KR102654655B1

KR102654655B1 - Method for stochastic optical reconstruction microscopy imaging and stochastic optical reconstruction microscopy imaging apparatus

Info

Publication number: KR102654655B1
Application number: KR1020210035404A
Authority: KR
Inventors: 김두리; 정진경; 정의돈
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2021-03-18
Publication date: 2024-04-05
Also published as: KR20220052256A

Abstract

본 발명은 초고해상도 형광 현미경의 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 개시한다. 본 발명은 커버 글라스에 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포를 고정하는 단계; 상기 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계; 상기 형광표지된 세포를 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계; 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계; 및 상기 형광 신호를 필터링하는 단계;를 포함하고, 상기 초고해상도 형광 현미경의 레이저 파워는 6mW 내지 50mW 인 것을 특징으로 한다.The present invention discloses a super-resolution fluorescence microscope imaging method and a super-resolution fluorescence microscope imaging device. The present invention includes the steps of culturing cells on a cover glass; Fixing the cultured cells; Marking the fixed cells with a fluorescent substance; Supporting the fluorescently labeled cells in an imaging buffer solution; Measuring and imaging the fluorescence of the cells using a super-resolution fluorescence microscope and analyzing the fluorescence signals; and filtering the fluorescence signal, wherein the laser power of the super-resolution fluorescence microscope is 6 mW to 50 mW.

Description

Super-resolution fluorescence microscope imaging method and super-resolution fluorescence microscope imaging device {METHOD FOR STOCHASTIC OPTICAL RECONSTRUCTION MICROSCOPY IMAGING AND STOCHASTIC OPTICAL RECONSTRUCTION MICROSCOPY IMAGING APPARATUS}

본 발명은 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로, 낮은 세기의 레이저로도 이미징이 가능한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치에 관한 것이다.The present invention relates to a super-resolution fluorescence microscope imaging method and a super-resolution fluorescence microscope imaging device. More specifically, it relates to a super-resolution fluorescence microscope imaging method and a super-resolution fluorescence microscope imaging device capable of imaging even with a low-intensity laser.

최근 빛의 회절 한계라고도 불리는 광학 현미경의 이론적인 해상도를 뛰어넘은 초고해상도 형광 현미경 기술이 다양하게 개발되었다. 그 중에서 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy: 초고해상도 형광 현미경 기술) 기술은 높은 세기의 레이저 파워에서 광 스위칭(photoswitching) 현상을 일으켜서 겹쳐져 있는 형광 분자(형광체 또는 형광 염료에 대응)들을 시간별로 분리하여 초고해상도로 이미징하는 기술이다.Recently, a variety of super-resolution fluorescence microscopy technologies have been developed that exceed the theoretical resolution of optical microscopy, also known as the diffraction limit of light. Among them, STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy: Super-resolution fluorescence microscopy technology) creates a photo-switching phenomenon at high intensity laser power, separating overlapping fluorescent molecules (corresponding to fluorescent substances or fluorescent dyes) over time, resulting in super-resolution This is an imaging technology.

기존 STORM 기술은 낮은 세기의 레이저 파워에서는 형광 세기가 낮고 광 스위칭이 불가능하여 초고해상도 이미징이 불가능한 문제가 있다.Existing STORM technology has a problem in that super-resolution imaging is impossible because the fluorescence intensity is low at low laser power and optical switching is not possible.

보다 구체적으로, 기존 STORM 기술은 낮은 세기의 레이저 파워에서는 광 스위칭이 잘 일어나지 않고 이미지의 해상도를 결정하는 형광 세기도 급격하게 떨어져서 초고해상도 이미징이 불가능하다는 어려움이 있다.More specifically, the existing STORM technology has the difficulty of making super-resolution imaging impossible because optical switching does not occur easily at low-intensity laser power and the fluorescence intensity, which determines the resolution of the image, drops sharply.

반면, 높은 세기의 레이저 파워에서는 형광체가 빠르게 광퇴색될 수 있고, 특히, 바이오 시료의 경우에는 높은 세기의 레이저 파워에 의해 구조가 파괴될 수 있어, 낮은 세기의 레이저 파워에서도 형광 이미징이 가능한 기술이 필요하다.On the other hand, at high-intensity laser power, the phosphor can quickly photobleach, and especially in the case of bio samples, the structure can be destroyed by high-intensity laser power, so a technology that enables fluorescence imaging even at low-intensity laser power is available. need.

대한민국 공개특허 제 2020-0024794호, "슈퍼-해상도 이미징"Republic of Korea Patent Publication No. 2020-0024794, “Super-resolution imaging” 대한민국 공개특허 제 2018-0130567호, "일반화된 스토캐스틱 초-해상 시퀀싱"Republic of Korea Patent Publication No. 2018-0130567, “Generalized Stochastic Super-Resolution Sequencing”

본 발명의 실시예는, 이미징 버퍼 용액의 화학적 조성(농도 또는/및 pH)을 조절함으로써 낮은 세기의 레이저 파워에서의 형광 세기를 높이고 광 스위칭을 활성화시킬 수 있으며, 해상도를 향상시킬 수 있는 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 제공하기 위한 것이다.Embodiments of the present invention can increase the fluorescence intensity at low intensity laser power, activate optical switching, and improve resolution by adjusting the chemical composition (concentration or/and pH) of the imaging buffer solution. The purpose is to provide a fluorescence microscope imaging method and a super-resolution fluorescence microscope imaging device.

또한, 상기 이미징 버퍼 용액은 낮은 세기의 레이저 파워 조건하에서도 유기 형광체에 광 스위칭을 빠르고 강하게 일으킬 수 있는 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 제공하기 위한 것이다.In addition, the imaging buffer solution is intended to provide a super-resolution fluorescence microscopy imaging method and a super-resolution fluorescence microscopy imaging device that can quickly and strongly cause optical switching in organic fluorescent substances even under low-intensity laser power conditions.

본 발명의 실시예는, 낮은 세기의 레이저 파워에서 광 스위칭이 잘 되지 않아 생긴 시그널 오류를 이미지 분석을 통해 필터링시킴으로서 낮은 세기의 레이저 파워에서도 이미징이 가능한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 제공하기 위한 것이다.An embodiment of the present invention provides a super-resolution fluorescence microscope imaging method and super-resolution fluorescence microscope imaging that enable imaging even at low-intensity laser power by filtering out signal errors resulting from poor optical switching at low-intensity laser power through image analysis. This is to provide a device.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 세포를 고정(fixation)하는 단계; 상기 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계; 상기 형광표지된 세포를 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계; 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계; 및 상기 형광 신호를 필터링하는 단계;를 포함하고, 상기 초고해상도 형광 현미경의 레이저 파워(Laser Power)는 6mW 내지 50mW이다.A super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention includes culturing cells on a cover glass; Fixing the cultured cells; Marking the fixed cells with a fluorescent substance; Supporting the fluorescently labeled cells in an imaging buffer solution; Measuring and imaging the fluorescence of the cells using a super-resolution fluorescence microscope and analyzing the fluorescence signals; and filtering the fluorescence signal, wherein the laser power of the super-resolution fluorescence microscope is 6mW to 50mW.

상기 초고해상도 형광 현미경은 상기 레이저 파워에 따라, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM) 및 형광 세기가 조절될 수 있다.In the super-resolution fluorescence microscope, the full width at half maximum (FWHM) and fluorescence intensity of the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance can be adjusted according to the laser power.

상기 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.The super-resolution fluorescence microscope may be STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy).

상기 이미징 버퍼 용액의 pH는 7.0 내지 9.0 일 수 있다.The pH of the imaging buffer solution may be 7.0 to 9.0.

상기 이미징 버퍼 용액은 Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액, 싸이올(thiol) 화합물 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함할 수 있다. The imaging buffer solution may include a Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) solution, a thiol compound, and an oxygen scavenger system.

상기 이미징 버퍼 용액에서 상기 싸이올(thiol) 화합물의 농도는 5 mM 내지 200 mM 일 수 있다.The concentration of the thiol compound in the imaging buffer solution may be 5mM to 200mM.

상기 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템은 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 글루코스(glucose) 및 과산화수소분해효소(catalase)를 포함할 수 있다. The oxygen scavenger system may include glucose oxidase, glucose, and catalase.

상기 형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지될 수 있다.The fluorescent label is at least one of cyanine series, atto series, fluorescein seires, rhodamine series, BODIPY series, and phorphyrin series. Can be labeled with any one dye.

상기 필터링은 EM-CCD 카메라 센서에서 감지되는 800(A.U.) 내지 2000(A.U.) 의 백그라운드 신호를 제거할 수 있다.The filtering can remove background signals of 800 (A.U.) to 2000 (A.U.) detected by the EM-CCD camera sensor.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 이미징 버퍼 용액에 담지된 형광표지된 세포가 배치되는 플레이트; 상기 형광표지된 세포에 레이저를 조사하는 광원부; 및 상기 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 검출기;를 포함하고, 상기 레이저 파워는 6mW 내지 50mW 이다.A super-resolution fluorescence microscopy device according to an embodiment of the present invention includes a plate on which fluorescently labeled cells supported in an imaging buffer solution are placed; a light source unit that irradiates a laser to the fluorescently labeled cells; And a detector for measuring and imaging the fluorescence of the cells and analyzing the fluorescence signals, and the laser power is 6mW to 50mW.

상기 초고해상도 형광 현미경으로 측정한 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)는 21.55nm 내지 50.00nm일 수 있다.The full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance measured using the super-resolution fluorescence microscope may be 21.55 nm to 50.00 nm.

상기 이미징 버퍼 용액에서 싸이올(thiol) 화합물의 농도는 5 mM 내지 200 mM 일 수 있다.The concentration of the thiol compound in the imaging buffer solution may be 5mM to 200mM.

상기 검출기는 상기 형광 신호를 필터링하고, 상기 필터링은 EM-CCD 카메라 센서에서 감지되는 800(A.U.) 내지 2000(A.U.)의 백그라운드 신호를 제거할 수 있다.The detector filters the fluorescence signal, and the filtering can remove a background signal of 800 (A.U.) to 2000 (A.U.) detected by the EM-CCD camera sensor.

본 발명의 실시예에 따르면, 이미징 버퍼 용액의 화학적 조성(농도 또는/및 pH)을 조절함으로서 낮은 세기의 레이저 파워에서의 형광 세기를 높이고 광 스위칭을 활성화시킬 수 있으며, 해상도를 향상시킬 수 있는 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, by adjusting the chemical composition (concentration or/and pH) of the imaging buffer solution, the fluorescence intensity at low intensity laser power can be increased, optical switching can be activated, and resolution can be improved. A high-resolution fluorescence microscope imaging method and a super-resolution fluorescence microscope imaging device can be provided.

또한, 상기 이미징 버퍼 용액은 낮은 레이저 파워 조건하에서도 유기 형광체에 광 스위칭을 빠르고 강하게 일으킬 수 있다.Additionally, the imaging buffer solution can quickly and strongly cause light switching in organic phosphors even under low laser power conditions.

본 발명의 실시예에 따르면, 낮은 세기의 레이저 파워에서 광 스위칭이 잘 되지 않아 생긴 시그널 오류를 이미지 분석을 통해 필터링시킴으로서 낮은 세기의 레이저 파워에서도 이미징이 가능한 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법 및 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치를 제공할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, a super-resolution fluorescence microscope imaging method and super-resolution fluorescence microscope capable of imaging even at low-intensity laser power by filtering out signal errors caused by poor optical switching at low-intensity laser power through image analysis. An imaging device may be provided.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 도시한 흐름도이다.
도 2a 내지 도 2f는 레이저 세기(laser power)를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지 및 형광 세기 그래프이고, 도 3은 도 2a 내지 도 2f에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 4는 도 2a 내지 도 2f에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.
도 5는 싸이올(thiol) 화합물의 농도(MEA의 농도에 대응)를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이고, 도 6은 도 5에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 7은 도 5에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.
도 8은 이미징 버퍼 용액의 pH를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이고, 도 9는 도 8에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 10은 도 8에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.
도 11은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지 및 실시예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이며, 도 12는 도 11에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이고, 도 13은 도 11에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.
도 14는 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 15는 높은 세기의 레이저 파워(100mW)에서 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이다.
도 16은 도 15에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 17은 도 15에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 18은 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 19는 약한 레이저 파워(12mW)에서 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 20은 도 19에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 21은 도 19에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 22는 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 23은 약한 레이저 파워(12mW)에서 실시예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 24는 도 23에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 25는 도 23에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 26은 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 27는 약한 레이저 파워(12mW)에서 실시예 3에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 28은 도 27에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 29는 도 27에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.
도 30은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광현미경 이미징 방법에서 신호 오류 필터링 이미지 분석에 따른 초고해상도 형광 이미징 효과를 도시한 초고해상도 STORM 이미지 및 그래프이다.1 is a flowchart showing a super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention.
FIGS. 2A to 2F are super-resolution STORM images and fluorescence intensity graphs of intracellular microtubules taken at different laser powers, and FIG. 3 shows fluorescence intensity (brightness; mean photon number) according to FIGS. 2A to 2F. ), and FIG. 4 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor according to FIGS. 2A to 2F.
Figure 5 shows super-resolution STORM images of intracellular microtubules taken at different concentrations of thiol compounds (corresponding to the concentration of MEA), and Figure 6 shows the fluorescence intensity (brightness; mean) according to Figure 5. It is a graph showing the photon number, and FIG. 7 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor according to FIG. 5.
Figure 8 shows super-resolution STORM images of intracellular microtubules taken at different pH of imaging buffer solutions, and Figure 9 is a graph showing the fluorescence intensity (brightness; mean photon number) according to Figure 8. 10 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor according to FIG. 8.
11 shows a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 and a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 1. 12 is a graph showing the fluorescence intensity (mean photon number) according to FIG. 11, and FIG. 13 is a graph showing the full width at half maximum for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor according to FIG. 11. , FWHM).
Figure 14 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 15 is a first image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 at high intensity laser power (100 mW). This is a high-resolution STORM image.
FIG. 16 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 15, and FIG. 17 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 15.
Figure 18 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 19 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 20 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 19, and FIG. 21 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 19.
Figure 22 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 23 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 2 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 24 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 23, and FIG. 25 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 23.
Figure 26 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 27 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 3 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 28 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 27, and FIG. 29 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 27.
Figure 30 is a super-resolution STORM image and graph showing the effect of super-resolution fluorescence imaging according to signal error filtering image analysis in the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention.

이하 첨부 도면들 및 첨부 도면들에 기재된 내용들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings and the contents described in the accompanying drawings, but the present invention is not limited or limited by the embodiments.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예를 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자는 하나 이상의 다른 구성요소, 단계, 동작 및/또는 소자의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.The terms used in this specification are for describing embodiments and are not intended to limit the invention. As used herein, singular forms also include plural forms, unless specifically stated otherwise in the context. As used herein, “comprises” and/or “comprising” refers to the presence of one or more other components, steps, operations and/or elements. or does not rule out addition.

본 명세서에서 사용되는 "실시예", "예", "측면", "예시" 등은 기술된 임의의 양상(aspect) 또는 설계가 다른 양상 또는 설계들보다 양호하다거나, 이점이 있는 것으로 해석되어야 하는 것은 아니다.As used herein, “embodiment,” “example,” “aspect,” “example,” etc. should be construed to mean that any aspect or design described is better or advantageous than other aspects or designs. It's not like that.

또한, '또는' 이라는 용어는 배타적 논리합 'exclusive or'이기보다는 포함적인 논리합 'inclusive or'를 의미한다. 즉, 달리 언급되지 않는 한 또는 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 'x가 a 또는 b를 이용한다'라는 표현은 포함적인 자연 순열들(natural inclusive permutations) 중 어느 하나를 의미한다.Additionally, the term 'or' means an inclusive OR 'inclusive or' rather than an exclusive OR 'exclusive or'. That is, unless otherwise stated or clear from the context, the expression 'x uses a or b' means any of the natural inclusive permutations.

또한, 본 명세서 및 청구항들에서 사용되는 단수 표현("a" 또는 "an")은, 달리 언급하지 않는 한 또는 단수 형태에 관한 것이라고 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 일반적으로 "하나 이상"을 의미하는 것으로 해석되어야 한다.Additionally, as used in this specification and claims, the singular expressions “a” or “an” generally mean “one or more,” unless otherwise indicated or it is clear from the context that the singular refers to singular forms. It should be interpreted as

아래 설명에서 사용되는 용어는, 연관되는 기술 분야에서 일반적이고 보편적인 것으로 선택되었으나, 기술의 발달 및/또는 변화, 관례, 기술자의 선호 등에 따라 다른 용어가 있을 수 있다. 따라서, 아래 설명에서 사용되는 용어는 기술적 사상을 한정하는 것으로 이해되어서는 안 되며, 실시예를 설명하기 위한 예시적 용어로 이해되어야 한다.The terms used in the description below have been selected as general and universal in the related technical field, but there may be different terms depending on technological developments and/or changes, customs, technicians' preferences, etc. Therefore, the terms used in the description below should not be understood as limiting the technical idea, but should be understood as illustrative terms for describing embodiments.

또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 설명 부분에서 상세한 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 아래 설명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가지는 의미와 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 이해되어야 한다.In addition, in certain cases, there are terms arbitrarily selected by the applicant, and in this case, the detailed meaning will be described in the relevant description. Therefore, the terms used in the description below should be understood based on the meaning of the term and the overall content of the specification, not just the name of the term.

한편, 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성 요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 구성 요소들은 용어들에 의하여 한정되지 않는다. 용어들은 하나의 구성 요소를 다른 구성 요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.Meanwhile, terms such as first and second may be used to describe various components, but the components are not limited by the terms. Terms are used only to distinguish one component from another.

또한, 막, 층, 영역, 구성 요청 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에" 있다고 할 때, 다른 부분의 바로 위에 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 막, 층, 영역, 구성 요소 등이 개재되어 있는 경우도 포함한다.Additionally, a part of an act, layer, area, component request, etc., is said to be "on" or "on" another part, not only when it is directly on top of the other part, but also when there are other acts, layers, areas, or components in between. Also includes cases where etc. are included.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in this specification may be used with meanings that can be commonly understood by those skilled in the art to which the present invention pertains. Additionally, terms defined in commonly used dictionaries are not interpreted ideally or excessively unless clearly specifically defined.

한편, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는, 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.Meanwhile, in describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description will be omitted. In addition, the terminology used in this specification is a term used to appropriately express the embodiments of the present invention, and may vary depending on the intention of the user or operator or the customs of the field to which the present invention belongs. Therefore, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법을 도시한 흐름도이다.1 is a flowchart showing a super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계, 배양된 세포를 고정(fixation)하는 단계, 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계, 형광표지된 세포를 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계, 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계 및 형광 신호를 필터링하는 단계를 포함한다.The super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention includes the steps of culturing cells on a cover glass, fixing the cultured cells, and labeling the fixed cells with a fluorescent substance. , including the step of supporting fluorescently labeled cells in an imaging buffer solution, measuring and imaging the fluorescence of the cells using a super-resolution fluorescence microscope, analyzing the fluorescence signal, and filtering the fluorescence signal.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 기존에 주로 쓰이던 레이저 세기의 12%에 해당하는 낮은 세기의 레이저 파워를 사용하여 고해상도를 구현할 수 있다.The super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention can achieve high resolution by using a low-intensity laser power equivalent to 12% of the laser intensity commonly used in the past.

이때의, 초고해상도 형광 현미경의 레이저 파워(Laser Power)는 6mW 내지 100mW일 수 있고, 레이저 파워가 6mW 이하이면 광 스위칭을 잘 하지 못하고, 100 mW를 초과하면 광 퇴색이 빨리 일어나며 살아있는 세포를 이미징 할 때에 시료를 손상 시키는 문제가 있다. 바람직하게는, 초고해상도 형광 현미경의 레이저 파워(Laser Power)는 6mW 내지 50mW일 수 있다.At this time, the laser power of the super-resolution fluorescence microscope can be 6mW to 100mW. If the laser power is less than 6mW, light switching is not good, and if it exceeds 100 mW, photobleaching occurs quickly and it is difficult to image living cells. There is a problem of damaging the sample at times. Preferably, the laser power of the super-resolution fluorescence microscope may be 6mW to 50mW.

또한, 초고해상도 형광 현미경은 레이저 파워에 따라, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM) 및 형광 세기가 조절될 수 있다.Additionally, in a super-resolution fluorescence microscope, the full width at half maximum (FWHM) and fluorescence intensity of the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance can be adjusted depending on the laser power.

단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full with at half maximum, FWHM)은 하나의 형광체가 프레임(frame) 별로 광 스위칭(photoswitching)되며 그 발광(emission)이 촬영될 때의 위치에 대한 분포를 의미한다. 즉, 높은 정확도(high precision)로 발광(emission)이 촬영되는 형광체의 경우에는 좁은 영역의 분포를 가져서 작은 반치폭(FWHM) 값을 가지나, 낮은 정확도(low precision)를 갖는 형광체의 경우에는 넓은 영역에 퍼져서 이미지됨으로써, 그 분포 영역이 넓어져서 큰 반치폭(FWHM) 값을 가질 수 있다.The full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor is the position of a single phosphor when photoswitching and its emission is imaged frame by frame. It means distribution. That is, in the case of phosphors whose emission is captured with high precision, they are distributed over a narrow area and have a small full width at half maximum (FWHM) value, but in the case of phosphors with low precision, they are distributed over a wide area. By being spread out and imaged, the distribution area can be expanded and have a large full width at half maximum (FWHM) value.

따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)이 감소됨에 따라 해상도가 향상될 수 있다. 즉, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치는 해상도의 기준을 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)으로 결정할 수 있다.Therefore, the resolution of the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention can be improved as the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance is reduced. In other words, the ultra-high-resolution fluorescence microscope imaging device can determine the resolution standard as the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance.

또한, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치(예; STORM)에서 하나의 형광체가 카메라에 이미징될 때의 형광 세기(Brightness, 광자수(photon number)를 의미함)는 그 형광체의 위치에 대한 정확도(precision)를 결정할 수 있다.In addition, in a super-resolution fluorescence microscope imaging device (e.g. STORM), the fluorescence intensity (brightness, meaning photon number) when one phosphor is imaged by the camera is determined by the precision of the location of the phosphor. can be decided.

즉, 밝은 형광체(brightness 가 높을수록)의 경우에는 높은 세기의 선명한 점상 확산 함수(Point spread function, PSF)를 만듦으로써 그 위치(centroid)가 매우 높은 정확도(high precision)로 결정될 수 있는 반면에 어두운 형광체(brightness가 낮을수록)의 경우에는 점상 확산 함수가 선명하지 않게 만들어지면서 그 위치(centroid)가 낮은 정확도(low precision)로 불확실하게 결정될 수 있다.That is, in the case of bright phosphors (the higher the brightness), the centroid can be determined with very high precision by creating a clear point spread function (PSF) of high intensity, whereas for dark phosphors, the centroid can be determined with very high precision. In the case of phosphors (lower brightness), the point diffusion function becomes unclear and the location (centroid) can be determined uncertainly with low precision.

이론적으로 이러한 정위 에러(localization error)의 정도는 에 반비례하기 때문에, 형광 세기(brightness)가 높을수록 높은 정확도(small error)로 위치를 잡을 수 있어 해상도가 증가될 수 있다.Theoretically, the degree of this localization error is Since it is inversely proportional to , the higher the fluorescence intensity (brightness), the higher the position can be located with high accuracy (small error), and the resolution can be increased.

먼저, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 커버 글라스(cover glass)에 세포를 배양하는 단계 및 배양된 세포를 고정(fixation)하는 단계를 진행한다.First, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention involves culturing cells on a cover glass and fixing the cultured cells.

세포는 세포, 세포 유형, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 다당류, 무코다당류, 프로테오글리칸, 지질, 미생물, 바이러스 및 분자 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있고, 바람직하게는, 단백질일 수 있다.The cell may include at least one of cells, cell types, polynucleotides, proteins, polysaccharides, mucopolysaccharides, proteoglycans, lipids, microorganisms, viruses, and molecules, and preferably may be proteins.

세포의 배양 방법 및 고정 방법으로는 당분야에 사용되는 다양한 방법이 제한없이 사용될 수 있다.As a method of culturing and fixing cells, various methods used in the art can be used without limitation.

이 후, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 고정된 세포에 형광체를 표지(marker)하는 단계를 진행한다.Afterwards, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention proceeds with the step of labeling the fixed cells with a fluorescent substance.

고정된 세포는 원하는 타겟에 형광체를 표지하고, 형광체를 표지하는 방법은 당분야에서 알려져 있는 다양한 항체염색(immunolabeling) 방법이 사용될 수 있으며, 항체염색(immunolabeling) 방법은 permeabilization 단계, blocking 단계 및 antibody labeling 단계를 포함할 수 있다.The fixed cells are labeled with a fluorescent substance on the desired target, and various antibody staining (immunolabeling) methods known in the art can be used to label the fluorescent substance. The antibody staining (immunolabeling) method includes a permeabilization step, a blocking step, and an antibody labeling step. May include steps.

형광표지는 시아닌계 염료(cyanine series) 아토계 염료(atto series), 플루오레세인계 염료(fluorescein seires), 로다민계 염료(rhodamine series), BODIPY계 염료 및 폴피린계 염료(phorphyrin series) 중 적어도 어느 하나의 염료로 표지될 수 있다.The fluorescent label is at least one of cyanine series, atto series, fluorescein series, rhodamine series, BODIPY series, and phorphyrin series. Can be labeled with a single dye.

이 후, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 형광표지된 세포를 이미징 버퍼 용액에 담지하는 단계를 진행한다.Afterwards, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention proceeds with the step of supporting fluorescently labeled cells in an imaging buffer solution.

이미징 버퍼 용액은 Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액, 싸이올(thiol) 화합물 및 탈산소제(oxygen scavenger) 시스템을 포함할 수 있다.The imaging buffer solution may include a Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) solution, a thiol compound, and an oxygen scavenger system.

바람직하게는, 싸이올(thiol) 화합물은 MEA (2-mercaptoethylamine) 및 ME(beta-mercaptoethanol) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.Preferably, the thiol compound is MEA (2-mercaptoethylamine) and It may contain at least one of ME (beta-mercaptoethanol).

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 12mW 레이저 파워에서, 평형에 이르는 광 스위칭 속도가 이미징 버퍼 용액의 농도에 따라 달라지면서 반치폭이 조절되고 pH에 따라 탈양성자화 되는 정도가 달라지면서 형광 세기 및 반치폭이 조절되어 해상도가 조절될 수 있다.In the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention, at 12 mW laser power, the optical switching speed reaching equilibrium varies depending on the concentration of the imaging buffer solution, the half width is adjusted, and the degree of deprotonation varies depending on pH. The resolution can be adjusted by adjusting the fluorescence intensity and half width.

광 스위칭 현상이라 함은 형광 염료가 형광을 낼 수 있는 온-상태(on-state)와 형광을 낼 수 없는 오프-상태(off-state)를 리버서블(reversible)하게 왔다갔다 할 수 있는 현상을 의미한다.The optical switching phenomenon refers to a phenomenon in which a fluorescent dye can reversibly go back and forth between the on-state, where it can emit fluorescence, and the off-state, where it cannot emit fluorescence. it means.

이 때에 이미징 버퍼 용액의 농도와 pH가 형광 염료의 온-상태(on-state)에서 오프-상태(off-state)로 변하는 과정에 영향을 줄 수 있기 때문에 두 상태(state) 간의 population 이 조절될 수 있고, 이에 따라 광 스위칭 속도가 조절될 수 있다. 뿐만 아니라 일반적으로 형광 염료는 주변 버퍼 용액 상태에 따라 그 형광 세기가 민감하게 변할 수 있기 때문에, 이로 인해 다양한 이미징 버퍼 용액 조건에서 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭 (FWHM)이 조절될 수 있다. At this time, the concentration and pH of the imaging buffer solution can affect the process of changing from the on-state to the off-state of the fluorescent dye, so the population between the two states can be adjusted. and the optical switching speed can be adjusted accordingly. In addition, since the fluorescence intensity of fluorescent dyes can generally change sensitively depending on the surrounding buffer solution condition, the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorophore can be adjusted under various imaging buffer solution conditions. You can.

이미징 버퍼 용액에서 싸이올(thiol) 화합물의 농도는 5 mM 내지 200 mM 일 수 있고, 싸이올(thiol) 화합물의 농도가 5 mM 미만이면 광 스위칭 속도가 너무 저하되는 문제가 있고, 200 mM를 초과하면 형광 세기가 감소하는 문제가 있다.The concentration of the thiol compound in the imaging buffer solution may be 5 to 200 mM. If the concentration of the thiol compound is less than 5 mM, there is a problem that the light switching speed is too low, and if the concentration of the thiol compound is less than 5 mM, the light switching speed is too low. There is a problem that the fluorescence intensity decreases.

바람직하게는, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 이미징 버퍼 용액에 20mM의 MEA를 포함할 수 있고, 이로 인해 형광 세기는 1.8배, 해상도는 1.26배 증가될 수 있다.Preferably, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention may include 20mM MEA in the imaging buffer solution, which can increase the fluorescence intensity by 1.8 times and the resolution by 1.26 times.

이미징 버퍼 용액의 pH는 7.0 내지 9.0 일 수 있고, 이미징 버퍼 용액의 pH가 7.0 미만이면 광 스위칭 속도가 저하하는 문제가 있으며 살아있는 세포에 적용 시키기 어려운 문제가 있고, 9.0을 초과하면 살아있는 세포의 이미징에 적용할 수 없는 문제가 있다.The pH of the imaging buffer solution may be from 7.0 to 9.0. If the pH of the imaging buffer solution is less than 7.0, there is a problem that the optical switching speed decreases and it is difficult to apply it to living cells, and if the pH of the imaging buffer solution exceeds 9.0, it is difficult to use for imaging of living cells. There is a problem that cannot be applied.

바람직하게는, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 이미징 버퍼 용액에 pH 9.0의 MEA를 포함하여 pH 9.0의 pH를 가질 수 있고, 이 때의 MEA의 농도는 100mM일 수 있으며, 이로 인해, 형광 세기는 1.7배, 해상도는 1.05배 증가될 수 있다.Preferably, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention may include MEA of pH 9.0 in the imaging buffer solution and have a pH of 9.0, and the concentration of MEA at this time may be 100mM, Because of this, the fluorescence intensity can be increased by 1.7 times and the resolution can be increased by 1.05 times.

따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 이미징 버퍼 용액의 농도 또는 pH를 조절함으로써, 6mW 내지 50mW의 낮은 세기의 레이저 파워 조건하에서도 유기 형광체에 빠르고 강하게 광 스위칭이 일어나, 초고해상도 이미지 촬영이 가능하다.Therefore, in the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention, light switching occurs quickly and strongly in the organic phosphor even under low-intensity laser power conditions of 6 mW to 50 mW by adjusting the concentration or pH of the imaging buffer solution, High-resolution image shooting is possible.

Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) 용액은 이미징 버퍼 용액에서 pH 버퍼로 사용될 수 있고, 바람직하게는 높은 레이저 세기 조건에서는 Tris-HCl 8.0 버퍼 용액(buffer solution)을 사용할 수 있고, 낮은 레이저 세기 조건에서는 Tris-HCl 7.0 또는 Tris-HCl 9.0 버퍼 용액(buffer solution)이 사용될 수 있다. Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) solution can be used as a pH buffer in the imaging buffer solution, and preferably, Tris-HCl 8.0 buffer solution can be used under high laser intensity conditions. And under low laser intensity conditions, Tris-HCl 7.0 or Tris-HCl 9.0 buffer solution can be used.

탈산소제(oxygen scavenger) 시스템은 산소로 인한 형광 시료의 형광 세기의 감소를 억제하는 효과를 가지며, 글루코스 산화효소(glucose oxidase), 글루코스(glucose) 및 과산화수소분해효소(catalase)를 포함할 수 있다. The oxygen scavenger system has the effect of suppressing the decrease in fluorescence intensity of the fluorescent sample due to oxygen, and may include glucose oxidase, glucose, and catalase.

이 후, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경을 이용하여 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 단계를 진행한다. Afterwards, the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention proceeds with the steps of measuring and imaging the fluorescence of cells using a super-resolution fluorescence microscope and analyzing the fluorescence signal.

바람직하게는, 형광 분자로부터 나온 형광은 EM-CCD 또는 sCMOS 카메라 센서를 통해 검출되고 픽셀 별로 읽혀지는 형광 세기를 기반으로 이미지를 얻을 수 있다.Preferably, fluorescence from fluorescent molecules is detected through an EM-CCD or sCMOS camera sensor, and an image can be obtained based on the fluorescence intensity read for each pixel.

이 때에 백그라운드 형광세기에 대해 한계 값을 설정하면, 각 프레임(frame)에서 한계 값 이상의 시그널에 대해 점 퍼짐 함수(PSF: Point Spread Function)를 인식하고, 각 점 퍼짐 함수의 형광세기에 알맞은 2차원 가우시안 곡선(curve)으로 고정(fitting) 함으로써 점 퍼짐 상수의 중심(centroid)을 단일 분자의 위치로써 정할 수 있다.At this time, if a threshold value is set for the background fluorescence intensity, a point spread function (PSF) is recognized for signals above the threshold value in each frame, and a two-dimensional function appropriate for the fluorescence intensity of each point spread function is generated. By fitting a Gaussian curve, the centroid of the point spreading constant can be determined as the position of a single molecule.

각 프레임별로 얻은 중심(centroid) 들을 모두 모으고, 시간에 따른 이동(drift)에 대해 보정함으로써 최종적인 STORM 이미지를 복원(reconstruction)할 수 있다. The final STORM image can be reconstructed by collecting all centroids obtained for each frame and correcting for drift over time.

초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), STED(Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM(PhotoActivation Localization Microscopy) 및 SIM(Structured Illumination Microscopy) 중 어느 하나일 수 있으나, 바람직하게는, STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.The super-resolution fluorescence microscope may be any one of STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy), STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy), PALM (PhotoActivation Localization Microscopy), and SIM (Structured Illumination Microscopy), but is preferably STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy). Microscopy).

마지막으로, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 형광 신호를 필터링하는 단계를 진행한다.Finally, the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention proceeds with the step of filtering the fluorescence signal.

초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 낮은 세기의 레이저 파워에서 이미징을 수행하는 경우, 광 스위칭이 잘 일어나지 않고 형광체의 밝기가 낮아 잘못된 형광 신호(localization)가 발생할 수 있으며, 이러한, 시그널 오류는 점상 확산 함수(Point spread function, PSF)가 2차원 가우시안 함수로 잘 고정(fitting)되지 않아 백그라운드 신호로 분류되기 때문에 발생할 수 있다.In the super-resolution fluorescence microscopy imaging method, when imaging is performed at a low intensity laser power, optical switching does not occur easily and the brightness of the fluorophore is low, which may result in incorrect fluorescence signals (localization), and these signal errors are caused by the point spread function ( This can occur because the Point spread function (PSF) is not well fitted with a two-dimensional Gaussian function and is therefore classified as a background signal.

백그라운드 신호(Background signal)는 형광체의 형광 방출이 없는 상태에서 가까운 프레임(frame) 간의 픽셀 신호 강도(pixel signal intensity)의 평균(average) 값이며, 식별(identified)된 각 로컬라이징(localization) 당 백그라운드(background) 값이 주어질 수 있다.The background signal is the average value of the pixel signal intensity between adjacent frames in the absence of fluorescence emission from the phosphor, and is the background ( background) value can be given.

따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 일정 세기 이상의 백그라운드 신호를 제거함으로써, 느린 광스위칭 현상을 나타내는 잘못된 백그라운드 신호를 제거하고, localization precision을 향상시킬 수 있다.Therefore, the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention can remove background signals of a certain intensity or more, thereby removing erroneous background signals indicating a slow optical switching phenomenon and improving localization precision.

바람직하게는, 필터링은 EM-CCD 카메라 센서에서 감지되는 800(A.U.) 내지 2000(A.U.) 의 백그라운드 신호를 제거하여 필터링을 진행함으로써, 겹쳐져 발광하여 잘못 배치(assign)되었던 시그널 오류를 제거하여 초고해상도 이미지의 질을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 값은 백그라운드 히스토그램(BG histogram)에서의 녹색 채널(green channel)에 대한 범위일 수 있다.Preferably, the filtering is performed by removing the background signal of 800 (A.U.) to 2000 (A.U.) detected by the EM-CCD camera sensor, thereby removing signal errors that were incorrectly assigned due to overlapping light emission, resulting in ultra-high resolution The quality of the image can be improved. For example, the value may be the range for the green channel in the background histogram (BG histogram).

각 로컬라이징(localization)에 대해 백그라운드 값에 대한 분포를 그려보았을 때, 높은 백그라운드와 낮은 백그라운드의 두 곡선(curve)으로 크게 나뉘며, 이 때 높은 백그라운드에 해당하는 로컬라이징(localization)을 시그널 오류로 판단하여 이들을 제거할 수 있다. When the distribution of background values for each localization is drawn, it is largely divided into two curves: high background and low background. At this time, the localization corresponding to the high background is judged to be a signal error, and the localization corresponding to the high background is judged to be a signal error. It can be removed.

실시예에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 초고해상도 형광 현미경 기술(STORM) 뿐만 아니라 다양한 형광 이미징 또는 분석에 적용함으로써, 레이저 파워에 빠르게 광퇴색되는 형광체들을 사용하여 문제가 되었던 모든 형광 분석에 적용이 가능하다.Depending on the embodiment, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to the embodiment of the present invention is applied not only to super-resolution fluorescence microscopy technology (STORM) but also to various fluorescence imaging or analysis, using phosphors that quickly photobleach with laser power. It can be applied to all fluorescence analyses.

높은 세기의 레이저(예; 100mW)를 이용하여 바이오 시료를 이미징하는 경우, 바이오 시료는 높은 세기의 레이저에 의해 구조가 파괴될 수 있으나, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 낮은 세기의 레이저를 사용하여 이미징하므로, 바이오 시료의 구조 파괴 없이 고해상도의 이미징이 가능하고, 나아가, 생세포 이미징(live cell imaging)이 가능하다.When imaging a bio sample using a high-intensity laser (e.g., 100 mW), the structure of the bio sample may be destroyed by the high-intensity laser, but the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention has low Since imaging is performed using a high-intensity laser, high-resolution imaging is possible without destroying the structure of the bio sample, and furthermore, live cell imaging is possible.

또한, 높은 세기의 레이저(예; 100mW)를 이용한 형광 현미경 장치의 경우, 고가의 초고해상도 형광 현미경 셋업 비용이 요구되나, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 낮은 세기의 레이저를 사용하여 제조 비용을 감소시킬 수 있다.In addition, in the case of a fluorescence microscope device using a high-intensity laser (e.g., 100 mW), an expensive super-resolution fluorescence microscope setup cost is required, but the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention uses a low-intensity laser. Manufacturing costs can be reduced by using

또한, 높은 세기의 레이저(예; 100mW)를 이용한 형광 현미경 장치의 경우, 광퇴색이 빨리 일어나 이미징할 수 있는 시간이 짧으나, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 낮은 세기의 레이저를 사용하여 광퇴색이 느리게 일어나 이미징할 수 있는 이미징 시간을 증가시킬 수 있다.In addition, in the case of a fluorescence microscope device using a high-intensity laser (e.g., 100 mW), photobleaching occurs quickly and the imaging time is short. However, the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention uses a low-intensity laser. By using , photobleaching occurs slowly and the imaging time that can be imaged can be increased.

이미징 시간은 미세소관처럼 높은 밀도의 구조를 이미징할 경우, 60Hz 기준 10분 내지 15분일 수 있고, 이미징 시간이 10분 미만이면 좋은 퀄리티의 이미지를 얻지 못하는 문제(혹은 localization 수가 낮아져 타겟의 형태를 불명확하게 관찰하게 되는 문제)가 있고, 30분을 초과하면 광 퇴색이 일어나는 문제가 있다.Imaging time can be 10 to 15 minutes at 60Hz when imaging high-density structures such as microtubules. If the imaging time is less than 10 minutes, there may be problems of not obtaining good quality images (or the shape of the target may be unclear due to low localization number). There is a problem of photo fading occurring if the time exceeds 30 minutes.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 이미징 버퍼 용액에 담지된 형광표지된 세포가 배치되는 플레이트, 형광표지된 세포에 레이저를 조사하는 광원부 및 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 검출기를 포함한다.A super-resolution fluorescence microscope device according to an embodiment of the present invention includes a plate on which fluorescently labeled cells supported in an imaging buffer solution are placed, a light source unit that irradiates a laser to the fluorescently labeled cells, measures the fluorescence of the cells, and images the fluorescent signal. Includes a detector that analyzes

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 이미징 방법과 동일한 구성 요소를 포함하고 있으므로, 동일한 구성요소에 대해서는 생략하기로 한다.Since the super-resolution fluorescence microscope device according to an embodiment of the present invention includes the same components as the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention, the same components will be omitted.

바람직하게는, 초고해상도 형광 현미경은 STORM(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)일 수 있다.Preferably, the super-resolution fluorescence microscope may be Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 이미징 버퍼 용액에 담지된 형광표지된 세포가 배치되는 플레이트를 포함한다.A super-resolution fluorescence microscopy device according to an embodiment of the present invention includes a plate on which fluorescently labeled cells supported in an imaging buffer solution are placed.

플레이트에는 이미징 버퍼 용액에 담지된 형광표지된 세포가 배치될 수 있다.Fluorescently labeled cells supported in an imaging buffer solution may be placed on the plate.

이미징 버퍼 용액에서 싸이올(thiol) 화합물의 농도는 5 mM 내지 200 mM 일 수 있고, 이미징 버퍼 용액의 pH는 7.0 내지 9.0 일 수 있다. The concentration of the thiol compound in the imaging buffer solution may be 5mM to 200mM, and the pH of the imaging buffer solution may be 7.0 to 9.0.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 형광표지된 세포에 레이저를 조사하는 광원부를 포함한다.A super-resolution fluorescence microscope device according to an embodiment of the present invention includes a light source unit that irradiates a laser to fluorescently labeled cells.

광원부에서 광원에서 방사되는 광은 형광표지된 세포에 도달하여 형광염색체를 여기 시킨 후, 초고해상도 형광 현미경의 렌즈에서 집광되어 상이 확대 및 필터링될 수 있다.The light emitted from the light source reaches the fluorescently labeled cells, excites the fluorescent chromosomes, and is then focused on the lens of a super-resolution fluorescence microscope, where the image can be magnified and filtered.

이때, 광원부의 레이저 파워는 6mW 내지 50mW이다.At this time, the laser power of the light source unit is 6mW to 50mW.

본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 현광 현미경 장치는 세포의 형광을 측정하여 이미징하고, 형광 신호를 분석하는 검출기를 포함한다.A super-resolution fluorescence microscope device according to an embodiment of the present invention includes a detector that measures and images the fluorescence of cells and analyzes the fluorescence signal.

검출기는 입사 레이저에 의하여 방출되는 형광체의 신호를 분석하고, 가우시안 점상 강도 분포함수를 이용하여 입사 레이저에 의하여 방출되는 형광체 신호를 분석하여 형광체의 위치정보를 획득할 수 있다.The detector analyzes the signal of the phosphor emitted by the incident laser and can obtain location information of the phosphor by analyzing the phosphor signal emitted by the incident laser using a Gaussian point intensity distribution function.

검출기는 형광 신호를 필터링하고, 필터링은 EM-CCD 카메라 센서에서 감지되는 800(A.U.) 내지 2000(A.U.) 의 백그라운드 신호를 제거할 수 있다.The detector filters the fluorescence signal, and the filtering can remove the background signal of 800 (A.U.) to 2000 (A.U.) detected by the EM-CCD camera sensor.

초고해상도 형광 현미경의 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)는 24nm 내지 50.00nm일 수 있다.The full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance in a super-resolution fluorescence microscope may be 24 nm to 50.00 nm.

실험예 1: 이미징 버퍼 용액의 제조Experimental Example 1: Preparation of imaging buffer solution

[비교예 1]: 100mM+ pH 8.0[Comparative Example 1]: 100mM+ pH 8.0

pH 8.0 MEA 100mM 기반 이미징 버퍼 용액의 경우, 먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, MEA 100mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다. For pH 8.0 MEA 100mM based imaging buffer solution, first mix 7.81mM of glucose oxidase, 5% glucose (w/v) and 0.16mM of catalase as an oxygen scavenger system in 50mM of Tris 8.0 buffer solution, then add 100mM of MEA and store at room temperature (21). Mix well at ℃).

[실시예 1]: 20mM+ pH 9.0[Example 1]: 20mM+ pH 9.0

pH 9.0 MEA 20mM 기반 이미징 버퍼 용액의 경우, 먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, MEA 20mM을 가하고 NaOH 로 pH 를 9.0 으로 맞춰준 후 상온(21℃)에서 잘 섞어준다. In the case of pH 9.0 MEA 20mM based imaging buffer solution, first mix 7.81mM of glucose oxidase, 5% glucose (w/v) and 0.16mM of catalase as an oxygen scavenger system in 50mM of Tris 8.0 buffer solution, then add 20mM of MEA and adjust the pH with NaOH. Set it to 9.0 and mix well at room temperature (21℃).

[실시예 2]: 20mM[Example 2]: 20mM

[예시]pH 8.0 MEA 20mM 기반 이미징 버퍼 용액의 경우, 먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, MEA 20mM을 가하여 상온(21℃)에서 잘 섞어준다. [Example] In the case of pH 8.0 MEA 20mM based imaging buffer solution, first mix 7.81mM of glucose oxidase, 5% glucose (w/v) and 0.16mM of catalase as an oxygen scavenger system in 50mM of Tris 8.0 buffer solution, then add 20mM of MEA. Mix well at room temperature (21℃).

[실시예 3]: pH 9.0 + 100mM[Example 3]: pH 9.0 + 100mM

[예시]pH 9.0 MEA 100mM 기반 이미징 버퍼 용액의 경우, 먼저 Tris 8.0 버퍼 용액 50mM 에 oxygen scavenger 시스템으로서 glucose oxidase 7.81 mM, 5% glucose (w/v)와 catalase 0.16 mM을 섞은 다음, MEA 100mM을 가하고 NaOH 로 pH 를 9.0 으로 맞춰준 후 상온(21℃)에서 잘 섞어준다. [Example] In the case of pH 9.0 MEA 100mM based imaging buffer solution, first mix 7.81mM of glucose oxidase, 5% glucose (w/v) and 0.16mM of catalase as an oxygen scavenger system in 50mM of Tris 8.0 buffer solution, then add 100mM of MEA. Adjust the pH to 9.0 with NaOH and mix well at room temperature (21°C).

실험예 2: 초고해상도 STORM 촬영Experimental Example 2: Ultra-high resolution STORM shooting

세포주는 COS-7 세포주로 세포주들의 배양용액은 둘베코 개질 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)에 10% 소 태아 혈청 (fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)을 넣어 사용하고 세포는 95% 공기/5% CO2의 습한 조건의 배양기에서 온도 36.5 ℃에서 배양하였다. 배양용액은 3 ~ 4일에 한번씩 교체하고 세포는 일주일마다 분주해 주었다.The cell line is the COS-7 cell line. The culture solution for the cell lines was Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin (v/v). The cells were cultured at a temperature of 36.5°C in an incubator under humid conditions of 95% air/5% CO2. The culture solution was changed once every 3 to 4 days, and cells were dispensed every week.

3% 파라폼알데하이드(PFA) + 0.1% 글루타르알데하이드(GA)로 세포를 고정해주고, 일반적인 면역형광법을 통하여 이미징할 타겟에 형광을 표지한다.Cells are fixed with 3% paraformaldehyde (PFA) + 0.1% glutaraldehyde (GA), and the target to be imaged is labeled with fluorescence using a general immunofluorescence method.

STORM 촬영 전 형광을 표지한 세포에 이미징 버퍼를 넣는다. 그리고 6mW 내지 100mW 의 레이저를 이용하여 형광을 발하게 한다.Before STORM imaging, imaging buffer is added to the fluorescently labeled cells. Then, a 6mW to 100mW laser is used to emit fluorescence.

마지막으로, 타겟으로부터 발하는 형광은 전하 증폭 전하 결합 소자 센서(Electron multiplying Charge-Coupled Device, EMCCD) 를 통해 이미징한다.Finally, the fluorescence emitted from the target is imaged through a charge-multiplying charge-coupled device (EMCCD) sensor.

도 2a 내지 도 2f는 레이저 세기(laser power)를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지 및 형광 세기 그래프이고, 도 3은 도 2a 내지 도 2f에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 4는 도 2a 내지 도 2f에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.FIGS. 2A to 2F are super-resolution STORM images and fluorescence intensity graphs of intracellular microtubules taken at different laser powers, and FIG. 3 shows fluorescence intensity (brightness; mean photon number) according to FIGS. 2A to 2F. ), and FIG. 4 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor according to FIGS. 2A to 2F.

표 1은 도 2a 내지 도 2f 및 도 3에 대한 결과값을 도시한 표이다.Table 1 is a table showing the results for FIGS. 2A to 2F and FIG. 3.

[표 1][Table 1]

도 2a 내지 도 2f, 도 4 및 표 1을 참조하면, 레이저 파워(laser power)가 감소됨에 따라, 100mW의 MEA를 포함하는 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 초고해상도 STORM 대비 반치폭이 증가되는 것으로 보아 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 2A to 2F, FIG. 4, and Table 1, as the laser power decreases, the full width at half maximum appears to increase compared to the ultra-high resolution STORM imaged using an imaging buffer solution containing 100 mW of MEA. It can be seen that the resolution is improved.

그러나, 레이저 파워가 감소됨에 따라, 형광 세기가 감소되기 때문에 레이저 파워 값에 따라 형광 세기 및 반치폭을 조절하여 해상도를 제어할 수 있다.However, as the laser power decreases, the fluorescence intensity decreases, so the resolution can be controlled by adjusting the fluorescence intensity and half width according to the laser power value.

바람직하게는, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 12mW의 레이저 파워를 인가할 수 있고, 이는 다양한 레이저 강도(laser intensity)에서의 시간(time trace) vs 강도(intensity)를 통하여 이미징 버퍼 용액의 조성을 바꿈으로써 해상도의 질이 향상될 수 있기 때문이다.Preferably, the super-resolution fluorescence microscopy imaging method according to an embodiment of the present invention can apply a laser power of 12 mW, which is obtained through time trace vs. intensity at various laser intensities. This is because the quality of resolution can be improved by changing the composition of the imaging buffer solution.

만약, 레이저 파워가 9mW 또는 6mW인 경우에는 시간(time trace) vs 강도(intensity) 그래프(도2 내지 도 4)에서 볼 수 있듯이 광 스위칭 특성(photoswitching property)이 12mW 보다는 다소 감소될 수 있다.If the laser power is 9mW or 6mW, the photoswitching property may be somewhat reduced than 12mW, as can be seen in the time trace vs. intensity graph (FIGS. 2 to 4).

그러나, 이 때, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 9mW 또는 6mW 의 레이저 파워에 최적화되록 이미징 버퍼 용액의 농도 및 pH를 조절하여 해상도 및 광 스위칭 특성을 향상시킬 수 있다.However, at this time, the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention can improve resolution and optical switching characteristics by adjusting the concentration and pH of the imaging buffer solution to optimize the laser power of 9 mW or 6 mW.

도 5는 싸이올(thiol) 화합물의 농도(MEA의 농도에 대응)를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이고, 도 6은 도 5에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 7은 도 5에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.Figure 5 shows super-resolution STORM images of intracellular microtubules taken at different concentrations of thiol compounds (corresponding to the concentration of MEA), and Figure 6 shows the fluorescence intensity (brightness; mean) according to Figure 5. It is a graph showing the photon number, and FIG. 7 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor according to FIG. 5.

표 2는 도 6 및 도 7에 대한 결과값을 도시한 표이다.Table 2 is a table showing the results for FIGS. 6 and 7.

[표 2][Table 2]

도 5 내지 도 7 및 표 2를 참조하면, 이미징 버퍼 용액에 포함되는 MEA의 농도가 감소됨에 따라 20mM 까지는 형광 세기는 증가되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)은 감소되어 광 스위칭 특성 및 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 5 to 7 and Table 2, as the concentration of MEA included in the imaging buffer solution decreases, the fluorescence intensity increases up to 20mM, and the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance decreases. It can be seen that optical switching characteristics and resolution are improved.

특히, 종래에 사용되는 MEA 농도인 100mM에 비해 20mM을 사용하는 본 발명의 경우, 낮은 세기의 레이저를 사용하여도 형광 세기가 증가되고, 반치폭이 감소되어 광 스위칭 특성 및 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.In particular, in the case of the present invention using a MEA concentration of 20mM compared to the conventionally used MEA concentration of 100mM, it can be seen that the fluorescence intensity is increased and the half width is reduced even when a low intensity laser is used, thereby improving optical switching characteristics and resolution. there is.

도 8은 이미징 버퍼 용액의 pH를 달리하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이고, 도 9는 도 8에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이며, 도 10은 도 8에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.Figure 8 shows super-resolution STORM images of intracellular microtubules taken at different pH of imaging buffer solutions, and Figure 9 is a graph showing the fluorescence intensity (brightness; mean photon number) according to Figure 8. 10 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor according to FIG. 8.

표 3은 도 9 및 도 10에 대한 결과값을 도시한 표이다.Table 3 is a table showing the results for FIGS. 9 and 10.

[표 3][Table 3]

도 8 내지 도 10 및 표 3을 참조하면, 기존에 쓰이던 pH8.0을 기준으로 이미징 버퍼 용액의 pH가 증가 또는 감소됨에 따라 형광 세기는 증가되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)은 감소되어 광 스위칭 특성 및 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 8 to 10 and Table 3, as the pH of the imaging buffer solution increases or decreases based on the previously used pH 8.0, the fluorescence intensity increases, and the half width for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorophore It can be seen that (FWHM) is reduced and optical switching characteristics and resolution are improved.

특히, pH7 및 pH 9의 이미징 버퍼 용액을 사용하는 경우, 형광 세기가 월등히 향상되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭이 감소되어 광 스위칭 특성 및 해상도가 매우 향상되는 것을 알 수 있다.In particular, when using imaging buffer solutions of pH 7 and pH 9, the fluorescence intensity is significantly improved, and the half width for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorophore is reduced, greatly improving optical switching characteristics and resolution. .

도 11은 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지 및 실시예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지를 도시한 것이며, 도 12는 도 11에 따른 형광 세기(Brightness; mean photon number)를 도시한 그래프이고, 도 13은 도 11에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(full width at half maximum, FWHM)을 도시한 그래프이다.11 shows a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 and a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 1. 12 is a graph showing the fluorescence intensity (mean photon number) according to FIG. 11, and FIG. 13 is a graph showing the full width at half maximum for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor according to FIG. 11. , FWHM).

표 4는 도 12 및 도 13에 대한 결과값을 도시한 표이다.Table 4 is a table showing the results for FIGS. 12 and 13.

[표 4][Table 4]

본 발명의 MEA 농도 범위 및 pH 범위(실시예 1: pH 9.0+ 20mM MEA)에서는 낮은 세기의 레이저 파워를 사용하여 초고해상도 STORM를 촬영하는 경우, 형광 세기가 향상되나, 높은 세기의 레이저 파워(100mW)에서 초고해상도 STORM를 촬영하는 경우, 도 11 내지 도 13 및 표 4에서와 같이 형광 세기가 감소되는 것을 알 수 있다.In the MEA concentration range and pH range of the present invention (Example 1: pH 9.0 + 20mM MEA), the fluorescence intensity is improved when imaging ultra-high resolution STORM using low intensity laser power, but high intensity laser power (100mW) ), it can be seen that the fluorescence intensity decreases as shown in Figures 11 to 13 and Table 4 when taking super-resolution STORM.

즉, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)은 레이저 파워에 따라 조절될 수 있기에, 밝은 형광 세기를 얻을 수 있는 최적의 조건(농도 및 pH)은 약한 레이저(12mW)와 높은 레이저(100 mW)에서 상이할 수 있다.In other words, since the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorophore can be adjusted depending on the laser power, the optimal conditions (concentration and pH) to obtain bright fluorescence intensity are a weak laser (12 mW) and a high laser power. May be different for laser (100 mW).

도 14는 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 15는 높은 세기의 레이저 파워(100mW)에서 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이다.Figure 14 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 15 is a first image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 at high intensity laser power (100 mW). This is a high-resolution STORM image.

도 14 및 도 15를 참조하면, 일반 형광 이미징 방법보다는 초고해상도 STORM 이미징 방법으로 촬영하였을 때, 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 14 and 15, it can be seen that the resolution is improved when imaging is performed using the super-resolution STORM imaging method rather than the general fluorescence imaging method.

도 16은 도 15에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)을 도시한 그래프이고, 도 17은 도 15에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.FIG. 16 is a graph showing the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor according to FIG. 15, and FIG. 17 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 15.

도 16에서 도시한 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM) 프로파일은 하나의 형광체가 프레임(frame) 별로 광 스위칭(photoswitching)되며 그 발광(emission)이 촬영될 때의 위치에 대한 분포를 도시한 것으로, 높은 정확도(high precision)로 발광(emission)이 촬영되는 형광체의 경우에는 좁은 영역의 분포를 가져서 작은 반치폭(FWHM) 값을 가지나, 낮은 정확도(low precision)를 갖는 형광체의 경우에는 넓은 영역에 퍼져서 이미지됨으로써, 그 분포 영역이 넓어져서 큰 반치폭(FWHM) 값을 가질 수 있다.The full width at half maximum (FWHM) profile for the imaging position (centroid) distribution of a single phosphor shown in Figure 16 shows the position when a single phosphor is photoswitched for each frame and its emission is imaged. This shows the distribution. In the case of a phosphor whose emission is captured with high precision, it has a distribution in a narrow area and has a small full width at half maximum (FWHM) value, but in the case of a phosphor with low precision, it has a small FWHM value. As the image is spread over a wide area, the distribution area is expanded and the image can have a large full width at half maximum (FWHM) value.

따라서, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광 현미경 이미징 방법은 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)이 감소됨에 따라 해상도가 향상되기에, 초고해상도 형광 현미경 이미징 장치는 해상도의 기준을 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)으로 결정할 수 있다. 즉, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭(FWHM)은 해상도에 대응될 수 있다.Therefore, in the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention, the resolution is improved as the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance is reduced, so the super-resolution fluorescence microscope imaging device has a high resolution. The standard can be determined by the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorophore. That is, the full width at half maximum (FWHM) for the distribution of the imaging position (centroid) of a single phosphor may correspond to the resolution.

도 17에서 도시한 강도 프로파일(Intensity profile, time trace)은 광 스위칭 현상을 보여주기 위한 데이터로서, 각 형광체가 위치한 픽셀(pixels) 공간에서 신호 강도(signal intensity)의 변화를 프레임(frame) 당 나타낸 데이터이다.The intensity profile (time trace) shown in FIG. 17 is data to show the light switching phenomenon, showing the change in signal intensity per frame in the pixel space where each phosphor is located. It's data.

이를 통해 발광 온-상태(fluorescence on-state) 및 발광 오프 상태(fluorescence off-state)를 구별할 수 있으며, 두 상태(state) 간의 전환(conversion)인 광 스위칭(photoswitching) 현상이 얼마나 빠르게 많이 일어나는지를 확인할 수 있다.This allows you to distinguish between fluorescence on-state and fluorescence off-state, and how quickly photoswitching, the conversion between the two states, occurs. You can check.

또한, 광 스위칭(Photoswitching) 현상은 빠르게 일어나고, 온-상태 시간(on-state time)이 짧을수록 다른 형광체의 발광과 겹칠 확률이 줄어들어 해상도를 높이고 좋은 질(quality)의 초고해상도 STORM 데이터(data)를 얻을 수 있다.In addition, the photoswitching phenomenon occurs quickly, and the shorter the on-state time, the less likely it is to overlap with the emission of other phosphors, thereby increasing resolution and producing high-quality, ultra-high-resolution STORM data. can be obtained.

도 14 내지 도 17을 참조하면, 비교예 1의 이미징 버퍼 용액은 높은 세기의 레이저 파워에서 빠른 광 스위칭 특성을 나타내는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 14 to 17, it can be seen that the imaging buffer solution of Comparative Example 1 exhibits fast optical switching characteristics at high intensity laser power.

도 18은 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 19는 약한 레이저 파워(12mW)에서 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 20은 도 19에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 21은 도 19에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.Figure 18 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 19 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 20 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 19, and FIG. 21 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 19.

도 18 내지 도 21을 참조하면, 비교예 1에 따른 이미징 버퍼 용액은 시간에 따른 형광 세기 그래프에서 느린 광스위칭을 나타내며, STORM 이미지에서는 겹쳐져서 잘못 배치(assign)되어 로컬라이징(localization)됨으로써 해상도가 낮아져 각 미세소관을 구별하지 어려운 것을 알 수 있다.Referring to Figures 18 to 21, the imaging buffer solution according to Comparative Example 1 shows slow optical switching in the fluorescence intensity graph over time, and in the STORM image, the resolution is lowered due to overlapping and incorrect assignment and localization. It can be seen that it is difficult to distinguish each microtubule.

도 22는 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 23은 약한 레이저 파워(12mW)에서 실시예 2에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 24는 도 23에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 25는 도 23에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.Figure 22 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 23 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 2 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 24 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 23, and FIG. 25 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 23.

도 22 내지 도 25를 참조하면, 도 18 내지 도 21와 달리 빠른 광스위칭 특성을 나타내며, STORM 이미지에서 미세소관들이 잘 구별되어 초고해상도 구조가 관찰되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 22 to 25, unlike Figures 18 to 21, it shows fast optical switching characteristics, and in the STORM image, microtubules are well distinguished and a super-resolution structure is observed.

표 5는 도 20 내지 도 24에 따른 결과값을 도시한 표이다.Table 5 is a table showing the result values according to FIGS. 20 to 24.

[표 5][Table 5]

도 14 내지 도 25 및 표 5를 참조하면, 낮은 세기의 레이저 파워(12mW)에서는 종래에 사용되는 100mM MEA를 포함하는 이미징 버퍼 용액인 비교예 1보다 20mM MEA를 포함하는 이미징 버퍼 용액인 실시예 2에서 형광 세기가 증가되어 광 스위칭이 빠르게 일어나고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭이 감소되어, 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 14 to 25 and Table 5, at a low intensity laser power (12 mW), Example 2, which is an imaging buffer solution containing 20mM MEA, is better than Comparative Example 1, which is an imaging buffer solution containing 100mM MEA, which is conventionally used. It can be seen that the fluorescence intensity increases, causing rapid optical switching, and the half width for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance is reduced, thereby improving resolution.

도 26은 일반 형광 이미징 방법으로 촬영된 세포 내 미세소관의 형광 이미지이고, 도 27는 약한 레이저 파워(12mW)에서 실시예 3에 따른 이미징 버퍼 용액을 사용하여 촬영한 세포 내 미세 소관의 초고해상도 STORM 이미지이며, 도 28은 도 27에 따른 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 그래프이고, 도 29는 도 27에 따른 형광 세기를 도시한 그래프이다.Figure 26 is a fluorescence image of intracellular microtubules taken using a general fluorescence imaging method, and Figure 27 is a super-resolution STORM image of intracellular microtubules taken using the imaging buffer solution according to Example 3 at weak laser power (12 mW). This is an image, and FIG. 28 is a graph showing the full width at half maximum for the distribution of the imaging position (centroid) of a single fluorescent substance according to FIG. 27, and FIG. 29 is a graph showing the fluorescence intensity according to FIG. 27.

도 26 내지 도 29를 참조하면, 시간에 따른 형광 세기 측정 그래프에서 빠른 광스위칭 특성을 나타내어, STORM 이미지에서 미세소관들이 잘 구별되어 초고해상도 구조가 관찰되는 것을 알 수 있다.Referring to Figures 26 to 29, the fluorescence intensity measurement graph over time shows fast optical switching characteristics, and it can be seen that microtubules are well distinguished in the STORM image and a super-resolution structure is observed.

표 6은 비교예 1(pH 8.0) 및 실시예 3(pH 9.0)의 형광세기 및 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭을 도시한 표이다.Table 6 is a table showing the fluorescence intensity of Comparative Example 1 (pH 8.0) and Example 3 (pH 9.0) and the full width at half maximum for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance.

[표 6][Table 6]

도 26 내지 도 29 및 표 6을 참조하면, 약한 레이저 파워(12mW)에서 비교예 1 대비 실시예 2의 형광 세기가 증가되어 광 스위칭 특성이 향상되고, 단일 형광체의 이미징 위치(centroid) 분포에 대한 반치폭이 감소되어 해상도가 향상되는 것을 알 수 있다.Referring to FIGS. 26 to 29 and Table 6, the fluorescence intensity of Example 2 is increased compared to Comparative Example 1 at a weak laser power (12 mW), thereby improving optical switching characteristics and improving the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance. It can be seen that the half width is reduced and the resolution is improved.

도 30은 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광현미경 이미징 방법에서 신호 오류 필터링 이미지 분석에 따른 초고해상도 형광 이미징 효과를 도시한 초고해상도 STORM 이미지 및 그래프이다.Figure 30 is a super-resolution STORM image and graph showing the effect of super-resolution fluorescence imaging according to signal error filtering image analysis in the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention.

도 30을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 초고해상도 형광현미경 이미징 방법은 백그라운드 신호를 필터링 함으로써 12mW의 낮은 세기의 레이저 파워에서도 초고해상도 STORM 이미징이 가능한 것을 알 수 있다.Referring to Figure 30, it can be seen that the super-resolution fluorescence microscope imaging method according to an embodiment of the present invention allows super-resolution STORM imaging even at a low intensity laser power of 12 mW by filtering the background signal.

한편, 본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시 예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.Meanwhile, the embodiments of the present invention disclosed in the specification and drawings are merely provided as specific examples to aid understanding, and are not intended to limit the scope of the present invention. It is obvious to those skilled in the art that in addition to the embodiments disclosed herein, other modifications based on the technical idea of the present invention can be implemented.

Claims

Culturing cells on a cover glass;
Fixing the cultured cells;
Marking the fixed cells with a fluorescent substance;
Supporting the fluorescently labeled cells in an imaging buffer solution containing a Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) solution, MEA (2-mercaptoethylamine), and an oxygen scavenger system;
Measuring and imaging the fluorescence of the cells using a super-resolution fluorescence microscope and analyzing the fluorescence signals; and
filtering the fluorescence signal;
Including,
The laser power of the super-resolution fluorescence microscope is 6mW to 50mW,
The filtering removes the background signal of 800 (AU) to 2000 (AU) detected by the EM-CCD camera sensor,
The full width at half maximum (FWHM) and fluorescence intensity for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance are adjusted depending on the concentration and pH of the MEA (2-mercaptoethylamine),
An imaging method for super-resolution fluorescence microscopy, characterized in that the concentration of MEA (2-mercaptoethylamine) is 5mM to 200mM.

According to paragraph 1,
The super-resolution fluorescence microscope is an imaging method of a super-resolution fluorescence microscope, wherein the full width at half maximum (FWHM) and fluorescence intensity of the imaging position (centroid) distribution of the single fluorophore are adjusted according to the laser power.

According to paragraph 1,
An imaging method of a super-resolution fluorescence microscope, characterized in that the super-resolution fluorescence microscope is STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy).

According to paragraph 1,
An imaging method for a super-resolution fluorescence microscope, characterized in that the pH of the imaging buffer solution is 7.0 to 9.0.

delete

According to paragraph 1,
An imaging method of a super-resolution fluorescence microscope, wherein the oxygen scavenger system includes glucose oxidase, glucose, and catalase.

According to paragraph 1,
The fluorescent label is at least one of cyanine series, atto series, fluorescein seires, rhodamine series, BODIPY series, and phorphyrin series. An imaging method for super-resolution fluorescence microscopy, characterized in that it is labeled with any one dye.

delete

A plate on which fluorescently labeled cells supported in an imaging buffer solution containing Tris (2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol) solution, MEA (2-mercaptoethylamine), and oxygen scavenger system are placed;
a light source unit that irradiates a laser to the fluorescently labeled cells; and
A detector for measuring and imaging the fluorescence of the cells and analyzing the fluorescence signals;
Including,
The laser power is 6mW to 50mW,
the detector filters the fluorescence signal,
The filtering removes the background signal of 800 (AU) to 2000 (AU) detected by the EM-CCD camera sensor,
The full width at half maximum (FWHM) and fluorescence intensity for the imaging position (centroid) distribution of a single fluorescent substance are adjusted depending on the concentration and pH of the MEA (2-mercaptoethylamine),
A super-resolution fluorescence microscope imaging device, characterized in that the concentration of the MEA (2-mercaptoethylamine) is 5mM to 200mM.

According to clause 10,
A super-resolution fluorescence microscope imaging device, characterized in that the full width at half maximum (FWHM) for the imaging position (centroid) distribution of the single fluorescent substance of the super-resolution fluorescence microscope is 24.00 nm to 50.00 nm.

According to clause 10,
A super-resolution fluorescence microscope imaging device, characterized in that the super-resolution fluorescence microscope is STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy).

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According to clause 10,
A super-resolution fluorescence microscope imaging device, characterized in that the pH of the imaging buffer solution is 7.0 to 9.0.

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