 첫째, NW의 열수 성장 기간이 형광 강화에 미치는 영향을 조사했다. ZnO NW는 AgNP의 빌딩 블록 역할을 할 수 있기 때문에 ZnO NW의 길이는 AgNP의 제조 및 후속 형광 향상에 영향을 줄 수 있다. ZnO NW 길이가 형광 향상에 미치는 영향을 알아보기 위해 ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 형광 강도를 유리의 형광 강도로 나누었다(정규화된 형광 강도, 도 6a). ZnO NW의 경우, ZnO NW(0), ZnO NW(0.5), ZnO NW(1) 및 ZnO NW(2)의 형광 강도는 각각 6-, 18-, 2- 및 21-배로 증가하였다. Ag-ZnO NC의 경우 Ag-ZnO NC(0), Ag-ZnO NC(0.5), Ag-ZnO NC(1), 및 Ag-ZnO NC(2), 각각 6-, 15-, 95- 및 70-배로 증가하였다. 가장 높은 형광 향상은 Ag-ZnO NC(1)에서 관찰되었다. 0시간과 0.5시간의 ZnO NW 성장 시간에서 ZnO NW와 Ag-ZnO NC의 정규화된 형광 강도는 매우 유사했다. 그러나, 1시간과 2시간의 ZnO NW 성장 후, Ag-ZnO NC의 형광 강화는 ZnO NW보다 훨씬 높았다. Ag-ZnO NCs(0.5)의 약한 형광 강화는 ZnO NW 표면에 AgNP가 불충분하게 형성되었기 때문에 발생한 것일 수 있다.Since the MEF effect is affected by the properties of the metal nanostructure, the conditions for synthesizing nanomaterials must be optimized. First, the effect of the hydrothermal growth period of NWs on fluorescence enhancement was investigated. Because ZnO NWs can serve as building blocks for AgNPs, the length of ZnO NWs can affect the fabrication and subsequent fluorescence enhancement of AgNPs. To determine the effect of ZnO NW length on fluorescence enhancement, the fluorescence intensity of ZnO NW and Ag-ZnO NCs was divided by that of glass (normalized fluorescence intensity, Figure 6 a). In the case of ZnO NW, the fluorescence intensity of ZnO NW(0), ZnO NW(0.5), ZnO NW(1), and ZnO NW(2) increased by 6-, 18-, 2-, and 21-fold, respectively. For Ag-ZnO NCs, 6-, 15-, 95-, and 70-, Ag-ZnO NC(0), Ag-ZnO NC(0.5), Ag-ZnO NC(1), and Ag-ZnO NC(2), respectively. -It increased twofold. The highest fluorescence enhancement was observed for Ag-ZnO NC(1). The normalized fluorescence intensities of ZnO NWs and Ag-ZnO NCs at ZnO NW growth times of 0 h and 0.5 h were very similar. However, after 1 and 2 h of ZnO NW growth, the fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs was much higher than that of ZnO NWs. The weak fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs (0.5) may be caused by insufficient formation of AgNPs on the ZnO NW surface.
AgNO3 용액의 농도와 광화학 증착 단계의 반응 시간은 Ag-ZnO NC의 MEF 효과에 영향을 줄 수 있다. 다양한 농도의 AgNO3에서 증착된 Ag-ZnO NC의 형광 강도를 비교했다(도 6b). 형광 강도는 AgNO3의 농도가 0.1에서 0.4 mM로 증가함에 따라 증가하였으나, 농도가 0.5 mM을 초과하면 감소하였다. 가장 높은 형광 강도는 0.4 mM AgNO3에서 관찰되었다. AgNP(0, 15, 30, 45 및 60분)에 대한 증착 시간의 영향을 조사하기 위해 Ag-ZnO NC에 대한 형광 강도를 분석하였다. 도 6c에서 볼 수 있듯이 AgNP의 증착 시간이 증가함에 따라 형광 강도가 증가하고, 30분 후에 형광 강도가 포화되었다. 따라서, ZnO NW 표면에 AgNP를 형성하기 위해 0.4 mM AgNO3 용액으로 30분 동안 광화학 증착하는 것이 형광 강화에 최적이었다.The concentration of AgNO 3 solution and the reaction time of the photochemical deposition step can affect the MEF effect of Ag-ZnO NCs. The fluorescence intensity of Ag-ZnO NCs deposited at various concentrations of AgNO 3 was compared (Figure 6b). The fluorescence intensity increased as the concentration of AgNO 3 increased from 0.1 to 0.4 mM, but decreased when the concentration exceeded 0.5 mM. The highest fluorescence intensity was observed at 0.4 mM AgNO 3 . To investigate the effect of deposition time on AgNPs (0, 15, 30, 45, and 60 min), the fluorescence intensity for Ag-ZnO NCs was analyzed. As can be seen in Figure 6c, the fluorescence intensity increased as the deposition time of AgNPs increased, and the fluorescence intensity saturated after 30 minutes. Therefore, photochemical deposition for 30 minutes with 0.4 mM AgNO 3 solution to form AgNPs on the ZnO NW surface was optimal for fluorescence enhancement.
<실험예 4> Ag-ZnO NC에 대한 MEF 효과를 통한 dsDNA 검출<Experimental Example 4> dsDNA detection through MEF effect on Ag-ZnO NC
MEF에 대한 이전 연구에서는 형광단과 금속 나노구조 사이의 최적 거리(5-90nm)의 중요성을 강조했다. MEF 기판은 수성 환경에서 금속 나노구조체로부터 최적의 거리에서 형광단을 유지하기 어렵기 때문에 바이오센서에 대한 적용에 제한이 있다. 이중 가닥 DNA 분자는 바이오센서의 주요 표적이며, 프라이머 디자인을 통해 다양한 길이로 쉽게 준비될 수 있다. 따라서 본 발명에서는 다양한 길이의 dsDNA를 사용하여 Ag-ZnO NC 기판의 형광 강화를 조사했다.Previous studies on MEFs have emphasized the importance of the optimal distance (5–90 nm) between the fluorophore and the metal nanostructure. MEF substrates have limited applications in biosensors because it is difficult to maintain the fluorophore at an optimal distance from the metal nanostructure in an aqueous environment. Double-stranded DNA molecules are the main target for biosensors, and can be easily prepared in various lengths through primer design. Therefore, in the present invention, we investigated fluorescence enhancement of Ag-ZnO NC substrates using dsDNA of various lengths.
DNA 가닥의 염기 수는 같지만 ssDNA와 dsDNA의 지속 길이는 상당히 다르다. ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 정규화된 형광 강도를 다양한 ZnO NW 성장 시간에서 분석했다. dsDNA 분자는 ssDNA 혼성화 프로브를 해당 상보 가닥과 혼성화하여 준비했다. dsDNA의 형성은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이미지로 확인되었다(도 7). 형광 신호를 측정하기 전에 Ag-ZnO NC 기판을 PBS에서 FAM으로 표지된 dsDNA와 함께 배양한 다음 TBS-T 완충액으로 세척했다. 모든 성장 시간에서 ZnO NW에서 dsDNA의 형광 강도는 극적으로 향상되지 않았다(1.1~1.6배, 도 8a). Ag-ZnO NC의 존재 하에서, Ag-ZnO NC에서 dsDNA의 형광 향상은 성장 시간 0, 0.5, 1 및 2시간에서 각각 3.1배, 7.0배, 16.9배 및 15.3배였다. ZnO NW 성장 시간 1시간에서 Ag-ZnO NC에서 가장 높은 형광 향상이 관찰되었다. 도 6a의 결과와 함께 이러한 결과는 1시간 동안 성장한 ZnO NW에서 AgNP의 형성이 ssDNA와 dsDNA 모두에 대한 형광 향상에 최적일 수 있음을 나타낸다.Although the number of bases in a DNA strand is the same, the duration of ssDNA and dsDNA is significantly different. The normalized fluorescence intensities of ZnO NWs and Ag-ZnO NCs were analyzed at various ZnO NW growth times. The dsDNA molecule was prepared by hybridizing an ssDNA hybridization probe with the corresponding complementary strand. The formation of dsDNA was confirmed by polyacrylamide gel electrophoresis images (Figure 7). Before measuring the fluorescence signal, the Ag-ZnO NC substrate was incubated with FAM-labeled dsDNA in PBS and then washed with TBS-T buffer. At all growth times, the fluorescence intensity of dsDNA in ZnO NWs was not dramatically enhanced (1.1- to 1.6-fold, Figure 8a). In the presence of Ag-ZnO NCs, the fluorescence enhancement of dsDNA on Ag-ZnO NCs was 3.1-fold, 7.0-fold, 16.9-fold, and 15.3-fold at growth times of 0, 0.5, 1, and 2 h, respectively. The highest fluorescence enhancement was observed for Ag-ZnO NCs at a ZnO NW growth time of 1 h. These results, together with those in Figure 6a, indicate that the formation of AgNPs in ZnO NWs grown for 1 h may be optimal for fluorescence enhancement for both ssDNA and dsDNA.
형광단과 Ag-ZnO NC 사이의 거리가 형광 강화에 미치는 영향을 dsDNA의 bp 수를 조정하여 조사했다. dsDNA의 bp 수는 10에서 60까지이며 계산된 거리는 ~8.4에서 25.4 nm 범위였다(표 3). ZnO NW와 Ag-ZnO NC에서 서로 다른 수의 bp를 가진 dsDNA의 표준화된 형광 강도가 도 8b에 나와 있다. Ag-ZnO NC는 모든 길이의 dsDNA에 대한 형광 강도를 향상시켰지만 유리와 비교하여 ZnO NW에서 감소하거나 유사한 강도가 관찰되었다. Ag-ZnO NC의 형광 향상은 10, 20, 40 및 60 bp dsDNA의 존재 하에서 각각 14.8배, 16.9배, 11.4배 및 14.2배였다. 도 8b에서 볼 수 있듯이 dsDNA의 길이와 Ag-ZnO NC의 형광 향상 사이에는 상관 관계가 없었다. 이러한 결과는 다양한 길이의 dsDNA가 MEF 현상을 위해 Ag-ZnO NC로부터 최적의 거리에 있을 수 있음을 보여주었다. 본 발명에서는 형광 향상이 형광단과 Ag-ZnO NC 기판 사이의 상호 작용 개선과 관련이 있을 수 있다고 제안한다.The effect of the distance between the fluorophore and Ag-ZnO NCs on fluorescence enhancement was investigated by adjusting the number of bp of dsDNA. The number of bp in dsDNA ranged from 10 to 60, and the calculated distances ranged from ∼8.4 to 25.4 nm (Table 3). The normalized fluorescence intensities of dsDNA with different numbers of bp on ZnO NWs and Ag-ZnO NCs are shown in Figure 8b. Ag-ZnO NCs enhanced the fluorescence intensity for dsDNA of all lengths, but reduced or similar intensity was observed for ZnO NWs compared to glass. The fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs was 14.8-fold, 16.9-fold, 11.4-fold, and 14.2-fold in the presence of 10, 20, 40, and 60 bp dsDNA, respectively. As shown in Figure 8b, there was no correlation between the length of dsDNA and the fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs. These results showed that dsDNA of various lengths could be at optimal distances from Ag-ZnO NCs for MEF phenomenon. We propose that the fluorescence enhancement may be related to the improved interaction between the fluorophore and the Ag-ZnO NC substrate.
유리 상의 dsDNA, ZnO NW, AgNIF 및 Ag-ZnO NC의 형광 수명도 분석하여 dsDNA의 이러한 형광 향상이 MEF 효과의 결과임을 확인했다(도 8c 및 표 4). 표 4에서 볼 수 있듯이 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC의 형광단 표지 dsDNA의 평균 수명은 각각 9.76, 9.34 및 7.86ns였다. 유리, ZnO NW, AgNIF 및 Ag-ZnO NC에서 dsDNA를 연속적으로 희석해가며 형광 강도를 비교하여 Ag-ZnO NC가 2D MEF 기판에 대한 표적 검출 감도를 향상시킬 수 있음을 입증했다. 2D MEF 기판과 비교하여 Ag-ZnO NC의 형광 향상을 비교하기 위해 AgNIF를 유리에서 합성하고 UV-가시 흡수 스펙트럼 및 SEM 이미지로 특성화했다(도 9). AgNP의 일반적인 흡수 스펙트럼은 도 9a에 나와 있다. 단면 SEM 이미지로부터 AgNIF가 단층 형태임을 확인하였다(도 9b). dsDNA의 형광 이미지를 얻어 위의 기질에서 연속적으로 희석된 dsDNA의 형광 강도를 비교했다(그림 8d 및 e). 유리와 비교하여 ZnO NW 및 AgNIF에서는 형광 향상이 관찰되지 않았으며 Ag-ZnO NC에서만 관찰되었다(도 8d 및 e). Ag-ZnO NC의 형광 강도는 dsDNA의 농도가 증가함에 따라 점차 향상되었으며 25nM 이상에서 포화되었다. 도 8e의 형광 강도 플롯을 기반으로 0에서 5nM 사이의 dsDNA 농도에 대해 R2 값이 0.94인 선형 회귀 곡선을 설정했다(형광 강도 = 7.11*농도 DNA + 4.67, 도 8f). 검출 한계(LOD)는 Fblank + 3*SDblank의 형광 강도 값을 초과하는 농도이다. LOD는 ZnO NW에서는 얻지 못했지만 AgNIF 및 Ag-ZnO NC에서는 LOD가 각각 25nM 및 0.5nM인 것으로 추정되었다. Ag-ZnO NC는 2D MEF 기질인 AgNIF보다 dsDNA 검출에 대해 50배 더 높은 감도를 보였다. 이러한 결과는 형광단이 도 1에 제시된 것처럼 다양한 시나리오에서 금속 나노구조로부터 최적의 거리에 있을 수 있음을 나타낸다.The fluorescence lifetimes of dsDNA, ZnO NWs, AgNIF, and Ag-ZnO NCs on glass were also analyzed and confirmed that this fluorescence enhancement of dsDNA was a result of the MEF effect (Figure 8c and Table 4). As shown in Table 4, the average lifetimes of fluorophore-labeled dsDNA on glass, ZnO NW, and Ag-ZnO NC were 9.76, 9.34, and 7.86 ns, respectively. By comparing the fluorescence intensities of dsDNA on glass, ZnO NWs, AgNIF, and Ag-ZnO NCs while serially diluted, we demonstrated that Ag-ZnO NCs can improve target detection sensitivity on 2D MEF substrates. To compare the fluorescence enhancement of Ag-ZnO NCs compared to 2D MEF substrates, AgNIFs were synthesized on glass and characterized by UV-vis absorption spectra and SEM images ( Figure 9 ). The typical absorption spectrum of AgNPs is shown in Figure 9a. From the cross-sectional SEM image, it was confirmed that AgNIF was in the form of a single layer (Figure 9b). Fluorescence images of dsDNA were obtained and the fluorescence intensity of serially diluted dsDNA in the above substrates was compared (Figure 8 d and e). Compared to glass, no fluorescence enhancement was observed for ZnO NWs and AgNIFs, only for Ag-ZnO NCs (Figure 8d and e). The fluorescence intensity of Ag-ZnO NCs gradually improved with increasing concentration of dsDNA and saturated above 25 nM. Based on the fluorescence intensity plot in Figure 8e, a linear regression curve was established with an R 2 value of 0.94 for dsDNA concentrations between 0 and 5 nM (fluorescence intensity = 7.11*concentration DNA + 4.67, Figure 8f). The limit of detection (LOD) is the concentration exceeding the fluorescence intensity value of F blank + 3*SD blank . The LOD was not obtained for ZnO NWs, but the LODs were estimated to be 25 nM and 0.5 nM for AgNIF and Ag-ZnO NCs, respectively. Ag-ZnO NCs showed 50-fold higher sensitivity for dsDNA detection than AgNIF, a 2D MEF substrate. These results indicate that the fluorophore can be at an optimal distance from the metal nanostructure in various scenarios, as shown in Figure 1.
a dsDNA 혼성화 프로브의 형광 수명은 사중 지수 붕괴 모델에 피팅하여 시간 분해 형광 붕괴 곡선(도 8c)에서 분석되었다. a The fluorescence lifetime of the dsDNA hybridization probe was analyzed from the time-resolved fluorescence decay curve (Figure 8c) by fitting a quadruple exponential decay model.
<실험예 5> 결론<Experimental Example 5> Conclusion
3D MEF 기판은 큰 형광 향상, 민감한 감지 및 바이오마커 감지를 위한 향상된 동적 범위를 포함하여 몇 가지 장점이 있다. 바이오 센서로서의 새로운 3D MEF 기판은 수성 환경에서 생체 분자와 금속 구조의 상호 작용을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 ZnO NW의 열수 합성, AgNP의 광화학 증착, SEM 이미지, UV-가시 흡수 스펙트럼, XPS 스펙트럼 및 EDS 매핑을 사용하여 3D MEF 기판으로서 Ag-ZnO NC를 개발하고 특성화했다. 새로운 Ag-ZnO NC 3D MEF 기판의 형광 향상은 10, 20, 40 및 60 bp dsDNA의 존재 하에서 각각 14.8배, 16.9배, 11.4배 및 14.2배였다. 본 발명에서는 이러한 향상이 형광단과 Ag-ZnO NC 기판 사이의 상호 작용 개선과 관련이 있을 수 있다고 제안한다. 유리, ZnO NW 및 Ag-ZnO NC에 대한 MEF 효과는 FAM 표지된 dsDNA의 형광 수명을 기준으로 분석되었으며, 각 기판의 평균 수명은 각각 9.76, 9.34 및 7.86 ns였다. Ag-ZnO NC는 2D MEF 기질인 AgNIF보다 dsDNA 검출에 대해 50배 더 높은 감도를 보였다. 3D MEF substrates have several advantages, including large fluorescence enhancement, sensitive detection, and improved dynamic range for biomarker detection. The novel 3D MEF substrate as a biosensor can enhance the interaction of biomolecules and metal structures in an aqueous environment. In this study, we developed and characterized Ag-ZnO NCs as 3D MEF substrates using hydrothermal synthesis of ZnO NWs, photochemical deposition of AgNPs, SEM images, UV-vis absorption spectra, XPS spectra, and EDS mapping. The fluorescence enhancement of the new Ag-ZnO NC 3D MEF substrate was 14.8-fold, 16.9-fold, 11.4-fold, and 14.2-fold in the presence of 10, 20, 40, and 60 bp dsDNA, respectively. We propose that this improvement may be related to the improved interaction between the fluorophore and the Ag-ZnO NC substrate. The MEF effect on glass, ZnO NWs, and Ag-ZnO NCs was analyzed based on the fluorescence lifetime of FAM-labeled dsDNA, with the average lifetimes of each substrate being 9.76, 9.34, and 7.86 ns, respectively. Ag-ZnO NCs showed 50-fold higher sensitivity for dsDNA detection than AgNIF, a 2D MEF substrate.
종합하면, 본 발명의 결과는 Ag-ZnO NC가 3D MEF 기판으로서 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다. MEF 현상은 다양한 시나리오에서 Ag-ZnO NC의 금속 나노구조 표면과 형광단 사이의 광범위한 상호작용을 통해 발생할 수 있다; 형광단과 형광단이 고정된 AgNP 사이의 상호작용, 형광단과 ZnO NW 가닥 내의 인접한 AgNP 사이의 상호작용, 및 형광단과 다른 ZnO NW 가닥에서 제조된 인접한 AgNP 사이의 상호작용. 본 발명의 Ag-ZnO NC는 수성 환경에서 DNA 검출을 위한 MEF 기반 바이오센서 개발의 기반을 제공한다.Taken together, our results indicate that Ag-ZnO NCs have potential as 3D MEF substrates. The MEF phenomenon can occur through extensive interactions between fluorophores and the metal nanostructure surface of Ag-ZnO NCs in various scenarios; Interactions between fluorophores and AgNPs on which fluorophores are immobilized, interactions between fluorophores and adjacent AgNPs within a ZnO NW strand, and interactions between fluorophores and adjacent AgNPs prepared on different ZnO NW strands. The Ag-ZnO NCs of the present invention provide a basis for the development of MEF-based biosensors for DNA detection in aqueous environments.
Claims (17)
상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리는 5 내지 95 nm인 것을 특징으로 하는 은나노 산화아연 나노선 어레이
Board; Zinc oxide nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; The fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe that can amplify the metal fluorescence signal,
A silver nano-zinc oxide nanowire array, characterized in that the distance at which the metal fluorescence signal can be amplified between the silver nanoparticles formed on the nanowires and the fluorescent molecules of the genetic probe is 5 to 95 nm.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe is formed by a genetic probe consisting of 10 to 90 nucleotides.
The silver nano zinc oxide nanowire array according to claim 3, wherein the genetic probe is selected from the group consisting of 10 to 60 base pairs of double-stranded nucleotides.
The silver nano-zinc oxide nanowire array of claim 1, wherein the substrate is any one selected from the group consisting of glass, paper, silica gel, silicon wafer, alumina, polystyrene, polyethylene, polypropylene, and polymer membrane.
The silver nano zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the nanowires contain 0.01 M zinc acetate dihydrate and 0.03 M sodium hydroxide as a seed solution.
The silver nano zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the nanowire contains 25 mM zinc nitrate hexahydrate and 25 mM hexamethylene tetramine as a precursor solution.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the nanowires are formed by hydrothermal synthesis for 1 to 2 hours.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the silver nanoparticles formed on the nanowires are formed by photochemical deposition.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the silver nanoparticles formed on the nanowires are formed by photochemical deposition containing a 0.1 to 0.5 mM silver nitrate solution.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the silver nanoparticles formed on the nanowires are formed by photochemical deposition for 15 to 60 minutes.
The silver nano zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the genetic probe is biotin bound to one side and fluorescently labeled to the other side.
The silver nano-zinc oxide nanowire array according to claim 1, wherein the genetic probe has a covalently bondable functional group introduced on one side or biotin bound on one side and a fluorescent label on the other side.
상기 나노선에 형성된 은나노 입자와 유전자 프로브의 형광 분자 사이의 금속 형광 신호 증폭이 가능한 거리는 5 내지 95 nm인 것을 특징으로 하는 은나노 산화아연 나노선 어레이를 이용한 형광신호 검출방법
Board; Zinc oxide nanowires grown on the substrate; and silver nanoparticles formed on the nanowires; Fluorescently labeled genetic probes; The fluorescent signal is amplified by maintaining a distance between the silver nanoparticles formed in the nanowire and the fluorescent molecule of the genetic probe that can amplify the metal fluorescence signal,
A fluorescence signal detection method using a silver nano-zinc oxide nanowire array, characterized in that the distance at which the metal fluorescence signal can be amplified between the silver nanoparticles formed on the nanowires and the fluorescent molecules of the genetic probe is 5 to 95 nm.
The method of claim 14, wherein the fluorescence signal amplification occurs when biotin and the biotin of the fluorescently labeled genetic probe bind to streptavidin.
(b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
(c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
(d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계;
(e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및
(f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 은나노 산화아연 나노선 어레이의 제조방법
(a) preparing a nanowire seed solution;
(b) preparing a nanowire precursor solution;
(c) growing nanowires on a substrate;
(d) forming silver nanoparticles on the nanowire;
(e) introducing streptavidin; and
(f) A method of manufacturing a silver nano-zinc oxide nanowire array comprising the step of fixing a genetic probe.
(b) 나노선 전구체용액을 제조하는 단계;
(c) 기판상에 나노선을 성장시키는 단계;
(d) 상기 나노선에 은나노 입자를 형성하는 단계;
(e) 스트렙트아비딘을 도입하는 단계; 및
(f) 유전자 프로브를 고정하는 단계;로 제조된 은나노 산화아연 나노선 어레이
(a) preparing a nanowire seed solution;
(b) preparing a nanowire precursor solution;
(c) growing nanowires on a substrate;
(d) forming silver nanoparticles on the nanowire;
(e) introducing streptavidin; and
(f) fixing the genetic probe; silver nano-zinc oxide nanowire array prepared by
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