KR102666998B1 - 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 방법, 및 이를 사용한 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법 - Google Patents

히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 방법, 및 이를 사용한 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물, 및 이를 사용하는 것을 특징으로 하는 히스티딘 키나아제 활성 측정 방법과 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 상기 조성물 및 방법은 탈인산화효소 및 이에 의한 pHis의 탈인산화를 이용하여 히스티딘 키나아제 또는 히스티딘 키나아제 저해제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 한다.

Description

히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 방법, 및 이를 사용한 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법 {COMPOSITION AND METHOD FOR MEASURING HISTIDINE KINASE ACTIVITY, AND METHOD FOR SCREENING HISTIDINE KINASE INHIBITORS BY USING THE SAME}
본 발명은 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물, 및 이를 사용하여 히스티딘 키나아제 활성을 측정하는 방법과 히스티딘 키나아제 저해제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
2성분 조절 시스템 (TCS)는 박테리아, 진균, 및 식물에서의 주요 신호 전달 시스템으로서, 외부 환경 변화와 스트레스를 감지하여 다양한 생물학적 반응을 조절하는 것이다. TCS는 일반적으로 히스티딘 키나아제(histidine kinase, HK) 및 이의 동족 반응 조절자 (response regulator, RR)로 이루어져 있다. 히스티딘 키나아제가 활성 신호를 감지하면 그의 히스티딘 잔기가 자가인산화되어 포스포히스티딘(pHis)을 형성하고, 그 후 Asp 잔기에서 RR을 트랜스-인산화한다. 이렇게 인산화된 RR은 표적 유전자의 발현을 조절하며, 이러한 조절의 대부분은 항생제 내성, 병독성, 및 바이오필름 형성과 관련되어 있다. 따라서, 히스티딘 키나아제 저해제는 새로운 항생제 후보로 주목을 받고 있다.
TCS 작용을 이해하고 히스티딘 키나아제 저해제를 찾기 위해서는, 히스티딘 키나아제 활성을 정량적으로 측정하는 것이 필수이다. 기존의 히스티딘 키나아제 모니터링 방법은 주로 방사성 동위원소 표지법에 의존하였다. 그러나, 이는 위험하고 복잡한 방법이고 효율도 낮았다. 이에 따라 최근 방사성 동위원소 표지법이 아닌 다른 분석법, 예를 들어 Phos-tag 겔 전기영동이나 pHis-특이적 항체를 이용하는 등의 다양한 분석법도 보고되었으나, 이러한 분석법은 인산화된 히스티딘 키나아제를 분리하는 과정과 같이 시간과 비용이 많이 소요되는 과정이 필요한 등의 단점이 있었고, 많은 저해제 후보 물질을 빠르게 테스트할 수 있는 고속 스크리닝에 적용할 수 없었다. 특히, 자가인산화 산물인 pHis 는 화학적으로 불안정하므로, 자가인산화된 히스티딘 키나아제 상의 pHis를 정확히 정량하는 것은 기술적으로 어려웠다.
본 발명의 일 목적은 방사성 동위원소 또는 항체와 같이 고가의 시약 등이 없어도 히스티딘 키나아제의 활성을 쉽고 빠르게, 그리고 정확히 측정할 수 있는 조성물 및 방법을 개발하는 것이다.
본 발명의 다른 일 목적은 상기와 같은 히스티딘 키나아제의 활성 측정법을 사용하여 히스티딘 키나아제 저해제를 찾는, 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 기존의 불안정한 pHis를 정량하는 것이 아니라, 이것을 탈인산화효소를 통해 분해하여 인산화 이전의 상태로 되돌리고, 이 과정에서 소모되는 ATP를 모니터링하고 정량함으로써 히스티딘 키나아제의 활성을 측정하는 방법을 착안하게 되었다.
이에 따라, 본 발명의 일 양태에 따르면, 탈인산화효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 히스티딘 키나아제(Histidine Kinase) 활성 측정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 히스티딘 키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하는 히스티딘 키나아제의 활성 측정 방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질 및 히스티딘 키나아제를, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면 기존에는 화학적 불안정성으로 인하여 활성의 측정이 어려웠던 히스티딘 키나아제의 활성을 간단하고 쉽게 정량적으로 측정할 수 있다.
구체적으로, 기존의 활성 측정 방법은 라벨링 과정이나, 인산화된 히스티딘의 분리와 같이 시간과 비용 소모적인 절차를 사용해야 한다는 단점이 있었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 이러한 과정의 수행 없이, 탈인산화효소를 이용하여 pHis를 탈인산화시키고 이 과정에서 소모되는 NADH의 양으로부터 활성을 측정할 수 있으므로, 히스티딘 키나아제의 활성 측정이 간단하고 손쉽다는 장점이 있다.
특히, 본 발명에 따르면 NADH 소모량을 흡광도에 의해 실시간으로 정량적으로 측정할 수 있으므로, 히스티딘 키나아제 활성의 실시간 모니터링이나 히스티딘 키나아제 저해제의 고속 스크리닝에 적합하다.
히스티딘 키나아제 저해제는 새로운 항생제 후보물질이며, 특히, 항생제 내성을 억제함으로써 내성균 타겟이 가능하다. 또한, 동물에는 히스티딘 인산화효소가 거의 없으므로, 이러한 저해제는 부작용이 낮을 것으로 예상된다. 본 발명에 의하면 이러한 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질을 손쉽고 빠르게 탐색할 수 있다. 특히, 히스티딘 키나아제는 그의 3차원 구조가 제대로 규명되지 않아서 단백질 구조에 기반한 docking 등의 계산화학적 방법론도 적용이 어려우므로, 본 발명에 따른 저해제 스크리닝 방법은 매우 유용하다고 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 히스티딘 키나아제 활성 시스템을 도식적으로 설명하는 도면이다.
도 2는 탈인산화효소에 의한 히스티딘 키나아제의 탈인산화를 확인하기 위한 실험 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 2의 (a)는 웨스턴블롯에 의한 히스티딘 키나아제의 탈인산화 분석 결과를 나타내며, 도 2의 (b)는 히스티딘 키나아제와 탈인산화효소에 의한 시간에 따른 NADH 소모량의 변화를 나타내는 그래프이고, 도 2의 (c)는 히스티딘 키나아제의 양에 따른 반응 변화를 보여주는 그래프이고, 도 2의 (d)는 히스티딘 키나아제의 농도와 반응 속도의 관계를 보여주는 그래프로서, 히스티딘 키나아제의 양과 반응속도가 잘 비례함을 보여준다.
도 3은 실시예 4에 따라 다양한 양의 탈인산화효소(PHPT1) 또는 PK/LDH를 사용하여 히스티딘 키나아제의 활성을 분석한 실험 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 3의 (a)는 PHPT1의 양에 따른 반응을 나타내고, 도 3의 (b)는 PK/LDH의 양에 따른 반응을 나타낸다. 이처럼 PHPT1, PK/LDH의 양은 전체 반응속도에 큰 영향이 없고, 본 발명이 히스티딘 키나아제의 반응속도를 잘 측정할 수 있음을 보여준다.
도 4는 실시예 5에 따라 PHPT1 이외의 다른 탈인산화효소 LHPP를 사용하여 히스티딘 키나아제의 활성을 분석한 실험 결과를 나타내는 것으로서도 4의 (a)는 PHPT1을 사용한 경우이고 도 4의 (b)는 LHPP를 사용한 경우이다.
도 5는 실시예 6에 따라 히스티딘 키나아제로서 PhoQ를 사용한 활성 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 6은 실시예 7에 따라 히스티딘 키나아제로서 VanS를 사용한 활성 측정 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 7은 실시예 8 에 따라 NH125에 의한 EnvZ 자가인산화의 저해 효과를 측정한 그래프이다. 도 7의 (a)는 kinetic parameter를 계산한 그래프이고, 도 7의 (b)는 IC50을 계산한 그래프이다.
도 8은 실시예 9 에 따라 VanS 히스티딘 키나아제의 저해제 후보물질들에 대해 본 발명의 스크리닝 방법을 적용하여 테스트한 결과를 나타낸다. 도 8의 (a)는 전체 후보물질들의 VanS 저해 활성을 나타내고, (b)는 후보물질들의 활성 histogram을 나타내고, 도 8의 (c)는 Z‘ 스코어를 구하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다, “함유”한다, “가지다”라고 할 때, 이는 특별히 달리 정의되지 않는 한, 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 탈인산화효소를 함유하는 것을 특징으로 하는 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물이 제공된다.
본 발명의 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정에 사용되는 탈인산화효소의 종류에는 특별히 제한이 없으며, 해당 효소에 의해 pHis의 탈인산화 반응을 일으킬 수 있는 것이라면 제한없이 이용될 수 있다. 이러한 탈인산화효소의 예로는 PHPT1, LHPP, SixA 등을 들 수 있으며, 구체적으로는 PHPT1 또는 LHPP, 특히 PHPT1을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 히스티딘 키나아제의 활성 측정 시스템에는 4가지 효소 반응이 연속적으로 커플링되어 있다: 목적하는 히스티딘 키나아제, 탈인산화효소, 피루베이트 키나아제 (pyruvate kinase, PK), 및 락테이트 탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH). 이러한 본 발명의 히스티딘 키나아제의 활성 측정 시스템을 도 1을 참조하여 구체적으로 설명하면, 히스티딘 키나아제의 자가인산화는 ATP를 소모하며, 이어서 탈인산화효소에 의해 탈인산화가 진행되어 히스티딘 키나아제가 재생된다. 이러한 순환 과정에서 ADP가 히스티딘 키나아제의 활성에 비례하여 연속 생성되고, 이러한 ADP는 공지의 PK/LDH-커플링 시스템에 따라 쉽게 정량된다. PK는 ADP 및 포스포에놀피루베이트(phosphoenolpyruvate, PEP)로부터 ATP를 생성하고, 이어서, 상기 피루베이트 부산물은 LDH에 의해 락테이트로 환원되고 이와 동시에 NADH 조효소가 산화되며, 이 과정에서 소모되는 NADH는 UV 흡광도 (340 nm)를 측정하여 모니터링된다.
이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물은 탈인산화효소에 추가하여, 전술한 시스템에 기여하는 성분들, 즉, NADH (nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen), ATP (adenosine triphosphate), PEP (phpsphoenolpyruvate), LDH (lactate dehydrogenase), 및 PK (pyruvate kinase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 더 함유할 수 있다. 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 탈인산화효소에 추가하여, 전술한 NADH, ATP, PEP, LDH, 및 PK를 모두 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 전술한 바와 같은 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 히스티딘 키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하는 히스티딘 키나아제의 활성 측정 방법이 제공된다.
본 발명에서 활성이 측정될 히스티딘 키나아제 종류는 특별히 제한이 없다. 본 발명은 히스티딘 키나아제의 pHis를 탈인산화하는 사상에 기초한 것이고, 상기 pHis 자리는 매우 보존적인 소위 H-박스(H-box) 영역 내에 있다. 따라서, 본 발명에서 히스티딘 키나아제로는, 인산화 자리를 포함하는 보존적 도메인, 즉, H-박스(H-box) 영역을 포함하는 것이라면 어떤 것이든 측정될 수 있을 것이다. 이러한 히스티딘 키나아제는 예를 들어, E. coli EnzZ, E. coli PhoQ, 또는 VanS 등을 들 수 있다. 참고로, 하기 [표 1]은 히스티딘 키나아제의 서열 배열이고, 회색 박스 표시부가 H-박스이며, 인산화 자리 (히스티딘)은 빨간색으로 표시하였다.
[표 1]
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 히스티딘 키나아제의 접촉 단계는, 버퍼, 예를 들어 Tris 버퍼에 전술한 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 첨가하는 단계, 및 그 후 히스티딘 키나아제 또는 이를 함유하는 용액을 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 히스티딘 키나아제의 활성 측정 방법은 NADH의 소모량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 히스티딘 키나아제의 pHis가 탈인산화효소에 의해 탈인산화되는 과정에서 NADH가 소모되는데, 여기서 NADH는 UV 흡광도, 구체적으로는 340 nm에서의 UV 흡광도에 의해 선택적으로 손쉽게 측정할 수 있다.
구체적으로, 히스티딘 키나아제와 탈인산화효소를 접촉시킨 후, 일정 시간 간격 동안 340 nm 에서의 흡광도를 모니터링하고, 해당 흡광도 판독값을 NADH의 양으로 변환시킨 후, 이렇게 구해진 NADH의 양에 대한 그래프를 x 축에 시간을 두고 그리면 시간에 따른 NADH 양의 변화가 도출되며, 이것으로부터 시간에 따른 반응 속도를 계산할 수 있는 것이다. 이러한 시간에 따른 반응 속도 (즉, 시간에 따른 NADH 소모량의 변화율)가 히스티딘 키나아제의 활성이 될 수 있다.
이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 히스티딘 키나아제 활성 측정 방법은, 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 히스티딘 키나아제와 접촉시키는 단계, 및 상기 접촉후 NADH의 소모량을 NADH의 흡광도 측정에 의해 구하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 히스티딘 키나아제 활성 측정 방법은 전술한 바와 같이 측정한 NADH의 소모량으로부터 시간에 따른 반응 속도를 구하는 단계를 더 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 히스티딘 키나아제 활성 측정 방법은 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 히스티딘 키나아제와 접촉시키는 단계; 상기 접촉후 NADH의 소모량을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 NADH의 소모량으로부터 시간에 따른 반응 속도를 구하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 반응 속도를 히스티딘 키나아제의 활성으로 취급할 수 있다.
본 발명의 또다른 일 양태에 따르면, 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질 및 히스티딘 키나아제를, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질과 상기 히스티딘 키나아제를 먼저 접촉시킨 후, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 접촉시킬 수 있다. 여기서, 상기 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질과 상기 히스티딘 키나아제의 접촉은 인큐베이팅일 수 있다.
상기 히스티딘 키나아제 활성의 측정 방법에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 히스티딘 키나아제가 자가인산화되어 pHis가 생성되면 상기 pHis를 탈인산화효소에 의해 탈인산화하고, 이 과정에서 소모되는 NADH의 양을 광학적 방법, 구체적으로 흡광도 측정에 의해 측정하는 것이다.
따라서, 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법은, 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질에 의한 인산화 저해 효과를, 탈인산화 과정에서의 NADH 소모량 감소에 의해 판단할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질, 히스티딘 키나아제, 및 상기 활성 측정용 조성물의 접촉 후, NADH의 소모량을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 NADH 소모량을 히스티딘 키나아제 또는 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질이 없는 대조군의 NADH 소모량과 비교하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법은, 다양한 농도의 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질을 사용하고, 이와 접촉한 히스티딘 키나아제가 탈인산화효소 과정 동안에 소모한 NADH의 양을 측정하고, 상기 측정한 시간에 따른 NADH의 소모량를 대조군의 것과 비교하여 저해 수준을 구하고, 이로부터 IC50을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 IC50의 계산은 공지의 프로그램, 예를 들어 Origin 등에 의해 계산될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 참고하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 단백질의 제조
실시예 1-1. 재조합 단백질 유전자의 클로닝
Phusion(등록상표) 폴리머라아제 (Thermo Scientific, Waltham, MA, cat. No. F-548)을 사용하여, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. PCR 생성물을 0.8% 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출법에 의해 정제한 후, 증폭된 메가프라이머는, Phusion(등록상표) 폴리머라아제를 사용하여 PCR에 의해 pET21a(+) 플라스미드에 삽입하였다. 그 후, 템플릿 플라스미드를 DpnI (Thermo Scientific, Waltham, MA, cat. no. FD1704)로 7분 동안 37℃에서 소화시켰다. 생성된 유전자는 히트 쇼크 (42℃에서 45초)에 의해 E. coli DH5α 세포로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아를 2 시간 동안 37℃에서 LB 에 성장시켰고 LB 아가/암피실린 플레이트에 스프레딩하였다. 최상의 박테리아 콜로니를 37℃에서 하룻밤 동안 성장시켰고, 플라스미드를 AccuPrep(등록상표) Nano-Plus Plasmid Mini Extraction kit (Bioneer, Daejeon, cat. No. K-3111)을 사용하여 추출하였다. 그 후, 정제한 플라스미드를 정량분석하였다. 포인트 돌연변이를 포함하는 프라이머를 사용하여 부위 지향적 돌연변이 유발에 의해 PHPT1 (H53A) 및 VanS (H164Q)의 불활성 돌연변이체를 제조하였다.
실시예 1-2. 재조합 단백질의 제조
43℃에서 45초 동안 히트 쇼크에 의해 E. coli BL21(DE3) 세포를 앞서 제조한 플라스미드로 형질전환시켰다. 형질전환된 박테리아를 항생제 없이 LB 브로쓰에서 인큐베이팅하고 0.1 mg/mL 암피실린과 함께 LB 아가에 스프레딩하였다. 최상의 콜로니를 LB 브로쓰/Amp (0.1 mg/mL의 암피실린을 사용한 LB 브로쓰)에서 하룻밤 동안 성장시키고, -80℃에서 글리세롤 세포 스톡으로서 보관하였다.
실시예 1-3. EnvZ 의 제조
형질전환한 박테리아를 37℃에서 200 mL의 LB 브로쓰/Amp 중에 성장시켰다. 37℃에서 0.3 mM IPTG 를 사용하여 3시간 동안 유도한 후, 세포를 원심분리하였다. 수집된 세포는, 2 mM PMSF를 사용하여 6 mL의 용균 버퍼 (pH 7.5, 50 mM Tris, 150 mM NaCl) 중에 현탁하였고, 팁(tip)-초음파발생장치 (3 s 펄스/ 10 s 휴식, 40% 진폭에서 총 2 분 펄스)를 사용하여 용균시켰다. 용균액을 원심분리하고, 상청액을 Ni-NTA 친화도 크로마토그래피 에 의해 정제하였다 (평형 및 세척용으로 20 mM 이미다졸, pH 7.5 TBS 중 용리용으로 200 mM 이미다졸). 정제된 단백질은 pH 7.5 TBS 1 L에 대해 3회 투석하고, -80℃에서 보관하였다. 정제한 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였고 Bradford 법으로 정량분석하였다.
실시예 1-4. PHPT1 (PHPT1 H53A) 의 제조
EnvZ 제조와 동일한 방법을 사용하였다. 형질전환된 BL21 (DE3) 세포는 0.5 OD600 이 될 때까지 200 mL LB 브로쓰/Amp에서 성장시켰고, 37℃에서 추가 3시간 동안 0.5 mM IPTG를 사용하여 발현을 유도하였다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 2 mM PMSF를 사용하여 pH 7.5 TBS 6 mL에서 초음파처리하여 용균하였다. 용균액을 원심분리하고, 상청액은 EnvZ 제조에서와 동일한 Ni-NTA 프로토콜로 정제하였다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE 로 분석하였고, Bradford 방법으로 농도를 측정하였다. PHPT1 H53A 돌연변이를 동일한 방법으로 제조하였다.
실시예 1-5. PhoQ 의 제조
EnvZ 제조와 동일한 방법을 사용하였다. 형질전환된 BL21 (DE3) 세포는 0.6 OD600 이 될 때까지 LB 브로쓰/Amp 중에 성장시켰고, IPTG (최종 농도 1 mM)을 첨가하여 과발현을 유도하였다. 3 시간 동안 37℃에서 인큐베이팅한 후, 6 mM의 용균 버퍼 (pH 7.9, 20 mM Tris, 500 mM NaCl)에서 초음파처리하여 세포를 용균하였다. 용균액을 원심분리하고, 상청액은 Ni-NTA 친화도 컬럼 (세척의 경우 30 mM 이미다졸, 용리의 경우 300 mM 이미다졸)을 사용하여 정제하였다. 수집한 분획을 SDS-PAGE 로 분석하였고 1 L의 PhoQ 투석 버퍼 (pH 7.9, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤)로 3회 투석하였고, -80℃에서 두었다. 단백질 농도는 Bradford 방법으로 측정하였다.
실시예 1-6. VanS (Vans H164Q) 의 제조
EnvZ 제조와 동일한 방법을 사용하되 약간 변형하였다. 형질전환된 BL21 (DE3) 세포를 0.25의 OD600일 때까지 LB 브로쓰/Amp에서 성장시켰고, 상온에서 하룻밤 동안 0.3 mM IPTG를 사용하여 발현을 유도하였다. 수집된 세포를 6 mL 용리 버퍼 (pH 7.8, 500 mM Tris, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2)에서 초음파처리하여 용균하였다. 용균액을 원심분리하고 상청액을 Ni-NTA 친화도 칼럼 (평형화 및 세척용으로 40 mM 이미다졸, 용리용으로 200 mM 이미다졸)을 사용하여 정제하였다. 수집한 분획은 1 L의 Vans 투석 버퍼 (pH 7.8, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% 글리세롤)로 3회 투석하였다. VansS H164Q 돌연변이를 동일한 방식으로 제조하였다.
* pHis 탈인산화효소가 pHis를 히스티딘 키나아제로 효과적으로 탈인산화하는지 여부를 확인하기 위해 다음의 실시예 2 내지 4를 실시하였다.
[실시예 2] 웨스턴 블롯에 의한 EnvZ의 자가인산화 및 탈인산화 분석
EnvZ (10 μM)을, 60 μL의 pH 7.8 TBS (50 mM Tris, 100 mM NaCl), 5 mM MgCl2, 1 mM DTT 중 2.5 mM ATP를 사용하여 1 시간 동안 37℃에서 자가인산화하였다. ADP를 재생시키기 위해, PK (20 μg/mL) 및 2 mM PEP를 첨가하였다. 13.3 μM의 PHPT1 또는 이의 불활성 돌연변이 (H53A)을 인산화 반응 혼합물에 첨가하여 탈인산화를 수행하였다. 반응 혼합물 (15 μL)을 5 μL의 4x SDS-PAGE 로딩 염료 (pH 8.5, 200 mM Tris, 8% SDS, 40% 글리세롤, 400 mM DTT, 0.4% 브로모페놀 블루)를 사용하여 켄칭(quenching)하고, 12% 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 전기영동을 실시하였고, 4℃에서 1.5 시간 동안 200 mM에서 Towbin 버퍼 (pH 8.3, 25 mM Tris, 192 mM 글라이신, 20% 메탄올) 중에서 겔 중의 단백질이 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF)로 이동하였다. TBS-Tween (pH 8.5, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1% v/v Tween 20) 중의 3% BSA를 사용하여 로킹(rocking) 하에 실온에서 1 시간 동안 멤브레인을 블록킹한 후, 실온에서 1시간 동안 항-pHis 프라이머리 항체 (3% BSA와 함께 TBS-T 중에 1:1000 으로 희석)와 함께 인큐베이팅하였다. 각각 5 분 동안 3회씩 TBS-Tween 으로 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 30 분 동안 염소 항-래빗 IgG-HRP 콘쥬게이트 (3% BSA와 함께 TBS-T 중에 1:5000 으로 희석)를 사용하여 인큐베이팅하였다. 멤브레인을 TBS-Tween 으로 각각 5분 동안 3회씩 세척한 후, ECL 화학발광 용액 (D-PlusTM ECL Pico System, 한국 서울 소재의 동인 LS 제품, cat. no. ECL-PS100)을 사용하여 실온에서 3 분 동안 인큐베이팅하였다. ChemiDocTM XRS+ System (Bio-rad, Hercules, CA)를 사용하여 화학발광을 영상화하였다. 영상화 후, 멤브레인을 증류수로 세척하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)로 염색하였다. 대조군으로서 변성 EnvZ (denatured EnvZ)의 경우, 10분 동안 95℃에서 1% SDS 중에서 변성시킨 EnvZ를 사용하여 동일한 방식으로 실험하였다.
위의 실험에 따른 결과를 도 2의 (a)에 도시하였다. 도 2의 (a)에서 6번 레인 결과로부터 알 수 있듯이, 탈인산화효소(PHPT1)을 첨가한 경우, 웨스턴 블롯에서 pHis 신호가 완전히 사라졌으며, 이는 탈인산화효소가 실제로 EnvZ에서 pHis 자리에 접근하여 탈인산화할 수 있다는 점을 입증한다. 탈인산화효소로서 PHPT1의 불활성 돌연변이 (His53A)를 사용한 네거티브 대조군에서는 pHis 수준이 감소되지 않았다 (도 2(a)의 7번 열). 이 결과는 탈인산화 효소(PHPT1)가 pHis-HK를 탈인산화할 수 있어서 본 발명의 효소-커플링 시스템이 설계대로 잘 작동하고 있다는 것을 나타낸다.
[실시예 3] 탈인산화효소에 의한 NADH 소모량 측정에 기초한 분석
표준 효소-커플링 분석 버퍼 (pH 7.8, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 25 mM GSH, 25 mM MgCl2)에서, 0.5 mM NADH, 2 mM PEP, 5 mM ATP, 20 μg/mL LDH, 20 μg/mL PK, 4 μM PHPT1을 순서대로 첨가하였다. 혼합물을 투명 96-웰 플레이트에 로딩하였다. 2 μM의 EnvZ 용액을 첨가하여 반응을 개시하였다. 총 30 분 동안의 판독 사이에 3 초간 쉐이킹하며 37℃에서 30초마다 340 nm 에서의 흡광도를 M5e Multi-Mode Microplate Readers (Molecular Devices) 상에서 모니터링하였다. 보정을 위해 반응 개시 전에 몇가지 포인트를 측정하고 데이터를 수집하였다. 배경값을 삭제하기 위해 양의 대조값과 음의 대조값을 사용하여 3회씩 분석을 수행하였다. 분석을 위해 흡광도 판독값 (임의 유닛)을 표준 NADH 보정 곡선을 사용하여 NADH 양 (nmol)로 변환시켰다. x 축에 시간을 두고 (분 단위), NADH 양에 대한 그래프를 그렸고, Origin(등록상표)를 사용하여 선형 피팅하여 전체 반응 속도 (nmol/분)을 계산하였다. 대조군으로서 변성 EnvZ의 경우, EnvZ를 10분 동안 95℃에서 가열하여 준비한 것을 사용하였고, 위와 동일한 방식으로 실험하였다. 그 결과를 도 2의 (b) 내지 (d)에 나타내었다.
해당 도 2로부터 NADH 소비가 히스티딘 키나아제의 활성과 상관관계가 있음이 확인되었다. 구체적으로, 도 2의 (b)에서 보는 바와 같이, EnvZ와 PHPT1을 모두 넣은 경우 NADH 소모량이 시간에 따라 증가하는 반면, 변성 EnvZ (De-EnvZ)를 사용하거나 EnvZ를 사용하지 않은(No EnvZ) 네거티브 대조군의 경우 NADH 최저 소비 수준이 0.05 nmol/분 보다 낮았다. 탈인산화효소를 생략한 경우 신호가 낮았고, 이는 pHis의 자발적 가수분해로 인한 것으로 생각된다. 이러한 신호는 탈인산화효소를 다시 첨가해주면 현저하게 증강되었으며, 이는 탈인산화효소에 의한 히스티딘 키나아제의 재생이 설계대로 작동한다는 것을 의미한다. 반응 속도와 EnvZ 양 사이에 선형의 훌륭한 상관관계가 나타났고 (도 2의 (d)), 이로부터 본 발명에 따른 방법에 의해 히스티딘 키나아제의 반응 속도를 측정할 수 있다는 점을 확인할 수 있다.
[실시예 4] PHPT1 또는 PK/LDH의 양에 따른 활성 분석
효소-커플링된 분석법에서 전체 반응 속도에 PHPT1 및 PK/LDH의 양이 영향을 주는지 여부를 알아보기 위해, 다양한 농도의 PHPT1 또는 PK/LDH를 사용하였다. 4 μM PHPT1 및 20 μg/ml PK 및 LDH를 표준으로 사용하였고, 다른 성분 농도는 일반 조건과 동일하게 하였다.
도 3의 (a)에서 PHPT1을 사용하지 않을 경우 전체 반응이 느려졌으나, 1, 2, 4, 또는 5 μM의 PHPT1을 사용한 경우에는 반응 속도가 유사했는데, 이는 EnvZ의 경우와는 대조적이다 (도 2의 (c)와 비교). 이로부터 탈인산화효소(PHPT1)을 과량으로 첨가해도 전체 반응 속도에 유의미한 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 도 3의 (b)에서 PK/LDH 양도 반응 속도에 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 알 수 있다. 상기 결과는 본 발명에 따른 분석법의 반응 속도 결정 단계가 EnvZ (히스티딘 키나아제)의 자가인산화에 있다는 것을 의미한다.
* PHPT1 이외의 다른 탈인산화효소를 사용하여도 본 발명의 측정법이 활용 가능한지 여부를 알아보기 위하여 PHPT1 대신에 LHPP를 사용하여 다음의 실시예 5의 실험을 해보았다.
[실시예 5] LHPP를 사용한 활성 분석
PHPT1대신 다른 탈인산화로서 LHPP를 사용하여 실시예 3에서와 동일한 방식으로 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 4의 (a)와 도 4의 (b)에서 보는 바와 같이 LHPP 또는 PHPT1이 첨가되었을 때에만 반응이 일어나며, 탈인산화효소가 없을 때에는 NADH가 거의 소비되지 않았다. 따라서, 본 발명의 측정법은 여러 탈인산화효소에 적용 가능함을 알 수 있다. 다만, PHPT1에 비해 LHPP가 첨가되었을 때에는 반응속도가 약 절반 이하로 감소하였으며, 이는 PHPT1이 본 발명의 측정법에 보다 적합하다는 것을 의미한다.
* EnvZ 이외의 다른 HK 에도 본 발명의 측정법이 활용 가능한지 여부를 알아보기 위하여 EnvZ 대신에 E.coli PhoQ 및 VanS를 사용하여 다음의 실시예 5 와 6의 실험을 해보았다.
[실시예 6] PhoQ를 사용한 활성 분석
E.coli PhoQ를 사용하여 실시예 3에서와 동일한 방식으로 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 5의 (a)와 도 5의 (b)에서 보는 바와 같이 반응 속도가 PhoQ 농도에 비례하였으며, 도 5의 (c)에서 보는 바와 같이 PhoQ를 사용하지 않거나(No PhoQ) 변성 PhoQ (Denatured PhoQ)를 사용한 네거티브 대조군의 경우 NADH가 거의 소비되지 않았으며, 탈인산화효소 (PHPT1)을 첨가하였을 때 NADH 소비가 일어났다. 이는 PhoQ 가 본 발명의 측정법에 적용 가능하다는 것을 의미한다.
[실시예 7] VanS를 사용한 활성 분석
VanS 는 반코마이신 내성 S. aureus (VRSA) 및 E. faucium (VRE) 의 히스티딘 키나아제이다. VanS를 사용하여 실시예 3에서와 동일한 방식으로 분석을 수행하였다. 도 6은 S. aureus의 VanS 히스티딘 키나아제 활성을 측정한 것이며, 그 결과, VanS 양과 반응 속도 사이의 훌륭한 선형 상관관계가 나타났다 (도 6의 (a) 및 (b)). 또한, 탈인산화효소 (PHPT1)의 첨가로 VanS 시스템에서 NADH 소비가 증강되었다. EnvZ를 사용한 실험에서와 마찬가지로, 탈인산화효소 (PHPT1)를 생략한 경우에도 다소 약한 신호가 생성되었으나 이는 pHis-VanS의 낮은 안정성으로 인해 ATPase 와 같은 활성이 관찰되었기 때문으로 생각된다.
* 본 발명에 따른 측정법이 히스티딘 키나아제 저해제의 저해 효과를 측정할 수 있는지 여부를 알아보기 위해 다음과 같이 실험하였다.
[실시예 8] NH125에 의한 EnvZ 자가인산화의 저해
히스티딘 키나아제 저해제로서, 공지의 EnvZ 저해제인 NH125를 사용하여 다음과 같이 실험하였다.
다양한 농도의 NH125를 준비하여 실온에서 25분 동안 EnvZ (최종 농도 2 μM)와 함께 인큐베이팅하였다. 여기에 본 발명에 따른 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 첨가하여 자가인산화를 개시하였다.
EnvZ의 kinetic parameter를 측정하여 도 7의 (a)에 나타내었다. 그 결과, 기존의 방사성 동위원소법으로 측정한 값 (K m ~ 200 μM)과 비슷한 결과 (K m = 455 μM)을 얻었다.
또한, 본 발명에 따라 측정한 히스티딘 키나아제 반응 속도를 EnvZ 또는 NH125가 없는 대조군과 비교하여 측정함으로써 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질 (NH125)의 저해 수준을 결정하였다. 해당 저해 수준을 투여량-반응 곡선으로 그려서 Origin을 사용하여 IC50을 계산하였다. 그 결과를 도 7의 (b)에 나타내었다. 그 결과, 기존의 방사성 동위원소법으로 측정한 값 (IC50 ~ 20 μM)과 비슷한 값 (IC50 = 23.45 μM)을 얻었다.
[실시예 9] VanS 에 대한 저해제 후보물질들의 고속 스크리닝 실험
히스티딘 키나아제로서 VanS를 저해할 수 있는 저해제 후보물질들을 약 200여종 도출한 후, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 고속 스크리닝을 실시하고 이로부터 구한 저해 수준을 도 8의 (a)에 나타내었다. 또한, 상기 실험 결과에 기초하여 도 8의 (b)에 후보물질들의 활성 histogram을 나타내고, 도 8의 (c)에 Z 스코어에 대한 그래프를 그려 도시하였다. 도 8의 (a)와 (b)로부터 저해 수준이 높은 (대략 70% 이상)인 후보물질의 스크리닝이 가능하다는 점을 알 수 있었으며, 도 8의 (c)로부터 본 발명의 방법이 신뢰성이 높은 측정법이라는 점을 확인할 수 있었다.

Claims (13)

  1. 탈인산화효소, NADH(nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen), ATP(adenosine triphosphate), PEP(phpsphoenolpyruvate), LDH(lactate dehydrogenase) 및 PK (pyruvate kinase)를 함유하는, 히스티딘 키나아제(Histidine Kinase) 활성 측정용 조성물로서,
    상기 히스티딘 키나아제는, PhoQ 또는 VanS이고,
    상기 히스티딘 키나아제 활성은, NADH의 흡광도 측정으로부터 NADH의 소모량을 계산함으로써 측정되는 것임을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈인산화효소가 PHPT1 또는 LHPP인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 NADH의 흡광도 측정은 340 nm에서의 UV 흡광도에 의해 측정되는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 따른 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 히스티딘 키나아제와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 히스티딘 키나아제의 활성 측정 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서, NADH의 소모량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 NADH의 소모량 측정은 340 nm에서의 UV 흡광도에 의해 상기 NADH의 흡광도를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 측정된 NADH의 소모량으로부터 시간에 따른 반응 속도를 구하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질 및 히스티딘 키나아제를, 제1항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 히스티딘 키나아제 저해제의 스크리닝 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질과 상기 히스티딘 키나아제를 먼저 접촉시킨 후, 상기 히스티딘 키나아제 활성 측정용 조성물을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 접촉 후 NADH의 소모량을 측정하는 단계 및 상기 측정된 NADH 소모량을 히스티딘 키나아제 또는 히스티딘 키나아제 저해제 후보물질이 없는 대조군의 NADH 소모량과 비교하는 단계를 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 NADH의 소모량 측정은 340 nm에서의 UV 흡광도에 의해 상기 NADH의 흡광도를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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