KR102641987B1 - Depressive disorder animal model, method for producing the same and uses thereof - Google Patents
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Abstract
우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 일 실시예에 따른 우울증 동물 모델을 제조하는 방법에 따르면 종래 우울증 동물 모델의 제조 방법과 달리 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 얻을 수 있으므로, 다인성 병인을 가진 우울증이나 불안 증상을 보이지 않는 우울증의 연구, 항우울제의 개발 및 스크리닝, 우울증의 발병 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.It relates to animal models of depression, their preparation methods and uses. According to the method of manufacturing an animal model of depression according to one embodiment, unlike the manufacturing method of a conventional animal model of depression, an animal model of depression can be obtained without external stress stimulation, thereby conducting research on depression with multifactorial etiology or depression that does not show anxiety symptoms. , can be useful in the development and screening of antidepressants, and in research on the pathogenesis of depression.
Description
우울증 동물 모델, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.It relates to animal models of depression, their preparation methods and uses.
우울증(Depressive disorder)은 생각의 내용, 사고과정, 동기, 의욕, 관심, 행동, 수면, 신체활동 등 전반적인 정신 기능이 저하된 상태를 지칭한다. 우울증은 현재 세계적으로 유병률이 날로 증가하는 질환 중 하나로, 한국 역시 2006-2010년 건강보험 진료비 지급 자료를 분석한 결과, 우울증 환자가 17% 정도 증가하였고, 한해 평균 4%씩 증가하였다. 또한 세계 보건기구(WHO)에서는 2020년 세계 5대 부담 질병에 우울증을 포함시켰다. 이처럼 우울증으로 인한 무기력감, 자살, 집중력 및 기억력의 감퇴는 개인의 건강뿐만 아니라 생산성 저하로 이어져 사회의 막대한 경제적 손실을 야기할 수 있어 심각한 상황이므로, 우울증을 연구할 수 있는 우울증 동물 모델에 대한 연구가 필요하다.Depressive disorder refers to a state in which overall mental functions are reduced, including the content of thoughts, thought processes, motivation, motivation, interest, behavior, sleep, and physical activity. Depression is currently one of the diseases whose prevalence is increasing worldwide. In Korea, too, according to an analysis of health insurance medical expense payment data from 2006 to 2010, the number of patients with depression increased by about 17%, with an average increase of 4% per year. Additionally, the World Health Organization (WHO) included depression among the world's five most burdensome diseases in 2020. As such, lethargy, suicide, and loss of concentration and memory due to depression are serious situations as they can lead to a decline in productivity as well as individual health and cause enormous economic losses to society. Therefore, research on animal models of depression that can study depression is needed. need.
종래 연구개발된 우울증 동물 모델은 보통 다양한 스트레스 자극을 급성 또는 만성으로 부여함으로써 동물에서 우울증을 유도하였다. 다양한 스트레스 자극으로는 신체 구금, 전기 자극, 태아 스트레스, 모노아민 박탈 약물, 엔도톡신, 염증성 사이토카인과 같은 염증성 물질의 투여가 있다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 스트레스 자극을 급성 또는 만성적으로 줘야 하므로 동물 윤리적인 문제가 발생하고 스트레스의 종류가 다양하므로 표준화하기 어려운 한계점이 있다. 또한, 모노아민 시스템의 변화에 국한된 기전을 가지고 있어 이종의 표현형(heterogeneous phenotype)을 갖는 우울증을 모두 반영할 수 없는 문제와 동물 모델이 불안 증상을 동반하는 문제가 있다. 즉, 기존의 우울증 동물 모델은 스트레스 자극 없이 발병하는 우울증 환자를 설명할 수 없었고, 다인성 병인을 가진 우울증을 연구하기에 부족하다. Conventionally developed animal models of depression usually induce depression in animals by acutely or chronically providing various stress stimuli. Various stressful stimuli include physical confinement, electrical stimulation, fetal stress, monoamine deprivation drugs, endotoxins, and administration of inflammatory agents such as inflammatory cytokines. In the case of conventional depression animal models prepared in this way, animal ethical issues arise because stress stimuli must be administered acutely or chronically, and there are limitations that make standardization difficult due to the diverse types of stress. In addition, because the mechanism is limited to changes in the monoamine system, there is a problem that it cannot reflect depression with a heterogeneous phenotype and that animal models are accompanied by anxiety symptoms. In other words, existing animal models of depression cannot explain patients with depression that develops without stressful stimuli and are insufficient to study depression with multifactorial etiology.
따라서, 종래 우울증 동물 모델의 문제점으로 지적되어 왔던 상기 한계점들을 극복할 수 있는 동물 모델 및 이의 제조 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.Therefore, there is a need for research on animal models and methods for producing them that can overcome the limitations that have been pointed out as problems with conventional animal models of depression.
일 양상은 외부 스트레스 자극을 주지 않고,는, 그리고 중추신경계의 모노아민 신경전달물질의 변화를 유도하지 않는 새로운 우울증 동물 모델을 제조하는 방법으로서, 안지오텐신 전환 효소 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 우울증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. One aspect is a method for producing a new animal model of depression without external stress stimulation and without inducing changes in monoamine neurotransmitters in the central nervous system, comprising administering an angiotensin-converting enzyme inhibitor to the animal for depression. It provides a method for manufacturing models.
다른 양상은 상기 방법에 의해서 제조된 우울증 동물 모델을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide an animal model of depression prepared by the above method.
다른 양상은 상기 우울증 동물 모델에 항우울제의 후보약물을 투여하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide a screening method for an antidepressant comprising administering a candidate antidepressant drug to the animal model of depression.
일 양상은 동물에 안지오텐신 전환 효소 억제제를 투여하는 단계를 포함하는 우울증 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다.One aspect provides a method of producing an animal model of depression comprising administering an angiotensin converting enzyme inhibitor to the animal.
본 명세서에서 용어 "우울증(Depressive disorder)"은 의욕 저하와 우울감을 주요 증상으로 하여 다양한 인지 및 정신 신체적 증상을 일으켜 일상 기능의 저하를 가져오는 질환을 지칭하며, 감정, 생각, 신체 상태, 그리고 행동 등에 변화를 일으키는 심각한 질환이다. As used herein, the term "depressive disorder" refers to a disease that causes a variety of cognitive and psychosomatic symptoms with low motivation and depression as the main symptoms, leading to a decline in daily functions, including emotions, thoughts, physical condition, and behavior. It is a serious disease that causes changes in the back.
본 명세서에서 용어 "안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme: ACE) 억제제"는 안지오텐신 I으로부터으로부터 다이펩타이드(dipeptide, His-Leu)를 절단함으로서 혈관 수축 작용을 갖는 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 역할을 하는 안지오텐신 전환 효소의 작용을 억제하는 기능을 작용제를 지칭한다. 안지오텐신 전환 효소 억제제는 조절 T 세포를 감소시킬 수 있다.As used herein, the term "angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor" refers to an angiotensin converting enzyme that cleaves the dipeptide (His-Leu) from angiotensin I and converts it into angiotensin II, which has a vasoconstrictive effect. The function that inhibits the action of is referred to as an agonist. Angiotensin-converting enzyme inhibitors can decrease regulatory T cells.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 조절 T 세포를 감소시킬 수 있는 것이라면 어떠한 것에 제한되는 것은 아니고, 알라세프릴(Alacepril), 베나제프릴(Benazepril), 캅토프릴(Captopril), 실라자프릴(Cilazapril), 델라프릴(Delapril), 에날라프릴(Enalapril), 포시노프릴(Fosinopril), 이미다프릴(Imidapril), 리시노프릴(Lisinopril), 모엑시프릴(Moexipril), 페린도프릴(Perindopril), 퀴나프릴(Quinapril), 라미프릴(Ramipril), 테모카프릴(Temocapril) 및 조페노프릴(Zofenopril)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상, 또는 이들의 염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 캅토프릴은 혈압 치료제로 사용된다.In one embodiment of the present invention, the angiotensin converting enzyme inhibitor is not limited to any one that can reduce regulatory T cells, and includes Alacepril, Benazepril, Captopril, Cilazapril, Delapril, Enalapril, Fosinopril, Imidapril, Lisinopril, Moexipril, Perindo One or more selected from the group consisting of Perindopril, Quinapril, Ramipril, Temocapril, and Zofenopril, or salts thereof, but are limited thereto. That is not the case. The captopril is used as a treatment for blood pressure.
상기 방법에서, 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여량은 통상의 기술자에 의하여 적절한 범위로 결정할 수 있다. 구체적으로, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 약 40mg/kg/일 이상, 예를 들어 약 4025mg/kg/일 내지 10055mg/kg/일, 약 4030mg/kg/일 내지 9050mg/kg/일, 약 4035mg/kg/일 내지 8045g/kg/일, 약 3840mg/kg/일 내지 4270mg/kg/일, 약 40mg/kg/일 내지 60mg/kg/일, 또는 약 40mg/kg/일 내지 50mg/kg/일의 농도로 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여량은 한번에 투여되거나 수회에 나누어 투여될 수 있다. In the above method, the dosage of the angiotensin converting enzyme inhibitor can be determined in an appropriate range by a person skilled in the art. Specifically, the angiotensin converting enzyme inhibitor is administered in an amount of about 40 mg/kg/day or more, for example, about 4025 mg/kg/day to 10055 mg/kg/day, about 4030 mg/kg/day to 9050 mg/kg/day, about 4035 mg/kg. /day to 8045 g/kg/day, about 3840 mg/kg/day to 4270 mg/kg/day, about 40 mg/kg/day to 60 mg/kg/day, or about 40 mg/kg/day to 50 mg/kg/day. It may be administered as. The dosage may be administered at once or in several divided doses.
상기 방법에서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 21일 이상 투여되는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제를 21일 이상 투여할 때부터 우울증 증세가 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 21일부터 우울증 증상을 회복하고자 할 때까지 투여할 수 있다., 예컨대 21일 내지 30일 동안 투여되는 것일 수 있다. In the method, the angiotensin converting enzyme inhibitor may be administered for 21 days or more. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that symptoms of depression appeared when the angiotensin converting enzyme inhibitor was administered for more than 21 days. Accordingly, the angiotensin converting enzyme inhibitor may be administered from day 21 until symptoms of depression are recovered. For example, it may be administered for 21 to 30 days.
상기 "투여"는 동물에 어떠한 형태의 경로를 통해서도 수행될 수 있다. 상기 안지오텐신 전환 효소 억제제가 동물에 투여되어 효과를 나타낼 수 있는 한 제한 없이 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 구체적으로, 주사제로서 피하 주사, 복강내 주사, 혈관내 주사 등으로 투여하거나, 제제화하여 경구투여하거나, 사료 또는 식수에 첨가하여 섭취시키는 방식으로 투여할 수 있다. The “administration” may be performed to the animal via any route. The angiotensin converting enzyme inhibitor can be administered through a general route without limitation as long as it can be effective when administered to an animal. Specifically, it can be administered as an injection by subcutaneous injection, intraperitoneal injection, intravascular injection, etc., or it can be formulated and administered orally, or it can be administered by adding it to feed or drinking water.
상기 방법에서, 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 제조하는 것일 수 있다. 종래 우울증 동물 모델을 제조하기 위해서, 외부의 신체적 및/또는 정신적 스트레스 자극, 예를 들어 신체 구금, 전기 자극, 태아 스트레스 등을 급성 또는 만성으로 받게 하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 스트레스 자극을 급성 또는 만성적으로 줘야 하므로, 동물 윤리적인 문제가 발생한다. 또한, 주어지는 스트레스의 종류가 다양하므로 우울증의 원인이나 증상을 표준화하기 어려운 한계점이 있다. 본 발명의 방법은 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 제조하는 것을 특징으로 하므로, 동물 윤리적인 문제가 발생하지 않고 스트레스 자극 없이 우울증을 유발할 수 있어 스트레스 자극 없이 발병하는 우울증에 대해 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다.In the above method, an animal model of depression may be prepared without external stress stimulation. In order to produce conventional depression animal models, they are subjected to external physical and/or mental stress stimuli, such as physical confinement, electrical stimulation, fetal stress, etc., acutely or chronically. In the case of conventional depression animal models prepared in this way, stress stimuli must be administered acutely or chronically, which raises animal ethical issues. Additionally, because there are various types of stress, it is difficult to standardize the causes or symptoms of depression. The method of the present invention is characterized by producing an animal model of depression without an external stress stimulus, so it can induce depression without a stress stimulus without causing animal ethical issues, making it an animal model that can study depression that develops without a stress stimulus. can be manufactured.
상기 방법에서, 모노아민계 신경전달물질의 변화를 유도하지 않고 우울증 동물 모델을 제조하는 것일 수 있다. 종래 우울증 동물 모델을 제조하기 위해서, 중추신경계의 모노아민계 신경전달물질(도파민, 노르에피네프린, 세로토닌 등)의 변화를 유도하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 종래 우울증 동물 모델의 경우 모노아민 가설에 기초하여 모노아민계의 변화에 국한된 기전을 가지므로, 다인성 병인을 가진 우울증을 연구하기에는 한계가 있었다. 상기 방법은 모노아민계 신경전달물질의 변화를 유도하지 않고 우울증 동물 모델을 제조하는 것을 특징으로 하므로, 다인성 병인을 가진 우울증에 대해 연구할 수 있는 동물 모델을 제조할 수 있다.In the above method, an animal model of depression may be prepared without inducing changes in monoamine neurotransmitters. To create a conventional animal model of depression, changes in monoaminergic neurotransmitters (dopamine, norepinephrine, serotonin, etc.) in the central nervous system were induced. Conventional animal models of depression prepared in this way have mechanisms limited to changes in the monoamine system based on the monoamine hypothesis, so there are limitations in studying depression with multifactorial etiology. Since the method is characterized by producing an animal model of depression without inducing changes in monoamine neurotransmitters, it is possible to produce an animal model that can study depression with multifactorial etiology.
상기 방법에서, 동물은 인간에게 나타나는 각종 질환을 지닌 동물로, 몇 세대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체 질환 규명과 치료법 개발에 사용되는 동물 모델에 해당할 수 있는 인간을 제외한 동물을 제한 없이 포함한다. 구체적으로, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 양 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물 중 마우스는 번식능력, 발육능력, 및 환경 적응능력이 좋고 자손의 수가 많아 실험군에 속하는 개체 수를 많이 확보할 수 있어 믿을만한 결과를 얻을 수 있으며, 조작이 간편한 장점이 있다.In the above method, animals are animals with various diseases that occur in humans, and are used in animal models used to identify human diseases and develop treatments, such as long-term genetic research that requires several generations or organ transplant experiments that are difficult to test directly on humans. Includes without limitation animals other than humans where applicable. Specifically, it may be selected from the group consisting of mouse, rat, guinea pig, monkey, dog, cat, rabbit, cow, sheep, pig, sheep, and goat. Among the above animals, mice have good reproductive ability, developmental ability, and environmental adaptation ability, and have a large number of offspring, so a large number of individuals belonging to the experimental group can be secured, thereby obtaining reliable results, and have the advantage of being easy to operate.
다른 양상은 상기 방법에 의해서 제조된 우울증 동물 모델을 제공한다.Another aspect provides an animal model of depression prepared by the above method.
상기 우울증 동물 모델은 우울증 울증상, 또는 우울증 유사 행동(depressive-like behavior)을 나타내는 것일 수 있다. 본 명세서에서 "우울증 증상", 또는 "우울증 유사 행동"은 우울감, 자살 사고, 의욕상실, 무기력감, 피로감, 수면 장애, 성기능 장애, 집중력 저하, 식욕장애, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 우울증 증상 또는 우울증 유사 행동은 FST 및/또는 TST에 의해 평가할 수 있으며, 본 발명에 따른 우울증 동물 모델은 FST 및 TST에서 대조군인 정상 마우스동물에 비해 부동 시간의 증가를 나타내었다.The animal model of depression may exhibit depressive symptoms or depressive-like behavior. As used herein, “depression symptoms” or “depression-like behavior” may include depression, suicidal thoughts, loss of motivation, lethargy, fatigue, sleep disorders, sexual dysfunction, poor concentration, appetite disorders, or combinations thereof. In one embodiment of the present invention, the depression symptoms or depression-like behavior can be evaluated by FST and/or TST, and the depression animal model according to the present invention has an increase in immobility time compared to the normal mouse control group in FST and TST. indicated.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 불안 및 사회성의 변화를 나타내지 않는 것일 수 있다. 본 명세서에서 "사회성의 변화"란 사회성의 증가, 또는 감소를 의미할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 우울증 동물 모델은 SI 및 LD에서 대조군인 정상 동물과 유사한 수준의 불안 및 사회성을 나타내었다. 종래 우울증 동물 모델은 불안 및/또는 사회성의 변화를 보였으나, 상기 우울증 동물 모델은 불안 및/또는 사회성의 변화를 나타내지 않기 때문에, 본 발명의 동물 모델은 기존 우울증 동물 모델과 구별되는 병리 메커니즘(pathomechanism)을 갖는 새로운 것모델일 수 있다.In the above animal model of depression, it may not show changes in anxiety or sociability. In this specification, “change in sociality” may mean an increase or decrease in sociality. In one embodiment of the present invention, the depression animal model showed similar levels of anxiety and sociability as control normal animals in SI and LD. Conventional animal models of depression showed changes in anxiety and/or sociability, but since the animal model of depression does not show changes in anxiety and/or sociability, the animal model of the present invention has a pathomechanism that is distinct from existing animal models of depression. ) may be a new model with
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여 중단에 의해 우울증 증상이 회복되는 것일 수 있다. 상기 동물 모델은 안지오텐신 전환 효소 억제제의 투여를 중단, 또는 지속함으로써 우울증 증상을 조절할 수 있으므로, 우울증 연구에 유용하게 사용할 수 있다. In the above animal model of depression, depression symptoms may be recovered by discontinuing administration of the angiotensin converting enzyme inhibitor. The animal model can be useful in depression research because depression symptoms can be controlled by discontinuing or continuing the administration of an angiotensin-converting enzyme inhibitor.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 말초 면역계의 변화에 의해 우울증 증상이 나타날 수 있다. 예를 들어, 상기 우울증 동물 모델은 정상 동물에 비해서 조절 T 세포 집단(Treg)이 감소하거나, 헬퍼 T 세포가 감소하거나, 전염증성 사이토카인의 수준이 증가될 수 있다.In the above animal model of depression, symptoms of depression may appear due to changes in the peripheral immune system. For example, the depression animal model may have a decrease in regulatory T cell population (Treg), a decrease in helper T cells, or an increase in the level of pro-inflammatory cytokines compared to normal animals.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 해마에서 소교세포 수가 증가하거나, 분지형 소교세포가 증가되거나, 글루코코르티코이드 수용체 단백질의 수준이 감소할 수 있다. 해마는 우울증에 관여하는 것으로 알려진 뇌의 영역의 하나이다.In the animal model of depression, the number of microglia in the hippocampus may increase, branched microglia may increase, or the level of glucocorticoid receptor protein may decrease. The hippocampus is one of the brain regions known to be involved in depression.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 시상 하부에서 염증성 사이토카인의 변화가 없거나, 소교세포의 수와 형태가 변화하지 않을 수 있다. 시상 하부는 해마와 마찬가지로 우울증에 관여하는 것으로 알려진 뇌의 영역의 하나이다.In the above animal model of depression, there may be no change in inflammatory cytokines in the hypothalamus, or there may be no change in the number and shape of microglial cells. The hypothalamus, like the hippocampus, is one of the brain regions known to be involved in depression.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 우울증이 우울증 관련 인자, 예컨대 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor)와 관련이 없거나, KYN 경로와 관련이 없거나, 세로토닌과 관련이 없을 수 있다. 구체적으로, 우울증이 해마에서 KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo의 발현을 변화시키지 않거나, 해마에서 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A의 발현을 변화시키지 않거나, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R의 발현을 변화시키지 않을 수 있다.In the animal model of depression, depression may be unrelated to depression-related factors, such as brain-derived neurotrophic factor (bdnf), unrelated to the KYN pathway, or unrelated to serotonin. Specifically, depression does not change the expression of KYN pathway-related factors ido, kat, and kmo in the hippocampus, or the expression of serotonin receptors 5-HT1A and 5-HT2A in the hippocampus, or the angiotensin receptors AT1bR and AT1bR. , and may not change the expression of AT2R.
상기 우울증 동물 모델에 있어서, 우울증은 해마에서 HPA 축(Hypothalamic-pituitary-adrenal axis) 활성화와 관련이 없을 수 있다. HPA 축은 주요 신경내분비계로서 스트레스에 대한 반응, 소화, 면역계, 감정과 기분, 성, 에너지 저장 및 소모를 포함하는 다양한 신체 과정을 조절하는 역할을 한다.In the above animal model of depression, depression may not be related to HPA axis (Hypothalamic-pituitary-adrenal axis) activation in the hippocampus. The HPA axis is a major neuroendocrine system responsible for regulating a variety of bodily processes, including response to stress, digestion, immune system, emotions and mood, sex, and energy storage and expenditure.
즉, 본 발명에 따른 우울증 동물 모델은 시존의 우울증 동물모델과 구별되는 새로운 병리 메커니즘을 갖는 것일 수 있다.In other words, the animal model of depression according to the present invention may have a new pathological mechanism that is distinct from existing animal models of depression.
다른 양상은 상기 우울증 동물 모델에 항우울제의 후보약물을 투여하는 단계; 및 우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법을 제공한다. Another aspect includes administering a candidate antidepressant drug to the animal model of depression; and determining whether symptoms of depression are alleviated.
본 발명에서 "후보약물"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물합물로, 우울증의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. In the present invention, “candidate drug” is a newly synthesized or known compound compound, and may include substances expected to be effective in preventing or treating depression without limitation.
상기 후보약물을 투여하여 우울증 증상, 예컨대 우울감, 자살 사고, 의욕상실, 무기력감, 피로감, 수면 장애, 성기능 장애, 집중력 저하, 또는 식욕장애의 완화가 관찰된다면 해당 후보약물이 우울증의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질로 판단할 수 있다.If the candidate drug is administered and alleviation of depression symptoms such as depression, suicidal thoughts, loss of motivation, lethargy, fatigue, sleep disorder, sexual dysfunction, decreased concentration, or appetite disorder is observed, the candidate drug is effective in preventing or treating depression. It can be judged as a substance with .
상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보약물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.“Administration” of the candidate drug means introducing a given substance into a subject by an appropriate method. The candidate drug can be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. It may be, but is not limited to, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and intrarectal administration.
상기 스크리닝 방법에서, 우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 상기 우울증 동물 모델의 혈액 중 우울증 관련 표지의 농도의 측정, 개방형 필드 테스트(open field test: OFT), 명-암 탐험 평가(Light-dark exploration), 꼬리 매달기 테스트 (tail suspension test: TST), 사회적 상호 작용 테스트(Social interaction test: SI), 잠재적 억제 테스트(Latent inhibition: LI), 강제 수영 테스트 (Forced swim test: FST), 과당 선호 테스트(Sucrosepreference test), 사전 파동 억제 (Prepulse Inhibition: PPI) 테스트, 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.In the screening method, the step of determining whether depression symptoms are alleviated may be performed using methods known in the art, such as measuring the concentration of depression-related markers in the blood of the animal model of depression, open field test (OFT), Light-dark exploration, tail suspension test (TST), social interaction test (SI), latent inhibition (LI), forced swimming test ( It may be performed by a Forced swim test (FST), a Sucrosepreference test, a Prepulse Inhibition (PPI) test, or a combination thereof.
일 실시예에 따른 우울증 동물 모델을 제조하는 방법에 따르면 종래 우울증 동물 모델의 제조 방법과 달리 외부 스트레스 자극 없이 우울증 동물 모델을 얻을 수 있으므로, 다인성 병인을 가진 우울증이나 불안 증상을 보이지 않는 우울증의 연구, 항우울제의 개발 및 스크리닝, 우울증의 발병 기전 연구에 유용하게 사용될 수 있다.According to the method of manufacturing an animal model of depression according to one embodiment, unlike the manufacturing method of a conventional animal model of depression, an animal model of depression can be obtained without external stress stimulation, thereby conducting research on depression with multifactorial etiology or depression that does not show anxiety symptoms. , can be useful in the development and screening of antidepressants, and in research on the pathogenesis of depression.
도 1은 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 용량 의존 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 2는 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 시간 경과 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 3은 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 EPM 결과(A) 및 LD 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 SI 결과를 나타낸 그림과 그래프이다.
도 5는 캅토프릴 세척의 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 이미프라민을 공동으로 처리함으로써 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 7은 이미프라민을 후처리함으로써 캅토프릴에 의해 유도된 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 대조군(CON)과 CHC 마우스에서의 유세포분석 결과 및 총 림프구에 대한 CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 9는 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 tbx21, gata3, 및 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 10은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 TNF-α의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 11은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-1β의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 12는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-6의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 13은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-17의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 14는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-4의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 15는 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IL-10의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 16은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 17은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 18은 CHC 마우스의 해마에서 우울증과 관련된 마커인 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor), KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo, 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1, 및 IL-6, 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R, 및 소교세포 기능 표현형 마커인 cx3cr1, cd200r, 및 p2ry12의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 19는 이미프라민 공동-처리군(+co-Imi), 우울증 마우스(CHC), 및 정상 마우스(CON)에서 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.
도 20은 정상 마우스(CON), 우울증 마우스(CHC), 및 이미프라민 공동-처리군(Co-Imi+CHC)의 해마에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 연구를 수행한 결과를 나타낸 사진이다: 20X(좌측), 40X(우측). 또한 영역 mm2당 Iba-1 양성 세포의 수를 카운팅한 그래프이다.
도 21은 정상 마우스(CON)와 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 GR 단백질의 수준을 확인한 사진 및 그래프이다.
도 22는 우울증 마우스의 시상 하부에서 전-염증성 사이토카인인 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 23은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부의 소교세포에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 사진이다: 4X 이미지.
도 24는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 세로토닌(5-히드록시트립타민: 5-HT) 및 이의 주요 대사 산물인 히드록시인돌아세트산(hydroxyindoleacetic acid: HIAA)의 수준을 HPLC로 측정한 그래프이다.
도 25는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부에서 코르티코트로핀-방출 호르몬(corticotropin-relieasing hormone: CRH)의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이다.
도 26은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)에서 혈청 글루코코르티코이드(Gc) 수준을 EIA 분석에 의해 측정한 그래프이다.Figure 1 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) to confirm the dose-dependent effect of captopril on depression-like behavior.
Figure 2 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) to confirm the time course effect of captopril on depression-like behavior.
Figure 3 is a graph showing EPM results (A) and LD results (B) to confirm the effect of captopril on anxiety and social skills.
Figure 4 is a picture and graph showing SI results to confirm the effect of captopril on anxiety and social skills.
Figure 5 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the effect of captopril washing.
Figure 6 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the antidepressant effect by jointly treating imipramine.
Figure 7 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the antidepressant effect induced by captopril by post-treatment with imipramine.
Figure 8 is a graph showing the results of flow cytometry in normal control (CON) and CHC mice and the percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ cells to total lymphocytes.
Figure 9 is a graph confirming the mRNA expression levels of tbx21, gata3, and foxp3 in mesenteric lymph nodes of CHC mice by qPCR.
Figure 10 is a graph confirming the mRNA expression level of TNF-α in the serum of CHC mice and normal mice (CON) by qPCR, respectively.
Figure 11 is a graph confirming the mRNA expression level of IL-1β in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, using qPCR.
Figure 12 is a graph confirming the mRNA expression level of IL-6 in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, by qPCR.
Figure 13 is a graph confirming the mRNA expression level of IL-17 in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, using qPCR.
Figure 14 is a graph confirming the mRNA expression level of IL-4 in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, by qPCR.
Figure 15 is a graph confirming the mRNA expression level of IL-10 in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, using qPCR.
Figure 16 is a graph confirming the mRNA expression level of IFN-γ in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, using qPCR.
Figure 17 is a graph showing circulating levels of angiotensin II measured in CHC mice and normal mice (CON).
Figure 18 shows brain-derived neurotrophic factor (bdnf), a depression-related marker, ido, kat, and kmo, KYN pathway-related factors, and pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 in the hippocampus of CHC mice. , and IL-6, serotonin receptors 5-HT1A and 5-HT2A, angiotensin receptors AT1bR, AT1bR, and AT2R, and microglial function phenotype markers cx3cr1, cd200r, and p2ry12 This is a graph confirmed by qPCR. .
Figure 19 is a graph showing the mRNA expression levels of tnf-α and il-6 in the imipramine co-treated group (+co-Imi), depressed mice (CHC), and normal mice (CON).
Figure 20 is a photograph showing the results of an immunohistochemical study on Iba-1 in the hippocampus of normal mice (CON), depressed mice (CHC), and imipramine co-treatment group (Co-Imi+CHC) : 20X (left), 40X (right). Also, this is a graph counting the number of Iba-1 positive cells per area mm 2 .
Figure 21 is a photograph and graph confirming the level of GR protein in the hippocampus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC).
Figure 22 is a graph showing the results of qPCR confirming the mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines tnf-α, il-1β, and il-6 in the hypothalamus of depressed mice.
Figure 23 is a photograph showing the results of immunohistochemistry for Iba-1 in microglia of the hypothalamus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC): 4X image.
Figure 24 shows HPLC levels of serotonin (5-hydroxytryptamine: 5-HT) and its main metabolite, hydroxyindoleacetic acid (HIAA), in the hippocampus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC). This is a graph measured by .
Figure 25 is a graph confirming the mRNA expression of corticotropin-releasing hormone (CRH) in the hypothalamus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC) by qPCR.
Figure 26 is a graph measuring serum glucocorticoid (Gc) levels in normal mice (CON) and depressed mice (CHC) by EIA analysis.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. This will be described in more detail through examples below. However, these examples are intended to illustrate one or more embodiments and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예Example 1. 우울증 동물 모델 제작 1. Creation of an animal model of depression
1.1 1.1 실험 동물laboratory animals
모든 실험에 20-25g의 7주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc. Seoul, Korea)를 사용하였다. 케이지 당 5마리의 동물을 22±0.5℃에서 12 시간 동안의 명-암 사이클에서 번갈아 가며 유지하였다. 음식과 물은 자유롭게 섭취하게 하였다. 동물들은 실험이 시작되기 1주일 전에 실험실에 순응하도록 하였다. 모든 실험 절차는 CHA 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC130018 및 IACUC130025)의 승인을 받았다.7-week-old male C57BL/6 mice (Orient Bio Inc. Seoul, Korea) weighing 20-25 g were used in all experiments. Five animals per cage were maintained in alternating light-dark cycles for 12 hours at 22±0.5°C. Food and water were allowed to be consumed ad libitum. Animals were allowed to acclimate to the laboratory 1 week before the start of the experiment. All experimental procedures were approved by CHA University's Animal Care and Use Committee (IACUC130018 and IACUC130025).
1.2 우울증 동물 모델 제작 및 우울증 확인1.2 Creation of depression animal model and confirmation of depression
우울증 동물 모델을 제작하기 위하여, 상기 1.1과 같이 준비된 마우스에 캅토프릴을 투여하였다.To create an animal model of depression, captopril was administered to mice prepared as in 1.1 above.
구체적으로, 캅토프릴 투여의 용량 의존 효과를 측정하기 위해, 캅토프릴(Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri)을 25mg/kg/일 또는 40mg/kg/일의 농도로 식수에 용해시켜 마우스에 투여했다. Specifically, to measure the dose-dependent effect of captopril administration, captopril (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) was dissolved in drinking water at a concentration of 25 mg/kg/day or 40 mg/kg/day and administered to mice. did.
또한, 캅토프릴 투여의 시간 경과 효과를 측정하기 위해, 캅토프릴 40mg/kg을 7일, 14일 및 21일 동안 식수에 용해시켜 마우스에 투여했다.Additionally, to measure the time course effect of captopril administration, 40 mg/kg of captopril dissolved in drinking water was administered to mice for 7, 14, and 21 days.
상기와 같이 제작한 마우스가 우울증 유사 행동을 나타내어 우울증 동물 모델로 사용될 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 다음과 같은 행동 실험을 수행하였다. In order to confirm whether the mouse prepared as above exhibited depression-like behavior and could be used as an animal model for depression, the following behavioral experiment was performed.
마우스는 행동 실험을 수행하기 전 적어도 30분 동안 실험실에 적응하도록 하였다. 모든 실험은 연속적인 실험으로 오전 9시부터 오후 4시 사이의 명(light) 단계에서 실시하였고, 하루에 한 번 실험을 수행하였다. 대조군(control: CON)은 아무 처리를 하지 않은 정상 마우스를 지칭한다. 만성 억제 스트레스군(chronic restraint stress: CRS)은 환기를 위한 코 구멍이 있는 50 mL 코닝 튜브에 넣어 하루에 2 시간(오전 11시-오후 1시)씩 21 일 동안 연속으로 억제 스트레스(restraint stress)를 부여한 마우스를 지칭한다. CRS군은 종래 우울증 마우스를 제조하는 방법인 억제 스트레스에 의해 마우스가 우울증을 갖도록 한 것으로, 양성 대조군으로서 사용하였다. Mice were allowed to acclimate to the laboratory for at least 30 min before performing behavioral experiments. All experiments were conducted as continuous experiments in the light phase between 9:00 am and 4:00 pm, and experiments were performed once a day. Control (CON) refers to normal mice without any treatment. The chronic restraint stress (CRS) group was subjected to restraint stress for 2 hours a day (11 AM - 1 PM) for 21 consecutive days in a 50 mL coning tube with a nostril for ventilation. Refers to the mouse that has been given a . The CRS group was used as a positive control group in which mice were made to have depression by suppressive stress, which is a conventional method of producing depressed mice.
꼬리 매달기 테스트 (Tail Tail suspension test suspensiontestsuspension test : : TSTTST ))
TST 장치는 상단에 부착된 후크가 있는 찬장으로 구성된다. 마우스의 꼬리 둘레에 접착 테이프를 감아 장치의 후크에 꼬리를 고정시킴으로써 마우스를 정지시켰다. 꼬리는 꼬리가 접히지 않도록 주의깊게 매달았고, 꼬리의 끝은 후크의 끝에서 2cm 떨어지도록 하였다. 꼬리를 올라간 마우스의 데이터는 테스트에서 제외하였다. 7 분간의 테스트 기간 동안 움직이지 않는 시간을 측정하였다. 두 관찰자들은 각 군에 대해 모르는 상태이고, 움직이지 않는 시간(부동 시간)을 측정하였다.The TST device consists of a cupboard with hooks attached to the top. The mouse was suspended by wrapping adhesive tape around its tail and securing it to the hook of the device. The tail was hung carefully to prevent it from being folded, and the tip of the tail was placed 2 cm away from the end of the hook. Data from mice with their tails raised were excluded from testing. The immobility time was measured during the 7-minute test period. The two observers were blind to each group and measured the immobility time.
강제 수영 실험(Forced swimming test: FST)Forced swimming test (FST)
우울증 유사 행동을 반영하는, 피할 수 없는 스트레스 상황에 대처하는 마우스의 능력을 평가하기 위하여 FST를 수행하였다. 마우스를 2L Pyrex 비이커 (직경 13cm, 높이 24cm)에 개별적으로 놓고, 17cm의 깊이로 23℃의 물을 채웠다. 모든 마우스를 6 분 동안 강제로 수영 시켰고, 실험의 마지막 5분 동안 부동 시간을 측정했다. 부동 시간은 마우스가 허우적거리지 않고 떠있거나 머리를 수면 위로 유지하는데 필요한 움직임만을 취하면서 소요된 시간으로 정의한다. 두 관찰자들은 각 군에 대해 모르는 상태이고, 움직이지 않는 시간을 측정하였다.FST was performed to evaluate the mice's ability to cope with unavoidable stressful situations, reflecting depression-like behavior. Mice were placed individually in a 2L Pyrex beaker (13cm diameter, 24cm height) and filled with water at 23°C to a depth of 17cm. All mice were forced to swim for 6 min, and immobility time was measured during the last 5 min of the experiment. Immobility time is defined as the time spent by the mouse floating without floundering or making only the movements necessary to keep its head above the water. The two observers were blind to each group and measured the immobility time.
도 1은 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 용량 의존 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다. Figure 1 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) to confirm the dose-dependent effect of captopril on depression-like behavior.
도 1에 나타낸 바와 같이, TST와 FST 의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)과 비교하여, 40mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(40mg/kg)]에서 부동 시간이 유의적으로 증가하였으나, 25mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(25mg/kg)]에서는 부동 시간이 변화하지 않았다. 양성 대조군(CRS)과 비교하여, 40mg/kg의 캅토프릴 투여군[Cap(40mg/kg)]의 부동 시간은 유사한 수준으로 측정되거나 더 긴 부동 시간을 나타내었다.As shown in Figure 1, the results of TST and FST were consistent. Compared to normal mice (CON), immobility time was significantly increased in the group administered 40 mg/kg of captopril [Cap (40 mg/kg)], but in the group administered 25 mg/kg of captopril [Cap (25 mg/kg)]. Dead time did not change. Compared to the positive control group (CRS), the immobility time of the group administered 40 mg/kg of captopril [Cap (40 mg/kg)] was measured at a similar level or showed a longer immobility time.
따라서, TST 및 FST 결과에 의해 40mg/kg의 캅토프릴 투여군에서 우울증 유사 행동이 나타났음을 확인하였다.Therefore, the results of TST and FST confirmed that depression-like behavior occurred in the group administered 40 mg/kg of captopril.
도 2는 우울증 유사 행동에 대한 캅토프릴의 시간 경과 효과를 확인하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다.Figure 2 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) to confirm the time course effect of captopril on depression-like behavior.
도 2에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)와 비교하여, 40mg/kg 캅토프릴의 7일 투여군[Cap(7d)], 40mg/kg 캅토프릴의 14일 투여군[Cap(14d)]의 부동 시간은 변화하지 않았으나, 40mg/kg 캅토프릴의 21일 투여군[Cap(21d)]의 부동 시간은 유의적으로 증가하였다. 양성 대조군(CRS)과 비교하여, 40mg/kg 캅토프릴의 21일 투여군[Cap(21d)]의 부동 시간은 유사한 수준으로 측정되거나 더 긴 부동 시간을 나타내었다.As shown in Figure 2, the results of TST and FST were consistent. Compared to normal mice (CON), the immobility time of the 40 mg/kg captopril 7-day administration group [Cap(7d)] and the 40 mg/kg captopril 14-day administration group [Cap(14d)] did not change, but the 40 mg/kg captopril administration group [Cap(14d)] The immobility time of the group [Cap(21d)] administered kg captopril for 21 days was significantly increased. Compared to the positive control group (CRS), the immobility time of the group administered 40 mg/kg captopril for 21 days [Cap(21d)] was measured at a similar level or showed a longer immobility time.
따라서, TST 및 FST 결과에 의해 40mg/kg의 캅토프릴을 21일 이상 투여함으로써 마우스에서 우울증 유사 행동이 나타났음을 확인하였다. Therefore, based on the TST and FST results, it was confirmed that depression-like behavior appeared in mice when 40 mg/kg of captopril was administered for more than 21 days.
상기 결과를 종합하여, 만성 고농도 캅토프릴(chronic high-dose captopril: CHC)의 처리에 의해 마우스가 우울증 유사 행동을 나타냄을 확인하였다. 이하에서 우울증 마우스를 "CHC"로 지칭하고, 이는 40mg/kg/일 농도의 캅토프릴을 21일 이상 동안 투여한 군으로 정의한다.Taking the above results together, it was confirmed that mice exhibited depression-like behavior due to treatment with chronic high-dose captopril (CHC). Hereinafter, depressed mice are referred to as “CHC” and are defined as a group administered captopril at a concentration of 40 mg/kg/day for more than 21 days.
실험예Experiment example 1. 우울증 마우스의 불안 및 사회성 평가 1. Assessment of anxiety and sociability in depressed mice
상기 실시예 1에 따라 제작한 우울증 마우스에서 불안 및 사회성을 평가하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.To evaluate anxiety and sociability in the depressed mice produced according to Example 1, the following experiment was performed.
위로 올려진 십자 형태의 미로(elevated plus maze: Elevated plus maze: EPMEPM ))
EPM 장치는 흰색 무광택 플렉시 유리로 만든 4 개의 열린 지붕 팔 (30Х5cm)로 구성된다. 두 개의 반대편 팔은 20-cm 높이 벽으로 닫혀있고(닫힌 팔), 나머지 두 팔은 벽을 갖지 않는다(열린 팔). 4 개의 팔은 중앙에 5Х5cm의 정사각형을 중심으로 서로 90°로 배치된다. 장치는 바닥에서 30cm 높게 상승된다. 초기에 마우스는 실험 장치로부터 열린 팔 중 하나를 향하여 장치의 중앙에 놓여졌고, 장치를 자유롭게 5 분 동안 탐험할 수 있게 하였다. 열린 팔과 닫힌 팔을 출입하는 수를 기록하고 각 팔에서 소비된 시간을 EthoVision XT9 비디오 추적 시스템을 사용하여 기록하였다.The EPM device consists of four open roof arms (30Х5 cm) made of white matte plexiglass. Two opposing arms are closed by a 20-cm high wall (closed arms), and the other two arms have no walls (open arms). The four arms are arranged at 90° to each other around a square of 5Х5 cm in the center. The device is raised 30 cm above the floor. Initially, the mouse was placed in the center of the apparatus facing one of the open arms from the experimental apparatus and allowed to freely explore the apparatus for 5 min. The number of entries and exits into the open and closed arms was recorded, and the time spent in each arm was recorded using the EthoVision XT9 video tracking system.
명-암 탐험(Light-dark exploration: LD)Light-dark exploration (LD)
불안 유사 행동을 평가하기 위해 밝은 빛과 열린 공간을 피하는 경향을 조사하는 LD를 수행하였다. 구체적으로, 이 평가에 사용된 장치는 밀폐된 암실에 연결된 하나의 개방된 밝은 챔버로 구성된 박스 (30Х30Х30cm)이다. 챔버는 작은 사각형 구멍 (7Х7cm)으로 연결된다. 어두운 챔버로부터 멀어지는 방향으로 밝은 챔버의 모서리에 마우스를 위치시키고, 챔버 사이의 이동 횟수 및 어두운 챔버에서 머문 시간을 수동으로 10 분 동안 측정하였다.To assess anxiety-like behavior, LD was performed to examine the tendency to avoid bright lights and open spaces. Specifically, the device used in this evaluation is a box (30Х30Х30 cm) consisting of one open bright chamber connected to a closed dark chamber. The chambers are connected by small square holes (7Х7cm). The mouse was placed in the corner of the bright chamber in the direction away from the dark chamber, and the number of movements between chambers and the time spent in the dark chamber were manually measured for 10 minutes.
사회적 상호작용(social interaction: social interaction: SISI ))
SI는 공지된 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 시도 1(empty)에서, 마우스를 한쪽 끝에 비어있는 와이어 메쉬 케이지가 있는 영역에 두었다. 마우스가 없는 경우 그들의 움직임을 2.5분 동안 모니터링하였다. 시도 2(social)에서, 마우스를 철망 케이지에 넣고 실험 대상 마우스를 넣고 2.5 분간 움직임을 기록하였다. 사회적 회피 행동 테스트에서 활동도는 EthoVision XT9 비디오 추적 시스템을 사용하여 비디오를 기록하고 분석하였다.SI was performed by a known method. Specifically, in trial 1 (empty), the mouse was placed in an area with an empty wire mesh cage at one end. In the absence of mice, their movements were monitored for 2.5 min. In trial 2 (social), the mouse was placed in a wire mesh cage, the experimental mouse was placed in it, and its movements were recorded for 2.5 minutes. Activity in the social avoidance behavior test was video recorded and analyzed using the EthoVision XT9 video tracking system.
도 3은 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 EPM 결과(A) 및 LD 결과(B)를 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing EPM results (A) and LD results (B) to confirm the effect of captopril on anxiety and social skills.
도 3에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스(CON)와 비교하여, CHC 마우스가 열린 팔에 머문 시간과 어두운 영역에서 머문 시간에 유의적인 차이가 없었다.As shown in Figure 3, compared to normal mice (CON), there was no significant difference in the time CHC mice stayed in the open arm and the time they stayed in the dark area.
도 4는 불안 및 사회성에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위한 SI 결과를 나타낸 그림과 그래프이다.Figure 4 is a picture and graph showing SI results to confirm the effect of captopril on anxiety and social skills.
도 4에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스(CON)와 CHC 마우스가 어두운 영역에서 머문 시간은 비슷한 수준으로, 사회적 상호작용은 유사한 양상을 나타내어 유의적인 차이가 없었다.As shown in Figure 4, the time that normal mice (CON) and CHC mice stayed in the dark area was similar, and their social interactions were similar, with no significant differences.
따라서, 캅토프릴은 우울증 마우스에서 불안 및 사회성에 영향을 주지 않음을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that captopril did not affect anxiety and sociability in depressed mice.
실험예Experiment example 2. 2. 캅토프릴captopril 세척의 효과 평가 Evaluate the effectiveness of cleaning
캅토프릴 세척(washout)의 효과를 평가하기 위해, 캅토프릴 세척 마우스에서 우울증 증상을 확인하였다. 구체적으로, 21일 동안 캅토프릴을 투여한 CHC 마우스에 대하여 22일차부터는 식수에서 캅토프릴을 제거하고 7일 동안 일반 식수를 제공하여 캅토프릴 세척 마우스를 제작하였다.To evaluate the effect of captopril washout, symptoms of depression were confirmed in captopril washout mice. Specifically, for CHC mice administered captopril for 21 days, captopril was removed from the drinking water on the 22nd day and regular drinking water was provided for 7 days to create captopril-washed mice.
캅토프릴 세척 마우스(CHC+Washout), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 실시예에 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.TST and FST were performed on captopril washed mice (CHC+Washout), normal mice (CON), and depressed mice (CHC) in the same manner as described in the above examples.
도 5는 캅토프릴 세척의 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다. Figure 5 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the effect of captopril washing.
도 5에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스에 비하여, 캅토프릴 세척 마우스의 부동 시간은 유의적으로 감소하였다.As shown in Figure 5, the results of TST and FST were consistent. Compared to depressed mice, whose immobility time was significantly increased compared to normal mice, the immobility time of captopril-washed mice was significantly decreased.
따라서, 캅토프릴의 투여를 중단한 후 7일 동안의 캅토프릴 세척에 의해 우울증 유사 행동이 정상 수준으로 회복되었음을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that depression-like behavior was restored to a normal level by washing out captopril for 7 days after stopping the administration of captopril.
실험예Experiment example 3. 3. 이미프라민Imipramine 공동-처리에 의한 항우울 효과 평가 Evaluation of antidepressant effects by co-treatment
이미프라민(imipramine)은 삼환계 항우울제이다. 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리에 의한 항우울 효과를 평가하기 위하여, 이미프라민(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) 20 mg/kg을 생리적으로 정상인 식염수에 용해시키고 캅토프릴을 투여하는 동안 하루 1 회 복강내로 처리 함으로써 이미프라민 공동-처리군을 제작하였다.Imipramine is a tricyclic antidepressant. To evaluate the antidepressant effect of co-treatment of captopril and imipramine, 20 mg/kg of imipramine (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) was dissolved in physiologically normal saline solution and administered while captopril was administered. An imipramine co-treatment group was created by intraperitoneal treatment once a day.
이미프라민 공동-처리군(co-Imi+CHC), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 실시예에 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.TST and FST were performed on the imipramine co-treated group (co-Imi+CHC), normal mice (CON), and depressed mice (CHC) in the same manner as described in the above examples.
도 6은 이미프라민을 공동으로 처리함으로써 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다. Figure 6 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the antidepressant effect by jointly treating imipramine.
도 6에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스(CHC)에 비하여, 이미프라민 공동-처리군(co-Imi+CHC)의 부동 시간은 정상 마우스와 유사한 수준으로 감소하였다.As shown in Figure 6, the results of TST and FST were consistent. Compared to depressed mice (CHC), whose immobility time was significantly increased compared to normal mice (CON), the immobility time of the imipramine co-treated group (co-Imi+CHC) was decreased to a level similar to that of normal mice.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이 항우울제인 이미프라민을 캅토프릴과 공동으로 처리하는 경우, 정상 수준으로 감소하였으므로 캅토프릴에 의해 유도된 우울증은 항우울제의 처리에 의해 회복되므로,복될 수 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이 다른 질병에 의해 발생한 움직임 문제가 아닌 것을 확인하였다. Therefore, the depression-like behavior shown by the administration of captopril was reduced to normal levels when the antidepressant imipramine was co-treated with captopril, and the depression induced by captopril was recovered by treatment with the antidepressant, so it could be recovered. It was confirmed that the depression-like behavior caused by the administration of captopril was not a movement problem caused by another disease.
실험예Experiment example 4. 4. 이미프라민Imipramine -후처리에 의한 항우울 효과 평가-Evaluation of antidepressant effect by post-treatment
캅토프릴에 의한 우울증 유도 후 이미프라민을 처리하여 이의 항우울 효과를 평가하기 위하여, 상기 실시예와 같이 캅토프릴을 21일 동안 처리한 후에 이미프라민(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) 20 mg/kg을 추가적으로 처리하였다. 이미프라민을 생리적으로 정상인 식염수에 용해시키고 캅토프릴 투여를 중단한 후 14일 동안 하루 1 회 복강내로 처리 함으로써 이미프라민 후-처리군을 제작하였다. In order to evaluate the antidepressant effect of imipramine after induction of depression by captopril, imipramine (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri) 20 was treated with captopril for 21 days as in the above example. mg/kg was additionally treated. An imipramine post-treatment group was created by dissolving imipramine in physiologically normal saline solution and administering intraperitoneal treatment once a day for 14 days after discontinuing captopril administration.
이미프라민 후-처리군(CHC+post-Imi), 정상 마우스(CON), 및 우울증 마우스(CHC)에 대하여 상기 기재한 바와 같은 방법으로 TST 및 FST를 수행하였다.TST and FST were performed as described above for the imipramine post-treatment group (CHC+post-Imi), normal mice (CON), and depressed mice (CHC).
도 7은 이미프라민을 후처리함으로써 캅토프릴에 의해 유도된 항우울 효과를 평가하기 위한 TST 결과(A) 및 FST 결과(B)를 나타낸 그래프이다. Figure 7 is a graph showing TST results (A) and FST results (B) for evaluating the antidepressant effect induced by captopril by post-treatment with imipramine.
도 7에 나타낸 바와 같이, TST와 FST의 결과가 일치하였다. 정상 마우스(CON)에 비해 부동 시간이 유의적으로 증가한 우울증 마우스(CHC)에 비하여, 이미프라민 후-처리군(CHC+post-Imi)의 부동 시간은 정상 마우스와 유사하거나 그 이하의 수준으로 감소하였다.As shown in Figure 7, the results of TST and FST were consistent. Compared to depressed mice (CHC), whose immobility time was significantly increased compared to normal mice (CON), the immobility time of the imipramine post-treatment group (CHC+post-Imi) was similar to or lower than that of normal mice. decreased.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의해 나타난 우울증 유사 행동이, 캅토프릴의 투여 중단 후에 항우울제인 이미프라민을 처리함으로써 정상 수준으로 감소하였으므로 캅토프릴에 의해 유도된 우울증은 항우울제의 처리에 의해 회복될 수 있음을 확인하였다. Therefore, since the depression-like behavior shown by the administration of captopril was reduced to a normal level by treatment with the antidepressant imipramine after discontinuation of the administration of captopril, the depression induced by captopril can be recovered by treatment with the antidepressant. was confirmed.
실험예Experiment example 5. 5. 캅토프릴에To captopril 의해 유도된 우울증 유사 행동과 말초 면역계의 관련성 확인 Confirmation of the relationship between depression-like behavior induced by the peripheral immune system
먼저, 조절 T 세포(regulatory T cells: Tregs) 집단에 대한 캅토프릴의 효과를 확인하기 위해, CHC 마우스의 비장에서 Treg 집단을 유세포분석으로 측정하였다. First, to confirm the effect of captopril on the regulatory T cell (Treg) population, the Treg population in the spleens of CHC mice was measured by flow cytometry.
구체적으로, 마우스의 비장을 37℃에서 30분 동안 RPMI 배지 (Gibco, Carlsbad, CA)에서 콜라게나제 IV (SigmaAldrich, St.Louis, MO)와 DNase I (Sigma-Aldrich)로 소화시키고, 40㎛ 거즈(BD Biosciences, San Jose, CA)를 사용하여 여과시켜서 단일 세포 현탁액을 생성하였다. 세포를 고정하고 투과성으로 만들고 마우스 조절 T 세포 염색 키트 (eBioscience, San Diego, CA, 88-8118-40)로 염색 하였다. 조절 T 세포를 측정하고 제조자의 지시에 따라 분석 하였다. 표면 단백질인 CD4, CD25 및 세포 내 단백질 FoxP3에 대한 항체를 사용하여 5x106/mL의 세포를 면역 표지 하였다. 요약하면, 세포를 CD4-FITC 및 CD25-PE 또는 아이소 타입 매치된 대조 항체에서 20 내지 23.5℃에서 20 분 동안 어둠 속에서 배양 하였다; 세포를 1 mL의 염색 완충액으로 세척하고 어둠 속에서 20-23.5℃에서 10 분 동안 마우스 조절 T 세포 염색 키트에 제공된 고정 완충액으로 세척하였다. 세포를 투과성 완충액으로 20-23.5℃에서 1 시간 동안 처리한 다음 1 mL의 염색 완충액으로 세척하였다. 세척 후, 세포를 APC 접합 항 마우스 FoxP3 또는 아이소 타입 대조군에서 적어도 30 분 동안 어둠 속 20-23.5℃에서 배양하였다. 배양이 끝나면 세포를 세척하고 염색 완충액에 재현탁하였다. BD FACS Calibur로 데이터 수집을 수행하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (Treestar Inc., Ashland, OR)로 분석하였다.Specifically, mouse spleens were digested with collagenase IV (SigmaAldrich, St. Louis, MO) and DNase I (Sigma-Aldrich) in RPMI medium (Gibco, Carlsbad, CA) for 30 minutes at 37°C, and incubated at 40 μm. A single cell suspension was generated by filtration using gauze (BD Biosciences, San Jose, CA). Cells were fixed, permeabilized, and stained with the Mouse Regulatory T Cell Staining Kit (eBioscience, San Diego, CA, 88-8118-40). Regulatory T cells were measured and analyzed according to the manufacturer's instructions. 5x10 6 /mL of cells were immunolabeled using antibodies against surface proteins CD4, CD25, and intracellular protein FoxP3. Briefly, cells were incubated in CD4-FITC and CD25-PE or isotype-matched control antibodies at 20 to 23.5°C for 20 min in the dark; Cells were washed with 1 mL of staining buffer and fixation buffer provided in the mouse regulatory T cell staining kit for 10 min at 20-23.5°C in the dark. Cells were treated with permeabilization buffer at 20-23.5°C for 1 hour and then washed with 1 mL of staining buffer. After washing, cells were incubated at 20-23.5°C in the dark for at least 30 min in APC-conjugated anti-mouse FoxP3 or isotype control. At the end of incubation, cells were washed and resuspended in staining buffer. Data collection was performed with a BD FACS Calibur and data were analyzed with FlowJo software (Treestar Inc., Ashland, OR).
도 8은 정상 대조군(CON)과 CHC 마우스에서의 유세포분석 결과 및 총 림프구에 대한 CD4+ CD25+ Foxp3+ 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다. 각 군에서 n=3이다. Figure 8 is a graph showing the results of flow cytometry in normal control (CON) and CHC mice and the percentage of CD4+ CD25+ Foxp3+ cells to total lymphocytes. n=3 in each group.
도 8에 나타낸 바와 같이, 고농도 캅토프릴의 만성 투여는 마우스의 비장에서 Treg 집단을 유의적으로 감소시킨 것을 확인하였다. As shown in Figure 8, it was confirmed that chronic administration of high concentration captopril significantly reduced the Treg population in the spleen of mice.
또한, 마우스의 장간막 림프절에서 T 세포의 다양한 아형과 관련이 있는 mRNA 마커를 분석하기 위하여, 마우스의 장간막 림프절을 절단하여 T 헬퍼 1 세포(Th1)의 마커인 tbx21, T 헬퍼 2 세포(Th2)의 마커인 gata3, 및 Treg의 마커인 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 측정하였다. In addition, in order to analyze mRNA markers associated with various subtypes of T cells in the mesenteric lymph nodes of mice, the mesenteric lymph nodes of mice were cut and tbx21, a marker for T helper 1 cells (Th1), and T helper 2 cells (Th2) were analyzed. The mRNA expression levels of the marker gata3 and the Treg marker foxp3 were measured by qPCR.
구체적으로, 상기와 같이 21 일 동안 캅토프릴을 투여한 후 장간막 림프절을 해부하였다. RNA 추출을 위해, 동결 조직을 조직 100mg 당 1mL의 QIAzol 시약(Qiagen, Valencia, CA)으로 균질화하였다. 클로로포름을 가하여 RNA를 함유하는 상을 분리하고, 이소프로필 알콜을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 침전된 RNA 펠렛을 공기 건조 후 DEPC-처리수 (Bioneer, 성남, 한국)에 재용해시켰다. 260nm에서의 흡광도에 의해 RNA 농도의 정량화를 수행하였다. RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo scientifc)를 사용하여 1㎍의 messenger RNA (mRNA)를 20μL의 반응 믹스에서 cDNA로 역전사시켰다. 정량적 PCR은 Power SYBR® Green PCR Master Mix (Life technologies, Warrington, UK)를 사용하여 수행하였다. 본 명세서에서 사용한 프라이머 서열은 표 1에 열거하였다. 사이클 조건은 95℃에서 5분 동안의 초기 효소 활성화, 95℃에서 20초 동안의 변성, 어닐링, 및 40초 동안의 PCR에 결합된 SYBR Green의 검출을 포함하는 연장 56℃에서의 반응이다. GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 정규화를 위한 대조군으로 사용하였다. PCR 단편의 상대적 양은 비교 CT 방법을 사용하여 계산하였다. 각 군에서 n=8-15이다.Specifically, mesenteric lymph nodes were dissected after captopril was administered for 21 days as described above. For RNA extraction, frozen tissue was homogenized with 1 mL of QIAzol reagent (Qiagen, Valencia, CA) per 100 mg of tissue. Chloroform was added to separate the RNA-containing phase, and isopropyl alcohol was added to precipitate the RNA. The precipitated RNA pellet was air-dried and re-dissolved in DEPC-treated water (Bioneer, Seongnam, Korea). Quantification of RNA concentration was performed by absorbance at 260 nm. 1 μg of messenger RNA (mRNA) was reverse transcribed into cDNA in 20 μL of reaction mix using the RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit (Thermo scientific). Quantitative PCR was performed using Power SYBR® Green PCR Master Mix (Life technologies, Warrington, UK). Primer sequences used herein are listed in Table 1. Cycling conditions were initial enzyme activation at 95°C for 5 min, denaturation at 95°C for 20 s, annealing, and extension reaction at 56°C including detection of bound SYBR Green for 40 s PCR. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a control for normalization. The relative amounts of PCR fragments were calculated using the comparative CT method. n=8-15 in each group.
생성물(bp)PCR
product (bp)
도 9는 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 tbx21, gata3, 및 foxp3의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 그래프이다.Figure 9 is a graph confirming the mRNA expression levels of tbx21, gata3, and foxp3 in mesenteric lymph nodes of CHC mice by qPCR.
도 9에 나타낸 바와 같이, Th2의 마커인 gata3와 Treg의 마커인 foxp3의 mRNA 발현은 CHC 마우스의 장간막 림프절에서 유의적으로 감소하였고, Th1의 마커인 tbx21 mRNA 발현에 유의한 변화는 없었다. As shown in Figure 9, the mRNA expression of gata3, a Th2 marker, and foxp3, a Treg marker, was significantly decreased in the mesenteric lymph nodes of CHC mice, and there was no significant change in the mRNA expression of tbx21, a Th1 marker.
또한, CHC와 염증과 관련된 혈청 사이토카인의 관련성을 확인하기 위해서, CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 전-염증성 사이토카인 및 항-염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 Bio-Rad Bio-Plex® assay (Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 확인하였다.In addition, to confirm the relationship between CHC and inflammation-related serum cytokines, pro-inflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines, TNF-α, IL-1β, and IL-1, were detected in the serum of CHC mice and normal mice (CON). 6, The mRNA expression levels of IL-17, IL-4, IL-10, and IFN-γ were confirmed using the Bio-Rad Bio-Plex® assay (Bio-Rad, Hercules, USA).
도 10-16은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)의 혈청에서 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준을 각각 qPCR로 확인한 그래프이다.Figures 10-16 show the mRNA expression levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-17, IL-4, IL-10, and IFN-γ in the serum of CHC mice and normal mice (CON), respectively, using qPCR. This is a graph confirmed by .
도 10-16에 나타낸 바와 같이, 캅토프릴의 투여는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-17, IL-4, IL-10 및 IFN-γ의 mRNA 발현 수준에는 유의한 영향을 주지 않았다. 한편, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 수준은 정상 대조군(CON)에 비해서 CHC 마우스에서 유의적으로 증가하였다.As shown in Figures 10-16, administration of captopril did not significantly affect the mRNA expression levels of inflammatory cytokines TNF-α, IL-17, IL-4, IL-10, and IFN-γ. Meanwhile, the mRNA expression levels of IL-1β and IL-6 were significantly increased in CHC mice compared to normal controls (CON).
또한, 안지오텐신 전환 효소 억제제인 캅토프릴이 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 수준에 영향을 주는지 확인하기 위해서, 효소면역측정법(Enzyme Immunoassay: EIA)으로 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 혈청에서 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하였다. 구체적으로, 마우스를 희생시키고 심장 찌르기로 전혈을 채취하였다. 전혈에서 혈청을 분리하고 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 보관된 혈??에서 안지오텐신 Ⅱ EIA 키트를 사용하여 제조사(Pheonix Pharmaceuticals, Burlingame,CA, USA)의 지침에 따라 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 수준을 측정하였다. 각 군에서 n=8-10이다. In addition, to determine whether captopril, an angiotensin-converting enzyme inhibitor, affects the level of serum angiotensin II, circulating levels of angiotensin II in serum were measured in CHC mice and normal mice (CON) using enzyme immunoassay (EIA). Measured. Specifically, mice were sacrificed and whole blood was collected by cardiac puncture. Serum was separated from whole blood and stored at -80°C until analysis was performed. The level of serum angiotensin II was measured in stored blood using an Angiotensin II EIA kit according to the manufacturer's instructions (Pheonix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA). n=8-10 in each group.
도 17은 CHC 마우스와 정상 마우스(CON)에서 혈청 안지오텐신 Ⅱ의 순환 수준을 측정하여 나타낸 그래프이다.Figure 17 is a graph showing circulating levels of serum angiotensin II in CHC mice and normal mice (CON).
도 17에 나타낸 바와 같이, 안지오텐신 I을 안지오텐신 Ⅱ로 전환하는 안지오텐신 전환 효소에 대한 억제제인 캅토프릴을 투여했음에도 불구하고, CHC 마우스는 정상 마우스(CON)에 비해 안지오텐신 Ⅱ의 혈청 농도가 더 높게 확인되었다. As shown in Figure 17, despite administration of captopril, an inhibitor of angiotensin converting enzyme that converts angiotensin I to angiotensin II, CHC mice were confirmed to have higher serum concentrations of angiotensin II compared to normal mice (CON). .
종합하면, 캅토프릴의 투여에 의해 말초 면역계에 변화가 생겼고, 캅토프릴에 의해 유도된 우울증 유사 행동은 말초 면역계과 연관되어 있음을 확인하였다.In summary, it was confirmed that the administration of captopril led to changes in the peripheral immune system, and that the depressive-like behavior induced by captopril was associated with the peripheral immune system.
실험예Experiment example 6. 6. 캅토프릴의of captopril 투여가 소교세포의 활성에 미치는 영향 평가 Evaluation of the effect of administration on the activity of microglial cells
해마는 우울증과 관련된 주요 뇌 영역으로 알려져 있다. 해마에서 캅토프릴의 효과를 확인하기 위해서, 염증성 사이토카인과 소교세포의 변화를 평가하였다.The hippocampus is known to be a major brain region associated with depression. To confirm the effect of captopril in the hippocampus, changes in inflammatory cytokines and microglial cells were evaluated.
구체적으로, 캅토프릴의 투여에 의해 제작된 CHC 마우스의 해마에서, 우울증과 관련된 마커인 bdnf(Brain-derived neurotrophic factor), KYN 경로 관련 인자인 ido, kat, 및 kmo, 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6, 세로토닌 수용체인 5-HT1A 및 5-HT2A, 안지오텐신 수용체인 AT1bR, AT1bR, 및 AT2R, 및 소교세포 기능 표현형 마커인 cx3cr1, cd200r, 및 p2ry12의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인하여 도 18에 나타내었다.Specifically, in the hippocampus of CHC mice produced by administration of captopril, the depression-related marker bdnf (Brain-derived neurotrophic factor), the KYN pathway-related factors ido, kat, and kmo, and the pro-inflammatory cytokine TNF- mRNA expression levels of α, IL-1β, and IL-6, serotonin receptors 5-HT1A and 5-HT2A, angiotensin receptors AT1bR, AT1bR, and AT2R, and microglial functional phenotype markers cx3cr1, cd200r, and p2ry12. This was confirmed by qPCR and is shown in Figure 18.
도 18에 나타낸 바와 같이, 전-염증성 사이토카인인 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 해마에서 증가하였다. 반면, bdnf, KYN 경로 관련 인자, 소교세포 기능 표현형 마커, 안지오텐신 수용체 및 세로토닌 수용체 마커는 해마에서 캅토프릴의 고용량 만성 투여에 의해 변화하지 않았다. As shown in Figure 18, the mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines tnf-α and il-6 increased in the hippocampus. On the other hand, bdnf, KYN pathway-related factors, microglial functional phenotype markers, angiotensin receptor and serotonin receptor markers were not changed by high-dose chronic administration of captopril in the hippocampus.
따라서, 캅토프릴의 처리에 의해 제작한 본 발명의 우울증 마우스는 우울증 관련 인자이며 항우울 연구의 주요 타겟으로 생각되는 BDNF, 세로토닌, 및 KYN 경로와는 관련이 없음을 확인하였다. Therefore, it was confirmed that the depressed mouse of the present invention produced by treatment with captopril is not related to the BDNF, serotonin, and KYN pathways, which are depression-related factors and are considered to be the main targets of antidepressant research.
또한, 캅토프릴의 처리에 의해 해마에서 증가한 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 수준이 항우울제인 이미프라민의 처리에 의해 정상 수준으로 회복되는지 확인하기 위해서, 상기 실시예에서 기술한 바와 같이 이미프라민 공동-처리군(+Co-Imi)에서 TNF-α 및 IL-6의 mRNA 발현 수준을 확인하여 도 19에 나타내었다. CT 값은 대조군을 1로 한 비율로 정규화하였고 RQ 값은 대조군의 퍼센트로서 각각의 전사 인자의 비율을 나타낸다. 각 군에서 n=7-12이다.In addition, in order to confirm whether the mRNA expression levels of TNF-α and IL-6, which increased in the hippocampus by treatment with captopril, are restored to normal levels by treatment with imipramine, an antidepressant, imipramine was used as described in the above example. The mRNA expression levels of TNF-α and IL-6 in the Min co-treated group (+Co-Imi) were confirmed and shown in Figure 19. CT values were normalized to the ratio of control to 1, and RQ values represent the ratio of each transcription factor as a percentage of control. n=7-12 in each group.
도 19는 이미프라민 공동-처리군(+co-Imi), 우울증 마우스(CHC), 및 정상 마우스(CON)에서 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 나타낸 그래프이다.Figure 19 is a graph showing the mRNA expression levels of tnf-α and il-6 in the imipramine co-treated group (+co-Imi), depressed mice (CHC), and normal mice (CON).
도 19에 나타낸 바와 같이, 캅토프릴의 처리에 의해 정상 마우스와 비교하여 우울증 마우스에서는 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 유의적으로 증가하였고, 증가한 tnf-α 및 il-6의 mRNA 발현 수준은 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 수준으로 회복되었다.As shown in Figure 19, the mRNA expression levels of tnf-α and il-6 were significantly increased in depressed mice compared to normal mice by treatment with captopril, and the increased mRNA expression of tnf-α and il-6 Levels were restored to normal levels by co-treatment with imipramine.
또한, 소교세포의 수와 형태 변화를 분석하기 위해서, Iba-1을 이용한 면역조직화학염색을 수행하였다. 구체적으로, 관류를 위해 CHC 처리 후 마우스를 희생하였다. 모든 마우스는 펜토바르비탈(100mg/kg, i.p.)로 완전히 마취한 후, 생리 식염수를 처리하고 차가운 인산염 완충된 4% 파라포름알데이드(pH 7.4)로 심장을 통해 관류하였다. 뇌 전체를 해부하여 4℃에서 4시간 동안 같은 고정액에서 후고정시켰다. 그런 다음 뇌 블록을 4℃에서 24 시간 동안 30% 수크로오스에서 동결 보존 하였다. 25mm의 두께로 절편을 전자 크리오톰으로 절단하였다. 면역조직화학염색은 Elite ABC Kit(Vector Laboratories)를 사용하여 수행하였다. 절편을 0.1M 소혈청알부민으로 각각 10 분씩 3 회 헹구고, 1% 소혈청알부민과 0.2% TritonX-100을 함유하는 0.1M PBS에서 30 분간 예비 배양 하였다. 0.5% BSA를 함유하는 0.1M PBS로 각각 10-15 분 동안 두 번 헹구고난 후, 0.5% BSA 및 0.05% 소듐 아자이드를 함유하는 0.1M PBS로 희석시킨 항-Iba-1 항체 (1:300; Wako, Cat. # 019-19741)와 4℃에서 배양하였다. 밤새 배양한 후 절편을 헹구고 실온에서 1시간 동안 0.5% BSA를 함유하는 0.1M PBS로 희석한 비오틴화된 항-토끼 IgG 2 차 항체 (벡터) 1:200과 배양 하였다. 헹구고 나서, 절편을 실온에서 1 시간 동안 PBS로 희석 한 ABC 시약 1:200과 배양한 후, PBS로 씻고 0.1M 인산 완충액으로 헹구었다. 마지막으로, 원하는 염색 강도가 나타날 때까지 절편을 SIGMA FAST DAB kit (Sigma)에서 배양하였다. 절편을 0.05 mol/L 인산염 완충액으로 헹군 후 절편을 차등 에탄올로 탈수하고 히스토클리어(Fisher)로 세척한 후 Permount(Fisher)를 사용하여 커버슬립으로 덮었다. Additionally, to analyze changes in the number and morphology of microglial cells, immunohistochemical staining using Iba-1 was performed. Specifically, mice were sacrificed after CHC treatment for perfusion. All mice were fully anesthetized with pentobarbital (100 mg/kg, i.p.), treated with saline, and perfused through the heart with cold phosphate-buffered 4% paraformaldehyde (pH 7.4). The whole brain was dissected and post-fixed in the same fixative solution for 4 hours at 4°C. Brain blocks were then cryopreserved in 30% sucrose for 24 h at 4°C. Sections with a thickness of 25 mm were cut with an electronic cryotome. Immunohistochemical staining was performed using the Elite ABC Kit (Vector Laboratories). Sections were rinsed three times for 10 min each with 0.1 M bovine serum albumin and preincubated for 30 min in 0.1 M PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.2% TritonX-100. After rinsing twice with 0.1 M PBS containing 0.5% BSA for 10–15 min each, anti-Iba-1 antibody diluted in 0.1 M PBS containing 0.5% BSA and 0.05% sodium azide (1:300) ; Wako, Cat. # 019-19741) and cultured at 4°C. After overnight incubation, sections were rinsed and incubated with biotinylated anti-rabbit IgG secondary antibody (Vector) 1:200 diluted in 0.1 M PBS containing 0.5% BSA for 1 h at room temperature. After rinsing, sections were incubated with ABC reagent 1:200 diluted in PBS for 1 h at room temperature, then washed with PBS and rinsed with 0.1 M phosphate buffer. Finally, sections were cultured in the SIGMA FAST DAB kit (Sigma) until the desired staining intensity was achieved. After rinsing the sections with 0.05 mol/L phosphate buffer, the sections were dehydrated with graded ethanol, washed with Histoclear (Fisher), and covered with a coverslip using Permount (Fisher).
조직학적 분석을 위해, 해마 내의 Iba-1 양성 뉴런의 수는 각 마우스에 대해 세 부분에서 카운팅하였다. 첫번째 부분(양측 귀 2.10 mm, 브레그마 -1.70 mm)부터 시작하여 0.135 mm 증가로 세 개의 관상 단면에서 카운팅하였다. Iba-1에 면역 반응이 있는 세포의 수는 동일한 뇌 영역(Nikon)에서 현미경을 사용하여 두 명의 시각 장애인 관찰자에 의해 카운팅 하였다. 시상 하부의 이미지에서 절편은 양측 귀 3.34 mm, 브레그마- 0.46 mm의 수준에서 양측 귀 1.50 mm, 브레그마-2.30 mm로 0.135 mm의 증가로 측정하였다.For histological analysis, the number of Iba-1 positive neurons in the hippocampus was counted in three sections for each mouse. Counting was performed in three coronal sections in increments of 0.135 mm, starting from the first segment (bilateral ears 2.10 mm, bregma -1.70 mm). The number of cells immunoreactive for Iba-1 was counted by two blind observers using a microscope in the same brain region (Nikon). In images of the hypothalamus, slices were measured at an increment of 0.135 mm from the level of 3.34 mm in both ears and bregma - 0.46 mm to 1.50 mm in both ears and bregma - 2.30 mm.
도 20은 정상 마우스(CON), 우울증 마우스(CHC), 및 이미프라민 공동-처리군(Co-Imi+CHC)의 해마에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 연구를 수행한 결과를 나타낸 사진이다: 20X(좌측), 40X(우측). 또한 영역 mm2당 Iba-1 양성 세포의 수를 카운팅한 그래프이다.Figure 20 is a photograph showing the results of an immunohistochemical study on Iba-1 in the hippocampus of normal mice (CON), depressed mice (CHC), and imipramine co-treatment group (Co-Imi+CHC) : 20X (left), 40X (right). Also, this is a graph counting the number of Iba-1 positive cells per area mm 2 .
도 20에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스(CHC)에서는 정상 마우스(CON)에 비해서 Iba-1 양성 세포의 수가 현저히 증가하였다. 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리군(Co-Imi+CHC)에서는 Iba-1 양성 세포의 수가 정상 마우스 수준으로 회복되었다. 또한, 우울증 마우스에서는 분지형(ramified) 소교세포 형태가 나타났다가 캅토프릴과 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 마우스의 소교세포 형태로 회복되었다.As shown in Figure 20, the number of Iba-1 positive cells was significantly increased in depressed mice (CHC) compared to normal mice (CON). In the captopril and imipramine co-treatment group (Co-Imi+CHC), the number of Iba-1 positive cells was restored to the normal mouse level. In addition, ramified microglial cells appeared in depressed mice, but were restored to the microglial cell form of normal mice by co-treatment with captopril and imipramine.
따라서, 캅토프릴의 처리에 의해 해마 내의 소교세포 수가 증가하고 분지형의 소교세포가 많이 발견되었고, 이러한 소교세포의 증가와 분지형태는 항우울제인 이미프라민의 공동-처리에 의해 정상 수준으로 회복되는 것을 확인하였다. Therefore, the number of microglia in the hippocampus increased and many branched microglia were found by treatment with captopril, and this increase in microglia and branched form were restored to normal levels by co-treatment with the antidepressant imipramine. Confirmed.
또한, 해마에서 캅토프릴의 영향을 확인하기 위해서 해마 내 글루코코르티코이드 수용체(glucocorticoid receptor: GR)의 단백질 수준을 웨스턴 블롯팅에 의해 측정하였다.Additionally, to confirm the effect of captopril on the hippocampus, the protein level of glucocorticoid receptor (GR) in the hippocampus was measured by Western blotting.
구체적으로, 해마를 절단한 후, 조직을 차가운 Tris 완충 식염수 (TBS, 20 mM Trizma 염기 및 137 mM NaCl, pH 7.5)로 2 회 세척 하였다. 세척 직후, 조직을 0.1mM Na3VO4, 3 mg/ml 아프로티닌 및 20 mM NaF를 함유하는 SDS 용해 완충액 (62.5 mM Trizma 염기, 2% w/v SDS, 10% 글리세롤)으로 용해시켰다. DNA를 자르고 점도를 줄이기 위해 짧은 초음파 처리 후 표준 단백질로 소 혈청 알부민을 사용하는 계면활성제 호환 단백질 분석 시약 (Bio-Rad Laboratories)으로 단백질 농도를 측정했다. DTT(dithiothreitol, 5 mM) 및 브로모페놀블루 (0.1% w/v)를 첨가한 후, 단백질을 끓여서 10% 폴리아크릴아미드 겔(Invitrogen)에서 전기영동으로 분리하고, PVDF 멤브레인(Bio-Rad Laboratories)으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 진탕기에서 차단시켰다. 차단 완충액은 TBST(트리스 완충 식염수/0.1% Tween-20) 및 5% 탈지유로 구성된다. 1차 항체를 차단 완충 용액에 용해시키고, 멤브레인을 글루코코르티코이드 수용체 (GR; 1:1000, 산타 크루즈, Sc-1004) 및 베타-액틴 (1:1000, Cell Signaling, 4970)에 대한 항체로 4℃에서 밤새 면역블롯하였다. 멤브레인을 차단 완충액에 용해 된 항-토끼 (1:2000, Cell Signaling, 7074)에서 실온에서 80분 동안 배양 하였다. 멤브레인을 ECL-plus 용액(Amersham Pharmacia Biotech)으로 시각화 하였다. 그런 다음, 멤브레인을 화학발광(LAS-4000, Fujiflm)에 노출하여 빛 방출을 검출하였다. 웨스턴 블롯 결과는 필름의 농도 측정 스캐닝을 한 후 ImageJ 1.51 소프트웨어 (National Institutes of Health, Bethesda, MD)를 사용하여 정량화하였다.Specifically, after sectioning the hippocampus, the tissue was washed twice with cold Tris-buffered saline (TBS, 20 mM Trizma base and 137 mM NaCl, pH 7.5). Immediately after washing, tissues were lysed with SDS lysis buffer (62.5 mM Trizma base, 2% w/v SDS, 10% glycerol) containing 0.1mM Na3VO4, 3 mg/ml aprotinin and 20mM NaF. After brief sonication to cleave the DNA and reduce viscosity, protein concentration was measured with a surfactant-compatible protein assay reagent (Bio-Rad Laboratories) using bovine serum albumin as the standard protein. After adding DTT (dithiothreitol, 5 mM) and bromophenol blue (0.1% w/v), the proteins were boiled, separated by electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel (Invitrogen), and transferred to a PVDF membrane (Bio-Rad Laboratories). ) was transferred to. The membrane was blocked on a shaker for 1 hour at room temperature. Blocking buffer consists of TBST (Tris-buffered saline/0.1% Tween-20) and 5% skim milk. Primary antibodies were dissolved in blocking buffer, and membranes were incubated with antibodies against glucocorticoid receptor (GR; 1:1000, Santa Cruz, Sc-1004) and beta-actin (1:1000, Cell Signaling, 4970) at 4°C. Immunoblot was performed overnight. Membranes were incubated in anti-rabbit (1:2000, Cell Signaling, 7074) dissolved in blocking buffer for 80 min at room temperature. Membranes were visualized with ECL-plus solution (Amersham Pharmacia Biotech). The membrane was then exposed to chemiluminescence (LAS-4000, Fujiflm) to detect light emission. Western blot results were quantified using ImageJ 1.51 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) after densitometric scanning of the film.
도 21은 정상 마우스(CON)와 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 GR 단백질의 수준을 확인한 사진 및 그래프이다.Figure 21 is a photograph and graph confirming the level of GR protein in the hippocampus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC).
도 21에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스와 비교하여 우울증 마우스의 해마에서는 GR 단백질의 수준이 유의적으로 감소하였다. As shown in Figure 21, the level of GR protein was significantly reduced in the hippocampus of depressed mice compared to normal mice.
또한, 해마 이외의 다른 뇌 영역에 대해 캅토프릴이 미치는 영향을 확인하기 위해서, 우울증과 연관된 것으로 알려진 시상 하부에서 상기와 같은 실험을 반복하였다.Additionally, in order to confirm the effect of captopril on brain regions other than the hippocampus, the above experiment was repeated in the hypothalamus, which is known to be associated with depression.
도 22는 우울증 마우스의 시상 하부에서 전-염증성 사이토카인인 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준을 qPCR로 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 22 is a graph showing the results of qPCR confirming the mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines tnf-α, il-1β, and il-6 in the hypothalamus of depressed mice.
도 22에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 시상 하부에서 tnf-α, il-1β, 및 il-6의 mRNA 발현 수준이 변화하지 않았다.As shown in Figure 22, the mRNA expression levels of tnf-α, il-1β, and il-6 were not changed in the hypothalamus of depressed mice.
도 23은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부의 소교세포에서 Iba-1에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 사진이다: 4X 이미지. 상기 이미지는 브레그마 수준-0.46 mm(좌)에서 브레그마 수준-2.06mm(우)에서 취하였다. 각 군에서 n=10-15이고, 스케일바=50μm이다. Figure 23 is a photograph showing the results of immunohistochemistry for Iba-1 in microglia of the hypothalamus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC): 4X image. The images were taken from bregma level-0.46 mm (left) to bregma level-2.06 mm (right). n=10-15 in each group, scale bar=50μm.
도 23에 나타낸 바와 같이, 정상 마우스와 우울증 마우스의 시상 사부의 Iba-1 양성 세포의 수에는 변화가 없었다.As shown in Figure 23, there was no change in the number of Iba-1 positive cells in the thalamus of normal mice and depressed mice.
따라서, 캅토프릴의 투여는 우울증 마우스의 시상 하부에서 염증성 사이토카인 및 소교세포에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that administration of captopril did not affect inflammatory cytokines and microglial cells in the hypothalamus of depressed mice.
실험예Experiment example 7. 7. 캅토프릴의of captopril 세로토닌 시스템 및 마우스 뇌의 The serotonergic system and the mouse brain HPAHPA 축에 대한 영향 평가 Impact assessment on axes
우울증과 관련된 다른 경로에 대한 만성 고농도 캅토프릴 투여의 효과를 확인하기 위해서, 뇌에서 모노아민계 및 HPA 축과 관련된 인자를 평가하였다. HPA 축(Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis)은 주요 신경내분비계로서 스트레스에 대한 반응과 소화, 면역계, 감정과 기분, 성, 에너지 저장 및 소모를 포함하는 다양한 신체 과정을 조절하는 것으로 알려져 있다. HPA 축은 우울증에서 항진되어 혈중 코티솔 증가, ACTH 증가 등이 나타나기도 한다.To confirm the effect of chronic high-dose captopril administration on other pathways related to depression, factors related to the monoaminergic system and HPA axis in the brain were evaluated. The HPA axis (Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis) is a major neuroendocrine system that is known to regulate a variety of bodily processes, including the response to stress, digestion, immune system, emotions and mood, sex, and energy storage and expenditure. The HPA axis is activated in depression, leading to increased cortisol and ACTH in the blood.
구체적으로, 21 일 동안의 캅토프릴 투여 후 즉시 마우스를 희생시켰다. 마우스의 뇌 조직 블록을 얼음 속에서 빠르게 해부하고 차가운 0.4M 과염소산으로 균질화한 다음 얼음에서 1 시간 동안 두었다. 4℃에서 30 분 동안 21,130g에서 원심 분리한 후, 상등액을 적절한 컬럼 (# Sc1000-1Kt, SigmaPrep 스핀 컬럼)을 사용하여 여과하였다. 여과된 상등액을 Nova-Pak C18 역상 컬럼에 직접 주입 하였다. 이동상은 pH 3.7에서 0.1M 제1인산나트륨, 0.1mM EDTA, 1mM 소듐 옥틸설페이트, 0.003% 트리메틸아민 및 10% 메탄올로 이루어진다. 각 분석물에 대한 외부 표준 용액은 HPLC 등급의 물에서 0.4M 과염소산과 함께 5-히드록시트립타민 (5-HT, sc-298707, Santa Cruz) 및 5-히드록시인돌-3-아세트산 (5-HIAA; # H8876, Sigma-Aldrich) 용액으로 하였다. 유속은 1 ml/분으로 일정하게 유지하였다. 크로마토그래피 피크 분석은 지연 시간에 따라 일치된 표본에서 알려지지 않은 피크의 동정을 수반하였다.Specifically, mice were sacrificed immediately after 21 days of captopril administration. Mouse brain tissue blocks were rapidly dissected on ice, homogenized in cold 0.4 M perchloric acid, and placed on ice for 1 h. After centrifugation at 21,130 g for 30 min at 4°C, the supernatant was filtered using an appropriate column (# Sc1000-1Kt, SigmaPrep spin column). The filtered supernatant was directly injected into a Nova-Pak C18 reversed-phase column. The mobile phase consists of 0.1M sodium phosphate monobasic, 0.1mM EDTA, 1mM sodium octyl sulfate, 0.003% trimethylamine and 10% methanol at pH 3.7. External standard solutions for each analyte were 5-hydroxytryptamine (5-HT, sc-298707, Santa Cruz) and 5-hydroxyindole-3-acetic acid (5-hydroxyindole-3-acetic acid) with 0.4 M perchloric acid in HPLC grade water. HIAA; #H8876, Sigma-Aldrich) solution. The flow rate was kept constant at 1 ml/min. Chromatographic peak analysis involved the identification of unknown peaks in matched samples according to delay time.
도 24는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 해마에서 세로토닌(5-히드록시트립타민: 5-HT) 및 이의 주요 대사 산물인 히드록시인돌아세트산(hydroxyindoleacetic acid: HIAA)의 수준을 HPLC로 측정한 그래프이다.Figure 24 shows HPLC levels of serotonin (5-hydroxytryptamine: 5-HT) and its main metabolite, hydroxyindoleacetic acid (HIAA), in the hippocampus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC). This is a graph measured by .
도 24에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 해마에서 5-HT 및 HIAA의 수준에는 유의적인 변화가 없었다. As shown in Figure 24, there was no significant change in the levels of 5-HT and HIAA in the hippocampus of depressed mice.
도 25는 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)의 시상 하부에서 코르티코트로핀-방출 호르몬(corticotropin-relieasing hormone: CRH)의 mRNA 발현을 qPCR로 확인한 그래프이다. 각 군에서 n=5이다.Figure 25 is a graph confirming the mRNA expression of corticotropin-releasing hormone (CRH) in the hypothalamus of normal mice (CON) and depressed mice (CHC) by qPCR. n=5 in each group.
도 26은 정상 마우스(CON) 및 우울증 마우스(CHC)에서 혈청 글루코코르티코이드(Gc) 수준을 EIA 분석에 의해 측정한 그래프이다. 각 군에서 n=5이다. 데이터를 평균±SEM으로 나타내었다.Figure 26 is a graph measuring serum glucocorticoid (Gc) levels in normal mice (CON) and depressed mice (CHC) by EIA analysis. n=5 in each group. Data are expressed as mean ± SEM.
도 25 및 도 26에 나타낸 바와 같이, 우울증 마우스의 시상 하부에서의 CRH mRNA 발현 수준과 혈청 글루코코르티코이드 수준에는 유의적인 변화가 없었다.As shown in Figures 25 and 26, there was no significant change in the CRH mRNA expression level and serum glucocorticoid level in the hypothalamus of depressed mice.
따라서, 캅토프릴의 투여에 의한 우울증은 세로토닌 시스템 및 마우스 뇌의 HPA 축에 영향을 주지 않는 것을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that depression caused by the administration of captopril did not affect the serotonin system and the HPA axis of the mouse brain.
상기 결과를 종합하면, 본 발명에서 제조한 우울증 마우스는 우울증 유사 행동을 나타내는데, 이러한 우울증 유사 행동이 말초 면역계의 변화와 연관된다. 말초 면역계의 변화는 Treg 및 Th2 감소와 함께 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL-1β, IL-6의 향상을 포함한다. 또한, 본 발명의 우울증 마우스의 해마에서 소교세포 수가 증가하였고 분지형태가 증가하였다. 또한, 본 발명의 우울증 마우스가 우울증 유사 행동을 나타내지만, 우울증 관련 인자인 BDNF, 세로토닌, 및 KYN 경로, HPA 축 활성화와는 관련이 없는 것으로 확인하였다.Summarizing the above results, the depressed mice produced in the present invention exhibit depression-like behavior, and this depression-like behavior is associated with changes in the peripheral immune system. Changes in the peripheral immune system include enhancement of pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, IL-6 along with reduction of Tregs and Th2. In addition, the number of microglial cells increased and their branching type increased in the hippocampus of the depressed mice of the present invention. In addition, it was confirmed that although the depressed mouse of the present invention exhibited depression-like behavior, it was not related to depression-related factors such as BDNF, serotonin, and KYN pathways, and HPA axis activation.
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Depressive disorder animal model, method for producing the same and uses thereof <130> 119556 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx21 forward primer <400> 1 caacaacccc tttgccaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx21 reverse primer <400> 2 tcccccaagc agttgacagt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata3 forward primer <400> 3 agaaccggcc ccttatcaa 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata3 reverse primer <400> 4 agttcgcgca ggatgtcc 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 forward primer <400> 5 gaacccaatg cccaacccta g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 reverse primer <400> 6 ttcttggttt tgaggtcaag gg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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producing the same and uses it <130> 119556 <160> 38 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx21 forward primer <400> 1 caacaacccc tttgccaaag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tbx21 reverse primer <400> 2 tcccccaagc agttgacagt 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata3 forward primer <400> 3 agaaccggcc ccttatcaa 19 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gata3 reverse primer <400> 4 agttcgcgca ggatgtcc 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 forward primer <400> 5 gaacccaaatg cccaacccta g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Foxp3 reverse primer <400> 6 ttcttggttt tgaggtcaag gg 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF forward primer <400> 7 tgcaggggca tagacaaaaag g 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BDNF reverse primer 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Claims (12)
상기 안지오텐신 전환 효소 억제제는 캅토프릴(Captopril)인 것인, 방법.
A method of producing an animal model of depression comprising administering an angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor to an animal other than a human, comprising:
The method wherein the angiotensin converting enzyme inhibitor is captopril.
The animal model according to claim 6, wherein symptoms of depression appear due to changes in the peripheral immune system, and the number of regulatory T cells (Tregs) in the spleen is reduced compared to a normal control group not treated with captopril. .
The animal model according to claim 6, wherein there is no change in the mRNA expression levels of Tnf-α and IL-6 and no change in the number of microglial cells in the hypothalamus compared to the normal control group not treated with captopril. .
우울증 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 항우울제의 스크리닝 방법.Administering a candidate antidepressant drug to the animal model of depression of claim 6; and
A method of screening for an antidepressant, comprising determining whether symptoms of depression are alleviated.
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| BMC Med. vol.15 no.1 pp.144(2017.08.01.) |
| Indian J Exp Biol. vol.46 no.3 pp.180-184 2008(2008.03.31.)* |
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