KR102651711B1 - 항균 및 항바이러스제, 이의 제조방법 및 이로부터 제조된 보조사료 - Google Patents
항균 및 항바이러스제, 이의 제조방법 및 이로부터 제조된 보조사료 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 팔각 추출물과 키토산-펩타이드 금속착물을 복합화하여 각종 바이러스에 효과가 있을 뿐 아니라 바이러스에 대한 내성을 나타내지 않으며, 특히 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대하여 효과가 있는 항균 및 항바이러스제, 이로부터 제조된 보조사료에 관한 것이다.
Description
본 발명은 팔각 추출물과 키토산-펩타이드 금속착물을 복합화하여 각종 바이러스에 효과가 있을 뿐 아니라 바이러스에 대한 내성을 나타내지 않으며, 특히 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대하여 효과가 있는 항균 및 항바이러스제, 이로부터 제조된 보조사료에 관한 것이다.
사료첨가제는 가축의 생산성 향상을 목적으로 배합사료에 첨가하는 제제로서 영양성분 강화를 위한 '일반 사료첨가제'와 면역력 향상, 소화율 향상, 정장작용, 항균작용 등 가축의 건강 증진이나 그 밖의 특수 용도를 위한 '기능성 사료첨가제'로 구분할 수 있다.
현재 국내 기능성 사료첨가제 산업은 약 130여개의 회사가 각축하고 있는 완전경쟁 시장으로 생산품이 거의 전량 국내 축산업에 소요되는 전형적인 내수시장 지향 산업의 성격을 띠고 있으며, 일부 가공된 원료만을 수출하고 있어 아직까지 국제경쟁력이 낮은 산업분야라고 할 수 있다.
현재까지 가축의 질병 예방, 치료 및 성장 촉진을 위한 목적으로 사용되고 있는 항생제의 경우 내성균 출현 등, 남용의 폐단에 대한 해결책 마련은 한국뿐만 아니라 세계적인 현안으로, 이미 선진국에서는 동물산업에서의 항생제 사용에 대한 강력한 규제법령을 시행 중이다. 여러 가지 질병 및 부작용들이 수반되어 나타나는 것을 감안하면 이러한 난점을 극복하기 위해서는 기존의 항생제 효과를 대체하고 축산물 안전성을 보증할 수 있는 효과적인 천연 항생물질이 절실한 실정이다.
H7N9형은 조류에서 저병원성이나, 2013년 중국에서 발생한 H7N9은 인간에게 감염을 유발하여 중증 폐렴을 일으킬 수 있는 것으로 보고되어 있으며, 주로 태국, 베트남 등 동남아시아에서 발생하였으나 러시아, 몽골, 유럽, 아프리카, 인도 등지에서도 발생하고 있다.
조류인플루엔자(Avian Influenza) 바이러스는 2016년 ~ 2017년 사이에 조류인플루엔자(Avian Influenza) 바이러스에 감염된 가금류의 살처분 소요액만 2천300억이며, 농가 생계안정 자금 등의 직접비용과 연관산업에 미치는 간접적 손실액이 1조원이 넘는 것으로 발표되었다.
2012년 2월에 발간된 "고병원성 조류독감바이러스(AI) 방제용 사료첨가제 및 식품소재 개발"이란 연구보고서에서는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스, 민족도리풀(Asarum sieboldii)속, 선복화, 연교, 관동화 꽃, 행인 종자, 패장 식물체 등이 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 효과가 있다는 것을 발표한 바 있다.
상기 "고병원성 조류독감바이러스(AI) 사료첨가제 및 예방소재 개발"이란 발표자료에서는 한약재 유래의 플라보노이드 성분과 유산균을 이용한 고병원성 조류독감바이러스(AI) 사료첨가제를 발표하였다. 국내에서 진행되는 조류인플루엔자 대응 연구의 대부분은 생명자원종의 추출물 또는 생명자원종 유래 화합물을 기반으로 연구하고 있는 것으로 판단된다.
곰팡이는 각종 바이러스보다 크기가 크고 세포조직도 강고하기 때문에 이제까지 각종 연구기관의 연구결과에 따르면 곰팡이에 대하여 항곰팡이의 효과가 있는 물질은 바이러스에도 똑같은 효과가 있는 것으로 확인되었다.
본 발명에서는 팔각 추출물; 키토산-아미노산 금속착물을 복합화한 물질을 제공하여 각종 바이러스에 대한 효과뿐만 아니라 바이러스에 대하여 내성을 나타내지 않는, 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대하여 효과가 있는 항균 및 항바이러스제를 제공하고자 한다.
본 발명과 관련하여, 대한민국 공개특허 10-2007-0035203(공개일자 2007년03월30일)에는 '식물 추출물로 이루어진 에비안 인플루엔자 바이러스에대한 항바이러스제 및 이를 함유하는 위생용품', 대한민국 등록특허 10-0721703(등록일자 2007년05월18일)에는 '오리나무 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물', 대한민국 공개특허 10-2011-0041936(공개일자 2011년04월22일)에는 '붉나무 유래 화합물을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염의 예방용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 기상 필터 및 상기 필터를 포함하는 공기청정기'에 대한 기술이 개시된 바 있다.
상기 공개특허 및 등록특허에는 각종 바이러스에 효과가 있을 뿐 아니라 바이러스에 대하여 내성을 나타내지 않는 물질을 제공하고 있지 않으며, 더욱이 이와 같은 물질을 이용하여 병원성 조류독감바이러스(AI)에 대하여 효과가 있는 항균 및 항바이러스제에 대한 기술을 개시하고 있지 않다.
본 발명은 팔각 추출물과 키토산-펩타이드 금속착물을 복합화하여 각종 바이러스에 효과가 있을 뿐 아니라 바이러스에 대한 내성을 나타내지 않으며, 특히 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대하여 효과가 있는 항균 및 항바이러스제, 이의 제조방법 및 이로부터 제조된 보조사료를 제공하고자 하는 것을 발명의 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 팔각 추출물과 키토산-트리펩타이드 금속착물을 복합화한 항균 및 항바이러스제를 제공한다.
상기 항균 및 항바이러스제를 제조하기 위한 것으로,
팔각추출물을 제조하는 단계와,
상기 팔각추출물과 트리펩타이드를 혼합한 혼합물에 키토산을 첨가하여, 상기 키토산을 용해시키는 단계와,
상기 키토산을 용해시킨 용해물에 아연 아세테이트(Zn acetate) 또는 질산은(AgNO3)을 첨가한 후 상온에서 9 ~ 14 시간 동안 반응시키는 단계를 포함하는 항균 및 항바이러스제 제조방법을 제공한다.
또한 상기 항균 및 항바이러스제를 사료의 전체 중량에 대해 0.1 ~ 30.0 wt%로 첨가하여 제조하는 항균 및 항바이러스성 보조사료를 제공한다.
본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제 및 이를 이용하여 제조된 보조사료는 다음의 효과를 갖는다.
첫째. 기존 사료첨가제에는 항생제가 포함되어 있으며 이와 같은 항생제를 과량 급여할 경우 가축 또는 그 생산물을 이용하는 사람에게 해를 끼칠 가능성이 있으나, 본 발명에 따른 항바이러스성 보조사료는 팔각 추출물; 키토산-아미노산 금속착물을 복합화하여 제조함으로써 항생제를 전혀 포함하고 있지 않으면서도 항진균 및 항바이러스 효과가 뛰어나다. 그리고 바이러스에 대한 내성을 나타내지 않는 물질이며, 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대한 효과가 뛰어나다는 장점을 갖는다.
둘째. 기존 사료첨가제는 고농도로 사용할 경우 인체에 대한 안전성 문제가 발생하게 되나, 인체에 무해하고 필요시 고농도로 사용가능하다는 장점을 갖는다.
셋째. 기존 사료첨가제는 환경독성에 문제가 있으나, 본 발명에 따른 항바이러스성 보조사료는 환경독성 문제가 없다.
넷째. 본 발명에 따른 항균 및 항바이러스성 보조사료는 부착력이 탁월하여 서방성으로 효과가 오래 지속된다는 장점을 갖는다.
다섯째. 본 발명에 따른 항균 및 항바이러스성 보조사료는 면역증강효과가 있어 고병원성 조류독감바이러스(AI)에 대한 예방효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 보조사료의 항균 및 항진균시험에 따른 대조군과 시험군의 시험결과 사진.
도 2는 본 발명에 따른 보조사료의 항균 및 항진균시험에 따른 대조군과 시험군의 시험결과 사진.
도 3은 본 발명에 따른 보조사료의 항균 및 항진균시험에 따른 대조군과 시험군의 시험결과 사진.
도 2는 본 발명에 따른 보조사료의 항균 및 항진균시험에 따른 대조군과 시험군의 시험결과 사진.
도 3은 본 발명에 따른 보조사료의 항균 및 항진균시험에 따른 대조군과 시험군의 시험결과 사진.
상기한 바와 같이,
본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제는 팔각 추출물과 키토산-트리펩타이드 금속착물을 복합화한 것으로서,
성분 및 배합비를 기준으로 항균 및 항바이러스제의 기술 구성을 살펴보면,
팔각 추출물 25.0 ~ 55.0 wt%와,
트리펩타이드 13.5 ~ 38.7 wt%와,
키토산 13.5 ~ 38.7 wt%와,
금속염 0.2 ~ 5.0 wt%를 포함한다.
상기 항균 및 항바이러스제의 배합예를 살펴보면 다음의 표 1과 같다.
| 배합예 1 | 배합예 2 | 배합예 3 | 배합예 4 | 배합예 5 | |
| 팔각 추출물 | 48.8 wt% | 49.1 wt% | 50.4 wt% | 51.7 wt% | 52.0 wt% |
| 트리펩타이드 | 31.9 wt% | 30.1 wt% | 29.4 wt% | 26.6 wt% | 24.3 wt% |
| 키토산 | 16.3 wt% | 18.7 wt% | 18.7 wt% | 20.9 wt% | 23.0 wt% |
| 아연 아세테이트(Zn acetate) 또는 질산은(AgNO3) | 3.0 wt% |
2.1 wt% |
1.5 wt% |
0.8 wt% |
0.7 wt% |
| 합 계 | 100.0 wt% | 100.0 wt% | 100.0 wt% | 100.0 wt% | 100.0 wt% |
[ 팔각 추출물 ]
상기 팔각 추출물은 팔각 분쇄물을 산(acid)을 이용하여 추출한 것을 사용한다.
상기 팔각 추출물은 추출물 내에 포함되어 있는 산을 이용하여 항균 및 항바이러스제를 구성하는 키토산을 용해시키는 역할을 한다.
추출하는데 사용하는 유기산은 초산, 젓산, 프로비온산, 구연산용액, 아스코브산용액을 사용하는 것이 바람직하며 추출 시 팔각의 함량은 5 내지 20 wt%를 사용한다.
상기 팔각은 팔각회향(Illicium verum Hooker filius)으로서 대회향 또는 스타아니스(star anise)라 불린다.
팔각회향의 성분을 보면 주성분은 anethole이며 quercetin계로는 quercetin-3-O-rhamnoside, quercetin-3-O-β-glucoside, quercetin-3-O-gfalactoside, quercetin-3-O-xyloside 등이 있고, kaempferol계로는 kaempferol-3-O-glucoside, kaempferol-3-O-galactoside, kaempferol-3-Orutinoside 등이 있으며 그외 anisaldehyde, anisic acid, phallandrene, limonene, cincole, safrole, pinene, phellandren, methylchavicol, 기타 phenylpropanoid glucosides 등을 함유하고 있다.
약리 작용으로는 구풍작용, 거담작용, 백혈구 증가작용, 장위의 연동운동 촉진작용, 복부 동통의 완해작용, 호흡기의 분비 촉진작용, 항균작용, 살충작용, 항진균작용, 지사작용, 항충치 및 항산화효과 등이 보고되어있다.
상기 팔각과 동일한 산(acid)을 이용한 추출방법으로 계피, 솔, 삼나무, 편백, 오리나무, 감초, 오미자 중 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상을 추출하여 사용할 수도 있다.
상기 팔각 추출물의 사용량이 25.0 wt% 미만인 경우에는 팔각회향의 약리작용이 제대로 발휘되기 어렵고, 또한 키토산 용해가 제대로 이루어지지 않을 수 있다는 문제가 있고, 55.0 wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 무의미하므로, 상기 팔각 추출물의 사용량은 항균 및 항바이러스제의 총량 중 25.0 ~ 55.0 wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.
[ 트리펩타이드 ]
1. 구슬 2~5개의 유리반응기를 세척한다.
2. 1 mol 레진(Resin)을 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)에 분산 후 30분간 팽윤(swelling)시킨다.
3. 3 mol 아미노산을 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)에 용해시키고, 2M HOBT(1-Hydroxybenzotriazole)를 첨가하여 1분간 희석시킨다. 추가로 2M DIC(diisopropylcarbodiimide)를 첨가해서 1분간 희석시킨 후 20분간 교반한다. 이는 아미노산에 -COOH를 활성하기 위한 것이다.
4. 상기 2. 과정이 끝나면 아스피레이터(Aspirator)를 사용하여 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone) 성분을 제거하고, 남은 레진(Resin)에 피페리딘(Piperidine) 20 %를 첨가하여 20 분간 반응시킨다. 반응이 끝나면 아스피레이터(Aspirator)를 이용하여 피페리딘(Piperidine)을 제거한 뒤, 다시 피페리딘(Piperidine) 20 %를 첨가하여 15 분간 반응시킨다. 반응이 완료된 후 남아 있는 피페리딘(Piperidine)을 상기 아스피레이터(Aspirator)를 이용하여 제거한다. 이와같은 과정은 레진(resin)에 protecting을 unprotecting하기 위한 것이다.
5. 유리반응기에 남아있는 레진(resin)을 DCM(dichloromethane)으로 1분당 1번씩 2번 세척한 후, NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)로 세척한 다음 아스피레이터(Aspirator) 제거한다. 다시 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)로 상기 3.과정의 아미노산을 투입한 후 2시간 동안 반응시킨다.
6. 반응이 끝나면 아스피레이터(Aspirator)로 요매를 제거한 후 DCM(dichloromethane)으로 1분당 1번씩 2번 세척하고, 다시 NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)로 세척한 다음 아스피레이터(Aspirator) 제거한다.
그 후 피페리딘(Piperidine) 20 %를 첨가하여 20 분간 분산시킨다. 반응이 완료된 후 남아 있는 피페리딘(Piperidine)을 상기 아스피레이터(Aspirator)를 이용하여 제거한 후 피페리딘(Piperidine) 20 %를 첨가하여 15 분간 분산시킨다. 상기 3.과정을 거친 3mol의 다른 아미노산을 투입 후 2시간 동안 반응시킨다.
7. 완결반응이 끝나면 피페리딘(Piperidine) 20%를 첨가하여 20 분간 반응시킨 후 추가로 15 분간 반응시킨다. 그런 다음 DCM(dichloromethane)으로 1분당 1번씩 2번 세척한 후, NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)으로 1번 세척한 뒤 또 한번 DCM(dichloromethane)으로 3번 세척한다. 그리고 cleavage용매 넣은 후 2 시간 동안 반응시킨다.
이때 cleavage용매는 EDT(Ethanedithiol), Thioanisole, Phenol, TFA, Water를 포함하는 것으로서, 더욱 구체적으로는 water : phenol : EDT : thioanisole : TFA의 배합비가 중량기준 5 : 5 : 2.5 : 5 : 82.5인 것을 사용한다.
8. 상기 cleavage용매가 있는 유리반응기에 에테르(ether)를 첨가하여 침전이(colloid) 생기는걸 확인한다. 침전이 일어나면 원심분리기로 침전을 뭉친 다음 용액을 버리고 에테르(ether)로 다시 한번 분산시킨뒤 용액을 버리고 침전물을 동결건조한다.
상기 트리펩타이드의 사용량이 13.5 wt% 미만인 경우에는 착물을 만드는데 문제가 있을 뿐아니라 항균성이 낮은 문제가 있고, 38.7 wt%를 초과하게 되는 경우에는 항균제의 가격이 비싸진다는 문제가 있으므로, 상기 트리펩타이드의의 사용량은 항균 및 항바이러스제의 총량 중 13.5 ~ 38.7 wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.
[ 키토산 ]
상기 키토산(Chitosan)은 2-amino-2deoxy-D-glucose 잔기들이 β-(1→4) 결합한 직쇄상의 천연고분자로서갑각류 절족동물의 외골격이나 균류등에 존재하는 키틴(Chitin)으로부터 탈아세틸화 처리에 의해 용이하게 얻을수 있으며 1차 아미노기와 수산기가 배위자로 작용하여 중금속이온들에 대한 흡착특성에 매우 우수한 킬레이트(chelate) 고분자이다.
상기 키토산(Chitosan)의 항균작용, 항암작용 및 면역활성증강작용 등의 여러 가지의 생리적 활성이 있는 것으로 밝혀짐으로써 최근에는 식품첨가제 및 의약품 소재로서의 용도개발이 활발히 연구되고 있다.
Zn, Fe, Mn, Cu, Ca, Co, Se의 광물질을 킬레이션(Chelation)하여 공급함으로써 필수 미네랄(Mineral)의 흡수율을 높일 수 있다.
상기 키토산은 13.5 ~ 38.7 wt%의 범위 내로 사용되며, 그 사용량이 13.5 wt% 미만인 경우에는 항균성 향상을 기대하기 어렵고, 38.7 wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 무의미하므로, 상기 키토산의 사용량은 항균 및 항바이러스제의 총량 중 13.5 ~ 38.7 wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.
[ 금속염 ]
상기 금속염은 염화아연, 초산아연, 황산아연 또는 질산아연 중 선택되는 1종 이상의 아연; 질산은, 황산은 또는 산화은 중 선택되는 1종 이상의 은(Ag); 황산마그네슘, 질산마그네슘, 염화마그네슘 또는 초산마그네슘 중 선택되는 1종 이상의 마그네슘; 염화코발트, 초산코발트, 질산코발트 또는 황산코발트 중 선택되는 1종 이상의 코발트; 또는 산화망간, 황산망간 또는 염화망간 중 선택되는 1종 이상의 망간; 중 선택되는 어느 1종 이상인 것을 사용한다.
보다 구체적으로는 아연 아세테이트(Zn acetate) 또는 질산은(AgNO3)을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 금속염은 0.2 ~ 5.0 wt%의 범위 내로 사용되며, 그 사용량이 0.2 wt% 미만인 경우에는 항균성 향상을 기대하기 어렵고, 5.0 wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 무의미하므로, 상기 금속염의 사용량은 항균 및 항바이러스제의 총량 중 0.2 ~ 5.0 wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제의 제조방법은
팔각추출물을 제조하는 단계와,
상기 팔각추출물과 트리펩타이드를 혼합한 혼합물에 키토산을 첨가하여, 상기 키토산을 용해시키는 단계와,
상기 키토산을 용해시킨 용해물에 금속염을 첨가한 후 상온에서 9 ~ 14 시간 동안 반응시키는 단계를 포함한다.
보다 구체적으로는, 팔각 추출물을 추출하고, GHK 트리펩타이드(히스티딘 함량이 0.01 mole)를 합성한다.
상기 팔각 추출물과 GHK 트리펩타이드의 혼합물에 키토산을 넣어 용해시킨 후, 용해물에 아연 아세테이트(Zn acetate) 또는 질산은(AgNO3)을 첨가한 후 상온에서 12시간 반응시켜서 항균 및 항바이러스 항균제를 제조한다.
상기 팔각추출물은 팔각을 산을 이용하여 추출한 것으로서, 보다 구체적으로는 팔각회향(Illicium verum Hooker filius)을 분쇄한 후, 분쇄된 팔각회향을 초산에 침지하여 추출한 것을 사용한다.
상기 트리펩타이드는 앞서 제시된 과정을 거쳐 합성된 것을 사용한다.
다음으로 상기 팔각추출물과 트리펩타이드를 혼합한 혼합물에 키토산을 첨가하여 상기 키토산을 용해시킨다. 이때 첨가량은 앞서 제시된 각 성분의 배합비를 기준으로 정한다.
상기 키토산은 상기 팔각추출물에 포함되어 있는 산(acid) 성분의 작용으로 용해된다.
상기 키토산을 용해시킨 후에는 금속염을 추가적으로 첨가한 후 15~25 ℃에서 9~14 시간 동안 반응시켜 본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제를 완성한다.
상기 반응온도 및 반응시간은 더욱 구체적으로는 20 ℃에서 12 시간으로 한정하는 것이 바람직하다.
이와 같이 제조된 항균 및 항바이러스제를 일반사료에 첨가함으로써 본 발명에 따른 항균 및 항바이러스성 보조사료가 완성된다.
이때 배합비율은 일반사료 70.0 ~ 99.0 wt%와 항균 및 항바이러스제 0.1 ~ 30.0 wt%가 되도록 유지하는 것이 바람직하다.
상기 첨가량이 0.1 wt% 미만인 경우에는 본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제에 의한 항바이러스성을 기대하기 어렵고, 30.0 wt%를 초과하게 되는 경우에는 필요 이상의 사용으로 인해 경제성이 떨어지므로, 상기 항균 및 항바이러스제의 첨가량은 항바이러스성 보조사료의 총량 대비 0.1 ~ 30.0 wt%의 범위 내로 한정하는 것이 바람직하다.
보다 구체적으로는, 항균 및 항바이러스제를 보조사료의 총량 중 10.0 wt% 비율로 옥수수 가루에 첨가하여 항균 및 항바이러스성 보조사료를 제조한다.
상기 일반사료로는 옥수수, 수수를 포함하는 곡류(Grains); 쌀겨, 밀기울을 포함하는 곡류를 정미, 제분, 정맥하는 과정에서 발생하는 부산물의 강피류(Brans); 대두박, 아마인박을 포함하는 유박류(Oil meals); 농산물 가공품 생산과정에서 발생하는 가공부산물(Industry by-products); 열매, 줄기 또는 잎을 이용하는 과실류, 채소를 포함하는 과채류(Fruits and vegetables); 타피오카, 고구마, 뚱단지를 포함하는 괴경류(Root and Stems); 벼, 보리, 콩, 옥수수의 알곡을 얻기 위하여 재배하여 수확한 후의 부산물인 농산부산물(Farm by-products); 목초류(Forages); 야초류(Native grass); 해초 및 수조류(Sea weeds and marine algae); 또는 수엽류(Forests) 중 선택되는 어느 1종 또는 2종 이상을 사용한다.
상기 제조된 항균 및 항바이러스성 보조사료를 시료로 사용하여 1.항바이러스, 2.급성독성, 3.경구투여독성, 4.항균 및 항진균시험을 측정하였다.
1. 항바이러스 측정
1) 시료정의: 보조사료
2) 측정시료 개수: 5
3) 측정방법(규격, 환경, 결과치 계산)
조류 인플루엔자 바이러스 H9N2(A/chicken/Korea/01310/2001) 및 돼지 인플루엔자 바이러스H1N1(A/Sw/Kor/CAN1/04, KCTC11165BP)을 이용하였고, 바이러스 감염에 의한 세포의 생존율을 분석함으로써 항바이러스 활성을 확인하였다.
96웰 플레이트(96 well plate)에 웰 당 1×104개의 MDCK (Madin-Darby, canine kidney) 세포를 분주한 후 5%FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 및 0.4% L-글루타민(Lglutamine)이포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지를 넣고 하루 동안 배양한 후, 배양액을 버리고 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하였다. 이후 세포에 감염배지(infection media, DMEM+0.5%BSA(bovine serum albumin)+1㎍/㎖ trypsin)를 넣고, 돼지 인플루엔자 바이러스 또는 조류 인플루엔자 바이러스를 50TCID50/100㎕/웰의 농도가 되도록 접종하고, 팔각 추출물의 최종 농도가 10㎍/㎖이 되도록 처리한 후 5일 동안 배양하였다. 이때, 세포에 아무것도 처리하지 않은 것을 정상 대조군으로이용하였고, 바이러스만을 처리한 것을 음성 대조군으로, 항바이러스제인 리바비린(ribavirin) 10uM을 처리한 것을 양성 대조군으로 이용하였다. 5일 동안 배양한 세포를 이용하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5 -diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행한다. 배양한 세포에 MTT 용액을 넣고 37℃에서 반응시킨 후 배양액을 제거하고 DMSO(dimethylsulfoxide) 200㎕를 넣었다. 피펫팅으로 잘 섞어 준 다음 10분 동안 방치한 후 550㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인한다. 이때, 정상 대조군의 세포생존율 100%를 기준으로 각 용매에 따른 추출물에 의한 세포생존율을 계산한다. 추출물의 항바이러스 활성으로 인해 인플루엔자 바이러스에 의한 세포사멸이 억제되었으므로, 추출물에 의한 세포생존율을 항바이러스 활성과 동일한 개념으로 사용하였다.
2. 급성독성
1) 시료정의: 보조사료
2) 측정시료 개수: 5
3) 측정방법(규격, 환경, 결과치 계산)
추출물을 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행한다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 30마리를 대조군과 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고 24시산 후 생존율을 조사한다.
3. 경구투여 독성시험
1) 시료정의: 보조사료
2) 측정시료 개수: 5
3) 측정방법(규격, 환경, 결과치 계산)
장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 8주 동안 본 연구 시료를 1.0g/㎏/일로 투여한 실험군과 30% PEG-400을 투여한 대조군의 동물로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamic-pyruvic transaminase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다.
항균 및 항바이러스제의 Sprague-Dawley 랫드를 이용한 단회 경구투여 독성시험을 하였다. Sprague Dawley 계 암수 6 주령 실험용 랫드에 단회 경구투여시 나타나는 독성을 평가하고 개략의 치사량을 구하기 위하여 실시하였다.
군구성은 시험물질 2 000 mg/kg 의 용량 및 대조군 주사용수의 2 군으로 하고, 암수 각각 5 마리씩 단회 경구 투여하였다.(표 2)
| 군 | 투여용량 (mg/kg) |
투여액량 (mL/kg) |
동물수(개체번호) | |
| 수컷 | 암컷 | |||
| 대조군 | 0 | 10 | 5(1101~1105) | 5(2101~2105) |
| 시험물질 투여군 | 2,000 | 0 | 5(1201~1205) | 5(2201~2205) |
투여 후 14 일 동안 일반증상의 관찰 및 체중측정을 실시하였고, 관찰기간 종료 시에 안락사시켜 부검하였다.
독성시험 결과 암수 2 ,000 mg/kg 투여군에서 사망례는 관찰되지 않았다. 또한 일반증상, 체중 및 부검에서 시험물질 투여에 의한 영향은 인정되지 않았다.
결과적으로 개략의 치사량은 암수 모두 2,000 mg/kg을 상회하는 것으로 판단된다.
4. 항균 및 항진균시험
본 시험은 시료(원액)에 시험균액인 E.coli(Gram negative), B. subtilis(Gram positive) 및 C. albicans(Yeast)를 접종하고 22 ± 2 ℃에서 18시간 동안 방치하였다. 이후 생균수를 측정하여 각 균주에 대한 log reduction을 확인하였다.
본 시험 조건하에서 시료에 대한 log reduction 값은 18시간 후 E.coli, B. subtilis 및 C. albicans에 대하여 각각 > 5.39, > 5.10 및 2.88로 나타났다.
1) 시험 조건
- 농도: 원액
- 반응온도: 22 ± 2 ℃
- 반응시간: 18시간
2) 시험균주
- Escherichia coli ATCC 10536
- Bacillus subtilis ATCC 6633
- Candida albicans ATCC10231
3) 시험절차
시료(원액) 10 mL에 시험균액 0.1 mL를 첨가하여 혼합한 후 22 ± 2 ℃에서 18시간 동안 방치하였다. 최초 희석은 D/E neutralizing broth를 이용하여 실시하였다. 중화된 시험액은 단계별로 희석하여 각 농도당 Petri dish 2매에 1 mL씩 분주하였다. 미리 준비된 45~50 ℃의 Tryptic soy agar를 Petri dish에 15~25 mL 분주하고, 상온에서 응고시켰다. 응고된 Petri dish는 거꾸로 하여 35±1 ℃에서 24~48 시간 동안 배양하였다. 시험은 각 균주당 2회 반복하여 실시하였으며, 초기생균수의 측정은 멸균생리식염수를 사용하여 실시하였다.
4) 결과
① E.coli에 대한 항균시험(표 3 및 도 1)
초기 접종균수는 4.9 × 106 CFU/mL, 18시간 후 균수는 2회 반복 시험에서 모두 < 10 CFU/mL로 관찰되었다.
| 구분 | 생균수(CFU/mL) | Log value | mean log | *LR1) | |
| 대조군(초기) | 4.9 × 106 | 6.69 | 6.69 | > 5.39 |
|
| 시험군 (18시간 후) |
Ⅰ | < 20 | < 1.30 | < 1.30 | |
| Ⅱ | < 20 | < 1.30 | |||
* LR: log reduction
LR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)
② B. subtilis에 대한 항균시험(표 4 및 도 2)
초기 접종균수는 2.5 × 106 CFU/mL, 18시간 후 균수는 2회 반복 시험에서 모두 < 10 CFU/mL로 관찰되었다.
| 구분 | 생균수(CFU/mL) | Log value | mean log | *LR1) | |
| 대조군(초기) | 2.5 × 106 | 6.40 | 6.40 | > 5.10 |
|
| 시험군 (18시간 후) |
Ⅰ | < 20 | < 1.30 | < 1.30 | |
| Ⅱ | < 20 | < 1.30 | |||
* LR: log reductionLR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)
③ C. albicans에 대한 항진균시험(표 5 및 도 3)
초기 접종균수는 1.5 × 106 CFU/mL, 18시간 후 균수는 2회 반복 시험에서 모두 < 10 CFU/mL로 관찰되었다.
| 구분 | 생균수(CFU/mL) | Log value | mean log | *LR1) | |
| 대조군(초기) | 1.5 × 106 | 6.40 | 6.40 | 2.88 |
|
| 시험군 (18시간 후) |
Ⅰ | 20 × 103 | 3.30 | 3.30 | |
| Ⅱ | 20 × 103 | 3.30 | |||
* LR: log reductionLR = mean log (microbial population) - mean log (surviving test population)
④ 결론
본 시험 조건하에서 시료에 대한 log reduction 값은 18시간 후 E.coli, B. subtilis 및 C. albicans에 대하여 각각 > 5.39, > 5.10 및 2.88로 나타났다.(표 6)
1)결과의 해석
| Log reduction | Percent(%) reduction |
| 1 이상 | 90 % 이상 |
| 2 이상 | 99 % 이상 |
| 3 이상 | 99.9 % 이상 |
| 4 이상 | 99.99 % 이상 |
| 5 이상 | 99.999 % 이상 |
5. 최종 성능 평가결과
이와 같은 평가결과를 정리하여 살펴보면, 다음의 표 7의 평가결과가 도출된다.
| 주요 성능지표 | 단위 | 결과값 |
| 1. 항바이러스 | % | 70 |
| 2. 급성독성 | % | 100 |
| 3. 경구독성 | LD50 (반치사용량) |
15,000 이하 |
| 4. 항균성 | % | 99.99 |
| 5. 메탈함량분석 | mg/kg | 50 이상(보조사료) |
| 6. L-글루타민산(보조사료지표) | % | 3.3 이상 |
본 발명에 따른 항균 및 항바이러스제 및 이로부터 제조된 항균 및 항바이러스성 보조사료는 팔각 추출물; 키토산-아미노산 금속착물을 복합화한 것으로서 전혀 항생제를 포함하지 않으면서도 높은 항균 및 항진균 효과를 가지며, 인체에 무해하고 필요시 고농도로 사용가능하고, 사료에 대한 부착력이 탁월하여 서방성으로 효과가 오래 지속되므로 산업상 이용가능성이 크다.
Claims (8)
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- 팔각회향(Illicium verum Hooker filius)을 분쇄한 후, 분쇄된 팔각회향을 초산에 침지하여 추출하여 팔각추출물을 제조하고,
상기 팔각추출물과 히스티딘 함량이 0.01 mole인 GHK 트리펩타이드를 혼합한 혼합물에 키토산을 넣어 용해시킨 후,
상기 키토산을 용해시킨 용해물에 질산은(AgNO3)을 첨가한 후 상온에서 12시간 동안 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 항균 및 항바이러스제 제조방법.
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