KR102656328B1 - Mass-production method of target protein - Google Patents

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KR102656328B1 KR1020210084632A KR20210084632A KR102656328B1 KR 102656328 B1 KR102656328 B1 KR 102656328B1 KR 1020210084632 A KR1020210084632 A KR 1020210084632A KR 20210084632 A KR20210084632 A KR 20210084632A KR 102656328 B1 KR102656328 B1 KR 102656328B1
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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 대장균에서 가용성으로 One step으로 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면, 대장균 내에서 목적 단백질을 가용성으로 균질하게 생산 가능하며, 세포 내에서 발현된 TEV 프로테아제에 의해 목적 단백질이 절단되므로, 순수한 목적 단백질만을 One step으로 정제할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a method for mass producing a target protein soluble in E. coli in one step. According to the method of the present invention, the target protein can be produced solublely and homogeneously in E. coli, and can be produced solublely and homogeneously in E. coli, using TEV protease expressed within the cell. Since the target protein is cleaved, only pure target protein can be purified in one step.

Description

목적 단백질의 대량 생산 방법{MASS-PRODUCTION METHOD OF TARGET PROTEIN}Method for mass production of target protein {MASS-PRODUCTION METHOD OF TARGET PROTEIN}

본 발명은 목적 단백질을 대장균에서 가용성으로 One step으로 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for mass producing a target protein in one step in a soluble manner in E. coli.

최근 유전공학 및 생명공학 기술의 발달로 대장균, 효모, 동식물세포 등을 이용하여 유용한 외래 단백질이 많이 생산되고, 이들 단백질이 의약품 등으로 널리 이용되고 있다. 구체적으로, 면역 조절제, 효소 저해제 및 호르몬 같은 의약 및 연구용 단백질이나 반응 첨가 효소와 같은 산업용 단백질에 대한 생산 공정 기술 개발 및 산업화가 추진되고 있다. 이중에서도 유전자 재조합 기술은 여러 목적 단백질들의 핵산을 발현벡터에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 얻고, 이를 적당한 숙주세포에 형질전환시켜 배양함으로써 목적 단백질 또는 목적 폴리펩타이드를 생산하는 방법이다. 재조합 단백질(펩타이드 포함)은 동물, 식물, 효모, 박테리아 등에서 유래한 고부가 가치의 유전 산물을 암호화하고 있는 유전자를 발현이 용이한 숙주에 이식하여 대량의 산물이 생산될 수 있도록 유전자 조작을 거친 단백질을 지칭한다. 특히, 재조합 미생물 기술을 이용하여 유용한 재조합 단백질을 생산할 때, 유전공학 관련 기술이 보편화 되어 있고 대량 배양이 용이한 대장균이 널리 사용되고 있다. 대장균에서 재조합 단백질을 생산하기 위하여 다양한 발현시스템이 현재까지 개발되었다. 그러나 숙주세포로 대장균을 이용하는 경우, 재조합 단백질이 대장균 내의 단백질 분해효소에 의해 분해되기 때문에 재조합 단백질의 수율이 저하되는 경우가 많으며, 특히 분자량이 10 kDa 이하의 펩타이드의 발현 시 이러한 경향이 심한 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 재조합 단백질을 대장균에서 과다 발현 시, 응집체(inclusion body)로 알려진 불용성 구조물을 형성하는 경우가 많아 단백질을 활성형으로 되돌려야 하는 과정이 필요하다 (Marston FA, Biochem J 240(1):1-12, 1986).Recently, with the development of genetic engineering and biotechnology, many useful foreign proteins have been produced using E. coli, yeast, animal and plant cells, etc., and these proteins are widely used as pharmaceuticals. Specifically, the development and industrialization of production process technology for pharmaceutical and research proteins such as immunomodulators, enzyme inhibitors, and hormones, and industrial proteins such as reactive enzymes are being promoted. Among these, genetic recombination technology is a method of producing a target protein or target polypeptide by cloning nucleic acids of various target proteins into an expression vector to obtain a recombinant expression vector, transforming it into an appropriate host cell, and culturing it. Recombinant proteins (including peptides) are proteins that have been genetically modified so that large quantities of products can be produced by transplanting genes encoding high value-added genetic products derived from animals, plants, yeast, bacteria, etc. into a host that can easily express them. refers to In particular, when producing useful recombinant proteins using recombinant microbial technology, E. coli, which has widespread genetic engineering technology and is easy to mass-cultivate, is widely used. Various expression systems have been developed to date to produce recombinant proteins in E. coli. However, when using E. coli as a host cell, the yield of the recombinant protein is often reduced because the recombinant protein is degraded by proteolytic enzymes within E. coli. This tendency is known to be particularly severe when expressing peptides with a molecular weight of 10 kDa or less. there is. In addition, when recombinant proteins are overexpressed in E. coli, insoluble structures known as inclusion bodies are often formed, so a process to return the proteins to their active form is necessary (Marston FA, Biochem J 240(1):1 -12, 1986).

한편, 표적지향성을 부여하는 대표적인 물질로써 신호펩티드와 항체가 많이 이용되고 있다. 항체는 척추동물의 면역반응으로 생성되는 단백질로서, 항원의 특정 부위를 특이적으로 인식하고 결합하여 항원의 작용을 비활성시키거나 제거시키는 면역 단백질인데, 표적지향성 물질로 일반적이나 항체의 특정부위를 선택적으로 수식(modification)하는 것이 매우 어려운 기술로 알려져 있다. 항체는 생체 특정 항원이나 세포를 특이적으로 표적하여 치료용 표적 항암제 등의 항체치료제로 이용되고 있으며, 중쇄(heavy chain) 2개와 경쇄(light chain) 2개를 가지고 기본적으로 Y자형을 이루고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변영역이 합쳐져 항원결합부위(antigen binding site)가 형성되는데 이 부위를 인위적으로 펩타이드 링커를 통해 연결한 작은 단편인 scFv(single chain variable fragment)을 이용하여 항체의 기능을 수행하고자 하는 연구가 진행되고 있다. scFv는 일반 항체에 비해 크기가 작기 때문에 항체의 항원 특이적 표적성은 유지하면서 조직이나 암 조직으로의 침투율이 높고, 대장균 시스템을 비롯한 다양한 발현시스템에서 대량생산이 가능하며, 다양한 분자생물학적 수식이 가능하고 생산에 드는 시간과 비용을 절감할 수 있는 장점이 있다. 그러나 scFv는 대장균에서 발현할 경우 대부분 불용성(insoluble)으로 발현되어 기능적으로 사용 가능한 단백질 발현 양이 매우 적은 문제점이 있어왔다. 이에, 종래에 대장균에서 scFv의 생산 수율을 개선하기 위하여 pelB 등이 시도되었으나 크게 효과가 없었으며, MBP를 융합하면 scFv를 가용화하는데는 효율적이었으나, 융합단백질로부터 순수한 scFv를 분리하기위해서는 추가적인 과정이 필요해 번거롭고 시간이 많이 소요되었다.Meanwhile, signal peptides and antibodies are widely used as representative substances that provide target targeting. Antibodies are proteins produced by the immune response of vertebrates. They are immune proteins that specifically recognize and bind to a specific part of an antigen to inactivate or eliminate the action of the antigen. They are generally target-directed substances, but are selective to a specific part of the antibody. It is known to be a very difficult technology to modify. Antibodies are used as antibody therapeutics such as targeted anti-cancer drugs for treatment by specifically targeting specific antigens or cells in the body, and are basically Y-shaped with two heavy chains and two light chains. The variable regions of the light and heavy chains are combined to form an antigen binding site. This site is used to perform the function of an antibody using scFv (single chain variable fragment), a small fragment artificially linked through a peptide linker. Research is in progress. Because scFv is smaller than a regular antibody, it has a high penetration rate into tissue or cancer tissue while maintaining the antigen-specific targeting of the antibody, can be mass-produced in various expression systems including the E. coli system, and can be subjected to various molecular biological modifications. It has the advantage of reducing production time and costs. However, when scFv is expressed in E. coli, it is mostly expressed insoluble, so there is a problem that the amount of functionally usable protein expressed is very small. Accordingly, pelB and other methods have been attempted to improve the production yield of scFv in E. coli, but were not very effective. Although fusion with MBP was efficient in solubilizing scFv, additional processes are required to separate pure scFv from the fusion protein. It was cumbersome and time consuming.

이에, 본 발명자들은 가용성의 scFv를 대장균에서 추가적인 과정 없이 한번에 정제할 수 있는 발현 시스템을 고안하였다.Accordingly, the present inventors designed an expression system that can purify soluble scFv from E. coli at once without additional processing.

본 발명의 목적은 목적 단백질의 대량 생산용 발현 벡터를 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide an expression vector for mass production of a target protein.

또한, 본 발명의 목적은 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터를 제공하는 것이다.Additionally, an object of the present invention is to provide an expression vector for mass production of anti-HER2 scFv.

또한, 본 발명의 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.Additionally, an object of the present invention is to provide host cells transformed with the expression vector.

또한, 본 발명의 목적은 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.Additionally, an object of the present invention is to provide a method for mass production of a target protein.

아울러, 본 발명의 목적은 항-HER2 scFv의 대량 생산 방법을 제공하는 것이다.Additionally, an object of the present invention is to provide a method for mass production of anti-HER2 scFv.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 목적 단백질의 대량 생산용 발현 벡터를 제공한다.To achieve the above object, the present invention provides an expression vector for mass production of a target protein encoding a fusion protein containing MBP, TEV protease, a TEV protease cleavage site, and the target protein.

또한, 본 발명은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 HER2 scFv를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는, HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터를 제공한다.Additionally, the present invention provides an expression vector for mass production of HER2 scFv, encoding a fusion protein comprising MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and HER2 scFv.

또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.Additionally, the present invention provides host cells transformed with the above expression vector.

또한, 본 발명은 목적 단백질의 대량 생산 방법을 제공한다.Additionally, the present invention provides a method for mass production of a target protein.

아울러, 본 발명은 항-HER2 scFv의 대량 생산 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for mass production of anti-HER2 scFv.

본 발명의 방법에 따르면, 대장균 내에서 목적 단백질을 가용성으로 균질하게 생산 가능하며, 세포 내에서 발현된 TEV 프로테아제에 의해 목적 단백질이 절단되므로, 순수한 목적 단백질만을 One step으로 정제할 수 있는 효과가 있다.According to the method of the present invention, the target protein can be soluble and homogeneously produced in E. coli, and since the target protein is cleaved by the TEV protease expressed within the cell, only the pure target protein can be purified in one step. .

도 1은 scFv (v21), PelB-scFv (v22), MBP-scFv (v23) 및 MBP-TEV-scFv (v24)의 융합 단백질을 발현하는 DNA 재조합체(recombinant)를 나타낸 모식도이다.
도 2는 대장균에서 Ni-NTA 크로마토그래피로 가용성의 항-Her2 scFv를 생산할 수 있는 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 v21 (A), v22 (B), v23 (C) 및 v24 (D) 재조합체에서 발현 및 정제된 scFv을 SDS-PAGE로 확인한 도이다:
M: 분자량 마커 (kDa);
T: 총 세포 단백질;
P: 불용성 분획 (Pelleted protein);
S: 가용성 분획 (Soluble protein);
BP: Binding pass;
W: Washing pass; 및
E: Ni-NTA 레진에서 용리한 단백질.
도 4는 v23을 발현시켜 MBP-scFv를 정제한 후 TEV 프로테아제를 처리하여 MBP를 분리한 scFv를 SDS-PAGE로 확인한 도이다:
M: 분자량 마커 (kDa);
T: 총 세포 단백질;
P: 불용성 분획 (Pelleted protein);
S: 가용성 분획 (Soluble protein);
BP: Binding pass;
W: Washing pass;
Mix; MBP-scFv 융합 단백질 (v23) + 정제된 TEV;
R1: 절단 12hr 후 반응물;
R2: 절단 24hr 후 반응물; 및
E: Capto-L 레진으로부터 용리된 단백질.
도 5는 v24의 융합 단백질을 적용하여 scFv를 발현 및 정제시 280nm에서 모니터링한 컬럼 크로마토 그램 및 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 도이다:
M: 마커;
N: Non Induced Cell Paste;
I: Induced Cell paste;
T: Induced Total Cell Lysate;
P: 펠릿;
S: 상등액;
BP: Bind Pass;
W: Washing Pass; 및
1 내지 14: 분획 번호.
도 6은 HER2 항원에 대한 특이성 및 친화도 분석 결과를 나타낸 도이다:
좌: HER2 항원;
우: BSA (대조군); 및
K D: 특이적 결합 친화도.
도 7은 세포 내 HER2에 대한 특이성 및 친화도 분석 결과를 나타낸 도이다:
좌: SKOV3 세포주; 및
우: MDA-MB-231 세포주.Figure 1 is a schematic diagram showing a DNA recombinant expressing fusion proteins of scFv (v21), PelB-scFv (v22), MBP-scFv (v23), and MBP-TEV-scFv (v24).
Figure 2 is a schematic diagram showing the ability to produce soluble anti-Her2 scFv in E. coli using Ni-NTA chromatography.
Figure 3 shows scFv expressed and purified in v21 (A), v22 (B), v23 (C), and v24 (D) recombinants confirmed by SDS-PAGE:
M: molecular weight marker (kDa);
T: total cellular protein;
P: Insoluble fraction (Pelleted protein);
S: Soluble fraction (Soluble protein);
BP: Binding pass;
W: Washing pass; and
E: Protein eluted from Ni-NTA resin.
Figure 4 is a diagram showing the scFv obtained by purifying MBP-scFv by expressing v23 and then separating MBP by treatment with TEV protease, confirmed by SDS-PAGE:
M: molecular weight marker (kDa);
T: total cellular protein;
P: Insoluble fraction (Pelleted protein);
S: Soluble fraction (Soluble protein);
BP: Binding pass;
W: Washing pass;
Mix; MBP-scFv fusion protein (v23) + purified TEV;
R1: reactant after cleavage 12hr;
R2: reactant 24hr after cleavage; and
E: Protein eluted from Capto-L resin.
Figure 5 is a diagram showing the column chromatogram and SDS-PAGE analysis results monitored at 280 nm when scFv was expressed and purified by applying the v24 fusion protein:
M: marker;
N: Non-Induced Cell Paste;
I: Induced Cell paste;
T: Induced Total Cell Lysate;
P: pellet;
S: supernatant;
BP: Bind Pass;
W: Washing Pass; and
1 to 14: Fraction number.
Figure 6 is a diagram showing the results of specificity and affinity analysis for HER2 antigen:
Left: HER2 antigen;
Right: BSA (control); and
K D : Specific binding affinity.
Figure 7 is a diagram showing the results of specificity and affinity analysis for HER2 in cells:
Left: SKOV3 cell line; and
Right: MDA-MB-231 cell line.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through embodiments of the present invention with reference to the attached drawings. However, the following embodiments are provided as examples of the present invention, and if it is judged that a detailed description of a technology or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description may be omitted. , the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the description of the claims described below and the scope of equivalents interpreted therefrom.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express preferred embodiments of the present invention, and may vary depending on the intention of the user or operator or the customs of the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Throughout the specification, when a part is said to “include” a certain element, this means that it may further include other elements rather than excluding other elements, unless specifically stated to the contrary.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 통합된다.All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, are used with the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art in the field related to the present invention. In addition, preferred methods and samples are described in this specification, but similar or equivalent methods are also included in the scope of the present invention. The contents of all publications incorporated herein by reference are hereby incorporated by reference.

본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-methylglycine) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 발명에서 약어로 언급된 아미노산은 하기와 같이 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다:Throughout this specification, the usual one- and three-letter codes for naturally occurring amino acids are used, as well as generally acceptable codes for other amino acids such as Aib (α-aminoisobutyric acid), Sar (N-methylglycine), etc. A three-character code is used. Additionally, amino acids referred to by abbreviations in the present invention are described according to the IUPAC-IUB nomenclature as follows:

알라닌: A, 아르기닌: R, 아스파라긴: N, 아스파르트산: D, 시스테인: C, 글루탐산: E, 글루타민: Q, 글리신: G, 히스티딘: H, 이소류신: I, 류신: L, 리신: K, 메티오닌: M, 페닐알라닌: F, 프롤린: P, 세린: S, 트레오닌: T, 트립토판: W, 티로신: Y 및 발린: V. Alanine: A, Arginine: R, Asparagine: N, Aspartic Acid: D, Cysteine: C, Glutamic Acid: E, Glutamine: Q, Glycine: G, Histidine: H, Isoleucine: I, Leucine: L, Lysine: K, Methionine : M, phenylalanine: F, proline: P, serine: S, threonine: T, tryptophan: W, tyrosine: Y and valine: V.

일 측면에서, 본 발명은 MBP(maltose-binding protein), TEV 프로테아제(Tobacco etch virus protease), TEV 프로테아제 절단 위치(cleavage site) 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 목적 단백질의 대량 생산용 발현 벡터에 관한 것이다.In one aspect, the present invention provides expression for mass production of a target protein encoding a fusion protein comprising maltose-binding protein (MBP), tobacco etch virus protease (TEV protease), a TEV protease cleavage site, and a target protein. It's about vectors.

일 구현예에서, 융합 단백질은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 목적 단백질이 순차적으로 연결될 수 있다.In one embodiment, the fusion protein may sequentially link MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and target protein.

일 구현예에서, MBP는 서열번호 1의 아미노산을 포함할 수 있고, TEV 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산을 포함할 수 있으며, TEV 프로테아제 절단 위치는 서열번호 3의 아미노산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the MBP may include the amino acid of SEQ ID NO: 1, the TEV protease may include the amino acid of SEQ ID NO: 2, and the TEV protease cleavage site may include the amino acid of SEQ ID NO: 3.

일 구현예에서, 융합 단백질은 6xHis 및 c-Myc를 추가로 포함할 수 있으며, 서열번호 8의 아미노산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the fusion protein may further include 6xHis and c-Myc and may include the amino acid of SEQ ID NO: 8.

일 구현예에서, 상기 발현 벡터는 MBP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 9), TEV 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 10) 및 TEV 프로테아제 절단 위치를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 11)을 포함할 수 있다.In one embodiment, the expression vector comprises a polynucleotide encoding MBP (SEQ ID NO: 9), a polynucleotide encoding TEV protease (SEQ ID NO: 10), and a polynucleotide encoding a TEV protease cleavage site (SEQ ID NO: 11). can do.

일 구현예에서, 상기 발현 벡터는 6xHis 및 c-Myc를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 15)을 포함할 수 있다.In one embodiment, the expression vector may include polynucleotides encoding 6xHis and c-Myc (SEQ ID NO: 15).

일 구현예에서, 목적 단백질은 항체의 면역학적 활성을 가진 단편일 수 있으며, 상기 면역학적 활성을 가진 단편은 Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab')2, scFv(single chain fragment variable), Fv, 단일쇄 항체, Fv 이량체, 상보성 결정 영역 단편, 인간화 항체, 키메라 항체 및 디아바디(diabody)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, scFv인 것이 가장 바람직하다.In one embodiment, the target protein may be an immunologically active fragment of an antibody, and the immunologically active fragment is Fab, Fd, Fab', dAb, F(ab'), F(ab') 2 , It may be any one selected from the group consisting of scFv (single chain fragment variable), Fv, single chain antibody, Fv dimer, complementarity determining region fragment, humanized antibody, chimeric antibody, and diabody, and scFv is the most suitable. desirable.

일 구현예에서, 상기 항체는 항-HER2 항체일 수 있고, 상기 목적 단백질은 항-HER2 항체의 scFv일 수 있다.In one embodiment, the antibody may be an anti-HER2 antibody, and the target protein may be an scFv of an anti-HER2 antibody.

일 구현예에서, 항-HER2 항체 (Trastuzumab)의 scFv는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄의 가변영역(VL) 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄의 가변영역(VH)을 포함할 수 있으며, 상기 경쇄의 가변영역과 중쇄의 가변영역은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 링커에 의해 연결될 수 있다.In one embodiment, the scFv of the anti-HER2 antibody (Trastuzumab) includes a light chain variable region (VL) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a heavy chain variable region (VH) containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. It can be done, and the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain can be connected by a linker containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.

일 구현예에서, 항-HER2 항체의 scFv는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.In one embodiment, the scFv of the anti-HER2 antibody may comprise the amino acid sequence of SEQ ID NO:7.

일 구현예에서, 항-HER2 항체 (Trastuzumab)의 scFv는 경쇄의 가변영역(VL)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 12) 및 중쇄의 가변영역(VH)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 14)을 포함할 수 있으며, 상기 경쇄의 가변영역과 중쇄의 가변영역을 연결하는 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 (서열번호 13)를 포함할 수 있다.In one embodiment, the scFv of the anti-HER2 antibody (Trastuzumab) is a polynucleotide encoding the variable region (VL) of the light chain (SEQ ID NO: 12) and a polynucleotide encoding the variable region (VH) of the heavy chain (SEQ ID NO: 14) It may include a polynucleotide (SEQ ID NO: 13) encoding a linker connecting the variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain.

일 구현예에서, 상기 발현 벡터는 대장균에서 목적 단백질과 MBP를 포함하는 융합 단백질을 가용성으로 발현할 수 있으며, 세포 내에서 발현된 융합 단백질 내의 TEV 프로테아제가 TEV 프로테아제 절단 위치 (인식 위치)를 절단하기 때문에 (self-cleavage) 순수한 목적 단백질을 One-step으로 정제할 수 있다.In one embodiment, the expression vector is capable of solublely expressing a fusion protein containing a target protein and MBP in E. coli, and the TEV protease in the fusion protein expressed in the cell cleaves the TEV protease cleavage site (recognition site). Because of this (self-cleavage), pure target proteins can be purified in one step.

일 측면에서, 본 발명은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 항-HER2 scFv를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는, 항-HER2 항체의 scFv(항-HER2 scFv)의 대량 생산용 발현 벡터에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an expression vector for mass production of an scFv of an anti-HER2 antibody (anti-HER2 scFv), encoding a fusion protein comprising MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and anti-HER2 scFv. will be.

일 구현예에서, 항-HER2 항체 (Trastuzumab)의 scFv는 서열번호 7의 아미노산을 포함할 수 있다.In one embodiment, the scFv of the anti-HER2 antibody (Trastuzumab) may include the amino acid of SEQ ID NO: 7.

본 발명에서 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 및 이들의 면역학적 활성을 가진 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다.In the present invention, the antibody or immunologically active fragment thereof may be selected from the group consisting of animal-derived antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, and immunologically active fragments thereof. The antibody may be recombinantly or synthetically produced.

상기 항체 또는 이의 면역학적 활성을 가진 단편은 생체에서 분리된 (생체에 존재하지 않는) 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있으며, 예컨대, 합성적 또는 재조합적으로 생산된 것일 수 있다.The antibody or fragment thereof with immunological activity may be isolated from a living body (not present in the living body) or non-naturally occurring, for example, synthetically or recombinantly produced. You can.

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서, 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 자연적 또는 비자연적(예컨대, 합성적 또는 재조합적)으로 얻어질 수 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.In the present invention, “antibody” refers to a substance produced by stimulation of an antigen within the immune system, the type of which is not particularly limited, and can be obtained naturally or unnaturally (e.g., synthetically or recombinantly). You can. Antibodies are very stable not only in vitro but also in vivo and have a long half-life, making them advantageous for mass expression and production. In addition, antibodies inherently have a dimer structure, so their adhesion ability (avidity) is very high. A complete antibody has a structure of two full-length light chains and two full-length heavy chains, and each light chain is connected to the heavy chain by a disulfide bond. The constant region of an antibody is divided into a heavy chain constant region and a light chain constant region, and the heavy chain constant region has gamma (γ), mu (μ), alpha (α), delta (δ), and epsilon (ε) types, and subclasses. It has gamma 1 (γ1), gamma 2 (γ2), gamma 3 (γ3), gamma 4 (γ4), alpha 1 (α1), and alpha 2 (α2). The constant region of the light chain has kappa (κ) and lambda (λ) types.

본 발명에서 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1 , CH2 및 CH3 과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.As used herein, the term "heavy chain" refers to a variable region domain V H and three constant region domains C H1 , C H2 and C H3 comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to include both the full-length heavy chain including the hinge and fragments thereof. Additionally, the term "light chain" refers to both a full-length light chain and fragments thereof comprising a variable region domain V L and a constant region domain C L comprising an amino acid sequence with sufficient variable region sequence to confer specificity to an antigen. It is interpreted to mean inclusive.

본 발명에서 용어, "가변 영역(variable region) 또는 가변 부위 (variable domain)"는 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변 영역에는 상보성 결정 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다. 상기 "상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.In the present invention, the term "variable region or variable domain" refers to a portion of an antibody molecule that performs the function of specifically binding to an antigen and exhibits many variations in sequence, and the variable region has complementary There are crystalline regions CDR1, CDR2 and CDR3. A framework region (FR) exists between the CDRs and serves to support the CDR ring. The “complementarity determining region” is a ring-shaped region involved in antigen recognition, and as the sequence of this region changes, the specificity of the antibody to the antigen is determined.

본 발명에서 사용되는 용어 "scFv(single chain fragment variable)"는 유전자 재조합을 통해 항체의 가변영역만을 발현시켜 만든 단쇄항체를 말하며, 항체의 VH 영역과 VL 영역을 짧은 펩티드 사슬로 연결한 단일쇄 형태의 항체를 말한다. 상기 용어 "scFv"는 달리 명시되지 않거나, 문맥상 달리 이해되는 것이 아니라면, 항원 결합 단편을 비롯한 scFv 단편을 포함하고자 한다. 이는 통상의 기술자에게 자명한 것이다.The term "scFv (single chain fragment variable)" used in the present invention refers to a single chain antibody made by expressing only the variable region of an antibody through genetic recombination, and is a single chain form in which the VH region and VL region of the antibody are connected by a short peptide chain. refers to the antibodies of The term “scFv” is intended to include scFv fragments, including antigen-binding fragments, unless otherwise specified or understood from context. This is self-evident to those skilled in the art.

본 발명에서 용어, "상보성결정영역(complementarity determining region, CDR)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역 (hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다 (CDRH1, CDRH2,CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 항원결정부위에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. In the present invention, the term “complementarity determining region (CDR)” refers to the amino acid sequence of the hypervariable region of the heavy and light chains of immunoglobulin. The heavy and light chains may each contain three CDRs (CDRH1, CDRH2, CDRH3 and CDRL1, CDRL2, CDRL3). The CDR may provide key contact residues for the antibody to bind to the antigen or epitope.

본 발명에 따른 발현벡터는, 통상 조절 또는 제어 (regulatory) 서열, 선별마커, 임의의 융합 파트너, 및/또는 추가적 요소와 작동가능하게 연결된, 즉, 기능적 관계에 놓인 단백질을 포함한다. The expression vector according to the present invention usually contains a protein that is operably linked, i.e., in a functional relationship, with regulatory or control sequences, a selectable marker, an optional fusion partner, and/or additional elements.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.Vectors of the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, etc. Suitable vectors include expression control elements such as promoters, operators, start codons, stop codons, polyadenylation signals, and enhancers, as well as signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion, and can be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. The signal sequence includes the PhoA signal sequence and OmpA signal sequence when the host is Escherichia sp., and the α-amylase signal sequence and subtilisin signal when the host is Bacillus sp. For sequences, etc., if the host is yeast, the MFα signal sequence, SUC2 signal sequence, etc. can be used, and if the host is an animal cell, the insulin signal sequence, α-interferon signal sequence, antibody molecule signal sequence, etc. can be used. It is not limited to this. Additionally, the vector may include a selection marker for selecting host cells containing the vector, and if it is a replicable expression vector, it will include an origin of replication.

본 발명에서 용어, "벡터"는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 의미한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 벡터로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology , John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994 등).In the present invention, the term “vector” refers to a carrier capable of inserting a nucleic acid sequence for introduction into a cell capable of replicating the nucleic acid sequence. Nucleic acid sequences may be exogenous or heterologous. Vectors include, but are not limited to, plasmids, cosmids, and viruses (eg, bacteriophages). Those skilled in the art can construct vectors by standard recombination techniques (Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; and Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc, NY, 1994, etc.).

일 구현예에서, 상기 벡터의 제작 시, 상기 항체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.In one embodiment, when constructing the vector, expression control sequences such as promoters, terminators, enhancers, etc., depending on the type of host cell for producing the antibody, membrane targeting or secretion Sequences, etc. can be appropriately selected and combined in various ways depending on the purpose.

본 발명에서, 용어 "발현 벡터"는 전사되는 유전자 산물 중 적어도 일부분을 코딩하는 핵산 서열을 포함한 벡터를 의미한다. 일부의 경우에는 그 후 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 벡터에는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.In the present invention, the term “expression vector” refers to a vector containing a nucleic acid sequence encoding at least a portion of the gene product to be transcribed. In some cases, the RNA molecule is then translated into a protein, polypeptide, or peptide. Expression vectors may contain various control sequences. In addition to regulatory sequences that regulate transcription and translation, vectors and expression vectors may also contain nucleic acid sequences that also serve other functions.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to host cells transformed with the expression vector of the present invention.

일 구현예에서, 상기 숙주세포는 박테리아일 수 있으며 대장균일 수 있다.In one embodiment, the host cell may be a bacterium or Escherichia coli.

외인성 핵산을 숙주세포에 도입하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 사용되는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. Methods for introducing exogenous nucleic acids into host cells are known in the art and will vary depending on the host cell used.

일 측면에서, 본 발명은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 목적 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 대장균에 형질전환하는 단계; 대장균을 배양하여 목적 단백질을 발현시키는 단계; 및 목적 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 대량 생산 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention includes the steps of transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein including MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and a target protein; Culturing E. coli to express a target protein; and a method for mass production of a target protein, including the step of purifying the target protein.

일 구현예에서, 융합 단백질은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 목적 단백질이 순차적으로 연결될 수 있다.In one embodiment, the fusion protein may sequentially link MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and target protein.

일 구현예에서, 목적 단백질은 Ni-NTA 크로마토그래피 방법 또는 태그를 이용한 풀-다운(pull-down) 방법으로 정제될 수 있다.In one embodiment, the target protein may be purified by Ni-NTA chromatography or a pull-down method using a tag.

일 측면에서, 본 발명은 MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 항-HER2 scFv를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 대장균에 형질전환하는 단계; 대장균을 배양하여 항-HER2 scFv를 발현시키는 단계; 및 항-HER2 scFv를 정제하는 단계를 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산 방법에 관한 것이다.In one aspect, the present invention includes the steps of transforming E. coli with an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein comprising MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and anti-HER2 scFv; Culturing E. coli to express anti-HER2 scFv; and purifying the anti-HER2 scFv.

일 구현예에서, 항-HER2 scFv은 Ni-NTA 크로마토그래피 방법 또는 태그를 이용한 풀-다운(pull-down) 방법으로 정제될 수 있다.In one embodiment, anti-HER2 scFv can be purified by Ni-NTA chromatography method or pull-down method using a tag.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 항-HER2 항체 (Trastuzumab)의 scFv에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an scFv of an anti-HER2 antibody (Trastuzumab) produced by the method of the present invention.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 항-HER2 항체 (Trastuzumab)의 scFv의 항체치료제로서의 용도에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to the use of the scFv of an anti-HER2 antibody (Trastuzumab) produced by the method of the present invention as an antibody therapeutic agent.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 항-HER2 항체를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to an anti-cancer composition comprising an anti-HER2 antibody produced by the method of the present invention as an active ingredient.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법으로 생산된 항-HER2 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.In one aspect, the present invention relates to a composition for diagnosing cancer comprising an anti-HER2 antibody produced by the method of the present invention as an active ingredient.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are only for illustrating the content of the present invention and are not intended to limit the present invention.

실시예 1. scFv 생산용 융합 단백질 설계 및 이를 암호화하는 플라스미드 제작Example 1. Design of fusion protein for scFv production and production of plasmid encoding it

본 발명자들은 기존 항체치료제를 대체할 수 있을 것으로 기대되는 scFv(single chain variable fragment)를 대장균에서 가용성(Soluble) 형태로 발현시켜 생산하기 위해, MBP(maltose-binding protein)를 scFv에 융합하였으며, 이를 scFv에서 제거하기 위해, TEV 프로테아제(Tobacco etch virus protease) 및 이의 인식 위치를 포함하도록 플라스미드를 제작하고, 이를 발현시키고 Ni-NTA 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 구체적으로, MBP (서열번호 1), TEV 프로테아제 (서열번호 2), TEV 인식 위치(cleavage site) (서열번호 3) 및 scFv (서열번호 7)가 순차적으로 연결된 한 가닥의 융합 단백질로 발현되도록 플라스미드를 제작하였으며, 이 때, scFv는 anti-HER2 항체 (Trastuzumab)의 경쇄 사슬의 가변 영역 (서열번호 4)과 중쇄 사슬의 가변 영역 (서열번호 6)을 링커 서열 (서열번호 5)로 연결하여 재조합하였고, 쉽게 정제하고 표지할 수 있도록 6xHis 및 c-Myc (서열번호 8)를 추가하였다 (도 1). 상기 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드를 대장균에서 발현시키면, 가용성의 도 1의 v24의 형태로 발현되고, 내재된 TEV 프로테아제에 의해 TEV 인식 위치가 절단되어 목적하는 가용성의 scFv 만을 Ni-NTA 크로마토그래피 방법으로 한 번에 정제할 수 있다 (도 2).The present inventors fused MBP (maltose-binding protein) to scFv to produce scFv (single chain variable fragment), which is expected to replace existing antibody therapeutics, by expressing it in a soluble form in E. coli. To remove scFv, a plasmid was constructed containing TEV protease (Tobacco etch virus protease) and its recognition site, expressed, and purified by Ni-NTA chromatography. Specifically, the plasmid is expressed as a single-stranded fusion protein in which MBP (SEQ ID NO: 1), TEV protease (SEQ ID NO: 2), TEV recognition site (SEQ ID NO: 3), and scFv (SEQ ID NO: 7) are linked sequentially. At this time, scFv was recombined by connecting the variable region of the light chain (SEQ ID NO: 4) and the variable region of the heavy chain (SEQ ID NO: 6) of the anti-HER2 antibody (Trastuzumab) with a linker sequence (SEQ ID NO: 5). 6xHis and c-Myc (SEQ ID NO: 8) were added for easy purification and labeling (Figure 1). When the plasmid encoding the fusion protein of the present invention is expressed in E. coli, it is expressed in the form of soluble v24 of Figure 1, and the TEV recognition site is cleaved by the inherent TEV protease to produce only the desired soluble scFv using Ni-NTA chromatography. It can be purified in one step using a graphic method (Figure 2).

실시예 2. 발현 플랫폼에 따른 scFv 발현 및 정제 확인Example 2. Confirmation of scFv expression and purification according to expression platform

2-1. 발현 플랫폼에 따른 scFv 발현 및 정제2-1. scFv expression and purification according to expression platform

상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 MBP-TEV 프로테아제-TEV 인식 위치-scFv가 순차적으로 연결된 융합 단백질 v24을 암호화하는 플라스미드와 대장균에서의 발현 및 정제 정도를 비교하기 위한 대조군 플라스미드들 [anti-HER2 항체의 경쇄 사슬의 가변 영역과 중쇄 사슬의 가변 영역을 링커 서열로 연결하여 재조합하고 6xHis 및 c-Myc를 부착한 scFv (도 1의 v21), v21에 PelB (박테리아 주변 세포질로 단백질을 유도하기 위한 Erwinia carotovora CE의 pectatelyase B의 N-말단 리더 서열 22개)를 부착한 융합 단백질 v22, 및 MBP-TEV 인식 위치(절단 위치) 및 scFv를 포함하는 융합 단백질 v23을 암호화하는 플라스미드]를 각각 대장균에서 발현시키고 (IPTG 유/무) Ni-NTA 레진을 이용하여 Ni-NTA 크로마토그래피 방법으로 정제하고, 정제된 단백질들을 SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. Control plasmids for comparing the degree of expression and purification in E. coli with the plasmid encoding the fusion protein v24 in which the MBP-TEV protease-TEV recognition site-scFv of the present invention prepared in Example 1 is sequentially linked [anti-HER2 The variable region of the light chain and the variable region of the heavy chain of the antibody were recombined by linking them with a linker sequence, and 6xHis and c-Myc were attached to the scFv (v21 in Figure 1), and v21 was replaced with PelB (to induce the protein into the bacterial periplasm). Plasmids encoding fusion protein v22, which attaches the N-terminal leader sequence of pectatelyase B from Erwinia carotovora CE (22), and fusion protein v23, which contains the MBP-TEV recognition site (cleavage site) and scFv] were expressed in Escherichia coli, respectively. and purified by Ni-NTA chromatography using Ni-NTA resin (with/without IPTG), and the purified proteins were confirmed using SDS-PAGE.

그 결과, v21의 경우 대부분 불용성(insoluble)으로 발현되어 펠릿(P)에 존재하고, 매우 적은 양 만이 가용성(Soluble)으로 발현되는 것으로 나타났으며 (도 3A), scFv 앞에 pelB 리더 서열을 추가한 v22의 경우에도 대부분의 scFv는 펠릿에 존재하고, 매우 적은 양 만이 가용성으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 3B). MBP와 scFv를 융합한 MBP-scFv 융합단백질 v23의 경우 효과적으로 가용화되어 대부분이 가용성으로 발현되어 가용성 분획(S)에 존재하는 것으로 나타났으며 (도 3C), MBP와 scFv 사이에 TEV 프로테아제 및 TEV 프로테아제 인식 위치를 추가한 본 발명의 융합 단백질 v24의 경우 TEV 프로테아제에 의해 세포내에서 절단된 scFv가 가용성 분획에 존재하였고, 상기 scFv는 Ni-NTA 크로마토그래피 또는 pull-down 방법으로 한 번에 순수 정제되는 것으로 나타났다 (도 3D).As a result, most of v21 was expressed insoluble and existed in the pellet (P), and only a very small amount was expressed soluble (Figure 3A), and the pelB leader sequence was added in front of scFv. Even in the case of v22, most scFvs were present in the pellet, and only a very small amount appeared to be expressed solublely (Figure 3B). In the case of MBP-scFv fusion protein v23, which is a fusion of MBP and scFv, it was effectively solubilized and most of it was expressed solublely and appeared to exist in the soluble fraction (S) (Figure 3C), and TEV protease and TEV protease were found between MBP and scFv. In the case of the fusion protein v24 of the present invention with an added recognition site, scFv cleaved intracellularly by TEV protease was present in the soluble fraction, and the scFv was purified at once by Ni-NTA chromatography or pull-down method. was found to be (Figure 3D).

2-2. v23으로부터 MBP를 절단하여 scFv 정제2-2. Purify scFv by cutting MBP from v23

상기 실시예 2-1에서 발현시킨 MBP-scFv 융합 단백질인 v23를 TEV 프로테아제로 절단한 뒤 Capto-L 레진으로 scFv를 정제한 뒤 이를 SDS-PAGE로 확인하였다.v23, the MBP-scFv fusion protein expressed in Example 2-1, was cleaved with TEV protease, and the scFv was purified with Capto-L resin and confirmed by SDS-PAGE.

그 결과, MBP-scFv 융합단백질 또한 시험관에서 TEV protease와 반응을 통해 절단하여 순수한 scFv를 정제할 수 있었으며 (도 4), 이를 세포 내에서 정제되어 scFv로 한 번에 정제된 본 발명의 V24에 의한 scFv와 구별하기 위해, 분리된 scFv (isolated scFv)로 표기하였다.As a result, the MBP-scFv fusion protein was also cleaved through reaction with TEV protease in a test tube to purify pure scFv (Figure 4), which was purified within the cell into scFv by the V24 of the present invention. To distinguish it from scFv, it was designated as isolated scFv (isolated scFv).

실시예 3. 본 발명의 발현 플랫폼을 적용한 scFv의 One-step 정제Example 3. One-step purification of scFv using the expression platform of the present invention

본 발명의 발현 플랫폼을 적용한 융합 단백질 v24을 이용하여 항-HER2 scFv를 One-step으로 정제하였다. 구체적으로, v24를 암호화하는 플라스미드를 대장균에 형질전환한 뒤, LB 액체 배지 (Ampicillin 100ug/mL) 500mL에서 O.D.600=1.0, IPTG 0.2mM 및 15℃의 조건으로 16hr 동안 발현 유도하고, 배양된 배양액으로부터 균체 약 3.1g을 획득하였다. 그 후, 획득한 균체를 세포 파쇄하고, 이의 상등액을 Ni-NTA 컬럼에 적용한 뒤 25mM 내지 500mM의 이미다졸 선형 구배로 용리하였다. 구배는 100ml에 걸쳐 확산(spread)하였으며, 분획은 4ml마다 채취하였다. 또한, 280nm에서 컬럼 크로마토그램을 모니터링하였고, 중요한 시료는 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 5). 최종적으로, 피크 Peak Fraction (#11-#13) 의 총 12mL에 달하는 단백질 용액을 수득하였으며, 약 10.5mg의 scFv 단백질 분자를 정제하였다.Anti-HER2 scFv was purified in one step using the fusion protein v24 using the expression platform of the present invention. Specifically, the plasmid encoding v24 was transformed into E. coli, and then expression was induced for 16 hours in 500mL of LB liquid medium (Ampicillin 100ug/mL) under the conditions of O.D.600=1.0, IPTG 0.2mM, and 15°C, and the culture was cultured. Approximately 3.1 g of bacterial cells were obtained from. Afterwards, the obtained bacterial cells were cell disrupted, and their supernatant was applied to a Ni-NTA column and eluted with a linear imidazole gradient of 25mM to 500mM. The gradient was spread over 100 ml, and fractions were collected every 4 ml. In addition, the column chromatogram was monitored at 280 nm, and important samples were confirmed by SDS-PAGE (Figure 5). Finally, a protein solution totaling 12 mL of peak fraction (#11-#13) was obtained, and approximately 10.5 mg of scFv protein molecules were purified.

실시예 4. 정제한 scFv의 결합 친화도 분석Example 4. Binding affinity analysis of purified scFv

4-1. HER2 단백질에 대한 결합 친화도 분석4-1. Binding affinity analysis for HER2 protein

HER2 단백질에 대한 상기 실시예 3에서 본 발명의 플랫폼으로 발현 및 정제한 scFv의 결합 친화도를 확인하였다. 구체적으로, HER2(Human Epidermal growth factor receptor2) 단백질 (Acro biosystem, HE2-H5225) 또는 BSA (대조군)를 코팅 버퍼 (200mM Na2Co3, 200mM NaHCo3, pH 9.6)에 50ng/mL로 희석하고, 100ul씩 96웰 ELISA 플레이트에 분주하여 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 그 후, PBS-T (PBS, 0.05% Tween20)로 3회 세척하여 흡착되지 않은 항원을 제거하고, 5% 스킴 밀크 (PBS, 5% w/v 탈지분유)를 각각의 웰에 200ul씩 실온에서 처리하고 1시간 동안 블로킹한 뒤 제거하였다. v21, v22, v23, 분리된 scFv (실시예 2-2), 양성 대조군으로서 허셉틴(Herceptin, Trastuzumab) 단백질 및 상기 실시예 3에서 발현 및 정제한 항-HER2 scFv (v24)을 0.1pM 내지 400nM의 농도로 각각의 웰에 100ul씩 처리하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T (PBS, 0.05% Tween20)로 3회 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하고, VL을 검출하는 ProteinL-HRP(Genscript, M00098) (in PBS)을 50ng/mL의 농도로 각각의 웰에 100ul씩 실온에서 처리하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T (PBS, 0.05% Tween20)로 3회 세척하여 결합하지 않은 ProteinL-HRP를 제거하고, 1.5% H2O2를 포함하는 TMB를 각각의 웰에 100ul씩 상온에서 처리하고 30분 동안 발색 반응을 유도하였다. 그 후, 1M HCL을 각각의 웰에 100ul씩 첨가하여 반응을 정지시키고 흡광도를 450nm에서 측정하였다. 각 실험은 3회 반복되었으며, 각 농도에서의 측정값과 표준편차를 Prism8 프로그램을 이용하여 도표화하였다. 또한, 특이적 결합 친화도 (K D 값)는 ELISA 및 LSF(least-squares fit)를 사용하여 결정하였다.The binding affinity of the scFv expressed and purified using the platform of the present invention in Example 3 to the HER2 protein was confirmed. Specifically, HER2 (Human Epidermal growth factor receptor2) protein (Acro biosystem, HE2-H5225) or BSA (control) was diluted to 50ng/mL in coating buffer (200mM Na2Co3, 200mM NaHCo3 , pH 9.6), and 96 ul of 100ul each. It was dispensed into a well ELISA plate and adsorbed at 4°C overnight. Afterwards, unadsorbed antigen was removed by washing three times with PBS-T (PBS, 0.05% Tween20), and 200ul of 5% skim milk (PBS, 5% w/v skim milk powder) was added to each well at room temperature. It was treated, blocked for 1 hour, and then removed. v21, v22, v23, isolated scFv (Example 2-2), Herceptin (Trastuzumab) protein as a positive control, and anti-HER2 scFv (v24) expressed and purified in Example 3 above at a concentration of 0.1 pM to 400 nM. Each well was treated with 100ul of the concentration and incubated for 1 hour at room temperature. Unbound antibodies were removed by washing three times with PBS-T (PBS, 0.05% Tween20), and ProteinL-HRP (Genscript, M00098) (in PBS), which detects VL, was added to each well at a concentration of 50ng/mL. 100ul each was treated at room temperature and incubated for 1 hour. Unbound ProteinL-HRP was removed by washing three times with PBS-T (PBS, 0.05% Tween20), and each well was treated with 100ul of TMB containing 1.5% H 2 O 2 at room temperature and developed for 30 minutes. A reaction was induced. Afterwards, 100ul of 1M HCL was added to each well to stop the reaction, and the absorbance was measured at 450nm. Each experiment was repeated three times, and the measured values and standard deviation at each concentration were plotted using the Prism8 program. Additionally, specific binding affinity ( K D value) was determined using ELISA and least-squares fit (LSF).

그 결과, 항원 HER2에 대한 정제된 scFv의 결합친화도는 각각 v24, 분리된 scFv (v23), v22, v21로부터 순으로 나타났으며, 특히, 본 발명의 세포 내에서 정제된 scFv (v24)의 결합친화도는 항원 HER2에 특이적이며, 대조군 단백질 BSA에 대하여서는 결합친화도를 가지지 않는 것으로 나타났다 (도 6). 또한, 절단 이전의 v23 (MBP-scFv)도 항원 HER2에 대하여 특이적 결합친화도를 보이나, 그 정도는 미비한 것으로 나타났다 (도 6).As a result, the binding affinity of the purified scFv to the antigen HER2 was shown in the order of v24, isolated scFv (v23), v22, and v21, respectively. In particular, the binding affinity of the purified scFv (v24) in the cells of the present invention was The binding affinity was specific to the antigen HER2, and did not appear to have binding affinity to the control protein BSA (FIG. 6). In addition, v23 (MBP-scFv) before cleavage also showed specific binding affinity for the antigen HER2, but the degree of binding affinity was found to be insignificant (Figure 6).

4-2. HER2 과발현 세포주에 대한 결합 친화도 분석4-2. Binding affinity analysis for HER2 overexpressing cell lines

HER2 과발현 세포주 SKOV3를 이용하여 상기 실시예 3에서 본 발명의 플랫폼으로 발현 및 정제한 scFv의 결합 친화도를 확인하였다. 구체적으로, 37℃, 5% CO2 환경의 배양접시에서 배양된 SKOV-3 세포주 (HER2 과발현) 또는 MDA-MB-231 세포주 (HER2 무발현)를 세척하고 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)에 재현탁하여 106 개씩 96웰 U-타입 바텀 플레이트에 분주하였다. 그 후, v21, v22, v23, 분리된 scFv (실시예 2-2), 양성 대조군으로서 허셉틴(Herceptin, Trastuzumab) 단백질 및 상기 실시예 3에서 발현 및 정제한 항-HER2 scFv (v24)를 0.1pM 내지 500nM의 농도로 각각의 웰에 처리하고 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃ 및 500g에서 5분간 원심분리한 후 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)에 재현탁하고 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)로 2회 세척하였다. 그 후, ProteinL-FITC (Acrobiosystems, RPL-PF141)을 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)에 5ug/mL로 희석하여 각각의 웰에 100ul씩 처리하고 4℃의 암실에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin)로 2회 세척한 뒤, 세포를 4℃ 및 500g에서 5분간 원심분리하고 PBS 100ul에 재현탁하였다. 그 후, FACSCalibur flow cytometer (BD, USA)를 이용해 유세포 분석 데이터를 도출하고 측정값과 표준편차를 Prism8 프로그램을 이용하여 도표화하였다. 또한, 특이적 결합 친화도 (K D 값)는 유세포 분석 및 LSF(least-squares fit)를 사용하여 결정하였다. 아울러, 다양한 scFv 농도에서 결합된 scFv의 MFI는 y = m1 + m2 × m0 / (m3 + m0) [m1 = scFv 0 (대조군)의 MFI, m2 = 포화 상태에서의 MFI, m3 = KD 및 m0 = 각 scFv 농도에서의 MIF]를 이용하여 결정하였다.The binding affinity of the scFv expressed and purified using the platform of the present invention in Example 3 was confirmed using the HER2 overexpressing cell line SKOV3. Specifically, SKOV-3 cell line (HER2 overexpression) or MDA-MB-231 cell line (HER2 non-expression) cultured in a culture dish in a 37°C, 5% CO 2 environment were washed and washed with 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum). Albumin) and distributed 10 6 each into a 96-well U-type bottom plate. Then, v21, v22, v23, isolated scFv (Example 2-2), Herceptin (Trastuzumab) protein as a positive control, and anti-HER2 scFv (v24) expressed and purified in Example 3 above were added at 0.1 pM. Each well was treated at a concentration of ~500nM and incubated at 4°C for 30 minutes. Cells were centrifuged at 4°C and 500g for 5 minutes, resuspended in 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin), and washed twice with 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin). Afterwards, ProteinL-FITC (Acrobiosystems, RPL-PF141) was diluted to 5ug/mL in 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin), treated with 100ul of each well, and incubated for 30 minutes in the dark at 4°C. did. After washing twice with 1% BSA (PBS, 1% Bovine Serum Albumin), the cells were centrifuged at 4°C and 500g for 5 minutes and resuspended in 100ul of PBS. Afterwards, flow cytometry data were derived using a FACSCalibur flow cytometer (BD, USA), and the measured values and standard deviation were plotted using the Prism8 program. Additionally, specific binding affinity ( K D value) was determined using flow cytometry and least-squares fit (LSF). Furthermore, the MFI of bound scFv at various scFv concentrations is y = m1 + m2 × m0 / (m3 + m0) [m1 = MFI of scFv 0 (control), m2 = MFI at saturation, m3 = KD and m0 = MIF at each scFv concentration] was determined using.

그 결과, HER2 과발현 세포주 SKOV3에 대한 정제된 scFv의 결합친화도는 각각 v24, 분리된 scFv(v23), v22, v21로부터 순으로 나타났으며, 상기 실시예 3에서 발현 및 정제한 본 발명의 항-HER2 scFv (v24)는 HER2 과발현 세포주 SKOV3에 특이적으로 결합친화도를 가지는 것으로 나타났고, 대조군 세포주인 MDA-MB-231에 대하여서는 결합친화도를 가지지 않는 것으로 나타났다 (도 7). 또한, 절단 이전의 v23 (MBP-scFv)또한 HER2 과발현 세포주 SKOV3에 대하여 특이적 결합친화도를 나타냈으나, 그 정도는 미비한 것으로 나타났다.As a result, the binding affinity of the purified scFv to the HER2 overexpressing cell line SKOV3 was shown in the order of v24, isolated scFv (v23), v22, and v21, respectively, and the binding affinity of the purified scFv for the HER2 overexpressing cell line SKOV3 was shown in the order of v24, isolated scFv (v23), v22, and v21, respectively. -HER2 scFv (v24) was found to have specific binding affinity to the HER2 overexpressing cell line SKOV3, and did not have binding affinity to the control cell line MDA-MB-231 (FIG. 7). In addition, v23 (MBP-scFv) before cleavage also showed specific binding affinity to the HER2 overexpressing cell line SKOV3, but the degree of binding affinity was found to be insignificant.

<110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> MASS-PRODUCTION METHOD OF TARGET PROTEIN <130> 2021-1-138-KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP <400> 1 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser 370 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease <400> 2 Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe 35 40 45 Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe 50 55 60 Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg 65 70 75 80 Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln 85 90 95 Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val 100 105 110 Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr 115 120 125 Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile 130 135 140 Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp 145 150 155 160 Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn 165 170 175 Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn 180 185 190 Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser 195 200 205 Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro 210 215 220 Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Gly Ser Ser Ser 225 230 235 240 Ser Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV cleavage site <400> 3 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser 100 105 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial 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acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcg 1113 <210> 10 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV Protease <400> 10 ggagaaagct tgtttaaggg gccgcgtgat tacaacccga tatcgagcac catttgtcat 60 ttgacgaatg aatctgatgg gcacacaaca tcgttgtatg gtattggatt tggtcccttc 120 atcattacaa acaagcactt gtttagaaga aataatggaa cactgttggt ccaatcacta 180 catggtgtat tcaaggtcaa gaacaccacg actttgcaac aacacctcat tgatgggagg 240 gacatgataa ttattcgcat gcctaaggat ttcccaccat ttcctcaaaa gctgaaattt 300 agagagccac aaagggaaga gcgcatatgt cttgtgacaa ccaacttcca aactaagagc 360 atgtctagca tggtgtcaga cactagttgc acattccctt catctgatgg catattctgg 420 aagcattgga ttcaaaccaa ggatgggcag tgtggcagtc cattagtatc aactagagat 480 gggttcattg ttggtataca ctcagcatcg aatttcacca acacaaacaa ttatttcaca 540 agcgtgccga aaaacttcat ggaattgttg acaaatcagg aggcgcagca gtgggttagt 600 ggttggcgat taaatgctga ctcagtattg tgggggggcc ataaagtttt catggtgaaa 660 cctgaagagc cttttcagcc agttaaggaa gcgactcaac tcatgaatgg ttcctcgagc 720 tcggga 726 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV cleavage site <400> 11 gaaaatttat atttccaggg t 21 <210> 12 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VL <400> 12 gacattcaaa tgacgcaatc gcctagttcg ctgagtgcga gtgtcggcga ccgcgtgacc 60 ataacgtgtc gggccagtca ggatgtaaat accgccgtgg cttggtacca gcagaagccg 120 ggcaaggcgc ctaagctgct tatatattcc gcttcctttc tgtacagcgg tgtgccatct 180 cgtttctcag gctcgcggtc tgggacggac ttcacactta caatctcctc tcttcagccg 240 gaggatttcg caacatatta ctgtcagcaa cactatacta caccccccac ttttggccaa 300 gggacgaaag tcgagatcaa acgttca 327 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 13 gggggaggcg gttctggcgg gggaggttcg ggaggaggtg gaagc 45 <210> 14 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VH <400> 14 gaagtacaac tggtggagag cggtggtggt ttagttcagc cgggcggttc tttgagatta 60 agctgtgctg ccagcggttt taatatcaag gatacttata ttcactgggt ccgtcaagct 120 ccaggaaaag gtttggaatg ggtggctaga atctacccta ccaacgggta tacacgttat 180 gccgactccg tgaaaggaag atttactatc agtgcagata cgtccaaaaa cacggcctac 240 cttcaaatga actcactgcg cgcagaagac acggcagttt attactgttc gcgttggggt 300 ggcgatgggt tttatgccat ggattattgg gggcagggta cccttgtgac cgtttcctcc 360 gcctcc 366 <210> 15 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc, 6His tag <400> 15 ggatccgagc agaaattgat ttcagaagag gatctgcacc atcatcatca tcacggatcc 60 tctagagtcg ac 72 <110> Konkuk University Glocal Industry-Academic Collaboration Foundation <120> MASS-PRODUCTION METHOD OF TARGET PROTEIN <130> 2021-1-138-KR <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 371 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP <400> 1 Met Lys Thr Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser 370 <210> 2 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV protease <400> 2 Gly Glu Ser Leu Phe Lys Gly Pro Arg Asp Tyr Asn Pro Ile Ser Ser 1 5 10 15 Thr Ile Cys His Leu Thr Asn Glu Ser Asp Gly His Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Tyr Gly Ile Gly Phe Gly Pro Phe Ile Ile Thr Asn Lys His Leu Phe 35 40 45 Arg Arg Asn Asn Gly Thr Leu Leu Val Gln Ser Leu His Gly Val Phe 50 55 60 Lys Val Lys Asn Thr Thr Thr Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Gly Arg 65 70 75 80 Asp Met Ile Ile Ile Arg Met Pro Lys Asp Phe Pro Pro Phe Pro Gln 85 90 95 Lys Leu Lys Phe Arg Glu Pro Gln Arg Glu Glu Arg Ile Cys Leu Val 100 105 110 Thr Thr Asn Phe Gln Thr Lys Ser Met Ser Ser Met Val Ser Asp Thr 115 120 125 Ser Cys Thr Phe Pro Ser Ser Asp Gly Ile Phe Trp Lys His Trp Ile 130 135 140 Gln Thr Lys Asp Gly Gln Cys Gly Ser Pro Leu Val Ser Thr Arg Asp 145 150 155 160 Gly Phe Ile Val Gly Ile His Ser Ala Ser Asn Phe Thr Asn Thr Asn 165 170 175 Asn Tyr Phe Thr Ser Val Pro Lys Asn Phe Met Glu Leu Leu Thr Asn 180 185 190 Gln Glu Ala Gln Gln Trp Val Ser Gly Trp Arg Leu Asn Ala Asp Ser 195 200 205 Val Leu Trp Gly Gly His Lys Val Phe Met Val Lys Pro Glu Glu Pro 210 215 220 Phe Gln Pro Val Lys Glu Ala Thr Gln Leu Met Asn Gly Ser Ser Ser 225 230 235 240 Ser Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV cleavage site <400> 3 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 1 5 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser 100 105 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VH <400> 6 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 7 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr 165 170 175 Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly 210 215 220 Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser Ala Ser 245 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc6His tag <400> 8 Gly Ser Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His 1 5 10 15 His His Gly Ser Ser Arg Val Asp 20 <210> 9 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP <400> 9 atgaaaactg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 accatggaaa acgcccagaa aggtgaaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcg 1113 <210> 10 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV Protease <400> 10 ggagaaagct tgtttaaggg gccgcgtgat tacaacccga tatcgagcac catttgtcat 60 ttgacgaatg aatctgatgg gcacacaaca tcgttgtatg gtattggatt tggtcccttc 120 atcatttacaa acaagcactt gtttagaaga aataatggaa cactgttggt ccaatcacta 180 catggtgtat tcaaggtcaa gaacaccacg actttgcaac aacacctcat tgatgggagg 240 gacatgataa ttattcgcat gcctaaggat ttcccaccat ttcctcaaaa gctgaaattt 300 agagagccac aaagggaaga gcgcatatgt cttgtgacaa ccaacttcca aactaagagc 360 atgtctagca tggtgtcaga cactagttgc acattccctt catctgatgg catattctgg 420 aagcattgga ttcaaaccaa ggatgggcag tgtggcagtc cattagtatc aactagagat 480 gggttcattg ttggtataca ctcagcatcg aatttcacca acacaaaacaa ttatttcaca 540 agcgtgccga aaaacttcat ggaattgttg acaaatcagg aggcgcagca gtgggttagt 600 ggttggcgat taaatgctga ctcagtattg tgggggggcc ataaagtttt catggtgaaa 660 cctgaagagc cttttcagcc agttaaggaa gcgactcaac tcatgaatgg ttcctcgagc 720 tcggga 726 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TEV cleavage site <400> 11 gaaaatttat atttccaggg t 21 <210> 12 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VL <400> 12 gacattcaaa tgacgcaatc gcctagttcg ctgagtgcga gtgtcggcga ccgcgtgacc 60 ataacgtgtc gggccagtca ggatgtaaat accgccgtgg cttggtacca gcagaagccg 120 ggcaaggcgc ctaagctgct tatatattcc gcttcctttc tgtacagcgg tgtgccatct 180 cgtttctcag gctcgcggtc tgggacggac ttcacactta caatctcctc tcttcagccg 240 gaggatttcg caacatatta ctgtcagcaa cactatacta caccccccac ttttggccaa 300 gggacgaaag tcgagatcaa acgttca 327 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 13 gggggaggcg gttctggcgg gggaggttcg ggaggaggtg gaagc 45 <210> 14 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-HER2 scFv VH <400> 14 gaagtacaac tggtggagag cggtggtggt ttagttcagc cgggcggttc tttgagatta 60 agctgtgctg ccagcggttt taatatcaag gatacttata ttcactgggt ccgtcaagct 120 ccaggaaag gtttggaatg ggtggctaga atctacccta ccaacgggta tacacgttat 180 gccgactccg tgaaaggaag atttactatc agtgcagata cgtccaaaaaa cacggcctac 240 cttcaaatga actcactgcg cgcagaagac acggcagttt attactgttc gcgttggggt 300 ggcgatgggt tttatgccat ggattattgg gggcagggta cccttgtgac cgtttcctcc 360 gcctcc 366 <210> 15 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-Myc, 6His tag <400> 15 ggatccgagc agaaattgat ttcagaagag gatctgcacc atcatcatca tcacggatcc 60 tctagagtcg ac 72

Claims (16)

MBP(maltose-binding protein), TEV 프로테아제(Tobacco etch virus protease), TEV 프로테아제 절단 위치(cleavage site) 및 항-HER2 항체의 scFv(single chain fragment variable)가 순차적으로 연결된 융합 단백질을 암호화하는 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터.Anti-HER2, which encodes a fusion protein in which MBP (maltose-binding protein), TEV protease (Tobacco etch virus protease), TEV protease cleavage site, and scFv (single chain fragment variable) of anti-HER2 antibody are linked sequentially. Expression vector for mass production of scFv. 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 scFv는 HER2 항체의 면역학적 활성을 가진 단편인, 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터.The expression vector for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 1, wherein the scFv is an immunologically active fragment of a HER2 antibody. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 MBP는 서열번호 1의 아미노산을 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터.The expression vector for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 1, wherein the MBP contains the amino acid of SEQ ID NO: 1. 제 1항에 있어서, 상기 TEV 프로테아제는 서열번호 2의 아미노산을 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터.The expression vector for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 1, wherein the TEV protease contains the amino acid of SEQ ID NO: 2. 제 1항에 있어서, 상기 TEV 프로테아제 절단 위치는 서열번호 3의 아미노산을 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터.The expression vector for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 1, wherein the TEV protease cleavage site includes the amino acid of SEQ ID NO: 3. 삭제delete 제 1항에 있어서, 상기 항-HER2 scFv는 서열번호 7의 아미노산을 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산용 발현 벡터. The expression vector for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 1, wherein the anti-HER2 scFv contains the amino acid of SEQ ID NO: 7. 제 1항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.A host cell transformed with the expression vector of claim 1. 제 11항에 있어서, 숙주세포는 대장균인, 숙주세포.The host cell according to claim 11, wherein the host cell is E. coli. a) MBP, TEV 프로테아제, TEV 프로테아제 절단 위치 및 항-HER2 scFv가 순차적으로 연결된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 대장균에 형질전환하는 단계;
b) 대장균을 배양하여 항-HER2 scFv를 발현시키는 단계; 및
c) 항-HER2 scFv을 정제하는 단계를 포함하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산 방법.a) Transforming an expression vector containing a polynucleotide encoding a fusion protein sequentially linked to MBP, TEV protease, TEV protease cleavage site, and anti-HER2 scFv into E. coli;
b) culturing E. coli to express anti-HER2 scFv; and
c) A method for mass production of anti-HER2 scFv, comprising the step of purifying the anti-HER2 scFv. 삭제delete 제 13항에 있어서, 상기 항-HER2 scFv는 Ni-NTA 크로마토그래피 방법 또는 풀-다운(pull-down) 방법으로 정제하는, 항-HER2 scFv의 대량 생산 방법.The method for mass production of anti-HER2 scFv according to claim 13, wherein the anti-HER2 scFv is purified by Ni-NTA chromatography or pull-down method. 삭제delete
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Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103: 6071-6079.*
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