KR102666716B1 - 비펜트린에 의한 혈관 형성 억제 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비펜트린의 혈관 형성 억제 및 혈관세포 증식 억제 용도에 관한 것으로서, 비펜트린은 염증 반응을 통하여 제브라피쉬 배아에서 배발생 및 혈관 발달의 손실을 야기하였다. 비펜트린은 장에서 ROS 축적과 tnfa, il6, il8 및 ptgs2b를 포함하는 염증 유전자를 증가시켜, 배아 사망을 유발하였다. 또한, 비펜트린은 배아에서 VEGF 수용체를 하향 조절하여 혈관신생을 억제하였다. 이에, 비펜트린은 혈관 형성 억제용 시약 조성물 개발에 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 비펜트린(Bifenthrin)에 의한 혈관 형성 억제 및 혈관세포 증식 억제 용도에 관한 것이다.
세포는 혈관으로부터 산소와 영양분을 공급받아 에너지를 생산하고 생존 및 증식을 유지하기 때문에, 세포증식이 조절되지 않고 과도하게 일어나는 양성 및 악성 종양 병변은 혈관 형성이 매우 촉진되어 있다. 따라서, 다양한 유효 활성 물질의 혈관 억제 효능을 밝혀내어 종양 치료에 도입하고자 하는 연구들이 진행 중이다. 체내에서 혈관 형성을 매개하는 인자는 VEGFA, VEGFB, VEGFC 및 이들의 수용체인 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 등이 있으며, 주로 VEGFA가 VEGFR2와 결합하여 혈관내피세포의 생존과 증식, 이동을 유도한다. 따라서 VEGFA의 체내 발현양이 감소하면, 혈관내피세포로의 혈관 형성 신호전달이 약해져서 세포 내 에너지 생산이 감소하여 혈관 증식이 감소한다. 반면, VEGFC와 VEGFD는 VEGFR3과 결합하여 임파선 형성 및 혈관 형성을 유도하는 Wnt 신호 전달경로를 촉진한다.
비펜트린(Bifenthrin)은 피레스로이드계(pyrethroid)계 살충제 가운데 하나로, 제충국(Chrysanthemum cinerariaefolium)에서 자연적으로 합성된다. 비펜트린의 작용 메커니즘은 채널 개방 및 뉴런 기능 장애를 유도하는 나트륨 이온 채널의 감소를 방해하는 것으로 알려져 있다. 이러한 메커니즘으로 인하여 비펜트린은 포유동물의 뇌에서 신경 독성을 유발할 수 있다. 최근에는 척추동물에서 비펜트린의 독성에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있는데, 어류 배아에서 비펜트린의 항에스트로겐 효과를 확인한 바 있다.
그러나, 비펜트린이 배아 발달 또는 기관 형성에 미치는 영향은 연구된 바가 거의 없으며, 본 발명자는 비펜트린의 항혈관신생 효과를 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 비펜트린(Bifenthrin)을 유효성분으로 함유하는 혈관 형성 억제용 시약 조성물을 제공하는 데에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 시험관 내에서(in vitro) 비펜트린을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 혈관 형성 억제 방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 비펜트린(Bifenthrin)을 유효성분으로 함유하는 혈관 형성 억제용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 비펜트린을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 혈관 형성 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 비펜트린의 혈관 형성 억제 및 혈관세포 증식 억제 용도에 관한 것으로서, 비펜트린은 염증 반응을 통하여 제브라피쉬 배아에서 배발생 및 혈관 발달의 손실을 야기하였다. 비펜트린은 장에서 ROS 축적과 tnfa, il6, il8 및 ptgs2b를 포함하는 염증 유전자를 증가시켜, 배아 사망을 유발하였다. 또한, 비펜트린은 배아에서 VEGF 수용체를 하향 조절하여 혈관신생을 억제하였다. 이에, 비펜트린은 혈관 형성 억제용 시약 조성물 개발에 활용될 수 있다.
도 1은 비펜트린을 처리한 제브라피쉬 배아의 형태(morphology)를 나타낸다. 도 1A에서 점선 경계는 눈, 심장 및 난황낭의 각 영역을 나타낸다. 도 1B, 도 1C, 도 1D, 도 1E 및 도 1F의 그래프는 각각 전신, 눈, 심장, 간 및 난황의 면적을 나타낸다. 별표는 유의미한 데이터를 의미하고(**P<0.01 및 ***P<0.001), 눈금 막대는 1mm를 나타낸다.
도 2는 세포주기 조절 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다. 도 2A 내지 2D는 ccnd1, ccne1, cdk2 및 cdk6의 mRNA 발현을 실시간 정량적 PCR로 검출한 것이다. 각 샘플에 대하여 3회 반복 수행하고, 전사 수준은 SAS 프로그램으로 분석하였다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001).
도 3은 제브라피쉬 배아에서 비펜트린의 독성을 나타낸 것이다. 도 2A는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 생존율을 나타낸 것이다. 도 2B는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 심장 박동(카운트/분)을 나타낸 것이다. 도 2C는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 자가 부화한(self-hatched) 배아의 수를 나타낸 것이다. 도 2D는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 DCFH-DA를 사용하여 형광 직립 현미경으로 ROS 생성을 검출한 결과이다. 형광의 세기는 image j 프로그램으로 측정하였다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 스케일 바는 500μm를 나타낸다.
도 4는 비펜트린의 제브라피쉬 배아에서 염증 반응 유도 효과를 나타낸 것이다. 도 4A 내지 4D는 제브라피쉬 배아에 비펜트리 처리 후 RNA를 추출하고, tnf-a, il6, il8 및 ptgs2b의 mRNA 발현을 실시간 정량적 PCR로 검출한 것이다. 각 샘플에 대하여 3회 반복 수행하고, 전사 수준은 SAS 프로그램으로 분석하였다. 도 4E는 제브라피쉬 단일 세포 현탁액을 Annexin V 및 PI로 염색하고 유세포 분석으로 비펜트리에 의한 세포 사멸을 확인하였다. 사분면의 왼쪽 상단은 괴사 세포의 백분율을 나타내고, 오른쪽 상단은 세포자멸 세포의 백분율을 나타낸다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001).
도 5는 비펜트린의 제브라피쉬 배아에 미치는 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. 도 5A는 형질전환 fli:eGFP 제브라피쉬 배아(n=10)를 사용하여 몸통 부위의 혈관 형태를 검출한 것이다. 도 5B는 배아에서 실시간 qPCR로 vegfaa, kdr, flt1 및 flt4의 mRNA 발현 수준을 확인한 것이다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 5x의 눈금 막대는 500μm를 나타내고 20x의 눈금 막대는 125μm를 나타낸다.
도 6은 비펜트린의 HUVEC에 미치는 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. 도 6A는 MTT 분석을 사용하여 비펜트린 처리 시 HUVEC의 세포 생존율을 확인 것이고, 도 6B는 비펜트린 처리에 따른 세포자멸을 확인한 것이다. 후기 세포자멸 세포의 수는 비펜트린을 처리하지 않은 HUVEC 대조군(100%)과 비교하여 표기하였다. 도 6C는 마트리겔 코팅 플레이트를 사용하여 비펜트린 처리 시 HUVEC의 관 형성(tube formation)을 확인한 것이다. 관 형성 비율은 비펜트린을 처리하지 않은 HUVEC 대조군과 비교하여 다각형(polygon)의 상대적인 수를 나타내었다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 눈금 막대는 500μm를 나타낸다.
도 7은 비펜트린의 발달 독성, 염증 반응 및 항혈관신생 효과를 나타낸 모식도이다. 비펜트린은 세포 주기 유전자를 하향 조절하여 정상적인 기관 형성을 방해한다. 비펜트린은 제브라피쉬 배아의 세포자멸 및 괴사를 유도하는 염증 반응과 산화 스트레스로 배아의 사멸을 야기할 수 있다. 또한, 비펜트린은 생체 내 및 시험관 내에서 심장 박동과 혈관 형성을 억제할 수 있다. 즉, 비펜트린은 제브라피쉬 배발생 동안 염증 반응으로 기관 형성 및 혈관 형성을 억제한다.
도 2는 세포주기 조절 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 것이다. 도 2A 내지 2D는 ccnd1, ccne1, cdk2 및 cdk6의 mRNA 발현을 실시간 정량적 PCR로 검출한 것이다. 각 샘플에 대하여 3회 반복 수행하고, 전사 수준은 SAS 프로그램으로 분석하였다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001).
도 3은 제브라피쉬 배아에서 비펜트린의 독성을 나타낸 것이다. 도 2A는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 생존율을 나타낸 것이다. 도 2B는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 심장 박동(카운트/분)을 나타낸 것이다. 도 2C는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 대조군 대비 자가 부화한(self-hatched) 배아의 수를 나타낸 것이다. 도 2D는 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 처리한 후 DCFH-DA를 사용하여 형광 직립 현미경으로 ROS 생성을 검출한 결과이다. 형광의 세기는 image j 프로그램으로 측정하였다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 스케일 바는 500μm를 나타낸다.
도 4는 비펜트린의 제브라피쉬 배아에서 염증 반응 유도 효과를 나타낸 것이다. 도 4A 내지 4D는 제브라피쉬 배아에 비펜트리 처리 후 RNA를 추출하고, tnf-a, il6, il8 및 ptgs2b의 mRNA 발현을 실시간 정량적 PCR로 검출한 것이다. 각 샘플에 대하여 3회 반복 수행하고, 전사 수준은 SAS 프로그램으로 분석하였다. 도 4E는 제브라피쉬 단일 세포 현탁액을 Annexin V 및 PI로 염색하고 유세포 분석으로 비펜트리에 의한 세포 사멸을 확인하였다. 사분면의 왼쪽 상단은 괴사 세포의 백분율을 나타내고, 오른쪽 상단은 세포자멸 세포의 백분율을 나타낸다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타낸다(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001).
도 5는 비펜트린의 제브라피쉬 배아에 미치는 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. 도 5A는 형질전환 fli:eGFP 제브라피쉬 배아(n=10)를 사용하여 몸통 부위의 혈관 형태를 검출한 것이다. 도 5B는 배아에서 실시간 qPCR로 vegfaa, kdr, flt1 및 flt4의 mRNA 발현 수준을 확인한 것이다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 5x의 눈금 막대는 500μm를 나타내고 20x의 눈금 막대는 125μm를 나타낸다.
도 6은 비펜트린의 HUVEC에 미치는 항혈관신생 효과를 나타낸 것이다. 도 6A는 MTT 분석을 사용하여 비펜트린 처리 시 HUVEC의 세포 생존율을 확인 것이고, 도 6B는 비펜트린 처리에 따른 세포자멸을 확인한 것이다. 후기 세포자멸 세포의 수는 비펜트린을 처리하지 않은 HUVEC 대조군(100%)과 비교하여 표기하였다. 도 6C는 마트리겔 코팅 플레이트를 사용하여 비펜트린 처리 시 HUVEC의 관 형성(tube formation)을 확인한 것이다. 관 형성 비율은 비펜트린을 처리하지 않은 HUVEC 대조군과 비교하여 다각형(polygon)의 상대적인 수를 나타내었다. 별표는 각 데이터의 유의성을 나타내고(*P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001), 눈금 막대는 500μm를 나타낸다.
도 7은 비펜트린의 발달 독성, 염증 반응 및 항혈관신생 효과를 나타낸 모식도이다. 비펜트린은 세포 주기 유전자를 하향 조절하여 정상적인 기관 형성을 방해한다. 비펜트린은 제브라피쉬 배아의 세포자멸 및 괴사를 유도하는 염증 반응과 산화 스트레스로 배아의 사멸을 야기할 수 있다. 또한, 비펜트린은 생체 내 및 시험관 내에서 심장 박동과 혈관 형성을 억제할 수 있다. 즉, 비펜트린은 제브라피쉬 배발생 동안 염증 반응으로 기관 형성 및 혈관 형성을 억제한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자는 시험관 내 및 생체 내에서 염증 반응, 세포자멸 및 혈관 신생에 대한 비펜트린(Bifenthrin)의 영향을 확인함에 따라, 혈관 형성을 억제하기 위해 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 비펜트린(Bifenthrin)을 유효성분으로 함유하는 혈관 형성 억제용 시약 조성물을 제공한다.
비펜트린은 하기 화학식으로 표시되는 것일 수 있다.
상기 혈관 형성 억제는 시험관(in vitro) 내에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 혈관 형성 억제는 세포 또는 배아에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 예를 들면, 혈관 내피 세포일 수 있다.
상기 비펜트린은 활성 산소종 생성 및 염증 반응을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 비펜트린은 tnf-a, il 6, il8 및 ptgs2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
상기 비펜트린은 vegfaa의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 비펜트린은 kdr, flt1 및 flt4로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
상기 비펜트린은 세포자멸(apoptosis)을 촉진하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관 내에서(in vitro) 비펜트린을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 혈관 형성 억제 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법은 VEGF 수용체를 하향 조절시키고, 세포자멸(apoptosis)을 촉진할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험예>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 제브라피쉬(Zebrafish) 모델 및 실험 방법
야생형 제브라피쉬(Danio rerio)는 질환 모델 제브라피쉬 센터(Zebrafish Center for Disease Modeling: KNRRC, 충남대학교, 대한민국)에서 얻었고, 형질전환 fli:eGFP 제브라피쉬는 제브라피쉬 기관발생 변이 은행(Zebrafish Organogenesis Mutant Bank: ZOMB, 경북대학교, 대한민국)에서 얻었다. 모든 제브라피시는 28.5℃에서 12시간 암주기 및 12시간 광주기로 유지하였다.
24웰 플레이트에서 6hpf 제브라피쉬 배아에 비펜트린(Cat No. N-11203, Chem Service, USA)을 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 생존율과 형상은 LEICA DM 2500(독일 라이카)로 확인하였다. 생존율 및 부화율을 매일 측정하여, 비히클 처리군 결과와 비교하여 그래프로 나타내었다. 또한, 바이펜트린 처리된 fil:eGFP 제브라피쉬 배아의 형광을 직립형광현미경(Zeiss Axio Imager, MI, ZEISSA, Germany)으로 검출하였다. 모든 현미경 검출을 위해, 배아를 트리카인 메테인 술포네이트(tricaine methane sulfonate, MS-222, Sigma-Aldrich, USA)로 마취하고, 3% 메틸셀룰로오스로 슬라이드에 고정하였다. 모든 제브라피쉬 이미지는 Image J 소프트웨어(NIH, USA)로 분석하였다.
2. 제브라피쉬의 ROS 생성 분석
세포 내 활성 산소 종(reactive oxygen species: ROS)의 생성은 디클로로-디히드로-플루오레세인 디아세테이트(dichloro-dihydro-fluorescein diacetate: DCFH-DA)를 이용하여 시각화하였다. 제브라피쉬 배아에 비펜트린을 48시간 동안 처리하고 30μM의 DCFH-DA를 함유하는 배아 배지에서 암 상태에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 이어서, 1x 배아 배지로 세척한 후, 산화된 DCFH-DA(DCF)의 녹색 형광 신호를 직립 형광 현미경(Zeiss Axio Imager, MI, ZEISSA, Germany)을 사용하여 검출하였다. 형광 강도는 Image J 소프트웨어(NIH, USA)의 'RawIntDen' 패키지를 사용하여 측정하고, 비히클 처리군인 대조군(100%)과 비교하여 그래프로 나타내었다.
3. 제브라피쉬 단일 세포 현탁액에서 Annexin V 유세포 분석
제브라피쉬 배아에 비펜트린을 48시간 동안 처리한 후, 제브라피쉬 배아를 각 EP 튜브에 수집하였다. EP 튜브에 0.25% 트립신-EDTA 및 콜라게나제 믹스처를 첨가하여 세포를 분리하고, 이어서 DMEM-10% FBS 배지를 첨가하여 중화하였다. 세포 현탁액을 회전시키고 펠렛을 1x PBS 1㎖로 세척하고 70㎛ 메쉬로 여과하였다. 수집된 세포 1㎖를 암 조건에서 15분 동안 FITC Annexin V 및 PI 5㎕로 염색하였다. 단일 세포는 Accuri C6 Plus(BD Biosciences)로 검출하였다.
4. 실시간 정량 RT-PCR 분석
제브라피쉬 배아에서 추출한 RNA, 랜덤 헥사머(random hexamers), 올리고 프라이머(oligo primers) 및 AccuPower RT PreMix(Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 실시간 PCR은 StepOnePlus™ 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)과 SYBR® 그린(Sigma)을 사용하여 수행하였다. 표 1에 나열된 프라이머를 사용하고 표준 곡선과 CT 값으로 각 유전자의 발현을 검출하였다. PCR 조건은 95℃에서 3분, 이어서 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초를 40 사이클 반복하였다. 실험은 3회 반복 수행하였으며, gapdh로 정규화하였다. 유전자의 상대적인 발현 수준은 2- ΔΔCT 방법으로 정량화하였다.
| Gene | GenBank no. | Forward (5′→ 3′) | Reverse(5′→ 3′) | |
| ccnd1 | NM_131025.4 | CCAGAACCTCACCAACTTCC | TGGTCTCTGTGGAGATGTGC | |
| ccne1 | NM_130995.1 | CGCAGTATGCATCAGAAAGC | TCCATAACGCGTGTATCTCG | |
| cdk2 | NM_213406.1 | GATCGGAGAGGGAACATACG | GCAGAGAGATCTCACGAATGG | |
| cdk6 | NM_001144053.1 | GGTGCAGACTGAGGAAGAGG | TCCTGGAAACTGTGCATACG | |
| tnfa | AY427649.1 | CTGCTTCACGCTCCATAAGA | GCCTGGTCCTGGTCATCTC | |
| il6 | JN698962.1 | GGTGAGAGACGGAGAGATGGAT | CACGCTGGAGAAGTTGAACAG | |
| il8 | XM_001342570.3 | TGGCATTTCTGACCATCATTG | TCTTCTTAACCCATGGAGCA | |
| ptgs2b | NM_001025504.2 | GGCTCATCCTTATTGGTGAGACTAT | TCGGGATCAAACTTGAGCTTAAAATA | |
| vegfaa | AF016244.1 | ATTCATACCCAGCAGCTTCG | GCAGACAGATGGAGGAGAGC | |
| kdr | NM_001024653.2 | CTTGGCAGCCAGAAATATCC | GACGAGCATCTCCTTTACGG | |
| flt1 | BC139515.1 | CTGGTTATTCGGGATGTTGC | TTTGGGGCTTCACATTTACC | |
| flt4 | AY833404.1 | TCACAACTGGATGGATTTGG | GCCGACAGTCTTTTCTTTGC | |
| gapdh | BC014175.2 | TTTGCTTCAGGGTTTCATCC | ACACTCGCTCAGCTTCTTGG | |
5. 혈관 내피 세포 배양
인간 제대 정맥 내피 세포주(Human umbilical vein endothelial cell line: HUVEC)는 Lonza 라이프 사이언스에서 구입하였다. 세포는 EGM™ BulletKit™ 배지(Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였고, 조직 배양 접시에서 세포가 70%가 찰때까지 24시간 마다 배지를 교체하였다. 이어서, 0.25% 트립신-EDTA로 세포를 분리하고 트립신 중화 용액(Trypsin Neutralizing Solution/l TNS)으로 중화하고 각 배양 접시에 시딩(seeding)하였다.
6. 세포 생존율(MTT) 분석
세포 생존율은 제조사 지침에 따라 MTT 분석 키트(Cat No. 11465007001, Roche, IN, USA)로 측정하였다. HUVEC 세포를 96웰 플레이트에 시딩하고 0, 1, 5, 10, 15 및 30μM의 비펜트린을 48시간 동안 처리하였다. MTT 표지 시약 10㎕를 처리 첨가하고 37℃에서 최대 4시간 동안 인큐베이션하였다. 가용화 완충액 100㎕를 첨가하고 37℃에서 추가로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도는 SPECTRO star Nano(BMG LABTECH, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 560nm와 680nm에서 측정하였다.
7. 마트리겔(Matrigel) 혈관 신생 분석
96웰 플레이트를 실온에서 마트리겔 75㎕로 코팅하고, 37℃에서 추가로 30분 동안 인큐베이션하였다. 2X 비펜트린 처리 믹스처 75㎕를 첨가하여 매트릭스를 경화하였다. 5.0 x 105 HUVEC 세포/㎖ 75㎕를 각 96-웰에 시딩하고, 37℃, 5% CO2에서 12시간 내지 16시간 배양하였다. 배지를 제거하고 LEICA DM 2500(Leica, Germany)을 사용하여 각 웰에서 HUVEC의 튜브 형성(tube formation)을 검출하였다. 각 영상에서 폴리곤(polygons)의 개수를 계산하여 비히클 처리군과 비교하여 상대값(%)으로 표시하였다.
8. 유세포 분석을 통한 Annexin V 및 PI 염색
HUVEC 세포에 비펜트린을 처리하고 세포자멸을 FITC Annexin V 아폽토시스 검출 키트 I(BD Biosciences)을 사용하여 검출하였다. 5.0 x 105 세포를 6웰 플레이트에 시딩하고 비펜트린을 처리하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 상청액 및 분리된 세포를 수집하고 1x PBS로 세척하고 1x Annexin V 결합 완충액 100㎕으로 재현탁하였다. 세포를 암실에서 15분 동안 FITC Annexin V 및 PI 5㎕로 염색하였다. 염색된 세포의 형광은 FACSCalibur(BD Biosciences)로 검출하였다.
9. 통계 분석
데이터는 SAS 프로그램(SAS Institute, Cary, NC, USA)의 일반 선형 모델(PROC-GLM)에 따라 분산 분석(ANOVA)을 수행하여 비펜트린 처리에 따른 유의한 차이가 있는지 확인하였다. P<0.05의 확률 값을 갖는 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시하였다.
<실시예>
1.
비펜트린에
의한 배아의 발달 이상
제브라피쉬 배아에 비펜트린을 농도 의존적으로 0, 15 및 30μM로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 발달 정도를 확인하였다.
도 1A는 눈, 심장, 간, 난황낭을 포함한 다양한 장기에서 비펜트린 처리에 따른 병리학적 특성과 변형/변태를 관찰한 결과이다. 도 1B, 1C, 1D 및 1E를 참고하면, 비펜트린은 전체 배아 체표면(body surface)에 영향을 미치지 않았으나, 눈의 기형을 유도하고, 심막(pericardium)과 간에 부종(edema)을 유발하였다. 그러나 도 1F에 나타낸 바와 같이, 난황낭은 비펜트린 처리 시에 거의 감소하지 않았다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 30μM의 비펜트린은 11.7%의 빈도로 복부 난황낭에서 장 손상을 유도하였다. 비펜트린은 발달 이상(developmental abnormalities)을 유발하는 것을 알 수 있다. 따라서, 전체 배아체에서 비펜트린을 처리한 경우 세포 주기 조절 유전자의 발현을 확인하였다. 도 2를 참고하면, 사이클린 D1(cyclin D1: ccnd1), ccne1, 사이클린 의존성 키나아제(cyclin-dependent kinase 2: cdk2), cdk4를 포함한 세포주기 조절인자는 30μM의 비펜트린 처리로 감소하였다. 즉, 비펜트린이 배아 발달(embryo development) 동안 세포 주기 진행의 억제를 통해 정상적인 제브라피쉬 배아에서 비정상적인 기관 형성(abnormal organogenesis)을 유도한 것을 알 수 있다.
2. 비펜트린에 의한 활성산소종 생성 및 염증 반응 유도
비펜트린이 제브라피쉬 배아의 생존율에 미치는 영향을 확인하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 30μM의 비펜트린 처리시, 비히클을 처리한 배아와 비교하여 생존율이 61%로 감소하였다. 도 3B 및 도 3C를 참고하면, 심장 박동과 부화율은 각각 70% 및 43%로 감소하였다. 배아는 역동적으로 움직이면서 부화하기 때문에, 심장 박동이 감소하여 움직임이 감소하면 부화율 또한 감소한다. 도 3D에 따르면, 비펜트린 처리 시, 간과 장에서 특히 활성산소 생성이 증가하였다.
비펜트린 처리 시 염증 관련 유전자의 발현과 과산화물에 의해 유도된 염증과의 관련성을 확인하였다. 도 4A 내지 4D를 참고하면, 비펜트린은 배아에서 종양 괴사 인자 a(tumor necrosis factor a: tnf-a), 인터루킨 6(interleukin 6: il 6), 인터루킨 8(interleukin 8: il8) 및 프로스타글란딘-엔도퍼옥사이드 합성효소(prostaglandin-endoperoxide synthase 2b: ptgs2; cox2b)를 포함하는 염증성 사이토카인 및 효소의 mRNA 발현을 유의하게 증가시켰다. 또한, 도 4E에 나타낸 바와 같이, 단일 세포 수준에서 비펜트린에 의한 괴사(necrotic) 및 세포자멸(apoptotic)에 따른 세포 사멸 유도로부터, 과산화물 관련 염증 반응이 배아 치사율을 증가시키는 것을 확인하였다. 즉, 비펜트린은 과산화 환경에 의한 염증 반응을 통하여 배아 손상 및 사멸을 야기할 수 있다.
3. 비펜트린에 의한 배아에서의 혈관 형성 억제
도 1D에 나타낸 바와 같이, 비펜트린에 의한 중요한 병리학적 특징으로 심장 부종을 관찰하였다. 따라서, 비펜트린에 의한 심장 독성(cardiotoxicity)이 심혈관 발달(cardiovascular development)에 영향을 미칠 것으로 예상하였다.
형질 전환 fli:eGFP 제브라피쉬에 비펜트린을 처리하고 배아 발생 동안 혈관 형성을 관찰하였다. 도 5A를 참고하면, 비펜트린을 처리한 제브라피쉬 배아에서 몸통 혈관의 등쪽 부분에서 혈관을 나타내는 녹색 형광은 불연속적이고 약하게 검출되었다. 즉, 비펜트린은 제브라피쉬 배아에서 배발생 혈관 발달을 방해하였다.
전 혈관생성(pro-angiogenetic) 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 도 5B 내지 도 5E를 참고하면, 비펜트린 처리 시, 혈관내피성장인자 Aa(vascular endothelial growth factor Aa: vegfaa)의 mRNA 발현은 증가한 반면, 혈관내피성장인자 수용체 2 전구체(vascular endothelial growth factor receptor 2 precursor: kdr), 혈관내피성장인자 수용체 1 전구체(vascular endothelial growth factor receptor 1 precursor: flt1) 및 혈관내피성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor 3: flt4)의 mRNA 발현은 감소하였다. 이러한 결과는 비펜트린이 제브라피쉬 배아에서 VEGF 수용체를 하향 조절하여 혈관 발달을 억제하는 것을 의미한다.
4. 비펜트린에 의한 인간 제대 정맥 내피 세포(umbilical vein endothelial cells)에서의 항혈관신생 효과 확인
비펜트린의 항혈관신생 효능을 확인하기 위하여, 비펜트린을 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)에 처리하였다. 도 6A를 참고하면, 비펜트린은 세포 생존율을 농도 의존적으로 감소시켰고, 30μM의 비펜트린 처리 시, 세포 생존율은 33%로 감소하였다. 또한, 도 6를 참고하면, HUVEC에 비펜트린 처리 시, 세포자멸은 485%로 증가하였다.
또한, HUVEC의 혈관 신생 기능을 확인하기 위하여, 마트리겔(Matrigel) 기반 혈관 신생 분석을 수행하였다. 도 6C에 나타낸 바와 같이, HUVEC의 관 형성은, 다각형의 수로 표시하였고, 비펜트린 처리 시 감소하였다. 이러한 결과는 비펜트린이 세포 사멸을 유도하여 내피 세포의 혈관신생 기능을 억제하는 것을 의미한다.
종합하면, 비펜트린은 염증 반응과 유도하여 배발생 및 혈관 발달의 손실을 야기할 수 있다. 비펜트린은 장에서 ROS 축적과 tnf-a, il6, il8 및 ptgs2b를 포함하는 염증 유전자를 증가시켜, 배아 사망을 유도하였다. 또한, 비펜트린은 배아에서 VEGF 수용체를 하향 조절하여 혈관신생을 억제하였다. 비펜트린은 HUVEC의 세포 생존율을 감소시키고 혈관 형성을 억제할 수 있다.
Claims (6)
- 비펜트린(Bifenthrin)을 유효성분으로 함유하는 혈관 형성 억제용 시약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 VEGF 수용체를 하향 조절하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 세포자멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
- 시험관 내에서(in vitro) 비펜트린을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 혈관 형성 억제 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 방법은 VEGF 수용체를 하향 조절시키고, 세포자멸(apoptosis)을 촉진하는 것을 특징으로 하는 혈관 형성 억제 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell: HUVEC)인 것을 특징으로 하는 혈관 형성 억제 방법.
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- 2021-11-08 KR KR1020210152226A patent/KR102666716B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
| Title |
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| Pesticide Biochemistry and Physiology, 122, 29-37, 2015. |
| The Journal of Biological Chemistry, 279(28), 29863-29869, 2004. |
| Toxicological Sciences, 162(1), 53-63, 2018. |
Also Published As
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