KR102645006B1 - 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 아가로스겔의 성형 후 저장이 가능하고, 이동 중에 겔 파손을 최소화할 수 있는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀을 제공함으로써, 전기영동 프로토콜에서 겔 성형과 DNA시각화단계까지 겔 제조보관틀 내부에서 실시되어 외부충격에 민감한 아가로스 겔의 파손을 최소화할 수 있고 기술이 미숙한 실험자의 사용에도 실험의 퀄리티가 떨어지지 않으며 대량의 아가로스 겔 제조 후 저장하고 사용이 가능함으로 실험 실시에 전반의 수고 및 시간 소요를 감소시킬 수 있다.
Description
본 발명은 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아가로스겔의 성형 후, 별도 저장이 가능하고, DNA 샘플로딩 및 전기영동을 위해 운반이동 중 겔 파손을 최소화할 수 있는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀에 관한 것이다.
전기영동은 주로 생체 고분자들의 성질을 연구하고, 그것들을 분석, 분리, 정제하는 중요한 방법 중의 하나이다. 전기영동은 DNA, RNA나 단백질 같은 것들이 고유의 전하를 띠고 있고, 그것들이 어떤 전기장에 놓이게 되면 이동할 수 있다는 사실을 기본으로 하고 있다. 이러한 물질들의 이동 정도는 각 물질의 크기나 모양 그리고 전하에 따라 달라진다. 즉, 크기가 큰 물질은 크기가 작은 물질보다 더 천천히 겔을 통과하기 때문에 크기에 따라 물질들이 분리된다.
초기의 전기영동은 수크로오스(sucrose) 용액 같은 액체 상태에서 수행되었지만 점차로 발전하여 종이, 셀룰로오스 아세테이트 막, 전분 겔 전기영동 등을 사용하다가, 현재까지도 널리 쓰이는 아가로오스와 아크릴아마이드를 이용한 겔, 원판형(disk) 겔, 면역체전기영동(immunoelectrophoresis) 등을 거쳐 isoelectric focusing 뿐만 아니라 2 차원(two-dimensional) 전기영동까지 발전하였다.
통상적인 전기영동의 방법은 거대분자가 완충용액 속에서 전하를 띠게 되는 성질을 이용한 것이다. 이 분자들의 전하는 그 완충용액의 pH에 따라 달라진다. 전체 전하는 전기영동에서 중요한 역할을 하는데 일정한 전기장 안에서 각 분자의 전체 전하나 크기에 따라 이동하는 속도가 달라짐으로 인해 물질의 분리가 일어나기 때문이다.
아크릴아마이드는 크기가 작은 물질을 높은 해상도로 구분할 수 있는 장점이 있고, 아가로오스는 해상도는 낮지만 아주 넓은 범위 (200 bp - 50 kb)의 DNA나 RNA 시료을 분리할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 사용이 간편하고 다루기가 쉽기 때문에 현재 가장 많이 사용되고 있는 전기영동이다.
아가로스 겔 전기영동은 생화학, 분자 생물학, 유전학 및 임상 화학에서 사용되는 젤 전기영동 방법으로 agar의 두 가지 주요 구성 요소 중 하나 인 아가로스 매트릭스에서 DNA 또는 RNA를 길이로 분리될 수 있다. 아가로스 겔에 전기장을 인가하면 하전된 분자를 아가로스 매트릭스를 통해 이동시키고, DNA/RNA 분자는 아가로스 겔 매트릭스에서 크기별로 분리가 가능하다.
일반적인 아가로스 겔 전기영동 프로토콜은 아가로스 겔 준비단계, DNA샘플 로딩 단계, 전기영동 실행단계, DNA 시각화 단계로 이루어진다. 아가로스 겔 준비단계는 적당한 완충용액(buffer)에 아가로즈를 녹이고 만들어진 용액이 실온에서 50도 전후에 도달하면 원하는 크기의 틀에 부어지며 겔이 굳도록 경화시키는 단계가 포함된다.
상기 틀은 통상적으로 콤(comb)슬롯이 구비된 것으로 겔이 굳는 동안 아가로스는 지지체(matrix) 형태가 되며 그 밀도는 아가로오스의 농도에 따라 정해진다. 이러한 겔에 전기장이 주어지면 음전하를 띠는 DNA는 양극으로 이동한다. 아가로오스 겔에서 DNA의 이동에 영향을 주는 요인에는 DNA크기, 아가로오스 농도, DNA 형태, 전압, 완충용액의 조성 등으로 DNA 크기와 전기장에서의 이동성 관계는 로그함수로 반비례한다.
DNA샘플 로딩 단계는 아가로스겔이 굳은 후, 콤슬롯을 제거하고 고정틀에서 분리한 후 실험실 테이블에서 추적염료(loading dye)와 샘플을 혼합한 후 직접 로딩하거나 전기영동 챔버에 담궈 샘플을 로딩하는 것이다. 이때 피펫의 날카로운 끝 부분으로 젤을 손상시키지 않기 위하여 상당한 경험을 가진 테크니션이 아닌 이상, 주의를 기울이지 않으면 샘플 결과에 영향을 미치게 된다. 이때, 전기영동 챔버에는 전단계의 겔 제조단계에서 사용한 완충액을 부어준다.
전기영동 실행단계는 전원 공급 장치에 연결하고 전류가 겔 전체에 적용되도록 한다. 목적하는 DNA/RNA 샘플의 분리를 위하여 30분-1시간 정도 전류를 흐르게 하면, 음전하를 띤 DNA 분자는 겔 매트릭스를 통해 양극으로 이동한다.
DNA 시각화단계는 SYBR Green과 같은 DNA 특정 염료는 DNA 염기쌍 사이에 삽입되어 UV 또는 LED Blue 아래서 형광을 발휘함으로 이러한 원리를 이용하여 DNA/RNA 밴드를 확인하는 단계이다. 이를 통해서 DNA/RNA의 존재 유무 혹은 크기를 추청하는데 사용할 수 있다.
이와 같은 과정이 실험과정에서 상당한 시간을 소요하는 단점이 있다. 또한, 아가로스 겔은 경화되었어도 외부 충격에 매우 민감함으로 DNA샘플 로딩 중 피펫에 손상되기 쉬울 뿐만 아니라 전후 단계 실시 중 이동 중에 파손 우려가 있다.
국내 공개특허번호 제10-2022-0021778호에는 겔 고형과 전기영동을 동시에 수행할 수 있는 장치를 제공하고, 일본 공개특허공보 특개평07-055768호에는 다수의 돌출부를 갖는 겔몰드를 제공하고 있다. 그러나, 상기 선행문헌들은 단일의 실험에 대응하여 제작된 전기영동에 관한 것으로 본원발명의 대형으로 생산 및 저장 후 다수의 실험에 대응하여 사용할 수 있는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀에 관한 구성은 개시하지 않아 차이를 보인다.
본 발명은 기존의 전기영동 프로토콜이 장시간을 소요하고, 제작된 아가로스 겔은 충격에 민감하여 미숙한 기술로 파손되거나 실험 전 후 과정에서 아가로스 겔 이동에 따라 파손율이 높아 정확한 실험결과 도출이 어려웠던 문제점을 해결하기 위한 것으로, 아가로스겔의 성형 후 저장이 가능하고, 아가로스 겔 이동 중에 겔 파손을 최소화할 수 있는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀은 전면 및 후면이 개구된 육면체구조인 틀프레임은 투명재질로 형성되고; 상기 틀프레임의 전면 및 후면 개구부와 대응하는 크기의 개폐프레임은 전, 후 개구부를 개방 및 폐쇄할 수 있는 구조로 형성되는 것일 수 있다.
상기 틀프레임 상측면에는 홀 형상으로 수평으로 일정간격 이격하여 이루어지는 로딩홀이 아가로스 겔의 웰 위치와 대응하게 형성되는 것일 수 있다. 또한, 상기 수평방향으로 다수개의 형성된 로딩홀은 수직 방향으로 이격되어 복수의 열로 이루어진 복수개의 로딩홀을 형성하는 것일 수 있다.
본 발명의 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀은 전기영동 프로토콜에서 겔 성형과 DNA 시각화 단계까지 겔 제조보관틀 내부에서 실시되어 외부충격에 민감한 아가로스 겔의 파손을 최소화할 수 있고 기술이 미숙한 실험자의 사용에도 실험의 정확도가 떨어지지 않으며 대량의 아가로스 겔 제조 후 저장하고 사용이 가능하여 실험 실시 전반의 수고 및 시간 소요를 감소시킬 수 있다.
도 1은 기존의 전기 영동용 아가로스 겔 제조장치 사진을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 사시도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 분리도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 틀프레임 사시도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀로 제조된 아가로스겔을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀로 제조된 아가로스겔을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 사시도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 분리도를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 틀프레임 사시도를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀로 제조된 아가로스겔을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀로 제조된 아가로스겔을 나타낸다.
본 발명은 생명공학 분야에서 PCR, enzyme digestion, fragmentation 방법, RNA 확인 및 분리 등 DNA/RNA 존재 유무를 band로 확인할 수 있는 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀을 제공하고자 한다.
본 발명에서 지칭하는 아가로스(agarose)는 한천을 함유하고 있는 해조류로부터 분리 및 정제된 갈락탄 친수성 콜로이드로서 친수성의 성질을 가지며 이온 존재에 의한 전하를 띠지 않고, 투명하고 겔 형성능이 우수하여 전기영동, 고정화 효소운반체, 어피니티 크로마토그래피 운반체 등 다양한 용도로 사용되고 있는 것을 지칭한다.
본 발명에서 지칭하는 아가로즈 겔은 적정 농도의 파우더로 이루어지는 아가로즈가 완충액에 용해된 후 경화(성형)된 것을 지칭하는 것이고, 아가로스 용액은 아가로스 파우더와 완충액이 용해 및 혼합된 것을 지칭한다. 상기 완충액은 통상적으로 아가로즈 겔 제조에 사용되는 버퍼인 TAE buffer(acetate) 또는 TBE buffer(borate)로 이루어지는 것일 수 있다.
도 1은 기존의 전기 영동용 아가로스 겔 제조장치 사진을 나타낸다. 기존의 전기 영동용 아가로스 겔 제조장치는 상부가 개구된 상자 구조의 프레임으로 형성되는 겔트레이와, 겔 트레이 프레임 측면에는 DNA 시료를 주입하는 웰을 성형할 수 있도록 콤(comb)이 거치될 수 있는 거치홈이 형성되며, 상기 내부 수용공간에는 젤 고형틀이 수용되어 이루어진다.
젤 고형틀은 양단에 손잡이 프레임이 형성된 상, 전, 후면이 개구된 형상으로 겔트레이의 상부 개구부를 통해 아가로스 용액을 주입한 후 경화가 완료되면 젤 고형틀 손잡이를 잡고 겔트레이와 분리하여 전기영동장치까지 옮긴 후 DNA샘플을 로딩한다. 이때, 미숙한 실험자의 경우 이동과 DNA로딩 중에 피펫팅으로 인해 겔이 파손되기 쉽다. 또한, 단일의 실험마다 아가로즈 겔을 제조해야함으로 실험시간 소요와 수고가 큰 문제점이 발생한다. 본 발명은 아가로스겔 제조 후 실험 전까지 저장이 가능한 아가로스 겔 제조보관틀과 외부 충격과 피펫팅에 겔 파손을 방지할 수 있는 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀을 제공하고자 한다.
이하, 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀과 관련한 도면을 첨부하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 2와 도 3은 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 사시도 및 분리도를 나타낸다. 본 발명의 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀은 전, 후면이 개구된 틀프레임(100)은 투명재질로 형성되고 상기, 틀프레임의 전, 후 개구부에는 개폐프레임(200)이 설치되어 이루어진다.
본 발명의 개폐프레임은 틀프레임의 전면 및 후면 개구부와 대응할 수 있는 크기로 형성되어 개구부를 폐쇄 및 개방하는 역할을 한다. 개폐프레임은 성형 전 틀프레임의 개구부를 폐쇄함으로써 내부에 주입된 아가로스 용액이 외부로 방출되는 것을 방지하고, 경화가 완료된 아가로스 겔의 전기영동 단계에서는 틀프레임과 분리한다. 개폐프레임은 틀프레임과 같은 재질로 제조될 수 있고, 일반 합성수지 테이프 등으로 밀봉할 수도있다.
본 발명의 틀프레임(100)은 자외선이 투과될 수 있는 투명한 재질로 형성되는 것으로 PS(폴리 스티렌), ABS(아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌수지), PETE, PC(폴리 카보네이트), PMMA(폴리 메틸메타크릴레이트), MMA(메틸메타크릴레이트), 투명 PP(폴리 프로필렌), 투명 PE(폴리 에틸렌), 및 유리로 구성된 군 등에서 선택된 것일 수 있다.
도 4는 본 발명의 틀프레임 사시도를 나타낸다. 본 발명의 틀프레임은 직육면체 형상으로 전, 후면에는 개구부가 형성되고 내부에는 아가로스 겔 용액이 투입되어 경화(성형)될 수 있는 저장공간이 마련되어 이루어진다.
상기 저장공간의 면적과 깊이는 통상 제작되어 전기영동되는 아가로즈 겔 크기와 대응하도록 형성되며, 상기 저장공간에는 아가로즈 겔 제작시에 제조되는 아가로즈와 완충액이 혼합된 용액이 저장되며 아가로즈 겔 사용을 위해 경화되는 틀 제공 역할을 할 수 있다.
틀프레임 상측면에는 통상의 아가로스 겔에 형성된 웰(well) 위치와 대응할 수 있도록 로딩(loading)홀(111)이 다수개 형성된다. 기존에 DNA샘플을 웰에 로딩하는 경우, 피펫의 끝이 웰에 닿아 겔이 손상되거나 미숙련된 작업자의 경우 웰에 DNA 샘플 주입에 실수가 발생할 수 있다.
본 발명의 로딩홀은 DNA 샘플을 웰에 로딩시에 피펫이 로딩홀 프레임 홀에 거치될 수 있는 지지대를 제공함으로써 겔 파손 및 샘플 주입에서 실수를 최소화할 수 있도록 돕는다. 또한, 본 발명의 로딩홀은 아가로스 겔 제조 단계시에 틀프레임의 개구부를 개폐프레임으로 폐쇄하고, 아가로스겔을 틀프레임 내부로 주입시킬 수 있는 주입구 역할을 동시에 수행할 수 있다.
또한, 로딩홀은 상기 로딩홀과 대응하는 콤(comb)프레임(S)이 로딩홀을 관통 및 고정되고 아가로스겔의 경화까지 콤을 거치하는 고정대 역할을 한다. 이에 경화 후 콤 제거시 겔의 파손이 거의 없이 웰을 형성할 수 있도록 도울 수 있다.
도 5 내지 도 6은 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀로 제조된 아가로스겔을 나타낸다. 본 발명의 실시예에 따른 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀은 도 5에 도시된 바와 같이, 웰이 수평으로 일정간격을 갖는 형태 및 규격으로 제조도 가능하고, 도 6과 같이, 수평으로 하나 이상의 웰이 수직으로 일정 간격 이격되어 형성될 수 있다. 이에 틀프레임 상측면의 로딩홀은 이와 같은 형태의 아가로스겔로 제조할 수 있도록 형성될 수 있다.
도 5에 도시된 본 발명의 실시예에 따르면 8개 샘플을 적재할 수 있는 웰(샘플 로딩 공간)로 구성되어 있으며, 첫 번째 웰에는 사이즈를 알고 있는 마커를 넣고, 나머지 7개 웰에 샘플을 로딩할 수 있고 또는, 1개의 사이즈 마커와 14개 샘플을 로딩할 수 있는 총 15개 웰로 구성되어 구현될 수 있다.
도 6에 도시된 본 발명의 실시예에 따르면 8샘플을 동시에 로딩할 수 있는 멀티채널 피펫을 이용하기 위한 간격과 위치를 계산하여 위/아래 샘플을 로딩할 수 있는 웰을 제조할 수 있도록 형성된다. 32 샘플을 한 샘플씩 로딩하려면 10분 이상의 시간이 소요되지만, 본 고형틀을 이용하면 3분 이내에 샘플 로딩이 완료되어 3배 이상의 시간을 절약할 수 있다.도 6에 도시된 아가로스겔은 샘플의 양을 증가시켜 좀더 선명한 사진을 얻고자 할 때 사용할 수 있다. 이에 기존의 방법으로 제작된 아가로스겔에 비해 실험시간이 단축되는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 전기영동장치와 관련한 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다.
<실시예 1> 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀 이용한 전기영동 실시
(가) 겔 제조 준비단계
본 발명의 겔 제조 준비단계는 틀프레임의 전, 후 개구부를 개폐프레임으로 폐쇄시킨 후, 아가로스 겔을 제조하여 틀프레임 내부로 주입시키는 단계이다. 1%의 아가로스젤을 제조하기 위해 아가로스 파우더를 계측하고 50ml TAE buffer를 플라스크에 넣었다. 이후 플라스크를 밀봉한 후 전자레인지에 넣어 아가로스 파우더를 용해시켰다. 이때 관찰시약(예:Et-Br)을 용액에 넣어줄 수 있다.
만들어진 용액을 실온에서 50도 전후에 도달하면, 아가로스 용액을 본 발명의 틀프레임의 로딩홀을 통해 주입하고 로딩홀에 콤(comb)프레임을 관통시켜 아가로스 겔의 웰을 성형하도록 한다. 이때, 로딩할 샘플의 양과 수를 고려하여 콤과 틀프레임을 선택한다. 아가로스겔이 경화되어 성형이 완료되면 콤프레임을 제거한다. 이상의 겔 제조 준비단계를 통해 여러 개의 겔을 제조하여 보관하고, 필요에 따라 사용할 수 있다.
(나) 전기영동 준비단계
상기 (가)단계를 거친 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 폐쇄프레임을 제거하고 전기영동장치에 위치시켜준다. 상기 폐쇄프레임을 제거하는 것은 이후 전기영동 실시시에 전하 이동이 가능하도록 하기 위함이다. 틀프레임의 개구부와 폐쇄프레임은 웰이 로딩되는 방향을 따라 형성 및 설치되는 것이 적절하다. 이후 (가)단계에서 겔을 제작할 시에 사용했던 완충액(TAE buffer 또는 TBE buffer)를 일정량 부어준다.
(다) DNA샘플 로딩 단계
상기 (나)단계의 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀에 DNA 샘플을 로딩시킨다. 추적염료(예: 브로모페놀 블루)와 DNA 샘플을 혼합하여 피펫팅하고 로딩홀에 피펫의 팁을 넣은 후 DNA 샘플을 로딩한다. 통상 DNA 샘플은 음전하를 띄고 양전하 방향으로 이동되며 분리됨으로 DNA 샘플이 로딩된쪽이 음전하가 되도록 세팅한다.
본 발명의 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀의 로딩홀은 팁이 아가로스겔에 닿지 않도록 팁의 측면이 밀착됨으로써 손의 흔들림을 최소화할 수 있고 이와 같은 지지대 역할은 웰 아래서부터 샘플이 잘 쌓일 수 있어 퀄리티를 높일 수 있는 효과가 있다.
(라) 전기영동 실시 및 DNA 시각화단계
상기 (다)단계를 거친 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀에 전기영동을 실시하고 로딩이 완료된 겔 매트릭스를 확인한다. 전기영동이 완료된 겔 제조보관틀은 UV 또는 LED Blue 광사장치에 그대로 옮겨 확인할 수 있다.
본 발명의 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀은 전기영동 프로토콜에서 겔 성형과 DNA 시각화단계까지 겔 제조보관틀 내부에서 실시되어 외부충격에 민감한 아가로스 겔의 파손을 최소화할 수 있고 기술이 미숙한 실험자의 사용에도 실험의 퀄리티가 떨어지지 않으며 대량의 아가로스 겔 제조 후 저장하고 사용이 가능함으로 실험 실시에 전반의 수고 및 시간 소요를 감소시킬 수 있다.
본 발명은 기존의 긴 시간과 수고가 소요되었던 전기영동 프로토콜이 보다 간소화됨과 동시에 겔 파손 방지와 미숙한 작업자가 보다 높은 퀄리티의 실험결과를 낼 수 있는 전기영동용 아가로스 겔 제조보관틀을 제공함으로 관련 산업인의 작업 효율성을 높여줌으로 산업상 이용가능성이 있다.
100: 틀프레임 111: 로딩홀
S: 콤프레임 200: 개폐프레임
S: 콤프레임 200: 개폐프레임
Claims (3)
- 전면과 후면이 개구되고 투명재질로 형성된 육면체구조의 틀프레임(100)의 전면 및 후면 개구부를 개방 또는 폐쇄할 수 있도록 개폐프레임(200)이 형성되며,
상기 틀프레임 상측면에는 홀형상으로 수평으로 일정간격 이격하여 이루어지는 로딩홀(111)이 틀프레임 내측으로 관통하여 형성되어, 아가로스겔을 틀프레임 내부로 주입시킬 수 있는 주입구 역할을 수행하며,
상기 로딩홀에는 로딩홀과 대응하는 콤(comb)프레임(S)이 로딩홀을 관통, 고정하여, 틀프레임 내부에 주입된 아가로스 겔이 경화시까지 콤을 지지하여 아가로스겔 상에 웰을 형성하도록 이루어진 것을 특징으로 하는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀 - 청구항 1에 있어서, 상기 수평으로 일정간격 이격하여 이루어지는 로딩홀은 수직방향으로 이격되어 복수 개의 열로 이루어진 것을 특징으로 하는 전기 영동용 아가로스 겔 제조보관틀
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 국내 공개특허번호 제10-1998-0009329호에는 프리캐스트 겔 중 불연속 겔 시스템의 스택킹 겔(stacking gel)과 레졸루션 겔 (resolution gel)사이에 박막을 설치함으로써 분해능을 장시간 보존할 수 있는 폴리아크릴아미드 전기영동 겔을 제조하는 방법에 관하여 개시하고 있다. |
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