KR102648221B1 - Composition comprising nanoceria compounds - Google Patents
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Abstract
본 발명은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 골관절염은 과도한 ROS 생성, 심각한 염증 반응, 연골 및 연골하 골의 해부학적 파괴를 수반한다. 나노세리아(Nanoceria) 화합물을 포함하는 조성물은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는 것으로, 상기 골관절염에 의해 얇아진 상기 관절 조직의 연골층의 두께를 회복시키는 것을 하나의 특징으로 할 수 있다. 생체 내에서 관찰된 나노세륨의 이러한 치료 효과는 특히 골관절염 모방 연골세포/대식세포 공동 배양 모델을 포함하는 시험관내 실험과 병행하여 추가적으로 입증되었다.The present invention relates to a composition containing a nanoceria compound that is locally injected into joint tissue affected by osteoarthritis, a degenerative joint disease, to treat or improve osteoarthritis. Osteoarthritis involves excessive ROS production, severe inflammatory response, and anatomical destruction of cartilage and subchondral bone. A composition containing a nanoceria compound is injected locally into joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has occurred, to treat or improve the osteoarthritis, and to reduce the thickness of the cartilage layer of the joint tissue thinned by the osteoarthritis. One feature can be said to be recovery. This therapeutic effect of nanocerium observed in vivo was further verified in parallel with in vitro experiments, especially involving an osteoarthritis-mimicking chondrocyte/macrophage co-culture model.
Description
본 발명은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 골관절염 관절에 국소적으로 주입되는 나노세리아의 용량을 최적화하여, 세포 사멸 및 염증의 억제 및 궁극적으로 연골 및 연골하 골의 회복에 대한 나노세리아 화합물의 효과를 심층적으로 분석하였다.The present invention relates to a nanoceria compound that is locally injected into joint tissue affected by osteoarthritis, a degenerative joint disease, to treat or improve osteoarthritis, and to a method for producing the same. By optimizing the dose of nanoceria injected locally into osteoarthritis joints, the effects of nanoceria compounds on inhibition of cell death and inflammation and ultimately recovery of cartilage and subchondral bone were analyzed in depth.
심각한 염증은 다양한 만성 질환 및 조직 기능 장애의 주요 원인을 구성하여 건강 관리에 심각한 문제를 야기한다. 골관절염(Osteoarthritis, OA)은 주로 국소 염증 또는 병리학적 기계적 스트레스에 의해 발생하며 관절에서 발생하는 가장 흔한 염증성 질환 중 하나이다.Severe inflammation constitutes a major cause of various chronic diseases and tissue dysfunction, posing serious challenges to health care. Osteoarthritis (OA) is mainly caused by local inflammation or pathological mechanical stress and is one of the most common inflammatory diseases occurring in joints.
골관절염 환경은 일반적으로 활성 산소 종(ROS)의 과잉 생산과 친염증성 사이토카인의 분비를 수반하며, 이는 세포의 항상성과 기능을 악화시켜 세포 사멸, 세포 외 분자 변성, 연골 및 과하골의 분해를 초래하여 궁극적으로 관절 기능과 일상 생활을 무력화시킨다. 따라서 골관절염의 치료 전략은 주로 염증 유발 사건을 개선하는 방법에 기초한다.The osteoarthritis environment is generally accompanied by overproduction of reactive oxygen species (ROS) and secretion of pro-inflammatory cytokines, which deteriorates cellular homeostasis and function, resulting in cell death, extracellular molecule degeneration, and degradation of cartilage and subcondylar bone. This ultimately disables joint function and daily life. Therefore, treatment strategies for osteoarthritis are mainly based on methods to ameliorate proinflammatory events.
임상적으로 사용할 수 있는 옵션에는 관절에 스테로이드 또는 히알루론산을 관절 내 주사하는 것이 포함되며, 이는 염증 및 관련 통증을 완화하고 퇴행성 과정을 지연시키는 것을 목표로 하지만 차선책으로 간주된다. 이에 최근 많은 노력을 기울이고 있다.Clinically available options include intra-articular injections of steroids or hyaluronic acid into the joint, which aim to relieve inflammation and associated pain and delay the degenerative process, but are considered suboptimal. A lot of effort has been put into this recently.
예를 들어, 항-세포사멸적(anti-apoptotic) /-염증성 분자가 발견되거나 직접 치료하도록 설계되었다. 또한 약물 분자의 생물학적 안정성과 국소 기능을 향상시키기 위해 나노 입자, 마이크로 입자 및 주사 가능한 하이드로겔과 같은 전달 매개체를 개발하였다.For example, anti-apoptotic/-inflammatory molecules have been discovered or designed for direct treatment. Additionally, delivery vehicles such as nanoparticles, microparticles, and injectable hydrogels have been developed to improve the biological stability and local functionality of drug molecules.
참고로, 생체 재료의 부류는 고유한 특성, 즉 촉매 및/또는 항산화(산소 조절) 활성을 나타내는 고유한 특성으로 인해 최근 강조되었으며, 이는 친염증성 과정을 약화시키는 데 중요한 역할을 하는 것으로 간주되어 OA의 무약물 요법에 사용될 수 있다.Of note, a class of biomaterials has recently been highlighted due to their unique properties, namely, exhibiting catalytic and/or antioxidant (oxygen regulation) activities, which are considered to play an important role in attenuating pro-inflammatory processes, leading to OA. It can be used in drug-free therapy.
나노세리아는 우수한 촉매, 항산화 및 ROS 소거 능력을 가진 이러한 종류의 생체 재료를 구성하며, 이는 주로 Ce4+/Ce3+ 산화환원 반응에서 파생된다.Nanoceria constitute this class of biomaterials with excellent catalytic, antioxidant and ROS scavenging abilities, which are mainly derived from Ce 4+ /Ce 3+ redox reactions.
ROS를 직접 소거하는 것과 함께 나노세리아는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 기타 항산화 효소의 활성을 조절하여 궁극적으로 자가 전파 자유 라디칼 및 세포 손상/사망에서 피드백 반응 주기를 방해하는 것으로 알려져 있다. 나노세리아의 치료 효과는 뇌허혈 뇌졸중, 류마티스 관절염(페라이트 포함) 및 척수 손상을 포함하여 염증이 우세한 여러 병리학적/외상 상태에서 입증되었다.Along with directly scavenging ROS, nanoceria are known to modulate the activity of superoxide dismutase and other antioxidant enzymes, ultimately disrupting the feedback reaction cycle in self-propagating free radicals and cell damage/death. The therapeutic effectiveness of nanoceria has been demonstrated in several pathological/traumatic conditions where inflammation predominates, including cerebral ischemic stroke, rheumatoid arthritis (including ferrite) and spinal cord injury.
한편, 조절된 산화 스트레스와 대식세포의 변형으로 인한 세포 사멸의 방지는 염증 및 퇴행성 상태를 회복 및 복구 단계로 전환할 가능성이 있는, 세포 및 분자 사건의 일부이다. 이러한 연구를 통해, 나노세리아가 염증성 골관절염에 대해서도 효과적일 수 있는지 검토되어 왔다.On the other hand, prevention of cell death due to regulated oxidative stress and transformation of macrophages are part of the cellular and molecular events that have the potential to transition inflammatory and degenerative states into restorative and repair phases. Through these studies, it has been examined whether nanoceria can be effective against inflammatory osteoarthritis.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물을 제공하는 것이다.Accordingly, the problem to be solved by the present invention is to provide a nanoceria compound that is locally injected into joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has developed, and treats or improves the osteoarthritis.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.In addition, another problem to be solved by the present invention is to provide a method for producing nanoceria compounds that are locally injected into joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has developed, thereby treating or improving osteoarthritis.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become clearer from the following detailed description, claims, and drawings.
상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 나노세리아(nanoceria) 화합물은 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선할 수 있다.In order to achieve the problem to be solved, the nanoceria compound according to an embodiment of the present invention can be locally injected into joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has occurred, thereby treating or improving the osteoarthritis.
나노세리아 화합물(이하, '나노세리아' 또는 'nCe'라 한다.)은 세륨(Ce)산화물인 세리아의 나노사이즈 화합물로, 본 발명에서 핵심을 이루는 요소이다. 세리아에 대해 보다 자세히 살펴보면 다음과 같다. 세리아(CeO2) 나노입자는 가역적으로 산소와 결합하고, CeO2 나노입자 표면에서 Ce3+ 및 Ce4+ 간의 산화상태 변화에 의해 자유라디칼 제거 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.Nanoceria compound (hereinafter referred to as 'nanoceria' or 'nCe') is a nano-sized compound of ceria, which is cerium (Ce) oxide, and is a key element in the present invention. A closer look at Seria is as follows. Ceria (CeO 2 ) nanoparticles are known to reversibly combine with oxygen and have free radical removal activity by changing the oxidation state between Ce 3+ and Ce 4+ on the surface of CeO 2 nanoparticles.
여기서, 상기 조직의 산화 스트레스(oxidative stress) 지표를 나타내는 iNOS(inducible Nitruc Oxide Synthase)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.Here, it is characterized by suppressing the production of iNOS (inducible Nitruc Oxide Synthase), which represents an indicator of oxidative stress in the tissue.
상기 관절 조직의 연골세포에서 ROS(Reactive Oxygen Species)의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by reducing the level of ROS (Reactive Oxygen Species) in cartilage cells of the joint tissue.
상기 골관절염에 의해 얇아진 상기 관절 조직의 연골층의 두께를 회복시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by restoring the thickness of the cartilage layer of the joint tissue thinned by the osteoarthritis.
상기 관절 조직의 연골(cartilage) 및 연골하(subchondral) 골의 프로테오글리칸(proteoglycan)의 분해를 완화하는 것을 특징으로 한다.It is characterized by alleviating the degradation of proteoglycan in cartilage and subchondral bone of the joint tissue.
상기 연골 및 연골하 골의 침식을 감소시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by reducing erosion of the cartilage and subchondral bone.
상기 관절 조직에 포함된 연골세포의 생존율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by improving the survival rate of cartilage cells contained in the joint tissue.
상기 연골세포의 세포사멸(apoptotic)을 감소시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by reducing apoptosis of the cartilage cells.
항-세포사멸(anti-apoptotic)의 지표인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)가 상향 조절되는 것을 특징으로 한다.It is characterized by upregulation of Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), an anti-apoptotic indicator.
대식세포에 의한 상기 연골세포의 사멸을 방지하는 것을 특징으로 한다.It is characterized by preventing death of the cartilage cells by macrophages.
상기 대식세포에 의해 영향을 받는 상기 연골세포 내의 ROS(Reactive Oxygen Species) 수준을 하향 조절시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by down-regulating the level of ROS (Reactive Oxygen Species) in the chondrocytes affected by the macrophages.
상기 골관절염에 의해 상기 관절 조직의 연골을 손상시키는 시클로옥시나아제 2(cyclooxygenase 2, COX2)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 한다.It is characterized by reducing the expression of cyclooxygenase 2 (COX2) and prostaglandin E2 (PGE2), which damage the cartilage of the joint tissue due to osteoarthritis.
상기 골관절염에 의한 퇴행 또는 손상에 대항하여 상기 관절 조직의 연골하(subchondral) 골을 보호하는 것을 특징으로 한다.It is characterized in that it protects the subchondral bone of the joint tissue against degeneration or damage caused by osteoarthritis.
상기 나노세리아는 400 내지 600 μg/ml의 용량 범위에서 효과적으로 산화 스트레스를 줄이고, 연골세포의 분화를 촉진하며, 골관절염 변성으로부터 연골하 골을 보호하는 데 효과적이다. The nanoceria is effective in reducing oxidative stress, promoting differentiation of chondrocytes, and protecting subchondral bone from osteoarthritis degeneration in the dosage range of 400 to 600 μg/ml.
상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선할 수 있는 나노세리아 (nanoceria) 화합물의 제조방법은, a) 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물 (hexadecyltrimethylammonium bromide을 준비하는 단계와, b) 상기 질산암모늄세륨(Ce(NH4)2(NO3)6)과 헥사데실트리메틸암모늄브롬화물(hexadecyltrimethylammonium bromide)을 용매에 투입하고 분산 및 용해시켜 혼합용액을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.Preparation of a nanoceria compound that can treat or improve osteoarthritis by locally injecting into joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has occurred according to another embodiment of the present invention to achieve the problem to be solved. The method includes a) preparing ammonium cerium nitrate (Ce(NH 4 ) 2 (NO 3 ) 6 ) and hexadecyltrimethylammonium bromide, and b) preparing ammonium cerium nitrate (Ce(NH 4 ) 2 (NO 3 ) 6 ) and hexadecyltrimethylammonium bromide may be added to a solvent and dispersed and dissolved to prepare a mixed solution.
상기 용매는 탈이온수이되, 상기 탈이온수의 pH는 8.0인 것을 특징으로 한다.The solvent is deionized water, and the pH of the deionized water is 8.0.
상기 혼합용액을 140℃의 온도인 열수 반응기로 이동시켜 24시간동안 반응시켜 나노세리아 화합물을 합성하는 단계를 더 포함할 수 있다.It may further include the step of synthesizing a nanoceria compound by moving the mixed solution to a hydrothermal reactor at a temperature of 140°C and reacting for 24 hours.
제조된 상기 나노세리아 화합물을 에탄올로 세척하고 80℃의 온도에서 24시간 동안 건조 하는 것을 특징으로 한다.The prepared nanoceria compound is washed with ethanol and dried at a temperature of 80°C for 24 hours.
본 발명에 의할 경우, 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물이 제공된다.According to the present invention, a nanoceria compound is provided that is locally injected into joint tissue affected by osteoarthritis, a degenerative joint disease, to treat or improve osteoarthritis.
또한, 퇴행성 관절질환인 골관절염이 발생된 관절 조직에 국소적으로 주입되어, 상기 골관절염을 치료 또는 개선하는, 나노세리아(nanoceria) 화합물의 제조방법이 제공된다.In addition, a method for producing a nanoceria compound is provided, which is locally injected into joint tissue affected by osteoarthritis, a degenerative joint disease, to treat or improve osteoarthritis.
도 1은 국부적으로 전달된 nCe가 골관절염 하악 관절의 병리학적 산화 스트레스를 감소시킨다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 2는 nCe는 골관절염 손상으로부터 연골층을 보호한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 3은 nCe가 세포 사멸을 억제하여 산화 스트레스로부터 연골세포를 구한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 4는 nCe가 항염증성 이벤트를 보조하여 대식세포를 조절하는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 5는 nCe에 의해 회수된 연골세포가 시험관 내에서 기능적 활성을 보존한다는 실험결과를 나타낸 것이다.
도 6은 nCe가 시험관내에서 연골세포와 친염증성 대식세포의 상호작용을 조절한다는 실험결과를나타낸 것이다.
도 7은 생체 내 골관절염 연골하 골 파괴는 nCe에 의해 방지된다는 실험결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows experimental results showing that locally delivered nCe reduces pathological oxidative stress in the osteoarthritic mandibular joint.
Figure 2 shows experimental results showing that nCe protects the cartilage layer from osteoarthritis damage.
Figure 3 shows the results of an experiment showing that nCe saves chondrocytes from oxidative stress by suppressing cell death.
Figure 4 shows the results of an experiment in which nCe regulates macrophages by supporting anti-inflammatory events.
Figure 5 shows experimental results showing that chondrocytes recovered by nCe preserve functional activity in vitro.
Figure 6 shows experimental results showing that nCe regulates the interaction between chondrocytes and pro-inflammatory macrophages in vitro.
Figure 7 shows experimental results showing that subchondral bone destruction in osteoarthritis in vivo is prevented by nCe.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.The advantages and features of the present invention and methods for achieving them will become clear by referring to the embodiments described in detail below along with the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and will be implemented in various different forms. The present embodiments only serve to ensure that the disclosure of the present invention is complete and that common knowledge in the technical field to which the present invention pertains is not limited. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims. Specific details for implementing the present invention will be described in detail with reference to the drawings attached below. Regardless of the drawings, the same reference numerals refer to the same elements, and “and/or” includes each and all combinations of one or more of the mentioned items.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.The terminology used herein is for describing embodiments and is not intended to limit the invention. As used herein, singular forms also include plural forms, unless specifically stated otherwise in the context. As used in the specification, “comprises” and/or “comprising” does not exclude the presence or addition of one or more other elements in addition to the mentioned elements.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in this specification may be used with meanings that can be commonly understood by those skilled in the art to which the present invention pertains. Additionally, terms defined in commonly used dictionaries are not interpreted ideally or excessively unless clearly specifically defined.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these are only for explaining the present invention in more detail, and the scope of the present invention is not limited thereto.
[실시예 1] nCe 준비 및 특성화[Example 1] nCe preparation and characterization
nCe는 열수 방법을 사용하여 합성되었다. 요약하면, 0.1M의 헥사데실트리메틸암모늄(CTAB; Sigma) 및 1M 세륨(IV) 질산암모늄 [Ce(NH4)2(NO3)6, 99.9% 순도, Sigma]을 pH 8.0의 탈이온수(DW)에 용해시키고 얻어진 용액을 140℃에서 24시간 동안 열수 오토클레이브로 옮겼다.nCe was synthesized using a hydrothermal method. Briefly, 0.1 M hexadecyltrimethylammonium (CTAB; Sigma) and 1 M cerium(IV) ammonium nitrate [Ce(NH 4 ) 2 (NO 3 ) 6 , 99.9% purity, Sigma] were dissolved in deionized water (DW) at pH 8.0. ) and the resulting solution was transferred to a hydrothermal autoclave at 140°C for 24 hours.
nCe를 에탄올로 충분히 세척하고 원심분리하여 분리한 다음 공기 중에서 80℃에서 24시간 동안 건조시켰다. 입자 크기, ζ-전위 및 표면적과 같은 물리화학적 특성은 이전에 설명한 대로 분석되었다. 요약하면, 입자의 평균 크기는 투과전자현미경 사진을 기준으로 19.5 nm이고 유체역학적 크기는 동적 광산란법으로 측정한 결과 28.4 nm였다.nCe was thoroughly washed with ethanol, separated by centrifugation, and dried in air at 80°C for 24 hours. Physicochemical properties such as particle size, ζ-potential and surface area were analyzed as previously described. In summary, the average size of the particles was 19.5 nm based on transmission electron microscopy images, and the hydrodynamic size was 28.4 nm as measured by dynamic light scattering.
ζ-전위는 17.5mV였고 표면적은 217m2/g이었다.The ζ-potential was 17.5 mV and the surface area was 217 m 2 /g.
nCe의 산화효소 유사 활성은 다른 농도에서 1M H2O2에 대한 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘 기반(TMB) 촉매 분석을 사용하여 테스트되었다. 이를 위해 320μg/mL까지 다양한 농도로 제조된 nCe를 TMB 용액에 첨가하고 혼합물 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다.The oxidase-like activity of nCe was tested using a 3,3',5,5' tetramethylbenzidine-based (TMB) catalyzed assay in 1 M H 2 O 2 at different concentrations. For this purpose, nCe prepared at various concentrations up to 320 μg/mL was added to the TMB solution, and the mixture solution was incubated at room temperature for 20 min.
그 후, UV-vis 분광법에 의해 652nm의 흡수에서 TMB의 청색으로의 촉매 산화를 분석하였다.Afterwards, the catalytic oxidation of TMB to blue at absorption at 652 nm was analyzed by UV-vis spectroscopy.
프로토콜에 따라 SOD 분석 키트(STA-340)를 사용하여 다양한 농도(40, 80, 160 및 320 μg/mL)에서 nCe의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(dismutase) 모방(SOD) 활성을 조사하였다. 자유 라디칼 소거 활성은 DPPH(1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) 키트로 측정하였다. nCe로의 FITC-접합은 생체 내 존재를 추적하기 위해 수행되었다. 이를 위해 나노세리아를 APTES에 의해 양성자화한 후 FITC와 결합시켰다.The superoxide dismutase mimetic (SOD) activity of nCe was investigated at various concentrations (40, 80, 160, and 320 μg/mL) using the SOD assay kit (STA-340) according to the protocol. Free radical scavenging activity was measured using a DPPH (1,1diphenyl-2-picrylhydrazyl) kit. FITC-conjugation to nCe was performed to track its presence in vivo. For this purpose, nanoceria was protonated with APTES and then combined with FITC.
[실시예 2] 생체 내 골관절염 모델 및 nCe 주입[Example 2] In vivo osteoarthritis model and nCe injection
생체 내 실험 절차는 대한민국 단국대학교 동물관리이용위원회에서 제정한 지침에 따라 검토 및 입증되었다. Sprague-Dawley 쥐(수컷, 8주)를 측두하악 관절(TMJ) 골관절염 모델에 사용하였다.In vivo experimental procedures were reviewed and validated in accordance with the guidelines established by the Animal Care and Use Committee of Dankook University, Republic of Korea. Sprague-Dawley rats (male, 8 weeks old) were used in a temporomandibular joint (TMJ) osteoarthritis model.
쥐는 제어된 습도(30 - 70%)와 온도(20 - 24℃)로 12시간 명암 주기로 유지되었다.Mice were maintained on a 12-h light/dark cycle with controlled humidity (30 - 70%) and temperature (20 - 24°C).
케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg) 혼합액을 근육주사하여 쥐를 마취시킨 후, 상부관절강에 Complete Freund's Adjuvant(CFA; 15μg/mL)를 20μL 주사하여 해밀턴 주사기가 있는 30게이지 바늘을 이용하여 염증성 골관절염을 유도하였다.After anesthetizing the rat by intramuscular injection of a mixture of ketamine (80 mg/kg) and xylazine (10 mg/kg), 20 μL of Complete Freund's Adjuvant (CFA; 15 μg/mL) was injected into the upper joint space using a 30-gauge needle with a Hamilton syringe. Inflammatory osteoarthritis was induced using this method.
3일 후, 다양한 농도(인산염 완충 식염수 중 250, 500, 1000, 2000μg/mL)로 제조된 nCe를 관절 활막강에 30μL 주입 부피로 주입했다(각 그룹에 대해 n = 4).After 3 days, nCe prepared at various concentrations (250, 500, 1000, and 2000 μg/mL in phosphate-buffered saline) was injected into the joint synovial space in a 30 μL injection volume (n = 4 for each group).
[실시예 3] microCT 및 조직학에 의한 생체 내 분석 [Example 3] In vivo analysis by microCT and histology
희생 후 TMJ 과두를 분리한 다음 일정한 교반 하에 24시간 동안 고정시켰다. 골 조직은 μCT 분석으로 평가되었다.After sacrifice, the TMJ condyles were isolated and fixed for 24 hours under constant agitation. Bone tissue was assessed by μCT analysis.
조직 샘플은 전류 385μA, 전압 65kV의 X선으로 카메라 픽셀 크기 12.56μm에서 μCT 스캐너(Skyscan 1176, Skyscan, Belgium)를 사용하여 스캔하였다.Tissue samples were scanned using a μCT scanner (Skyscan 1176, Skyscan, Belgium) at a camera pixel size of 12.56 μm with X-rays at a current of 385 μA and a voltage of 65 kV.
컴퓨터 분석 프로그램(CTAn Skyscan)을 통해 3차원(3D) 영상을 재구성하고 원기둥 모양의 관심 영역(ROI)을 선택하여 TMJ의 골 부피(㎣)를 계산하였다.Three-dimensional (3D) images were reconstructed using a computer analysis program (CTAn Skyscan), and a cylindrical region of interest (ROI) was selected to calculate the bone volume (㎣) of the TMJ.
조직학적 분석을 위해 고정된 조직을 탈회 용액으로 옮기고 자일렌과 일련의 등급별 에탄올 용액(70, 90, 95 및 100%)에서 탈수 과정을 수행하였다. 파라핀 블록은 마이크로톰(RM2245, Leica, Germany)에 의해 약 5μm 두께로 절단되었다.For histological analysis, fixed tissues were transferred to decalcification solution and dehydrated in xylene and a series of graded ethanol solutions (70, 90, 95, and 100%). Paraffin blocks were cut to a thickness of approximately 5 μm by a microtome (RM2245, Leica, Germany).
샘플을 Hematoxylin & Eosin(H&E)으로 염색한 다음 광학 현미경(IX71, Olympus, Japan)으로 검사하였다. 염색 이미지는 연골 미란, 연골 세포 배열 및 구조, 배경 염색 강도를 평가할 수 있는 Mankin의 점수 시스템을 사용하여 점수를 매겼다.Samples were stained with Hematoxylin & Eosin (H&E) and then examined under a light microscope (IX71, Olympus, Japan). Staining images were scored using Mankin's scoring system, which allows evaluation of cartilage erosion, chondrocyte arrangement and structure, and background staining intensity.
절편된 샘플을 0.2% Triton X-100으로 5분 동안 투과하고 3% BSA 용액으로 1시간 동안 차단한 다음 PBS로 세척하였다.The sectioned samples were permeabilized with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes, blocked with 3% BSA solution for 1 hour, and then washed with PBS.
샘플을 1:200에서 밤새 1차 항체로 처리하고 여러 번 세척한 다음 DAPI(Vector Laboratories)의 대조염색을 사용하여 1:200에서 90분 동안 2차 항체와 접합하였다. 슬라이드를 형광 현미경으로 캡처하고 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 강도를 정량화하였다.Samples were treated with primary antibodies at 1:200 overnight, washed several times, and then conjugated with secondary antibodies at 1:200 for 90 min using counterstaining from DAPI (Vector Laboratories). Slides were captured under a fluorescence microscope and intensity quantified using Image J software.
[실시예 4] 생체 외 이식편 연구 [Example 4] In vitro graft study
연골 조직으로의 나노세리아 침투 연구를 위해, 쥐의 TMJ 및 무릎 연골에서 관찰되지 않는 nCe의 이동을 시각화하기 위한 적절한 3D 연골 부피를 갖는 이식편 샘플을 토끼 연골로부터 제조하였다. 연골 외식편에 FITC-컨쥬게이션된 nCe를 처리한 후 샘플을 37℃, 5% CO2, 정적 조건에서 배양하였다.To study nanoceria penetration into cartilage tissue, graft samples with appropriate 3D cartilage volume to visualize the migration of nCe, which was not observed in rat TMJ and knee cartilage, were prepared from rabbit cartilage. After treating the cartilage explants with FITC-conjugated nCe, the samples were cultured at 37°C, 5% CO 2 , and under static conditions.
배양 2일 후 체외이식편을 PBS로 세척하고 과두 연골 부분을 절개한 후 공초점 레이저 현미경(z-stack mode, CLSM, LSM 700, Carl Zeiss)으로 관찰하였다. 그런 다음 침투 깊이를 계산하였다.After 2 days of culture, the explants were washed with PBS, the condylar cartilage was cut, and observed under a confocal laser microscope (z-stack mode, CLSM, LSM 700, Carl Zeiss). The penetration depth was then calculated.
[실시예 5] 체외 연골 세포 배양[Example 5] In vitro chondrocyte culture
모든 생화학 제품은 달리 명시되지 않는 한 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 공급되었다.All biochemical products were supplied by Sigma (St. Louis, MO, USA) unless otherwise specified.
체외 세포 배양 실험을 위해 흉골 부착부 근처의 갈비뼈 앞쪽 끝인 늑골의 관절 연골에서 쥐의 1차 늑골 연골세포를 추출하고 최대 3개의 계대 동안 세포를 단층 확장시켰다.For in vitro cell culture experiments, rat primary rib chondrocytes were extracted from the articular cartilage of the rib, the anterior end of the rib near the sternal attachment, and the cells were expanded in monolayer for up to three passages.
세포 성장 배지는 Dulbecco의 Modified Eagle 배지(DMEM), 10% FBS 및 1% PS로 구성된다. 연골세포(5000/웰)를 96-웰 플레이트의 각 웰에 24시간 동안 배양한 후, nCe(80 ~ 320μg/mL)를 처리하였다.Cell growth medium consists of Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM), 10% FBS and 1% PS. Chondrocytes (5000/well) were cultured in each well of a 96-well plate for 24 hours and then treated with nCe (80 to 320 μg/mL).
높은 산화 스트레스 조건은 30분 동안 H2O2(0.5 또는 1mM)의 전처리에 의해 활성화되었다.High oxidative stress conditions were activated by pretreatment with H 2 O 2 (0.5 or 1mM) for 30 min.
ROS 수준은 제조사 지침에 따라 Cellrox orange (Thermofisher, USA)에 의해 나노세리아 처리 1시간 후 측정되었으며 (H2O2를 추가하기 전에 염료 전처리 30분), ROS 신호는 디지털 이미징 시스템 (Celena® S, Logos Biosystems, 한국)으로 시각화되었다. 신호 강도는 Image J(1.46 version, USA)로 측정하였다.ROS levels were measured 1 h after nanoceria treatment by Cellrox orange (Thermofisher, USA) according to the manufacturer's instructions (dye pretreatment for 30 min before adding H 2 O 2 ), and ROS signals were measured using a digital imaging system (Celena® S, Logos Biosystems, Korea) was visualized. Signal intensity was measured with Image J (1.46 version, USA).
[실시예 6] 세포 생존율 및 세포자멸사(apoptosis) 분석[Example 6] Cell viability and apoptosis analysis
세포 생존율은 수용성 테트라졸륨염(WST, EZ-CYTOX, Daeillab Service, Korea)을 사용하여 평가하였다.Cell viability was assessed using water-soluble tetrazolium salt (WST, EZ-CYTOX, Daeillab Service, Korea).
세포 생존은 또한 이전 문헌에 따라 살아있는/죽은 염색(0.5μM 칼세인 AM 및 2μM ethidium homodimer-1 용액, Thermofisher, USA)에 의해 조사되었다.Cell survival was also examined by live/dead staining (0.5 μM calcein AM and 2 μM ethidium homodimer-1 solution, Thermofisher, USA) according to previous literature.
세포 사멸 거동을 평가하기 위해 4시간 동안 nCe로 처리한 세포를 분석을 위해 수집하였다. Annexin V 및 PI 염색은 제조사 지침에 따라 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, USA)를 사용하여 수행되었다.To assess cell death behavior, cells treated with nCe for 4 h were collected for analysis. Annexin V and PI staining was performed using the FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, USA) according to the manufacturer's instructions.
면역블롯팅 분석을 위해 세포(3mL의 5x104/mL)를 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 시드하고 90% 합류에 도달하도록 보충 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.For immunoblotting analysis, cells (3 mL of 5x104 /mL) were seeded in each well of a six-well plate and incubated for 24 h in supplemented medium to reach 90% confluence.
1% FBS 보충 배지에서 30분 동안 nCe(20μg/mL)를 처리한 후, 8시간 동안 배양하는 동안 750μM H2O2를 첨가하였다.After treatment with nCe (20 μg/mL) for 30 minutes in 1% FBS-supplemented medium, 750 μM H 2 O 2 was added during incubation for 8 hours.
단백질은 정지 프로테아제 및 포스파타제 억제제(Sigma Aldrich PPC1010)가 보충된 빙냉(ice cold) 용해 완충액(ELPISBIO EBA-1149)을 사용하여 세포로부터 추출하고 4℃에서 12,000g에서 원심분리하였다.Proteins were extracted from cells using ice cold lysis buffer (ELPISBIO EBA-1149) supplemented with quiescent protease and phosphatase inhibitors (Sigma Aldrich PPC1010) and centrifuged at 12,000g at 4°C.
pierce BCA 단백질 분석 키트(ThermoFisher Scientific 23225)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. Western blot은 이전 문헌에 따라 수행되었다.Protein concentration was measured using the pierce BCA protein assay kit (ThermoFisher Scientific 23225). Western blot was performed according to previous literature.
요약하면, 용해물을 로딩 완충액(0.25M Tris-HCl pH 6.8, 0.5M DTT, 10% SDS, 50% 글리세롤, 0.5% 브로모페놀 블루)과 1:5로 혼합하였다. 샘플을 95℃에서 5분 동안 가열하였다.Briefly, lysates were mixed 1:5 with loading buffer (0.25M Tris-HCl pH 6.8, 0.5M DTT, 10% SDS, 50% glycerol, 0.5% bromophenol blue). The sample was heated at 95°C for 5 minutes.
12.5% 또는 15%의 SDS-폴리아크릴아미드(polyacrylamide) 겔에 각 샘플 20μg을 로딩하였다. 단백질을 전기영동으로 분리하고 니트로셀룰로오스(nitrocellulose) 멤브레인(공극 크기 0.22μm, Bio RAD 162 - 0112)으로 이동시켰다.20 μg of each sample was loaded on a 12.5% or 15% SDS-polyacrylamide gel. Proteins were separated by electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane (pore size 0.22 μm, Bio RAD 162 - 0112).
멤브레인을 먼저 5% BSA(SolMate SM-BOV-100), 10x TBST 완충액(LPS 용액 CBT007) 및 DW로 구성된 차단 용액에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.The membrane was first incubated in blocking solution consisting of 5% BSA (SolMate SM-BOV-100), 10x TBST buffer (LPS solution CBT007) and DW for 1 hour at room temperature.
그런 다음 블로킹 버퍼에 희석된 1차 항체를 4℃에서 락킹 플랫폼에서 밤새 첨가하였다. TBST 용액으로 헹군 후, 멤브레인을 1시간 동안 흔들 플랫폼에서 실온에서 HRP-접합 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다.Primary antibodies diluted in blocking buffer were then added overnight on a rocking platform at 4°C. After rinsing with TBST solution, the membrane was incubated with HRP-conjugated secondary antibodies at room temperature on a rocking platform for 1 h.
단백질은 고감도를 위해 supersignal west pico PLUS 화학발광 기질(ThermoFisher Scientific 34580)을 사용하여 검출되었다. iBright CL1500 이미징 시스템(Thermofisher Scientific)을 사용하여 화학발광 검출을 수행하였다.Proteins were detected using supersignal west pico PLUS chemiluminescent substrate (ThermoFisher Scientific 34580) for high sensitivity. Chemiluminescence detection was performed using an iBright CL1500 imaging system (Thermofisher Scientific).
다음의 항체가 사용되었다: 항-BAX (1:1000, abcam ab32503), 항-Bcl-2 (1:1000, 세포 신호 3498 s), 항-절단된 카스파제-3 (세포 신호 9664), b-액틴(1:15000, Sigma aldrich A3854), 항-토끼 이차 HRP 항체 (세포 신호 7074).The following antibodies were used: anti-BAX (1:1000, abcam ab32503), anti-Bcl-2 (1:1000, Cell Signaling 3498 s), anti-cleaved caspase-3 (Cell Signaling 9664), b -Actin (1:15000, Sigma aldrich A3854), anti-rabbit secondary HRP antibody (Cell Signaling 7074).
[실시예 7] 연골세포의 분화 분석 [Example 7] Differentiation analysis of chondrocytes
정상 또는 고 ROS 조건에서 연골 세포의 분화는 성장 배지, 50μg/mL 아스코르브산, 1% ITS 프리믹스, 100nM 덱사메타손 및 10ng/mL 형질전환 성장 인자-β1로 구성된 분화 배지에서 평가되었다(Pepro-Tech, USA).Differentiation of chondrocytes under normal or high ROS conditions was assessed in growth medium consisting of 50 μg/mL ascorbic acid, 1% ITS premix, 100 nM dexamethasone and 10 ng/mL transforming growth factor-β1 (Pepro-Tech, USA ).
쥐의 1차 연골세포(30000개 세포)를 분화 전 1일 동안 24-웰 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 7일 또는 14일 동안 분화하는 동안 H2O2(0.125 - 0.5mM)를 격일로 선택적으로 처리하였다. nCe는 0.5mM H2O2-손상의 30분 후에 연골세포에 처리되었다.Rat primary chondrocytes (30000 cells) were inoculated into each well of a 24-well plate for 1 day before differentiation. H2O2 (0.125 - 0.5mM) was selectively treated every other day during differentiation for 7 or 14 days. nCe was treated with 0.5mM H 2 O 2 -chondrocytes after 30 min of injury.
연골세포 분화 마커(Sox9 및 aggrecan)는 실시간 PCR 분석을 사용하여 7일째에 평가되었다.Chondrocyte differentiation markers (Sox9 and aggrecan) were assessed at day 7 using real-time PCR analysis.
사프라닌 O (safranin O) 염색은 0.05% 패스트 그린(fast green) (5분), 1% 아세트산(acetic acid)(10초), 0.1% 사프라닌 O(safranin O) 용액(5분)을 사용하여 수행되었다(n = 5).Safranin O staining was performed using 0.05% fast green (5 minutes), 1% acetic acid (10 seconds), and 0.1% safranin O solution (5 minutes). was carried out using (n = 5).
[실시예 8] IL-1β 처리된 연골세포의 염증 징후[Example 8] Signs of inflammation in IL-1β treated chondrocytes
생체 내 염증 상태를 모방하기 위해 IL-1β(100ng/mL)를 연골 세포에 처리하였다. 24웰 플레이트의 각 웰에 5,000개의 세포를 시드한 후 나노세리아와 IL-1β를 함께 투여하였다.To mimic in vivo inflammatory conditions, chondrocytes were treated with IL-1β (100 ng/mL). After seeding 5,000 cells in each well of a 24-well plate, nanoceria and IL-1β were administered together.
그런 다음 유전자 및 단백질 수준을 실시간 PCR 및 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)법에 의해 분석하였다. 세포 증식은 WST 분석에 의해 측정되었다.Gene and protein levels were then analyzed by real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) methods. Cell proliferation was measured by WST analysis.
세포노화는 Cellular Senescence Detection Kit를 이용하여 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 효소활성을 조사하였다. 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2,PGE2)의 분비는 또한 ELISA Kit(Abcam, Cambridge, United Kingdom)에 의해 세포 배양 상층액으로부터 분석되었다(n = 3).Cellular senescence was examined for β-galactosidase enzyme activity using the Cellular Senescence Detection Kit. Secretion of prostaglandin E2 (PGE2) was also analyzed from cell culture supernatants by ELISA Kit (Abcam, Cambridge, United Kingdom) (n = 3).
[실시예 9] 대식세포 배양[Example 9] Macrophage culture
대식세포에 대한 효과는 RAW264.7 세포(ATCC, USA)를 사용하여 평가하였다.The effect on macrophages was evaluated using RAW264.7 cells (ATCC, USA).
세포(1x104, 600μL)를 24웰 플레이트의 각 웰에 시드하고 1시간의 기아 상태(완전 배지를 추가하지 않음) 후, 10% FBS, 1% PS 및 0.5mM H2O2로 보충된 DMEM에서 72시간 동안 배양하였다.Cells (1x104, 600 μL) were seeded into each well of a 24-well plate and after 1 h of starvation (no complete medium added) in DMEM supplemented with 10% FBS, 1% PS and 0.5mM H 2 O 2 Cultured for 72 hours.
그런 다음 세포 내 ROS 수준의 변화를 Cellrox orange assay(Thermofisher, USA)로 측정하였다.Then, changes in intracellular ROS levels were measured using Cellrox orange assay (Thermofisher, USA).
3일째에 염증유발(IL-1β 및 TNF-α) 및 항염(IL-10 및 CD163)과 관련된 mRNA 수준의 발현을 qPCR로 분석하였다.On day 3, the expression of pro-inflammatory (IL-1β and TNF-α) and anti-inflammatory (IL-10 and CD163) related mRNA levels was analyzed by qPCR.
[실시예 10] 연골세포/대식세포의 공동 배양[Example 10] Co-culture of chondrocytes/macrophages
연골 세포와 RAW264.7 세포의 공동 배양은 24웰과 트랜스웰(Transwell) 삽입물(3μm 기공)을 사용하여 수행되었다.Co-culture of chondrocytes and RAW264.7 cells was performed using 24-well and Transwell inserts (3 μm pores).
RAW264.7 세포를 2% FBS가 보충된 배지의 24개 웰에 24시간 동안 시딩한 후, 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS, 1μg/mL), 포르볼 미리스테이트 아세테이트(phorbol myristate acetate, PMA, 1μM), H2O2(0.5mM)를 4시간 동안 공동 처리하였다. 그 후, 배지를 교체하고 4시간 동안 배양하였다.RAW264.7 cells were seeded in 24 wells of medium supplemented with 2% FBS for 24 hours, followed by lipopolysaccharide (LPS, 1μg/mL) and phorbol myristate acetate (PMA, 1μM). , H 2 O 2 (0.5mM) was co-treated for 4 hours. Afterwards, the medium was replaced and cultured for 4 hours.
상층액(500g, 3분)에서 세포 또는 파편을 제거한 후, 컨디셔닝된 배지를 삽입물에 미리 부착된 연골세포(5,000개 세포)로 24시간 동안 이동시켰다.After removing cells or debris from the supernatant (500 g, 3 min), the conditioned medium was transferred to the chondrocytes (5,000 cells) pre-attached to the inserts for 24 h.
1시간의 공동 배양 후, 나노세리아를 연골세포로 삽입물에 직접 처리하였다. WST 분석에 의한 살아있는/죽은 염색 및 세포의 생존력은 삽입된 세포 샘플로 24시간에 수행되었다.After 1 hour of co-culture, nanoceria were treated directly on the implant with chondrocytes. Live/dead staining and cell viability by WST analysis was performed at 24 h with embedded cell samples.
활성화된 RAW264.7에서 생성된 과산화수소 수준은 Pierce™ Quantitative Peroxide Assay Kit(Thermofisher)를 사용하여 조절 배지(24시간 동안)로 평가되었다.Hydrogen peroxide levels produced in activated RAW264.7 were assessed in conditioned media (over 24 hours) using the Pierce™ Quantitative Peroxide Assay Kit (Thermofisher).
컨디셔닝된 배지를 원심분리하고(12000g, 5분) 제조사 프로토콜에 따라 수준을 측정하였다. The conditioned medium was centrifuged (12000 g, 5 min) and levels were measured according to the manufacturer's protocol.
컨디셔닝된 배지로부터의 ROS 수준의 변화는 컨디셔닝된 배지를 연골세포에 처리하기 30분 전에 첨가한 Cellrox 오렌지(Thermofisher)에 의해 감지되었으며, 30분 후에 적색 강도를 포착하고 Image J(1.46 version, USA)로 정량화하였다.Changes in ROS levels from conditioned medium were detected by Cellrox orange (Thermofisher) added 30 min before treatment of conditioned medium to chondrocytes, capturing the red intensity 30 min later and using Image J (1.46 version, USA). It was quantified.
연골 세포의 상층액을 4시간에서 수확하고 ELISA Kit(Abcam)에 의한 PGE2 검출을 위해 80℃에서 보관하였다.The supernatant of chondrocytes was harvested at 4 hours and stored at 80°C for PGE2 detection by ELISA Kit (Abcam).
[실시예 11] 통계분석[Example 11] Statistical analysis
모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시된다. 모든 분석에 대해 일원 ANOVA 및 Tukey의 비교 테스트를 수행하여 그룹 간의 가능한 유의미한 차이를 확인하였다. 통계 계산에는 SPSS PASW 버전 23.0 소프트웨어 프로그램(SPSS Inc.)이 사용되었다.All results are expressed as mean ± standard deviation. For all analyses, one-way ANOVA and Tukey's comparison tests were performed to determine possible significant differences between groups. The SPSS PASW version 23.0 software program (SPSS Inc.) was used for statistical calculations.
[실험예 1] 나노세리아의 국소 전달은 골관절염 관절의 병리학적 산화 스트레스를 감소시킴[Experimental Example 1] Local delivery of nanoceria reduces pathological oxidative stress in osteoarthritis joints
합성된 나노세리아(nCe)는 양의 표면 전하(ζ-전위 +17.8 mV)를 갖는 ~20nm(±6.5 nm, 도 1의 A의 삽입 이미지)의 평균 크기를 갖는다. The synthesized nanoceria (nCe) has an average size of ~20 nm (±6.5 nm, inset image in Figure 1A) with a positive surface charge (ζ-potential +17.8 mV).
급성 골관절염 동물 모델은 잘 알려진 골관절염 유도제이며 불활성화 및 건조 마이코박테리아로 구성된 완전한 프로인트(Freund) 보조제(CFA)의 관절 활막 주사에 의해 측두하악 관절(TMJ)에 생성되었다(보통 결핵균).Acute osteoarthritis animal models were created in the temporomandibular joint (TMJ) by joint synovial injection of complete Freund's adjuvant (CFA), a well-known osteoarthritis inducer, consisting of inactivated and dried mycobacteria (usually Mycobacterium tuberculosis).
CFA 주입 3일 후 μCT 및 조직학적 분석으로 골관절염의 유도가 확인되었으며, 비대층이 손상된 연골 용해, 하부관절에서 표면이 거칠어진 과두골 파괴 등 4기(중증 형태) 골관절염의 증상을 보였다. Three days after CFA injection, μCT and histological analysis confirmed the induction of osteoarthritis, showing symptoms of stage 4 (severe form) osteoarthritis, including cartilage lysis with damaged hypertrophic layer and destruction of the condylar bone with a rough surface in the lower joint.
CFA 주입 후 3일 후, 500μg/ml nCe(인산염 완충 식염수 중 용액 30μL)의 농도를 국소적으로 한 번 주입하여 치료 효과를 결정하였다.Three days after CFA injection, the treatment effect was determined by a single local injection of a concentration of 500 μg/ml nCe (30 μL of solution in phosphate-buffered saline).
첫째, 관절 활막에서 nCe의 존재는 FITC-conjugated nCe의 광학 신호를 기반으로 시각화되었으며 (도 1의 B), ~120μm(±40)μm 깊이의 프로파일로 측정된 토끼 과두 외식편을 사용하여 (자세한 내용은 측정된 방법 섹션) 평가한 바와 같이 과두 조직으로의 깊은 침투도 입증되었다.First, the presence of nCe in the joint synovium was visualized based on the optical signal of FITC-conjugated nCe (Figure 1B), using rabbit condylar explants measured with profiles at a depth of ∼120 μm (±40) μm (see details). Deep penetration into the condylar tissue was also demonstrated, as assessed in the Methods section).
치료 후 3일째에 회수된 조직 샘플을 분석하여 골관절염 염증 진행에 대한 500㎍/ml nCe의 효과를 평가하였다. CFA에 의해 유발된 염증 연골에서 붕괴된 비대층이 nCe 처리된 샘플에서 실질적으로 회복되었다.Tissue samples collected 3 days after treatment were analyzed to evaluate the effect of 500 μg/ml nCe on the progression of osteoarthritis inflammation. The collapsed hypertrophic layer in CFA-induced inflamed cartilage was substantially recovered in nCe-treated samples.
nCe의 생체 내 독성과 관련하여, 국소 주사 후 주요 장기(간, 폐 및 신장)에 nCe의 축적 가능성도 분석했지만, 전신 투여 시에도 nCe의 심각한 장기 독성이 확인되지 않았다.Regarding the in vivo toxicity of nCe, the possibility of accumulation of nCe in major organs (liver, lung, and kidney) after local injection was also analyzed, but no serious organ toxicity of nCe was confirmed even when administered systemically.
조직 샘플의 조직학적 관찰은 TMJ 주입 nCe의 식별 가능한 기관 독성을 명확히 하지 않았지만, nCe의 미래에 대한 장기적인 임상적 이용 가능성을 찾아야 할 수도 있다.Although histological observations of tissue samples did not clarify any discernible organ toxicity of TMJ-injected nCe, the long-term clinical use of nCe may need to be explored in the future.
다음으로 조직 내 높은 산화 스트레스의 지표로 잘 알려진 iNOS의 발현을 확인하였다.Next, the expression of iNOS, a well-known indicator of high oxidative stress in tissues, was confirmed.
면역 조직 화학에 기초하여, OA군에서 다수의 Inos(+) 세포가 확인된 반면, nCe 처리군(도 1의 D)에서 그 수가 현저히 감소하여 생체 내 세포에 의한 iNOS 생성을 억제하는 nCe의 효과적인 역할을 시사한다.Based on immunohistochemistry, a large number of Inos(+) cells were identified in the OA group, whereas their number was significantly reduced in the nCe-treated group (Figure 1D), indicating the effectiveness of nCe in inhibiting iNOS production by cells in vivo. suggests a role.
조직 샘플에서 생성된 ROS는 염료 강도에 의해 시각화된 바와 같이 상당히 감소되었다(도 1의 E).ROS generated in tissue samples were significantly reduced as visualized by dye intensity (Figure 1E).
본 발명자들은 높은 산화 스트레스 조건하의 연골 세포 배양에서 세포 수준으로 nCe의 효능을 추가로 테스트하였다.We further tested the efficacy of nCe at the cellular level in chondrocyte cultures under high oxidative stress conditions.
nCe 농도(최대 640μg/mL)의 시험관 내 세포 생존 범위를 스크리닝한 후, 쥐의 연골 세포의 시험관 내 배양을 모델링하였다.After screening the range of in vitro cell survival at nCe concentrations (up to 640 μg/mL), in vitro culture of rat chondrocytes was modeled.
ROS assay의 경우, 두 가지 다른 용량의 H2O2(0.5 또는 1mM)를 먼저 30분 동안 연골세포에 처리한 다음, nCe(80 ~ 320μg/mL)를 60분 동안 처리하였다.For the ROS assay, chondrocytes were first treated with two different doses of H 2 O 2 (0.5 or 1mM) for 30 minutes, and then with nCe (80 to 320 μg/mL) for 60 minutes.
H2O2 처리는 세포 내 ROS 수준을 증가시켰고, nCe 처리 시 ROS 수준은 nCe의 용량 의존적으로 실질적으로 감소(30 ~ 80% 감소)하여 산화 스트레스를 받은 연골 세포에서 nCe의 ROS 소거 효과를 보여주었다(도 1의 F).H 2 O 2 treatment increased intracellular ROS levels, and upon nCe treatment, ROS levels were substantially reduced (30 to 80% reduction) in a nCe dose-dependent manner, demonstrating the ROS scavenging effect of nCe in chondrocytes subjected to oxidative stress. (F in Figure 1).
사실, nCe의 효소 및 촉매 활성이 주목할만하다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 분석에 의한 퍼옥시다제 활성, SOD 억제 및 DPPH 억제는 모두 용량 의존적 방식으로 nCe 처리에 의해 증가되었다. 이는 생체 내 골관절염 조건 및 시험관 내 높은 산화 스트레스 조건 모두에서 세포에서 과도한 ROS를 제거하는 데 nCe의 효과적인 역할을 지원한다.In fact, the enzymatic and catalytic activities of nCe are noteworthy. Peroxidase activity, SOD inhibition, and DPPH inhibition by 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) assay were all increased by nCe treatment in a dose-dependent manner. This supports an effective role of nCe in scavenging excess ROS from cells both under osteoarthritis conditions in vivo and high oxidative stress conditions in vitro.
관찰된 바와 같이, 염증이 심한 관절에 대한 단일 국소 치료와 함께 nCe의 효과적인 역할은 이전에 개발된 생체 재료가 치료 효능을 얻기 위해 다중 주입되었기 때문에 주목할만한 것이다.As observed, the effective role of nCe with single topical treatment for highly inflamed joints is noteworthy as previously developed biomaterials were injected multiple times to achieve therapeutic efficacy.
[실험예 2] nCe는 골관절염 손상으로부터 연골층을 보호함[Experimental Example 2] nCe protects the cartilage layer from osteoarthritis damage
골관절염 조건에서 500μg/ml nCe의 생체 내 효능을 간단히 확인한 후, 농도 범위를 250 - 2000μg/mL로 확장했다.After briefly confirming the in vivo efficacy of 500 μg/ml nCe in osteoarthritis conditions, the concentration range was extended to 250 - 2000 μg/mL.
10일째의 헤마톡실린 및 에오신(H&E)의 조직학적 관찰 결과, 섬유성 붕해층('F')과 증식층('P', 줄기층)의 과형성이 있는 골관절염 대조군에서 연골층에 심한 염증 징후가 나타났으며, 연골의 조직학적 표지자로 여겨지는 비대('H', 붉은 점선) 층이 현저하게 얇아졌다(도 2의 A). 그러나, nCe 처리 그룹은 500μg/mL에서 피크로 포물선 형태로 연골층의 용량 의존적 보존을 보여주었다.Histological observation of hematoxylin and eosin (H&E) at day 10 shows signs of severe inflammation in the cartilaginous layer in the osteoarthritis control group with hyperplasia of the fibrous disintegrating layer ('F') and the proliferative layer ('P', stem layer). appeared, and the hypertrophic ('H', red dotted line) layer, which is considered a histological marker of cartilage, became significantly thinner (Figure 2A). However, the nCe-treated group showed a dose-dependent preservation of the cartilage layer in a parabolic fashion with a peak at 500 μg/mL.
조직학적 이미지에서 측정된 비대층의 두께를 기반으로 nCe의 효능은 명확했다. 온전한 그룹에서 125μm의 두께는 OA 그룹에서 50μm까지 얇아졌고 500μg/mL nCe로 최대 105μm까지 회복되었다(보존은 다른 nCe의 투여량에서도 관찰되었으며, 각각 250, 1000 및 2000μg/mL에서 70, 90 및 75μm).Based on the thickness of the hypertrophic layer measured in histological images, the efficacy of nCe was clear. The thickness of 125 μm in the intact group was thinned to 50 μm in the OA group and recovered up to 105 μm with 500 μg/mL nCe (preservation was also observed at different doses of nCe, 70, 90, and 75 μm at 250, 1000, and 2000 μg/mL, respectively. ).
이러한 nCe의 포물선 효과는 500mg/mL가 개별 나노입자가 잘 분산되고 응집되어 관련 세포 독성을 일으키지 않고 생물학적 분자와 세포와 효과적으로 상호 작용하는 데 최적일 수 있기 때문에 고려되며, 이는 다른 생체 내 실험에서도 유사하게 나타났다.This parabolic effect of nCe is considered because 500 mg/mL may be optimal for individual nanoparticles to be well dispersed and aggregated to interact effectively with biological molecules and cells without causing associated cytotoxicity, which is similar in other in vivo experiments. It appeared.
다음으로 사프라닌 O(safranin O)/패스트 그린(fast green) 염색으로 연골 프로테오글리칸(연골 내 주요 ECM 분자로 수화 및 팽창을 통한 압축력에 견디는)을 평가하였다. Next, cartilage proteoglycans (major ECM molecules in cartilage that resist compressive forces through hydration and swelling) were evaluated using safranin O/fast green staining.
아그레칸(aggrecan)에 부착된 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans)의 조직학적 염색을 반정량적으로 평가하였다(도 2의 B).Histological staining of glycosaminoglycans attached to aggrecan was semiquantitatively evaluated (Figure 2B).
풍부하고 균일하게 분포된 프로테오글리칸(proteoglycan)은 손상되지 않은 그룹에서 잘 관찰되었지만 연골과 연골하골이 실질적으로 침식된 OA 그룹에서는 거의 파괴되었다.Abundant and uniformly distributed proteoglycan was well observed in the intact group, but was almost destroyed in the OA group, where cartilage and subchondral bone were substantially eroded.
nCe(특히 500μg/mL)로 처리했을 때 연골 프로테오글리칸은 연골과 연골하 골의 침식을 감소시키면서 잘 보존되는 것으로 나타났다.When treated with nCe (particularly at 500 μg/mL), cartilage proteoglycans were shown to be well preserved while reducing erosion of cartilage and subchondral bone.
연골의 골관절염 병변의 중증도에 대해 자주 사용되는 조직병리학적 분류인 Mankin 점수는 프로테오글리칸 분해를 포함한 병리학적 중증도를 완화하는 데 nCe 처리의 효과를 분명히 보여주었으며, 이는 압축 하중에 대한 저항과 같은 연골의 기계적 기능의 가능한 회복을 제안한다.The Mankin score, a frequently used histopathological classification for the severity of osteoarthritis lesions of cartilage, clearly demonstrated the effectiveness of nCe treatment in alleviating the severity of the pathology, including proteoglycan degradation, which in turn improved the mechanical properties of cartilage, such as resistance to compressive loading. Suggest possible restoration of function.
[실험예 3] nCe는 세포 사멸을 억제하여 산화 스트레스로부터 연골 세포를 구함[Experimental Example 3] nCe saves chondrocytes from oxidative stress by inhibiting cell death
생체 내 연구 결과에 따라 nCe 치료가 연골 세포 생존에 영향을 미칠 수 있다고 가정하고, 이를 테스트하기 위해 H2O2 손상(insult)을 사용하여 높은 산화 스트레스 조건에서 쥐 연골 세포의 시험관 내 배양을 설계하고 살아있는/죽은 염색 및 세포 계수 키트-8(CCK 분석)에 의해 세포 생존을 측정하였다(도 3의 B).Based on our in vivo findings, we hypothesized that nCe treatment may affect chondrocyte survival, and to test this, we designed in vitro cultures of rat chondrocytes under high oxidative stress conditions using H2O2 injury (insult) and live/ Cell survival was measured by dead staining and cell counting kit-8 (CCK assay) (Figure 3B).
연골세포(chondrocytes)의 30%만이 저산소 조건으로 인해 1mM의 H2O2에서 생존했지만, nCe 처리(최대 160μg/ml의 용량)로 생존율이 ~80%로 증가하였다. nCe에 의한 세포 구조 효과는 세포 사멸 사건의 관점에서 더 조사되었다.Only 30% of chondrocytes survived in 1mM H 2 O 2 due to hypoxic conditions, but nCe treatment (dose up to 160 μg/ml) increased the survival rate to ~80%. The cytostructural effects caused by nCe were further investigated from the perspective of cell death events.
1mM H2O2에 의한 높은 산화 스트레스 하에서, 배양 4시간 및 8시간에 연골세포의 annexin V 및 PI 염색은 80㎍/ml의 nCe 처리가 세포사멸적(apoptotic) 세포의 분율을 유의하게 감소시키는 것을 보여주었다(H2O2군 대비 25~40%)(도 3의 C).Under high oxidative stress caused by 1mM H 2 O 2 , annexin V and PI staining of chondrocytes at 4 and 8 hours of culture showed that treatment with 80 μg/ml nCe significantly reduced the fraction of apoptotic cells. (25-40% compared to the H 2 O 2 group) (C in Figure 3).
nCe의 항-세포사멸적(anti-apoptotic) 효과는 백혈구 세포주(U937 및 Jurkat 세포)와 같은 다른 유형의 세포에서도 보고되었다. 그런 다음 친-(pro-) 또는 항-(anti-) 세포사멸적(apoptotic) 경로와 관련된 주요 신호 분자 중 일부(각각 Bax2 및 Bcl-2)는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다(도 3의 D).The anti-apoptotic effect of nCe has also been reported in other cell types, such as leukocyte cell lines (U937 and Jurkat cells). Then, some of the key signaling molecules (Bax2 and Bcl-2, respectively) involved in pro- or anti-apoptotic pathways were identified by Western blot analysis (Figure 3D). .
결과는 항 세포 사멸 마커 Bcl-2가 높은 ROS 조건에서 nCe 치료군에서 상향 조절되었지만 친-세포사멸적(pro-apoptotic) 마커 BAX는 크게 변경되지 않았음을 보여 주었으며, 아마도 친-세포사멸적 경로(pro-apoptotic pathways)의 억제가 아니라, Bcl-2가 nCe의 항-세포사멸적(anti-apoptotic) 역할을 매개한다는 것을 암시한다.The results showed that the anti-apoptotic marker Bcl-2 was upregulated in the nCe treated group under high ROS conditions, but the pro-apoptotic marker BAX was not significantly altered, possibly affecting the pro-apoptotic pathway. This suggests that Bcl-2, rather than inhibition of apoptotic pathways, mediates the anti-apoptotic role of nCe.
다음으로, 관절염 연골에서 세포 DNA 손상 정도를 검출하는 데 사용되어 온 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP nick end labeling(TUNEL) 분석에 의해 생체 내 샘플에서 항-세포자멸사 효과를 분석하였다.Next, the anti-apoptotic effect was analyzed in in vivo samples by terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) assay, which has been used to detect the extent of cellular DNA damage in arthritic cartilage.
골관절염 관절 조직에서 TUNEL 양성 세포는 특히 OA 그룹의 증식층(빨간색 화살표)과 연골하 영역의 일부(흰색 화살표)에서 명확하게 검출되었지만, 가장 높은 나노세리아 그룹에서 실질적으로 감소하였고, 500㎍/ml에서 관찰된 효과(도 3의 E)는 연골 비대층 두께 및 프로테오글리칸 함량의 전술한 조직학적 발견과 일치하였다.In osteoarthritis joint tissue, TUNEL-positive cells were clearly detected, especially in the proliferative layer (red arrow) and part of the subchondral area (white arrow) in the OA group, but were substantially reduced in the highest nanoceria group, at 500 μg/ml. The observed effect (Figure 3E) was consistent with the previously described histological findings of cartilage hypertrophy thickness and proteoglycan content.
생체 내 및 시험관 내에서 관찰된 이러한 발견은 항-세포자멸사에 대한 nCe 효과가 항산화제인 시스타티오닌과 유사한 경우로 간주되는 특히 산화환원 의존적일 수 있음을 의미한다.These findings, observed in vivo and in vitro, imply that the nCe effect on anti-apoptosis may be particularly redox dependent, which is considered to be the case similarly to the antioxidant cystathionine.
프로그램된 죽음으로 인한 높은 산화 스트레스 하에서의 세포 구조는 퇴행성 상태를 복구 단계로 전환하기 위한 전제 조건으로 간주되며, 이는 항염증성 사이토카인 분비 및 기질 합성과 같은 일련의 부스팅 이벤트를 동반하여 기능 회복으로 이어진다.Cellular rescue under high oxidative stress resulting from programmed death is considered a prerequisite for transitioning the degenerative state into a repair phase, which is accompanied by a series of boosting events such as anti-inflammatory cytokine secretion and matrix synthesis, leading to functional recovery.
[실험예 4] nCe는 대식세포를 항염증제로 조절함[Experimental Example 4] nCe regulates macrophages as an anti-inflammatory agent
다음으로 본 발명자들은 골관절염 상태에서 관찰된 항-세포자멸사 및 세포 구조 역할과 관련된 nCe의 항염증 작용을 조사하였다. 조직 샘플을 면역조직화학적 염색으로 분석하여 몇 가지 주요 친전염성 마커를 확인하였다. Next, we investigated the anti-inflammatory action of nCe in relation to its anti-apoptotic and cell structural roles observed in osteoarthritis conditions. Tissue samples were analyzed by immunohistochemical staining to identify several key pro-infectious markers.
시클로옥시게나아제 2(cyclooxygenase 2, COX2)와 프로스타글란딘 E2(prostaglandin E2, PGE2)는 골관절염이 COX2의 활성화를 통해 연골 분해에 중요한 금속단백분해효소(metalloproteinase, MMP) 효소를 생산하는 주요 이화(catabolic) 인자 중 하나인 PGE2의 생산을 자극한다고 알려져 선택되었고, COX2의 과잉 생산은 친전염성 사이토카인에 의해 유발된다.Cyclooxygenase 2 (COX2) and prostaglandin E2 (PGE2) are major catabolic agents in osteoarthritis that produce metalloproteinase (MMP) enzymes important for cartilage breakdown through activation of COX2. It was selected because it is known to stimulate the production of PGE2, one of the factors, and overproduction of COX2 is caused by pro-inflammatory cytokines.
COX2 및 PGE2(적색)의 발현은 OA 그룹에서 실질적으로 상승한 반면, 두 발현 모두 nCe 처리 그룹에서 유의하게 감소하였다(OA군 대비 50~20% 하락)(도 4의 A). nCe에 의한 COX2 및 PGE2의 하향 조절은 연골 세포에 무독성인 것으로 스크리닝된 농도(20 ~ 80μg/mL)를 사용하는 시험관 연골 세포 배양에서 추가로 확인되었다.The expression of COX2 and PGE2 (red) was substantially elevated in the OA group, while both expressions were significantly decreased in the nCe-treated group (50-20% drop compared to the OA group) (Figure 4A). Downregulation of COX2 and PGE2 by nCe was further confirmed in in vitro chondrocyte cultures using concentrations (20–80 μg/mL) screened to be nontoxic to chondrocytes.
이를 위해 IL-1β를 연골세포에 4시간 동안 처리하여 PGE2 및 COX2 생성을 활성화시켰다(도 4의B-i).For this purpose, chondrocytes were treated with IL-1β for 4 hours to activate PGE2 and COX2 production (Figure 4B-i).
IL-1β-자극된 COX2 mRNA 발현(IL-1β로 자극된 ~3.8배)은 H2O2 조건에서 특히 두드러진 nCe에 의해 상당히 하향 조절되는 것으로 나타났다(도 4의 B-ii).IL-1β-stimulated COX2 mRNA expression (~3.8-fold when stimulated with IL-1β) was found to be significantly downregulated by nCe, which was particularly pronounced under H 2 O 2 conditions (Figure 4B-ii).
nCe에 의한 COX2 유전자의 하향 조절은 손상된 척수에서도 관찰되었다. 또한, IL-1β에 의해 자극된 PGE2의 분비는 산화 스트레스 조건에서 nCe 처리에 의해 유의하게 감소되었다.Downregulation of the COX2 gene by nCe was also observed in injured spinal cord. Additionally, the secretion of PGE2 stimulated by IL-1β was significantly reduced by nCe treatment under oxidative stress conditions.
다음으로 조직 샘플을 분석하여 대식세포 표현형의 유병률을 확인하여 해당 과정이 염증을 유발하는지 또는 복구 단계로 이동하는지를 나타낸다.Next, tissue samples are analyzed to determine the prevalence of macrophage phenotypes, indicating whether the process is proinflammatory or moving toward a repair phase.
관절 연골에 침투한 대식세포는 초기에 고전적으로 활성화되어(M1), 친염증성 사이토카인으로 신호를 보내는 동안 세포 파편의 식균 작용에 참여하는 반면 대안적으로 활성화된 단계(M2)로, 극성화되어 환경을 항염증성으로 전환한다.Macrophages infiltrating the articular cartilage are initially classically activated (M1), where they participate in phagocytosis of cellular debris while signaling with pro-inflammatory cytokines, while in an alternatively activated phase (M2), they are polarized. Transforms the environment to be anti-inflammatory.
여기에서 두 개의 서로 다른 마커(M2의 경우 CD206 및 M1의 경우 IL-1β)를 사용한 조직 샘플의 면역조직화학적 염색은 연골층 전체에 걸쳐 OA 대조군과 나노세리아 처리군 사이의 분명한 차이를 보여주었다.Here, immunohistochemical staining of tissue samples using two different markers (CD206 for M2 and IL-1β for M1) showed clear differences between the OA control and nanoceria-treated groups throughout the cartilage layer.
nCe 그룹은 IL-1β(+) 세포의 발현이 적은 더 뚜렷한 CD206(+) 세포를 나타낸 반면, OA 그룹은 반대 현상(도 4의 C)을 보여 특히 OA 환경에서 대식세포를 항염증 및 복구 단계로 분극화하는 면역 조절에서 nCe의 역할을 입증하였다.The nCe group showed more pronounced CD206(+) cells with less expression of IL-1β(+) cells, whereas the OA group showed the opposite phenomenon (Figure 4C), specifically supporting macrophages in the OA environment during the anti-inflammatory and repair phases. The role of nCe in polarizing immune regulation was demonstrated.
그런 다음 산화 스트레스 하에 nCe에 대한 대식세포의 전환 가능한(친염증 또는 항염증) 행동을 시험관 내 배양에서 조사하였다.The switchable (pro- or anti-inflammatory) behavior of macrophages toward nCe under oxidative stress was then investigated in in vitro cultures.
높은 H2O2 손상(insult) 하에서 나노세리아로 처리된 대식세포 세포주 (RAW264.7)는 생체 내 연구 결과와 일치하는 도 4의 D와 같이 항염증 유전자(IL-10)의 동시 상향 조절과 함께 유의하게 하향 조절된 친염증 유전자(TNF-α 및 IL-1β)를 발현하였다.Under high H 2 O 2 insult, the macrophage cell line (RAW264.7) treated with nanoceria showed simultaneous upregulation of anti-inflammatory gene (IL-10) as shown in Figure 4D, consistent with in vivo study results. Together, significantly downregulated pro-inflammatory genes (TNF-α and IL-1β) were expressed.
[실험예 5] 연골 세포의 기능적 활성은 nCe에 의해 보존됨[Experimental Example 5] Functional activity of chondrocytes is preserved by nCe
높은 산화 스트레스로부터 연골 세포를 구출할 뿐만 아니라 대식세포를 항염증 및 회복으로 조절하는 nCe의 효과적인 역할을 확인한 후, 본 발명자들은 그 효과가 연골 세포의 기능적 활성(분화)에도 반영될 수 있다고 가정하였다.After confirming the effective role of nCe in rescuing chondrocytes from high oxidative stress as well as regulating macrophages in anti-inflammatory and reparative ways, we hypothesized that the effect may also be reflected in the functional activity (differentiation) of chondrocytes. .
이를 위해 H2O2(0.5mM의 단일 용량)로 분화 조건에서 쥐의 1차 연골세포를 배양하였다(도 5의A-i).For this purpose, rat primary chondrocytes were cultured under differentiation conditions with H 2 O 2 (single dose of 0.5mM) (Figure 5Ai).
정상산소 상태에서 nCe 처리는 사프라닌 O(safranin O) 염색에 의한 보존된 GAG 침착과 qPCR에 의한 주요 연골원성 전사(Sox2) 및 기질 유전자(aggrecan)의 자극된 발현에 의해 나타난 바와 같이 연골세포 분화를 감소시키지 않았다(도 5의 A-ii).Under normoxic conditions, nCe treatment resulted in chondrocytes, as shown by preserved GAG deposition by safranin O staining and stimulated expression of key chondrogenic transcripts (Sox2) and matrix genes (aggrecan) by qPCR. It did not reduce differentiation (Figure 5A-ii).
일시적인 산화 스트레스 조건(0.5mM에서 단일 H2O2 손상)에서 nCe 처리된 연골세포는 처리되지 않은 것보다 GAG 침착 및 유전자 발현이 약간 더 높은 것으로 나타났다(그림 5의 A-iii).Under transient oxidative stress conditions (single H2O2 damage at 0.5mM), nCe-treated chondrocytes showed slightly higher GAG deposition and gene expression than untreated ones (A-iii in Figure 5).
H2O2 손상이 연속적인 골관절염 미세 환경을 더 잘 모방하기 위해 H2O2(0.125, 0.25 및 0.5mM)를 분화 조건의 7일까지 격일로 처리하였다(도 5의 B-i).To better mimic the osteoarthritis microenvironment in which H 2 O 2 damage is continuous, H 2 O 2 (0.125, 0.25, and 0.5mM) was treated every other day until day 7 of differentiation conditions (Bi in Figure 5).
nCe 처리군은 훨씬 더 많은 생존 세포를 나타내었지만, 산화 스트레스 조건에서는 거의 관찰되지 않은 반면 GAG 침착은 크게 다르지 않았다(도 5의 B-ii, iii).The nCe-treated group showed significantly more viable cells, but few were observed under oxidative stress conditions, while GAG deposition was not significantly different (Figure 5B-ii, iii).
나노세리아에 의해 회수된 연골세포를 분화 배지에서 추가로 7일(총 14일) 동안 배양했을 때, 사프라닌 O에 대해 양성인 보다 강한 신호가 관찰되었으며(도 5의 B-iv), 이는 높은 산화 스트레스로부터 구조된 연골세포에 연장된 분화 신호가 제공될 때 후속 연골 분화 활성을 발휘함을 나타낸다.When chondrocytes recovered by nanoceria were cultured in differentiation medium for an additional 7 days (total 14 days), a stronger signal positive for safranin O was observed (Figure 5B-iv), indicating a high It is shown that chondrocytes rescued from oxidative stress exert subsequent chondrogenic differentiation activity when provided with a prolonged differentiation signal.
[실험예 6] nCe는 염증성 대식세포와 연골세포의 상호작용을 조절함[Experimental Example 6] nCe regulates the interaction between inflammatory macrophages and chondrocytes
i) ROS의 제거, ii) 연골세포의 구조 및 분화 기능 보존, 및 iii) 대식세포 표현형의 이동을 포함하는 일련의 분자 및 세포 이벤트에서 높은 산화 스트레스 또는 친염증성 조건에서 nCe의 역할을 확인했지만, 연골세포와 대식세포의 상호작용 행동도 조사할 필요가 있다.confirmed the role of nCe under conditions of high oxidative stress or pro-inflammatory conditions in a series of molecular and cellular events, including i) removal of ROS, ii) preservation of chondrocyte structure and differentiation function, and iii) shift of macrophage phenotype; The interactive behavior of chondrocytes and macrophages also needs to be investigated.
조직 상주 기질 세포(연골 세포, 섬유아세포, 내피 세포 등)와 면역 세포의 상호 작용은 변경된 환경과 세포 및 조직 운명에 답하는 데 중요한 것으로 간주된다.The interaction of immune cells with tissue-resident stromal cells (chondrocytes, fibroblasts, endothelial cells, etc.) is considered important in responding to altered environments and cell and tissue fates.
이 문제를 해결하기 위해 여기에서 연골 세포로 염증을 유발하도록 고도로 활성화된 대식세포의 공동 배양을 모델링하였다.To address this issue, we modeled here a co-culture of highly activated macrophages to induce inflammation with chondrocytes.
대식세포의 활성화는 4시간 동안 H2O2와 함께 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 및 프로볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(probol 12-myristate 13-acetate, PMA)의 추가 인자로 가능했으며 연골 세포와의 상호 작용은 조절 배지를 통하거나 트랜스웰(transwell)에서 공동 배양을 통해 이루어졌다. Activation of macrophages was possible with the additional factors of lipopolysaccharide (LPS) and probol 12-myristate 13-acetate (PMA) along with H2O2 for 4 hours and interaction with chondrocytes. Action was achieved via conditioned medium or via co-culture in transwells.
LPS/PMA/H2O2를 사용한 자극은 현미경 이미지에서 볼 수 있듯이 대식세포를 손상시키고 활성화시키는 것으로 나타났다. 또한, 활성화된 대식세포의 조절 배지로 처리하면 많은 연골세포가 사멸되는 것으로 나타났지만 (도 6의 C에서 정량화된 바와 같이 처리되지 않은 대조군의 ~30%까지) 나노세리아의 투여에 의해 상당히(최대 80%) 회복될 수 있었다.Stimulation with LPS/PMA/H2O2 was shown to damage and activate macrophages, as seen in the microscopic images. Additionally, although treatment with conditioned medium from activated macrophages resulted in the death of many chondrocytes (up to ~30% of untreated controls, as quantified in Figure 6C), they were killed significantly (up to ~30% of untreated controls) by administration of nanoceria. 80%) was able to recover.
활성화된 대식세포와 직접 공동 배양하는 경우, 연골세포는 nCe를 투여해야만 잘 생존할 수 있었다(도 6의 D).When directly co-cultured with activated macrophages, chondrocytes could survive well only when nCe was administered (Figure 6D).
동시에 활성화된 대식세포에서 정량화된 산화 스트레스 수준은 배양 기간 동안 상당히 높은 것으로 기록되어 (특히 4h에서 정점)(도 6의 E), 활성화된 대식세포에 의해 생성된 산화 스트레스가 연골세포 손상의 중요한 원인일 수 있음을 시사한다.At the same time, the level of oxidative stress quantified in activated macrophages was recorded to be significantly high during the culture period (particularly peaking at 4 h) (Figure 6E), suggesting that oxidative stress generated by activated macrophages is an important cause of chondrocyte damage. suggests that it may be possible.
결과적으로, 활성화된 대식세포에 의해 영향을 받는 연골세포의 세포내 ROS 수준(조건 배지 포함)은 ~2.5배 증가를 보여 nCe의 존재 하에서 후속적으로 하향 조절되었다(도 6의 F). 또한, 면역 반응성 연골세포 이화 작용의 주요 다운스트림 산물로 간주되는 연골세포의 이화 마커 PGE2를 분석하였다.As a result, intracellular ROS levels in chondrocytes affected by activated macrophages (including conditioned medium) showed an ∼2.5-fold increase and were subsequently downregulated in the presence of nCe (Figure 6F). Additionally, we analyzed the chondrocyte catabolic marker PGE2, which is considered a major downstream product of immunoreactive chondrocyte catabolism.
ELISA(도 6의 F)에 의한 정량 분석은 PGE2가 친염증성 대식세포로 조절된 연골세포로부터 상당한 수준으로 분비되었음을 보여주었으며, 이는 나노세리아의 존재와 함께 배양될 때 유의하게 감소하여 염증성 이화 작용에 대한 연골세포의 보호를 시사한다.Quantitative analysis by ELISA (Figure 6F) showed that PGE2 was secreted at significant levels from chondrocytes conditioned by pro-inflammatory macrophages, which was significantly reduced when cultured in the presence of nanoceria, contributing to inflammatory catabolism. This suggests protection of cartilage cells.
연골 세포가 이화 작용을 하고 대식세포와의 피드백에 관여하는 것을 금지함으로써, 활성화된 대식세포가 있는 연골세포의 모델링된 실험은 대식세포로부터의 염증촉진 신호(특히 여기에서 설명된 ROS 및 PGE2)가 연골세포의 생존 가능성과 추가 기능적 활성에 미치는 중요한 영향과 세포 상호작용에서 nCe의 개입 역할의 기초가 된다.By prohibiting chondrocytes from engaging in catabolism and feedback with macrophages, modeled experiments of chondrocytes with activated macrophages allow pro-inflammatory signals from macrophages (particularly ROS and PGE2 described here) to occur. It underlies the important impact on the viability and further functional activity of chondrocytes and the intervening role of nCe in cellular interactions.
연골세포에서 나노세리아의 직접적인 역할과 함께, 세포 상호작용에 대한 개입은 세포가 고도의 염증 환경을 극복하고 복구 과정에 응답하는 데 도움이 될 것이다.In addition to the direct role of nanoceria in chondrocytes, intervention in cellular interactions will help cells overcome the highly inflammatory environment and respond to repair processes.
[실험예 7] nCe는 연골하 골 파괴를 예방함[Experimental Example 7] nCe prevents subchondral bone destruction
본 발명자들은 항염증 및 연골 보호 이벤트가 일반적으로 연골 변성을 동반하는 연골하 골 손실의 변화와 관련이 있는지 조사하고 심각한 골관절염 관절의 최신 병리학적 증상으로 간주하였다. 하부 관절 뼈는 μCT 분석으로 평가되었다.We investigated whether anti-inflammatory and chondroprotective events are associated with changes in subchondral bone loss, which are usually accompanied by cartilage degeneration and considered to be the latest pathological manifestations of severe osteoarthritic joints. Subarticular bone was assessed by μCT analysis.
시상면 및 관상면에서 재구성된 3D 이미지는 OA 그룹에서 뼈 파괴의 주목할만한 징후, 즉, 원래 위치 (빨간색 점선 영역)에서 뼈 가장자리의 수축 및 과두 조직의 경계 근처의 다공성 형태 (강도 기준)를 나타내었지만, 이는 나노세리아-처리군에서 실질적으로 방지되었다(도 7의 A).The reconstructed 3D images in the sagittal and coronal planes reveal notable signs of bone destruction in the OA group, i.e. shrinkage of bone edges from their original positions (red dotted area) and porous morphology near the border of the condylar tissue (based on intensity). However, this was substantially prevented in the nanoceria-treated group (A in Figure 7).
이미지에서 정량화된 골용적(BV), 골용적/조직용적비(BV/TV), 골표면/골용적비(BS/BV)는 OA군에서 유의하게 감소된 골손실(무손상 대조군의 ~50%)을 나타내었지만, 특히 500μg/mL에서 nCe 처리로 잠재적으로 예방(손상되지 않은 대조군의 ~70-80%로 회복됨)할 수 있었고(도 7의 B), nCe가 심각한 골관절염 변성으로부터 연골하 골을 보호하는 데 효과적임을 입증했으며, 그렇지 않으면 심각하게 손상될 수 있다.Bone volume (BV), bone volume/tissue volume ratio (BV/TV), and bone surface/bone volume ratio (BS/BV) quantified from the images showed significantly reduced bone loss in the OA group (~50% of the intact control group). However, treatment with nCe, especially at 500 μg/mL, was potentially preventive (recovery to ∼70-80% of intact controls) (Figure 7B), suggesting that nCe protected subchondral bone from severe osteoarthritic degeneration. It has proven to be effective in doing so, otherwise it can be seriously damaged.
nCe 단회 투여는 다른 병리학적 경로의 개입으로 인한 연골 및 연골 내 뼈의 손상을 완전히 예방할 수 없었지만 연골 기질과 골량을 보존하는 데 매우 효과적이었다.A single dose of nCe was highly effective in preserving cartilage matrix and bone mass, although it could not completely prevent damage to cartilage and endochondral bone due to the involvement of other pathological pathways.
골관절염 관절 재생을 위한 분자 및 세포 이벤트에서 nCe의 역할은 다음과 같이 요약될 수 있다.The role of nCe in molecular and cellular events for osteoarthritis joint regeneration can be summarized as follows.
최적의 nCe 용량(여기서 500μg/ml)은 세포에서 생성된 ROS를 소거함으로써 산화 스트레스를 줄이는 데 매우 효과적이며, 이는 차례로 연골 세포가 세포 사멸 및 이화 작용으로부터 구출되어 궁극적으로 분화 및 기질 합성에 관여하도록 돕는다The optimal nCe dose (here 500 μg/ml) is highly effective in reducing oxidative stress by scavenging ROS generated in cells, which in turn rescues chondrocytes from apoptosis and catabolism and ultimately engages in differentiation and matrix synthesis. helps
친염증성 사건을 억제하여 항염증성 표현형으로 분극화하는 대식세포의 부스팅은 퇴행성 환경을 회복 단계로 전환하는 데 도움이 되는 nCe 치료에서 고무적인 현상으로 입증되었다.Boosting of macrophages, which polarize to an anti-inflammatory phenotype by suppressing pro-inflammatory events, has proven to be an encouraging phenomenon in nCe treatment, helping to transform the degenerative environment into a restorative phase.
nCe의 개입은 활성화된 대식세포가 연골세포로 보내는 역 신호전달이 억제될 수 있는 대식세포와 연골세포의 상호작용 이벤트에서도 분명했으며, 친염증성 세포 피드백 루프를 깨는 데 도움이 될 수 있다.The involvement of nCe was also evident in macrophage-chondrocyte interaction events, where reverse signaling from activated macrophages to chondrocytes could be inhibited, helping to break the pro-inflammatory cellular feedback loop.
결국 관절에 대한 nCe의 국소 전달은 연골 기질과 뼈 질량이 실질적으로 보존된 해부학적 골연골 구조를 복원하는 데 매우 효과적이었다. Ultimately, local delivery of nCe to the joint was highly effective in restoring anatomical osteochondral structure with substantial preservation of cartilage matrix and bone mass.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.Although the embodiments of the present invention have been described above, the present invention is not limited to the above embodiments and can be manufactured in various different forms, and those skilled in the art will understand the technical idea of the present invention. It will be understood that it can be implemented in other specific forms without changing the essential features. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive.
Claims (17)
상기 골관절염에 의해 얇아진 상기 관절 조직의 연골층의 두께를 회복시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아(nanoceria) 화합물을 포함하는 조성물.It is locally injected into the joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has developed, to treat or improve osteoarthritis.
A composition comprising a nanoceria compound, characterized in that it restores the thickness of the cartilage layer of the joint tissue thinned by the osteoarthritis.
상기 관절 조직의 연골(cartilage) 및 연골하(subchondral) 골의 프로테오글리칸(proteoglycan)의 분해를 완화하고,
상기 연골 및 연골하 골의 침식을 감소시키는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물을 포함하는 조성물.It is locally injected into the joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has developed, to treat or improve osteoarthritis.
Alleviating the degradation of proteoglycan in cartilage and subchondral bone of the joint tissue,
A composition comprising a nanoceria compound, characterized in that it reduces erosion of the cartilage and subchondral bone.
상기 관절 조직에 포함된 연골세포의 생존율을 향상시키고,
상기 연골세포의 세포사멸(apoptotic)을 감소시키며,
항-세포사멸(anti-apoptotic)의 지표인 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)가 상향 조절되는 것을 특징으로 하는 나노세리아 (nanoceria) 화합물을 포함하는 조성물.
It is locally injected into the joint tissue where osteoarthritis, a degenerative joint disease, has developed, to treat or improve osteoarthritis.
Improves the survival rate of chondrocytes contained in the joint tissue,
Reduces apoptosis of the chondrocytes,
A composition comprising a nanoceria compound characterized in that Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), an indicator of anti-apoptosis, is upregulated.
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