KR102646915B1 - Primer sets for detecting Escherichia coli, Shigella spp. and polymerase chain reaction kit thereof - Google Patents

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KR102646915B1 KR1020230103042A KR20230103042A KR102646915B1 KR 102646915 B1 KR102646915 B1 KR 102646915B1 KR 1020230103042 A KR1020230103042 A KR 1020230103042A KR 20230103042 A KR20230103042 A KR 20230103042A KR 102646915 B1 KR102646915 B1 KR 102646915B1
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shigella
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chain reaction
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최진호
허건
문혜진
남은우
김민곤
김은진
정진승
남수진
이가영
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Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli), 시겔라 속(Shigella spp.) 균주를 동시 구분 검출할 수 있는 특이적 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것으로, 이를 이용함으로써 대장균과 시겔라 속 균주를 모두 검출할 수 있으면서도 시겔라 속 균주를 구분하여 신속하고 정확하게 높은 민감도와 특이도로 동시 검출할 수 있다.The present invention relates to a specific primer set that can simultaneously detect and distinguish Escherichia coli and Shigella spp. strains and a polymerase chain reaction kit containing the same. By using this, Escherichia coli and Shigella spp. While it is possible to detect all strains, it is also possible to distinguish strains of the Shigella genus and simultaneously detect them quickly and accurately with high sensitivity and specificity.

Description

대장균 및 시겔라 속 균주를 동시 구분 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트{Primer sets for detecting Escherichia coli, Shigella spp. and polymerase chain reaction kit thereof}A primer set capable of simultaneously detecting Escherichia coli and Shigella strains and a polymerase chain reaction kit containing the same {Primer sets for detecting Escherichia coli, Shigella spp. and polymerase chain reaction kit}

본 발명은 대장균(Escherichia coli), 시겔라 속(Shigella spp.) 균주를 동시 구분 검출할 수 있는 특이적 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a specific primer set capable of simultaneously detecting Escherichia coli and Shigella spp. strains and a polymerase chain reaction kit containing the same.

대장균(Escherichia coli, E. coli)은 온혈동물의 대장에 서식하는 세균으로, 분변에 의해 오염된 환경에서 쉽게 발견할 수 있어 식품, 음료 등 청결이 필요한 대상의 오염 지표로 사용되는 균이다. 이는 대부분 병원성이 없으나, 일부 균주는 장내염증과 설사를 유도하며 이를 병원성 대장균 (Pathogenic E. coli)이라고 한다. 병원성 대장균은 발병특성에 따라 장병원성 대장균(Enteropathogenic E. coli, EPEC), 장출혈성 대장균(Enterohaemorrhagic E. coli, EHEC), 장독소형 대장균(Enterotoxigenic E. coli, ETEC), 장관응집성 대장균(Enteroaggregative E. coli, EAEC), 장침입성대장균(Enteroinvasive E. coli, EIEC)으로 구분된다. Escherichia coli ( E. coli ) is a bacterium that lives in the large intestine of warm-blooded animals. It can be easily found in environments polluted by feces and is used as a contamination indicator for objects that require cleanliness, such as food and beverages. Most of these strains are not pathogenic, but some strains induce intestinal inflammation and diarrhea and are called Pathogenic E. coli . Depending on the pathogenic characteristics, pathogenic E. coli includes Enteropathogenic E. coli (EPEC), Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC), Enterotoxigenic E. coli (ETEC), and Enteroaggregative E. coli (Enteroaggregative E. coli) . coli , EAEC) and Enteroinvasive E. coli (EIEC).

한편, 세균성 이질(Shigellasis)은 이질균(Shigella)이 원인이 되어 급성으로 염증성 장염이 발생하는 법정 제1군 전염병이다. 고열과 구역질, 구토, 경련성 복통, 설사가 주요 증상이며 대변에 혈액이나 고름이 섞여 나오고, 이는 세균의 침입으로 인해 미세농양이 생기기 때문이다. 세균성 이질은 감염 후 4주까지 다른 사람에게 전파할 수 있고, 적은 양의 세균으로도 감염될 수 있어 전염성이 매우 높은 질병이다. 이에 시겔라 속(Shigella spp.) 균주는 이의 감염성으로 인해 역학 및 임상질병에서 별도로 구분되어 관리된다. Meanwhile, shigellasis is a statutory Group 1 infectious disease that causes acute inflammatory enteritis caused by Shigella . High fever, nausea, vomiting, cramping abdominal pain, and diarrhea are the main symptoms, and blood or pus is mixed in the stool. This is because microabscesses are formed due to bacterial invasion. Bacterial dysentery is a highly contagious disease that can be spread to other people for up to 4 weeks after infection and can be infected with even a small amount of bacteria. Accordingly, Shigella spp. strains are managed separately in epidemiology and clinical diseases due to their infectiousness.

특히, 국내에서는 원인균의 동정 결과에 따라 대장균 또는 시겔라 속 균주에 의한 감염을 구분하고 있으며, 효과적인 항생제를 판별하여 이용하는 등 선택적으로 치료법을 적용하고 있다. 이러한 이유로 대장균 및 시겔라 속 균주를 신속하고 정확히 구별 및 동정하기 위한 진단법의 수요가 지속적으로 높아지고 있는 실정이다.In particular, in Korea, depending on the results of identification of the causative bacteria, strains of the genus Escherichia coli or Shigella Infections caused by infection are classified, and treatment is applied selectively, such as identifying and using effective antibiotics. For this reason, the demand for diagnostic methods to quickly and accurately distinguish and identify E. coli and Shigella strains is continuously increasing.

그러나 Enterobacteriaceae에 속하는 대장균 및 시겔라 속 균주는 유전적으로 97% 이상 일치하고, 생화학적 특성이 유사하여 분자생물학적으로 구별이 쉽지 않다. 특히, 시겔라 속 균주의 특이 유전자 마커(gene marker)로 사용되는 invasion plasmid antigen H (ipaH) gene을 장침입성대장균(EIEC)도 보유하고 있어, PCR 후에도 정확한 진단을 위해 추가적인 생화학적 실험을 필요로 한다. 또한, 대장균 및 시겔라 속 균주를 구별하기 위해 상용화된 면역학적 검사의 경우 낮은 검사비를 장점으로 가지는 반면, 원인균을 배양 후 응집 반응법으로 결과를 확인하기 때문에 진단을 위해 오랜 시간이 소요됨과 동시에 반응법의 특성으로 인해 민감도가 낮은 단점이 존재한다.However, strains of the Escherichia coli and Shigella genera belonging to Enterobacteriaceae are genetically identical by more than 97% and have similar biochemical characteristics, making it difficult to distinguish them molecularly. In particular, enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) also possesses the invasion plasmid antigen H (ipaH) gene, which is used as a specific gene marker for strains of the Shigella genus, so additional biochemical tests are required for accurate diagnosis even after PCR. do. In addition, commercialized immunological tests to distinguish E. coli and Shigella strains have the advantage of low test costs, but since the results are confirmed by agglutination reaction after culturing the causative bacteria, it takes a long time for diagnosis and at the same time causes reaction. Due to the nature of the law, there is a disadvantage of low sensitivity.

이에 장내염증과 설사를 유도하는 병원성 대장균으로 작용할 수 있는 대장균과 세균성 이질을 일으켜 심각한 염증성 장염을 발병시키는 시겔라 속 균주를 모두 검출할 수 있으면서도 시겔라 속 균주를 구분하여 동시 검출할 수 있는, 신속하고 정확한 분리 동정이 가능한 기술이 필요한 실정이다.Therefore, it is possible to detect both E. coli, which can act as a pathogenic E. coli that induces intestinal inflammation and diarrhea, and Shigella strains, which cause bacterial dysentery and cause serious inflammatory enteritis, while also being able to distinguish and simultaneously detect Shigella strains. And there is a need for technology that allows accurate separation and identification.

대한민국 등록특허 제10-1817108호(등록일자: 2018.01.04.)는, 리얼타임 ＰＣＲ을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트 및 방법에 대한 것으로, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 대해 기재되어 있다.Republic of Korea Patent No. 10-1817108 (registration date: 2018.01.04.) is about an enterohemorrhagic Escherichia coli and Shigella dysentery test kit and method using real-time PRC, and Shigella dysenteri glycosyl transferase (Shigella A rapid test kit and method for enterohemorrhagic E. coli and Shigella dysenteri using real-time PCR that can specifically distinguish enterohemorrhagic E. coli and Shigella dysenteri using the rfpB gene of (dysenteriae glycosyl transferase) as a secondary genetic marker. It is written about.

본 발명은 장내염증과 설사를 유도하는 병원성 대장균과 이질을 일으킬 수 있는 시겔라 속 균주에 대해 검출하되, 시겔라 속 균주를 구분하여 동시 구분 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트를 개발하여 제공하고자 한다.The present invention detects pathogenic Escherichia coli that induces intestinal inflammation and diarrhea and Shigella strains that can cause dysentery, and a primer set that can simultaneously distinguish and detect Shigella strains, and a polymerase chain reaction containing the same. We would like to develop and provide a kit.

본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (a) 및; 서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.The present invention provides a primer set (a) for detecting E. coli and Shigella spp., consisting of a forward primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2; E. coli, characterized in that it includes a primer set (b) for detecting Shigella spp. consisting of a forward primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 Provides a multiplex primer set for simultaneous detection of ) and Shigella spp.

한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋다.Meanwhile, in the multiplex primer set of the present invention, the primer set (a) preferably further includes a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the primer set (b) preferably includes It is better to further include a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.

한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단에 형광염료가, 3'말단에 소광물질이 태깅(taggin)되어 있는 것이 좋다.Meanwhile, in the multiplex primer set of the present invention, the probe is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' end and a quencher at the 3' end.

또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다.Additionally, the present invention provides a kit for polymerase chain reaction, which includes the multiplex primer set.

한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것이 좋다.Meanwhile, in the kit for polymerase chain reaction of the present invention, the polymerase chain reaction is preferably real-time polymerase chain reaction (real-time PCR).

본 발명의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트를 이용함으로써 대장균과 시겔라 속 균주를 모두 검출할 수 있으면서도 시겔라 속 균주를 구분하여 신속하고 정확하게 높은 민감도와 특이도로 동시 검출할 수 있다.By using the primer set of the present invention and the polymerase chain reaction kit containing the same, both E. coli and Shigella strains can be detected, while Shigella strains can be distinguished and simultaneously detected quickly and accurately with high sensitivity and specificity.

도 1은 본 발명의 프라이머세트를 이용하였을 때의 리얼-타임 PCR의 특이도 검증 실험결과이다.
도 2는 본 발명의 프라이머세트를 이용하였을 때의 리얼-타임 PCR의 최소 검출한계 검증 실험결과이다.Figure 1 shows the results of a specificity verification experiment of real-time PCR using the primer set of the present invention.
Figure 2 shows the results of an experiment verifying the minimum detection limit of real-time PCR when using the primer set of the present invention.

대장균(Escherichia coli, E. coli)은 분변에 의해 오염된 환경에서 쉽게 발견할 수 있어 식품, 음료 등 청결이 필요한 대상의 오염 지표로 사용되는 균으로, 일부 균주는 장내염증과 설사를 유도하여 이를 병원성 대장균 (Pathogenic E. coli)이라고 한다. 이러한 병원성 대장균은 발병 특성에 따라 EPEC, EHEC, ETEC, EAEC, EIEC 등으로 구분될 수 있다. 한편, 급성으로 심각한 염증성 장염을 발병시킬 수 있는 세균성 이질의 원인균인 시겔라 속(Shigella spp.) 균주는 이의 감염성으로 인해 역학 및 임상질병에서 별도로 구분되어 관리된다. Escherichia coli (E. coli ) is a bacterium that can be easily found in environments contaminated by feces and is used as a contamination indicator for objects that require cleanliness, such as food and beverages. Some strains induce intestinal inflammation and diarrhea. It is called Pathogenic E. coli . These pathogenic E. coli can be classified into EPEC, EHEC, ETEC, EAEC, EIEC, etc. depending on their pathogenic characteristics. Meanwhile, Shigella spp., the causative agent of bacterial dysentery that can cause acute and severe inflammatory enteritis, is managed separately in epidemiology and clinical diseases due to its infectious nature.

특히, 국내에서는 원인균의 동정 결과에 따라 대장균과 시겔라 속 균주에 의한 감염을 구분하고 있으며, 효과적인 항생제를 판별하여 이용하는 등 선택적으로 치료법을 적용하고 있다. 이러한 이유로 대장균과 이질균(Shigella)을 신속하고 정확히 구별 및 동정하기 위한 진단법의 수요가 지속적으로 높다. In particular, in Korea, infections caused by E. coli and Shigella strains are classified according to the results of identification of the causative bacteria, and treatment is applied selectively, such as identifying and using effective antibiotics. For this reason, the demand for diagnostic methods to quickly and accurately distinguish and identify E. coli and Shigella continues to be high.

그러나 두 균주는 Enterobacteriaceae에 속하여 유전적으로 97% 이상 일치하고, 생화학적 특성이 유사하여 분자생물학적으로 구별이 쉽지 않다. 특히, 시겔라 속 균주의 특이 유전자 마커(gene marker)로 사용되는 invasion plasmid antigen H (ipaH) gene을 장침입성대장균(EIEC)도 보유하고 있어, PCR 후에도 정확한 진단을 위해 추가적인 생화학적 실험을 필요로 한다. 또한, 대장균 및 시겔라 속 균주를 구별하기 위해 상용화된 면역학적 검사의 경우 낮은 검사비를 장점으로 가지는 반면, 원인균을 배양 후 응집 반응법으로 결과를 확인하기 때문에 진단을 위해 오랜 시간이 소요됨과 동시에 반응법의 특성으로 인해 민감도가 낮은 단점이 존재한다.However, the two strains belong to the Enterobacteriaceae family and are genetically identical by more than 97%, and their biochemical characteristics are similar, so it is not easy to distinguish them molecularly. In particular, enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) also possesses the invasion plasmid antigen H (ipaH) gene, which is used as a specific gene marker for strains of the Shigella genus, so additional biochemical tests are required for accurate diagnosis even after PCR. do. In addition, commercialized immunological tests to distinguish E. coli and Shigella strains have the advantage of low test costs, but since the results are confirmed by agglutination reaction after culturing the causative bacteria, it takes a long time for diagnosis and at the same time causes reaction. Due to the nature of the law, there is a disadvantage of low sensitivity.

이에 장내염증과 설사를 유도하는 병원성 대장균으로 작용할 수 있는 대장균과 세균성 이질을 일으켜 심각한 염증성 장염을 발병시키는 시겔라 속 균주를 모두 검출할 수 있으면서도 시겔라 속 균주를 구분하여 동시 검출할 수 있는, 신속하고 정확한 분리 동정이 가능한 기술이 필요하다.Therefore, it is possible to detect both E. coli, which can act as a pathogenic E. coli that induces intestinal inflammation and diarrhea, and Shigella strains, which cause bacterial dysentery and cause serious inflammatory enteritis, while also being able to distinguish and simultaneously detect Shigella strains. And a technology that allows accurate separation and identification is needed.

따라서 본 발명에서는 이를 해결하기 위해 예의 노력하였으며 그 결과, 대장균과 시겔라 속 균주를 모두 검출하되, 시겔라 속 균주를 구분하여 신속하고 정확하게 높은 민감도와 특이도로 동시 구분 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였다. Therefore, in the present invention, we made diligent efforts to solve this problem, and as a result, we developed a primer set that can detect both E. coli and Shigella genus strains, and simultaneously distinguish and detect Shigella strains quickly and accurately with high sensitivity and specificity. did.

이에 본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (a) 및; 서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.)의 동시 검출을 위한 멀티플렉스 프라이머 세트를 제공한다.Accordingly, the present invention provides a primer set (a) for detecting E. coli and Shigella spp., consisting of a forward primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2, and ; E. coli, characterized in that it includes a primer set (b) for detecting Shigella spp. consisting of a forward primer consisting of a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5 Provides a multiplex primer set for simultaneous detection of ) and Shigella spp.

한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 프라이머 세트 (a)는, 바람직하게 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하고, 상기 프라이머 세트 (b)는, 바람직하게 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것이 좋다.Meanwhile, in the multiplex primer set of the present invention, the primer set (a) preferably further includes a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, and the primer set (b) preferably includes It is better to further include a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.

한편, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트에 있어서, 상기 탐침(probe)은, 바람직하게 5'말단에 형광염료가, 3'말단에는 소광물질이 태깅(taggin)되어 있는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는 상기 서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침은, 상기 5'말단에 형광염료로 FAM이 태깅되어 있고, 3'말단에 소광물질로 BHQ1이 태깅되어 있는 것이 좋고, 상기 서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침은, 상기 5'말단에 형광염료로 CY5가 태깅되어 있고, 3'말단에 소광물질로로 BHQ2가 태깅되어 있는 것이 좋다. 상기와 같이 형광염료 및 소광물질이 태깅되어 있음으로써 타겟균들의 감염여부를 형광 분석기를 통해 바로 확인할 수 있다.Meanwhile, in the multiplex primer set of the present invention, the probe is preferably tagged with a fluorescent dye at the 5' end and a quencher at the 3' end. More preferably, the probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is preferably tagged with FAM as a fluorescent dye at the 5' end and BHQ1 as a quencher at the 3' end, and SEQ ID NO: 6 The probe consisting of the nucleic acid sequence described in is preferably tagged with CY5 as a fluorescent dye at the 5' end and with BHQ2 as a quencher at the 3' end. As the fluorescent dye and quencher are tagged as described above, infection of the target bacteria can be immediately confirmed through a fluorescence analyzer.

또한, 본 발명은 상기 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트를 제공한다. 상기 중합효소연쇄반응용 키트에는 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 외 버퍼, dNTP 등이 첨가될 수 있는데 이는 당업계에 널리 알려져 있으므로, 이에 대한 구체적인 기재는 생략하기로 한다.Additionally, the present invention provides a kit for polymerase chain reaction, which includes the multiplex primer set. In addition to the multiplex primer set of the present invention, buffers, dNTPs, etc. may be added to the kit for polymerase chain reaction. Since this is widely known in the art, detailed description thereof will be omitted.

한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)용 키트에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은, 바람직하게 실시간중합효소연쇄반응 (real-time PCR)인 것이 좋다. 연쇄중합반응 결과 산물을 실시간에 정량적으로 확인할 수 있어, 현장에서 병원성 균주의 감염을 즉시 확인할 수 있는 장점이 있다.Meanwhile, in the kit for polymerase chain reaction of the present invention, the polymerase chain reaction is preferably real-time polymerase chain reaction (real-time PCR). The product of the chain polymerization reaction can be quantitatively confirmed in real time, which has the advantage of allowing immediate confirmation of infection by pathogenic strains in the field.

한편, 본 발명의 중합효소연쇄반응용 키트에 있어서, 상기 서열번호 1, 서열번호 2에 기재된 프라이머의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17㎕ 정도에 대해 0.025 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 서열번호 3에 기재된 탐침의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17㎕ 정도에 대해 0.02 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋다. 또한, 상기 서열번호 4, 서열번호 5에 기재된 프라이머의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17㎕ 정도에 대해 0.05 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋고, 서열번호 6에 기재된 탐침의 경우 바람직하게 중합효소연쇄반응을 위해 워킹볼륨 17 ㎕ 정도에 대해 0.025 ㎕ 첨가되어 사용되는 것이 좋다. 이와 같은 처리농도 및 첨가량을 사용할 경우, 타겟 미생물들의 검출 감도를 더욱 유사하게 맞출 수 있는 장점이 있다.Meanwhile, in the kit for polymerase chain reaction of the present invention, the primers shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are preferably used by adding 0.025 μl to a working volume of about 17 μl for polymerase chain reaction. , in the case of the probe shown in SEQ ID NO: 3, it is preferably used by adding 0.02 ㎕ to a working volume of about 17 ㎕ for polymerase chain reaction. In addition, in the case of the primers shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, it is preferably used by adding 0.05 ㎕ to a working volume of about 17 ㎕ for polymerase chain reaction, and in the case of the probe shown in SEQ ID NO: 6, it is preferably used for polymerase chain reaction. For enzyme chain reaction, it is recommended to add 0.025 ㎕ to a working volume of about 17 ㎕. When using such treatment concentration and addition amount, there is an advantage in that the detection sensitivity of target microorganisms can be more similar.

한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하여 리얼-타임 PCR을 수행할 시, E.coli와 Shigella spp.를 타겟으로 하는 마커(marker)를 통해 대장균과 시겔라 속 균주를 다른 균주들과 구분하여 특이적으로 검출하였으며, Shigella spp.를 타겟으로 하는 마커를 통해 시겔라 속 균주만을 특이적으로 검출하는 것을 확인하였다. 또한, 이를 이용한 최소 검출한계를 검증하였을 때도, 2 log CFU/ml 수준의 낮은 농도까지 높은 민감도로 검출이 가능한 것을 확인하였다. 이와 같이 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 포함하는 중합효소연쇄반응 키트를 이용함으로써 대장균과 시겔라 속 균주를 모두 검출할 수 있으면서도 시겔라 속 균주를 구분하여 신속하고 정확하게 높은 민감도와 특이도로 동시 검출할 수 있다.Meanwhile, according to the following experiment, when performing real-time PCR including the primer set of the present invention, strains of the genus E. coli and Shigella spp. are identified through markers targeting E. coli and Shigella spp. It was specifically detected by distinguishing it from other strains, and it was confirmed that only strains of the genus Shigella were specifically detected through a marker targeting Shigella spp. In addition, when the minimum detection limit using this was verified, it was confirmed that detection was possible with high sensitivity up to a concentration as low as 2 log CFU/ml. In this way, by using the primer set of the present invention and the polymerase chain reaction kit containing the same, both E. coli and Shigella strains can be detected, and Shigella strains can be distinguished and simultaneously detected quickly and accurately with high sensitivity and specificity. there is.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.Hereinafter, the contents of the present invention will be described in more detail through the following examples. However, the scope of the present invention is not limited to the following examples, but also includes modifications of the technical idea equivalent thereto.

[실시예 1: 대장균([Example 1: E. coli ( Escherichia coliEscherichia coli ), 시겔라 속(), Shigella genus ( Shigella Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트의 제작]spp.) Preparation of a primer set for simultaneous detection of strains]

본 실시예에서는 대장균(Escherichia coli), 시겔라 속(Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 제작하였으며, 그 상세한 구성은 표 1과 같았다.In this example, Escherichia coli , Shigella spp. A primer set for simultaneous identification and detection of strains was produced, and its detailed composition is shown in Table 1.

TargetTarget Primer & ProbePrimers & Probes Sequence(5'→3')Sequence(5'→3') 서열
정보order
information E.coli & Shigella spp. E. coli & Shigella spp. Forward primerForward primer ACM TGG TAT GAG ATT GCCACM TGG TAT GAG ATT GCC 서열
번호1order
number 1 Reverse primerReverse primer CRG TAA AGT AMG CTT TCCCRG TAA AGT AMG CTT TCC 서열
번호2order
number 2 ProbeProbe FAM ACT CTG YTG CCA CAT YYC TCT GT BHQ1 FAM ACT CTG YTG CCA CAT YYC TCT GT BHQ1 서열
번호3order
number 3 Shigella spp. Shigella spp. Forward primerForward primer TTR CCG ATG TAC TGG ATA ACTTR CCG ATG TAC TGG ATA AC 서열
번호4order
number 4 Reverse primerReverse primer GGT CAC CTT CCC ATT TCA AGGT CAC CTT CCC ATT TCA A 서열
번호5order
number 5 ProbeProbe CY5 TCC TGA ACT GTG CTG CRA TTG TCC BHQ2 CY5 TCC TGA ACT GTG CTG CRA TTG TCC BHQ2 서열
번호6order
number 6

[실험예 1 : 상기 실시예 1에서 제작한[Experimental Example 1: Product prepared in Example 1 above 대장균(E. coli ( Escherichia coliEscherichia coli ), 시겔라 속(), Shigella genus ( Shigella Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리얼-타임 PCR 키트의 특이도 검증 실험]spp.) specificity verification experiment of a real-time PCR kit containing a primer set for simultaneous detection of strains]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 대장균(Escherichia coli), 시겔라 속(Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트가 리얼-타임 PCR을 진행할 시에도 대상 균주들만 특이적으로 증폭하는지 여부를 확인하기 위한 검증 실험을 진행하였다. 리얼-타임 PCR 반응을 위한 상세 구성은 표 2와 같았으며, 그 조건은 표 3과 같았다(Thermo Fisher Scientific 사의 AB7500 FAST Real-time PCR Instrument System을 사용함).In this experimental example, it was tested whether the primer set for simultaneous detection of Escherichia coli and Shigella spp. strains produced in Example 1 specifically amplifies only the target strains even when performing real-time PCR. A verification experiment was conducted to check whether or not. The detailed configuration for the real-time PCR reaction was shown in Table 2, and the conditions were shown in Table 3 (using the AB7500 FAST Real-time PCR Instrument System from Thermo Fisher Scientific).

성분ingredient 제조사manufacturing company Con.
(nM)Con.
(nM) Stock 농도
(μM)Stock concentration
(μM) 1회 용량 (㎕)One dose (㎕) Forward primer(E.coli
& Shigella spp.)Forward primer ( E. coli
& Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.125 pmole/uL0.125 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.0250.025 Reverse primer(E.coli
& Shigella spp.)Reverse primer ( E. coli
& Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.125 pmole/uL0.125 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.0250.025 Probe(E.coli
& Shigella spp.)Probe ( E. coli
& Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.1 pmole/uL0.1 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.020.02 Forward primer(Shigella spp.)Forward primer ( Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.25 pmole/uL0.25 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.050.05 Reverse primer(Shigella spp.)Reverse primer ( Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.25 pmole/uL0.25 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.050.05 Probe(Shigella spp.)Probe ( Shigella spp.) BiobasicBiobasic 0.125 pmole/uL0.125 pmole/uL 100 pmole/uL100 pmole/uL 0.0250.025 RoxRox BiofactBiofact 0.40.4 FastFACT™ qRT-PCR Master Mix
(For Probe)FastFACT™ qRT-PCR Master Mix
(For Probe) BiofactBiofact x1x1 x2x2 1010 DWD.W. 펩진Pepgene 6.4056.405

구분division 온도(℃)Temperature (℃) 시간hour Cycle 수Number of Cycles DenaturationDenaturation 9595 2 min2min 1One Cycling stageCycling stage 9595 5 sec5 seconds 4040 6060 30 sec30 seconds

증폭된 정도는 표적 유전자의 역치 주기수(Ct value)를 확인하여 예측할 수 있는데, 그 값이 10~35일 때 검출되었다고 판단할 수 있다. 그 결과, 하기 표 4 및 도 1과 같이 E.coli와 Shigella spp.를 타겟으로 하는 마커(marker)로 대장균 5 균주와 시겔라 속 2균주를 특이적으로 검출하였으며, Shigella spp.를 타겟으로 하는 마커로는 시겔라 속 2균주만 특이적으로 구분 검출하는 것을 확인하였다.The degree of amplification can be predicted by checking the threshold cycle number (Ct value) of the target gene, and it can be judged to have been detected when the value is 10 to 35. As a result, as shown in Table 4 and Figure 1 below, 5 strains of E. coli and 2 strains of the Shigella genus were specifically detected with markers targeting E. coli and Shigella spp., and markers targeting Shigella spp. It was confirmed that only two strains of the Shigella genus were specifically detected using the marker.

Strain / 균주 번호Strain / strain number Ct value
CT value
 E.coli & Shigella spp. marker E. coli & Shigella spp. marker Shigella spp. markerShigella spp. marker E.coli(EIEC) E.coli (EIEC) NCCP 15663NCCP 15663 17.917.9 ND* ND * E.coli(ETEC) E.coli (ETEC) NCCP 15732NCCP 15732 18.418.4 ND* ND * E.coli(EPEC) E.coli (EPEC) NCCP 15661NCCP 15661 18.118.1 ND* ND * E.coli(EAEC) E.coli (EAEC) NCCP 14039NCCP 14039 17.317.3 ND* ND * E.coli(EHEC) E.coli (EHEC) ATCC 43895ATCC 43895 18.918.9 ND* ND * Shigella boydiiShigella boydii KCTC 22528KCTC 22528 17.917.9 16.816.8 Shigella sennneiShigella sennnei KCTC 22530KCTC 22530 17.917.9 17.217.2 Listeria monocytogenesListeria monocytogenes ATCC 19115ATCC 19115 ND* ND * ND* ND * Salmonella typhimuriumSalmonella typhimurium ATCC 43971ATCC 43971 ND* ND * ND* ND * Vibrio vulnificusVibrio vulnificus CMCP6CMCP6 ND* ND * ND* ND * Vibrio choleraeVibrio cholerae NCCP 14552NCCP 14552 ND* ND * ND* ND * Vibrio parahaemolyticusVibrio parahaemolyticus KCTC 2471KCTC 2471 ND* ND * ND* ND * Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus ATCC ccARM 3089ATCC ccARM 3089 ND* ND * ND* ND * Clostridium perfringensClostridium perfringens NCCP 15911NCCP 15911 ND* ND * ND* ND * Campylobacter jejuniCampylobacter jejuni NCTC 11192NCTC 11192 ND* ND * ND* ND * Campylobacter coliCampylobacter coli NCTC 11191NCTC 11191 ND* ND * ND* ND * Yersinia enterocoliticaYersinia enterocolitica KCCM 41657KCCM 41657 ND* ND * ND* ND * Bacillus cereusBacillus cereus ATCC 27348ATCC 27348 ND* ND * ND* ND *

ND* : Non-DetectedND * : Non-Detected

[실험예 2: 상기 실시예 1에서 제작한[Experimental Example 2: Produced in Example 1 above 대장균(E. coli ( Escherichia coliEscherichia coli ), 시겔라 속(), Shigella genus ( Shigella Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리얼-타임 PCR 키트의 최소 검출한계 검증 실험]spp.) Minimum detection limit verification experiment of a real-time PCR kit containing a primer set for simultaneous detection of strains]

본 실험예에서는 상기 실시예 1에서 제작한 대장균(Escherichia coli), 시겔라 속(Shigella spp.) 균주의 동시 구분 검출용 프라이머 세트가 리얼-타임 PCR을 진행할 시 최소 검출가능한 균 수를 측정하는 검증실험을 진행하였다. Thermo Fisher Scientific 사의 AB7500 FAST Real-time PCR Instrument System을 사용하여 시겔라 세네이(Shigella sennnei) (KCTC 22530)를 배양하여 DNA를 추출하고, 십진 희석하여 Real-time PCR을 2반복 수행하였다. 그 결과, 도 2와 같이 2 log CFU/ml 수준의 균까지 검출이 가능한 것을 확인하였다. In this experimental example, the primer set for simultaneous detection of Escherichia coli and Shigella spp. strains produced in Example 1 was verified to measure the minimum number of detectable bacteria when performing real-time PCR. An experiment was conducted. Shigella sennnei using the AB7500 FAST Real-time PCR Instrument System from Thermo Fisher Scientific. (KCTC 22530) was cultured, DNA was extracted, decimal diluted, and real-time PCR was performed twice. As a result, it was confirmed that detection of bacteria up to 2 log CFU/ml was possible, as shown in Figure 2.

Claims (5)

서열번호 1의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 2의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (a) 및;
서열번호 4의 핵산서열로 이루어진 정방향 프라이머와 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 역방향 프라이머로 구성된 시겔라 속(Shigella spp.) 검출용 프라이머 세트 (b);를 포함하며,
상기 프라이머 세트 (a)는,
서열번호 3에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하고,
상기 프라이머 세트 (b)는,
서열번호 6에 기재된 핵산서열로 이루어진 탐침(probe)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.)의 동시 검출을 위한 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)용 멀티플렉스 프라이머 세트.
A primer set (a) for detecting E. coli and Shigella spp., consisting of a forward primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 2;
It includes a primer set (b) for detecting Shigella spp., consisting of a forward primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a reverse primer consisting of the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 5,
The primer set (a) is,
It further includes a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3,
The primer set (b) is,
Real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of E.coli and Shigella spp., characterized in that it further comprises a probe consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 6. Multiplex primer set for PCR).
 삭제delete 제1항에 있어서,
상기 탐침(probe)은,
5'말단에 형광염료가, 3'말단에 소광물질이 태깅(taggin)되어 있는 것을 특징으로 하는 대장균(E.coli)과 시겔라 속(Shigella spp.)의 동시 검출을 위한 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)용 멀티플렉스 프라이머 세트.
According to paragraph 1,
The probe is,
Real-time polymerase chain reaction for simultaneous detection of E.coli and Shigella spp., characterized by tagging a fluorescent dye at the 5' end and a quencher at the 3' end. Multiplex primer set for (real-time PCR).
 제1항 또는 제3항 중 선택되는 어느 하나의 항의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간중합효소연쇄반응(real-time PCR)용 키트.A kit for real-time polymerase chain reaction (real-time PCR), comprising the multiplex primer set of any one of claims 1 and 3. 삭제delete
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대한민국 등록특허 제10-1817108호(등록일자: 2018.01.04.)는, 리얼타임 ＰＣＲ을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리 검사 키트 및 방법에 대한 것으로, 시겔라 디젠테리 글리코실 전달효소(Shigella dysenteriae glycosyl transferase)의 rfpB 유전자를 2차 유전자 마커로 사용하여 장출혈성 대장균과 시겔라 디젠테리를 특이적으로 구분할 수 있는 리얼타임 PCR을 이용한 장출혈성 대장균 및 시겔라 디젠테리의 신속 검사 키트 및 방법에 대해 기재되어 있다.

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