KR102641277B1 - Tyrosinase modified black phosphorus and its application in the field of biosensors - Google Patents
Tyrosinase modified black phosphorus and its application in the field of biosensors Download PDFInfo
- Publication number
- KR102641277B1 KR102641277B1 KR1020217017963A KR20217017963A KR102641277B1 KR 102641277 B1 KR102641277 B1 KR 102641277B1 KR 1020217017963 A KR1020217017963 A KR 1020217017963A KR 20217017963 A KR20217017963 A KR 20217017963A KR 102641277 B1 KR102641277 B1 KR 102641277B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- tyrosinase
- black phosphorus
- biosensor
- electrode
- modified
- Prior art date
Links
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical class [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 88
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 title claims description 49
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 title claims description 49
- IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N bisphenol A Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 IISBACLAFKSPIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 71
- 229910021397 glassy carbon Inorganic materials 0.000 claims description 64
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 8
- -1 amino alkane Chemical class 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- ZZYASVWWDLJXIM-UHFFFAOYSA-N 2,5-di-tert-Butyl-1,4-benzoquinone Chemical compound CC(C)(C)C1=CC(=O)C(C(C)(C)C)=CC1=O ZZYASVWWDLJXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- 229930185605 Bisphenol Natural products 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 abstract description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 230000004044 response Effects 0.000 description 12
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- RDQSIADLBQFVMY-UHFFFAOYSA-N DTBQ Natural products CC(C)(C)C1=CC(=O)C=C(C(C)(C)C)C1=O RDQSIADLBQFVMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 6
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 238000004098 selected area electron diffraction Methods 0.000 description 4
- WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 1,2-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC=CC1=O WOAHJDHKFWSLKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011247 coating layer Substances 0.000 description 3
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 239000000598 endocrine disruptor Substances 0.000 description 2
- 231100000049 endocrine disruptor Toxicity 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 229920002545 silicone oil Polymers 0.000 description 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004298 SiO 2 Inorganic materials 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036982 action potential Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000001312 dry etching Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000750 endocrine system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000004299 exfoliation Methods 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002135 nanosheet Substances 0.000 description 1
- 230000005693 optoelectronics Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N phosphorine Chemical compound C1=CC=PC=C1 UNQNIRQQBJCMQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920005668 polycarbonate resin Polymers 0.000 description 1
- 239000004431 polycarbonate resin Substances 0.000 description 1
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 231100000205 reproductive and developmental toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/403—Cells and electrode assemblies
Abstract
본 발명은 티로시나아제 변형 흑린, 이를 포함하는 금속 전극 및 바이오센서, 이들이 바이오센서 분야에서의 응용을 개시한다. 상기 바이오센서는 우수한 반복성, 감도 및 장기 안정성을 구비하며, 이런 바이오센서는 예를 들어 비스페놀 A의 검출에 적용할 수 있다.The present invention discloses tyrosinase-modified black phosphorus, metal electrodes and biosensors containing it, and their application in the biosensor field. The biosensor has excellent repeatability, sensitivity and long-term stability, and this biosensor can be applied to the detection of bisphenol A, for example.
Description
본 발명은 바이오센서 분야에 관한 것이고, 구체적으로 티로시나아제 변형 흑린, 이를 포함하는 금속 전극 및 바이오센서, 및 상기 바이오센서의 응용에 관한 것이다.The present invention relates to the field of biosensors, and specifically relates to tyrosinase-modified black phosphorus, metal electrodes and biosensors containing the same, and applications of the biosensors.
2014년 흑린(BP)이 성공적으로 분리되었으며, 흑린은 뛰어난 이방성 기계적, 전자적, 광전자적 특성을 지닌 2차원(2D) 재료(블랙 포스포린)로 알려져 있다. 단층 BP는 캐리어 이동도가 높은(약 cm2/V·s) 신규 2D 재료이다. 그러나 각각의 인 원자에 있는 비공유 전자쌍으로 인해, 포스포린은 수용액에서 불안정하며, 이 문제는 수성 용매에서 소자 성능을 현저히 저하시킨다.Black phosphorus (BP) was successfully isolated in 2014, and black phosphorus is known as a two-dimensional (2D) material (black phosphorene) with excellent anisotropic mechanical, electronic, and optoelectronic properties. Monolayer BP is a novel 2D material with high carrier mobility (about cm 2 /V·s). However, due to the lone pair of electrons on each phosphorus atom, phosphorine is unstable in aqueous solution, and this problem significantly reduces device performance in aqueous solvents.
BP의 안정성을 향상시킬 수 있는 방법에는 여러 가지가 있는데, 즉 산소 플라즈마 건식 에칭을 통해 포스포린 표층을 산화시키고, 2D 그래핀을 사용하여 BP를 캡슐화하며, 무수 유기 용매(즉, N-메틸피롤리돈)의 용매 박리 등이다. 이방성 전도도와 큰 표면적을 가진 이런 안정적인 BP는 센서 관련 분야에서 점점 더 많은 관심을 받을 것이다.There are several ways to improve the stability of BP, namely, oxidizing the phosphorene surface layer through oxygen plasma dry etching, using 2D graphene to encapsulate BP, and encapsulating BP in anhydrous organic solvent (i.e., N-methylpyrrolidone). Rolidone) solvent stripping, etc. These stable BPs with anisotropic conductivity and large surface area will receive increasing attention in sensor-related fields.
적절한 바이오 센싱 재료는 바이오센서의 체외 장기 안정성, 검출 한계(LOD) 및 감도 등을 향상시키는 핵심 기술이다.Appropriate biosensing materials are a key technology to improve the in vitro long-term stability, limit of detection (LOD), and sensitivity of biosensors.
선행기술에 존재하는 다양한 문제에 대해, 본 발명은 BP를 유기 용매에 첨가하고 BP에 산화 표층을 형성한다. 티로시나아제를 이용하여 유리 탄소 전극(Glassy carbon electrode)의 2차원(2-D) 흑린(BP)을 고정하여 신규 전류 바이오센서를 구축하였다.In response to various problems existing in the prior art, the present invention adds BP to an organic solvent and forms an oxidized surface layer on BP. A new current biosensor was constructed by fixing two-dimensional (2-D) black phosphorus (BP) on a glassy carbon electrode using tyrosinase.
본 발명의 일 양태에 따르면, 티로시나아제 변형 흑린을 제공하고, 티로시나아제는 흑린 표면을 변형시키며, 변형을 거친 흑린 표면에는 대량의 티로시나아제가 로딩되어 티로시나아제의 촉매화 능력을 향상시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 티로시나아제 변형 흑린을 형성하기 전에, 흑린을 유기 용매와 혼합한다.According to one aspect of the present invention, tyrosinase modified black phosphorus is provided, tyrosinase modifies the black phosphorus surface, and a large amount of tyrosinase is loaded on the modified black phosphorus surface to improve the catalytic ability of tyrosinase. You can do it. In a preferred embodiment, prior to forming the tyrosinase modified black phosphorus, black phosphorus is mixed with an organic solvent.
바람직한 실시형태에서, 유기 용매는 클로로포름, n-헥산, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔 등 logp 값이 2보다 큰 유기 용매로부터 선택되는 하나이다.In a preferred embodiment, the organic solvent is one selected from organic solvents with a logp value greater than 2, such as chloroform, n-hexane, cyclohexane, benzene, toluene, etc.
바람직한 실시형태에서, 유기 용매는 2,5-디-t-부틸-1,4-벤조퀴논을 전해질로 포함한다.In a preferred embodiment, the organic solvent comprises 2,5-di-t-butyl-1,4-benzoquinone as electrolyte.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 흑린-티로시나아제/유리 탄소 전극을 제공하고, 상기 전극은 유리 탄소 전극 표면에 인가되는 티로시나아제 변형 흑린을 적어도 포함한다.According to another aspect of the present invention, a black phosphorus-tyrosinase/glassy carbon electrode is provided, the electrode comprising at least tyrosinase modified black phosphorus applied to the surface of the glassy carbon electrode.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 티로시나아제 변형 흑린의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 흑린이 배치된 편상 기재를 용기에 넣고 밀폐하는 단계; 오일 베스를 130 ℃ ~ 150 ℃로 가열하고 온도를 20 ~ 30분 동안 유지하는 단계; 0.5~1 : 2~20 : 0.3~1.5의 질량비로 흑린 용액을 티로시나아제 및 키토산과 혼합하여 상기 티로시나아제 변형 흑린을 얻는 단계를 적어도 포함한다.According to another aspect of the present invention, a method for producing tyrosinase-modified black phosphorus is provided, the method comprising the steps of placing a flaky substrate on which black phosphorus is disposed in a container and sealing it; heating the oil bath to 130°C to 150°C and maintaining the temperature for 20 to 30 minutes; It includes at least the step of mixing the black phosphorus solution with tyrosinase and chitosan at a mass ratio of 0.5-1:2-20:0.3-1.5 to obtain the tyrosinase-modified black phosphorus.
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은, 흑린 용액을 티로시나아제 및 키토산과 혼합하는 단계 전에, 90 ℃ ~ 120 ℃에서 아미노 알칸 또는 아미노 방향족 탄화수소를 이용하여 상기 흑린을 클로로포름, n-헥산, 시클로헥산, 벤젠, 톨루엔 등 logp 값이 2보다 큰 유기 용매로부터 선택되는 하나의 유기 용매에 옮기는 단계를 더 포함한다. 바람직하게, 상기 아미노 알칸 또는 방향족 탄화수소는 헥사메틸렌아민이다.In a preferred embodiment, the method involves mixing the black phosphorus solution with chloroform, n-hexane, cyclohexane, It further includes transferring to an organic solvent selected from organic solvents with a logp value greater than 2, such as benzene and toluene. Preferably, the amino alkane or aromatic hydrocarbon is hexamethyleneamine.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 흑린-티로시나아제/유리 탄소 전극의 제조 방법을 제공하고, 상기 방법은 제조한 티로시나아제 변형 흑린을 유리 탄소 전극 표면에 첨가하는 단계를 적어도 포함한다.According to another aspect of the present invention, a method for producing a black phosphorus-tyrosinase/glassy carbon electrode is provided, the method comprising at least adding the prepared tyrosinase modified black phosphorus to the surface of the glassy carbon electrode.
바람직한 실시형태에서, 유기 용매는 2,5-디-t-부틸-1,4-벤조퀴논을 전해질로 포함한다.In a preferred embodiment, the organic solvent comprises 2,5-di-t-butyl-1,4-benzoquinone as electrolyte.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 바이오센서를 제공하고, 상기 바이오센서는 티로시나아제 변형 흑린, 흑린-티로시나아제/유리 탄소 전극, 상기 방법으로 제조한 티로시나아제 변형 흑린 및 흑린-티로시나아제/유리 탄소 전극 중 어느 하나를 포함한다.According to another aspect of the present invention, a biosensor is provided, wherein the biosensor includes tyrosinase-modified black phosphorus, black phosphorus-tyrosinase/glass carbon electrode, tyrosinase-modified black phosphorus and black phosphorus-tyrosina prepared by the above method. Includes either an azeoside/free carbon electrode.
본 발명에 따른 바이오센서는 유기상 중의 분석물을 검출할 수 있다.The biosensor according to the present invention can detect analytes in the organic phase.
바람직한 실시형태에서, 상기 유기상 중의 분석물은 비스페놀이다.In a preferred embodiment, the analyte in the organic phase is bisphenol.
본 발명에 의해 생성되는 유익한 효과는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에서 BP가 유기상 바이오센서의 제조에서의 응용이 처음 보고되고, 소수성 용매에서 BP 기반 티로시나아제 바이오센서의 성능을 테스트하였다. 결과는 BP 기반 티로시나아제 바이오센서가 우수한 반복성, 감도 및 장기 안정성을 구비함을 보여준다. 이런 바이오센서는 환경 분석물을 측정하는데 사용되며, 환경 분석물을 현장에서 빠르고 선택적으로 측정할 수 있다.Beneficial effects produced by the present invention include, but are not limited to: In the present invention, the application of BP in the preparation of organic phase biosensors was reported for the first time, and the performance of BP-based tyrosinase biosensor was tested in hydrophobic solvents. The results show that the BP-based tyrosinase biosensor has excellent repeatability, sensitivity and long-term stability. These biosensors are used to measure environmental analytes, and can measure environmental analytes quickly and selectively in the field.
도 1은 티로시나아제/GC 바이오센서가 유기 용매에서의 제조 공법 및 BPA 검출 메커니즘의 모식도이다.
도 2(A)는 BP의 TEM 이미지이고, 도 2(B)는 고배율 조건에서 BP의 선택 영역 전자 회절 패턴이며, 도 2(C)는 BP의 SEM 이미지이다.
도 3은 (A) BP, (B) BP가 수중에서, (C) 헥사메틸렌아민 변형 BP, (D) 수중에서 헥사메틸렌아민 변형 BP의 원자력 현미경 이미지이다.
도 4는 상이한 GC 전극이 5 mmol L-1 [Fe(CN)6]3-/4-에서의 순환 전압 전류도이고, (a) 베어 GC 전극, (b) 티로시나아제/GC 전극 및 (c) BP-티로시나아제/GC 전극이다.
도 5는 BP 기반 티로시나아제 바이오센서가 1 1 μmol L-1 비스페놀 A 반응에 대한 인가 전위의 영향이다. 전해질, 10 ml 클로로포름은 0.1M DTBQ의 클로로포름을 함유한다.
도 6 (A)는 10 mL 클로로포름 용매에 10 μL 100 μmol L-1 BPA를 연속 첨가하고, BP-티로시나아제/GC(a), 티로시나아제/GC 바이오센서(b) 및 베어 GC 바이오센서(c)에 대해 수행한 전류 측정이다. 인가 전위: Ag/AgCl에 -0.15 V를 인가; 도 6(B)는 정상 상태 전류가 BPA 농도에 대한 상응한 검정 곡선이다. 표준 편차는 모두 5%보다 작다.
도 7은 0.1M DTBQ을 전해질로 포함하고 클로로포름 중 비스페놀 A의 안정성을 8번 반복 측정한 결과이다.
도 8(A)는 BP에 고정된 티로시나아제의 모식도이고, 도 8(B)는 DTBQ을 새로운 전해질로 하면 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 신호를 증폭할 수 있음을 보여준다.Figure 1 is a schematic diagram of the tyrosinase/GC biosensor manufacturing method and BPA detection mechanism in an organic solvent.
Figure 2(A) is a TEM image of BP, Figure 2(B) is a selected area electron diffraction pattern of BP under high magnification conditions, and Figure 2(C) is an SEM image of BP.
Figure 3 is an atomic force microscope image of (A) BP, (B) BP in water, (C) hexamethyleneamine modified BP, and (D) hexamethyleneamine modified BP in water.
Figure 4 is a cyclic voltammogram at 5 mmol L -1 [Fe(CN) 6 ] 3-/4- for different GC electrodes, (a) bare GC electrode, (b) tyrosinase/GC electrode, and ( c) BP-tyrosinase/GC electrode.
Figure 5 shows the effect of applied potential on the 1 1 μmol L -1 bisphenol A reaction of the BP-based tyrosinase biosensor. Electrolyte, 10 ml chloroform contains 0.1M DTBQ of chloroform.
Figure 6 (A) shows continuous addition of 10 μL 100 μmol L -1 BPA to 10 mL chloroform solvent, BP-tyrosinase/GC (a), tyrosinase/GC biosensor (b), and bare GC biosensor. This is the current measurement performed for (c). Applied potential: -0.15 V applied to Ag/AgCl; Figure 6(B) is the corresponding calibration curve of steady-state current versus BPA concentration. The standard deviations are all less than 5%.
Figure 7 shows the results of eight repeated measurements of the stability of bisphenol A in chloroform containing 0.1M DTBQ as an electrolyte.
Figure 8(A) is a schematic diagram of tyrosinase immobilized on BP, and Figure 8(B) shows that the signal of the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor can be amplified by using DTBQ as a new electrolyte.
아래 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명은 이런 실시예에 제한되지 않는다.The present invention will be described in detail with reference to the examples below, but the invention is not limited to these examples.
비스페놀 A(BPA), 클로로포름, 염화메틸렌, 2,5-디-t-부틸-1,4-벤조퀴논(DTBQ), 및 티로시나아제는 Sigma Aldrich(미국)에서 입수하였다. 키토산(게 껍질에서 유래, 최소 85%가 탈아세틸화)은 Sigma Aldrich(미국)에서 구입하였다. K2HPO4 및 KH2PO4의 표준 용액을 혼합하여 인산 완충액(PBS, 50 mM, pH 7.0)을 제조하였다. 바람직하게, 유기 용매에서 100 mmol L-1 DTBQ을 전해질로 사용한다. 투과 전자 현미경(TEM) 이미지는 JEM-2100(일본)에 의해 획득하였다. 주사 전자 현미경(SEM) 이미지는 ZeIS-SIGMA300(독일)에 의해 획득하였다. CHI 660B 전기 화학 워크 스테이션(CHI기구회사)은 순환 전압 전류법(CV) 및 전기 화학 측정에 의한 테스트를 위한 것이다. 3 전극 시스템은 작업 전극인 유리 탄소(GC) 전극, 기준 전극인 Ag/AgCl 전극, 및 보조 전극인 백금 와이어를 포함한다.Bisphenol A (BPA), chloroform, methylene chloride, 2,5-di-t-butyl-1,4-benzoquinone (DTBQ), and tyrosinase were obtained from Sigma Aldrich (USA). Chitosan (derived from crab shell, at least 85% deacetylated) was purchased from Sigma Aldrich (USA). Phosphate buffer solution (PBS, 50 mM, pH 7.0) was prepared by mixing standard solutions of K 2 HPO 4 and KH 2 PO 4 . Preferably, 100 mmol L -1 DTBQ in organic solvent is used as electrolyte. Transmission electron microscopy (TEM) images were acquired by JEM-2100 (Japan). Scanning electron microscopy (SEM) images were acquired by ZeIS-SIGMA300 (Germany). The CHI 660B Electrochemical Work Station (CHI Instruments) is for testing by cyclic voltammetry (CV) and electrochemical measurements. The three-electrode system includes a glassy carbon (GC) electrode as a working electrode, an Ag/AgCl electrode as a reference electrode, and a platinum wire as an auxiliary electrode.
실시예 1: BP, 티로신 변형 BP의 제조Example 1: Preparation of BP, tyrosine modified BP
BP의 제조 과정은 소정량의 H2O 및 O2가 포함된 아크릴 글러브 박스에서 수행되며, BP 표면층의 균일한 산화 및 히드록실화를 위해 필수적이다. 클로로포름 및 DMF(1:1)에서 초음파 처리를 진행하여 BP 나노 시트가 떨어진다. BP는 상층액에 있으며, 원심 분리 후 떨어지지 않은 입자는 제거된다. SiO2/Si 웨이퍼로 옮겨진 BP를 유리병에 담그고, 유리병의 마개를 닫고 실리콘 오일에 넣었다. 실리콘 오일을 130 ℃로 가열하고 온도를 20 분 동안 유지하였다. 이 단계 후, -OH 그룹이 BP 표면에 형성되었다. 그후 100 ℃에서 헥사메틸렌디아민을 이용하여 BP를 클로로포름에 30 분 동안 옮겼다. BP의 OH 그룹과 헥사메틸렌디아민 사이의 이온 결합을 통해, 균일한 보호 단층을 구비하는 안정적인 BP를 형성하였다. 도 1은 티로신 변형 BP의 제조 방법을 도시하였고, BP 용액(0.5 mg mL-1)을 5 μL 10 mg mL-1 티로시나아제 및 5 μL 1.5 mg mL-1 키토산과 혼합하여, 티로신 변형 BP(G1#로 표기)를 얻었다.The manufacturing process of BP is carried out in an acrylic glove box containing a certain amount of H 2 O and O 2 , which is essential for uniform oxidation and hydroxylation of the BP surface layer. BP nanosheets fall off by ultrasonic treatment in chloroform and DMF (1:1). BP is in the supernatant, and any particles that do not fall off after centrifugation are removed. The BP transferred to the SiO 2 /Si wafer was immersed in a glass bottle, the bottle was capped, and placed in silicone oil. The silicone oil was heated to 130 °C and the temperature was maintained for 20 minutes. After this step, -OH groups were formed on the BP surface. BP was then transferred to chloroform using hexamethylenediamine at 100°C for 30 minutes. Through ionic bonding between the OH group of BP and hexamethylenediamine, stable BP with a uniform protective monolayer was formed. Figure 1 shows the preparation method of tyrosine-modified BP, BP solution (0.5 mg mL -1 ) was mixed with 5 μL 10 mg mL -1 tyrosinase and 5 μL 1.5 mg mL -1 chitosan to obtain tyrosine-modified BP ( (notated as G1#) was obtained.
샘플 G2# ~ 샘플 G5#의 제조 과정은 샘플 G1#과 같고, 다른 점은 원료 비율 및 반응 조건을 변화시키는 것이며, 얻은 샘플의 샘플 번호와 원료 비율 및 반응 조건의 관계는 표 1과 같다.The manufacturing process of samples G2# to sample G5# is the same as sample G1#, the difference is that the raw material ratio and reaction conditions are changed, and the relationship between the sample numbers of the obtained samples and the raw material ratio and reaction conditions is shown in Table 1.
실시예 2: 흑린-티로시나아제/유리 탄소 전극Example 2: Black phosphorus-tyrosinase/glassy carbon electrode
흑린-티로시나아제/GC 전극은 아래 방법으로 제조하였다. Black phosphorus-tyrosinase/GC electrode was manufactured by the method below.
깨끗한 전극을 얻기 위해, 일련의 알루미나(직경: 0.3 및 0.05 μm)를 사용하여 유리 탄소 전극 표면을 연마하고, 에탄올 및 탈이온수로 3 번 세척하였다. 다음 GC 전극은 반복 가능한 순환 전압 전류도가 얻어질 때까지 전위 스캐닝을 통해 1 mol L-1 H2SO4에서 0으로부터 1.7 V까지 전기 화학적 세척을 진행하였다. 실시예 1에서 제조한 티로신 변형 흑린(G1# ~ G5#) 용액을 볼텍서에서 30분 동안 진탕한 후 GC 전극의 표면에 첨가하였다.To obtain a clean electrode, the glassy carbon electrode surface was polished using a series of alumina (diameter: 0.3 and 0.05 μm) and washed three times with ethanol and deionized water. Next, the GC electrode was electrochemically cleaned from 0 to 1.7 V in 1 mol L -1 H 2 SO 4 through potential scanning until a repeatable cyclic voltammogram was obtained. The tyrosine-modified black phosphorus (G1# to G5#) solution prepared in Example 1 was shaken in a vortexer for 30 minutes and then added to the surface of the GC electrode.
전기 화학적 측정 전에 모든 전극을 과량의 탈이온수로 세척하여 약하게 흡착된 효소를 제거하였다. 티로시나아제 바이오센서의 제조 공법은 흑린 티로시나아제/GC 센서와 유사하다. 5 mmol L-1 [Fe(CN)6]4-/3- 용액에서 전기 화학적 스캐닝을 통해 흑린-티로시나아제/GC 전극 및 기타 전극을 특성화하였다.Before electrochemical measurements, all electrodes were washed with excess deionized water to remove weakly adsorbed enzymes. The manufacturing method of the tyrosinase biosensor is similar to the black phosphorus tyrosinase/GC sensor. The black phosphorus-tyrosinase/GC electrode and other electrodes were characterized by electrochemical scanning in 5 mmol L -1 [Fe(CN) 6 ] 4-/3- solution.
실시예 3: 흑린-티로시나아제/GC 전극에 의해 비스페놀 A를 검출Example 3: Detection of bisphenol A by black phosphorus-tyrosinase/GC electrode
비스페놀 A(BPA)는 인간의 내분기계에 악영향을 미치는 가장 중요한 내분비 교란 물질(EDC) 중 하나이다. 10 μL BPA 용액을 0.1 mol L-1 DTBQ로 유기 용매(10 mL, 50 μL 아세트산 용액(pH 5)을 포함)에 침지시킨 후, 인가된 -0.15 V 전위하에 전류 측정을 수행하였다.Bisphenol A (BPA) is one of the most important endocrine disruptors (EDCs) that adversely affects the human endocrine system. 10 μL BPA solution was immersed in an organic solvent (10 mL, containing 50 μL acetic acid solution (pH 5)) with 0.1 mol L -1 DTBQ, and then current measurement was performed under an applied potential of -0.15 V.
실시예 4: 흑린의 물리적 특성Example 4: Physical properties of black phosphorus
샘플 G1#를 전형적인 대표 샘플로 취하여 흑린의 물리적 특성을 관찰하였다.Sample G1# was taken as a typical representative sample to observe the physical properties of black phosphorus.
투과 전자 현미경(TEM) 및 주사 전자 현미경(SEM)을 이용하여 얻은 BP의 구조 및 형태를 특성화하였다. 도 2A는 대표적인 흑린의 TEM 이미지로서, 액체박리법을 통해 격자 줄무늬가 있는 고품질 흑린을 제조하였음을 보여준다. 도 2B는 흑린의 선택 영역 전자 회절(SAD) 패턴이고, 사방 정계 특징은 SAD 패턴에 의해 확인되었다. 도 2C에 도시된 바와 같이 흑린은 SEM 이미지에서 층상 구조를 나타낸다.The structure and morphology of the obtained BP were characterized using transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Figure 2A is a representative TEM image of black phosphorus, showing that high-quality black phosphorus with lattice stripes was manufactured through a liquid exfoliation method. Figure 2B is a selected area electron diffraction (SAD) pattern of black phosphorus, and the orthorhombic feature was confirmed by the SAD pattern. As shown in Figure 2C, black phosphorus shows a layered structure in the SEM image.
원자력 현미경 법으로 흑린 코팅층의 안정성을 특성화하였다. 도 3A 및 3B에 도시된 바와 같이, 헥사메틸렌디아민을 코팅하지 않은 경우 대다수 흑린은 12시간 후 수용액 중의 산소에 의해 분해되었다. 흑린 표면에 헥사메틸렌디아민을 코팅한 후, 코팅층 흑린은 습한 공기 중에서 원래 형태를 4 주 넘게 유지할 수 있었다(도 3C 및 3D). 본 실시예의 흑린 코팅층을 유기 용매에서의 바이오센서 고정 플랫폼으로 사용하면, 흑린 코팅층이 수성 용매에서의 사용 수명이 더 길어진다.The stability of the black phosphorus coating layer was characterized using atomic force microscopy. As shown in Figures 3A and 3B, when hexamethylenediamine was not coated, most of the black phosphorus was decomposed by oxygen in the aqueous solution after 12 hours. After coating the black phosphorus surface with hexamethylenediamine, the coated black phosphorus was able to maintain its original form in humid air for over 4 weeks (Figures 3C and 3D). When the black phosphorus coating layer of this example is used as a biosensor fixation platform in an organic solvent, the black phosphorus coating layer has a longer service life in an aqueous solvent.
샘플 G2# ~ 샘플 G5#는 샘플 G1#과 유사한 물리적 특성을 구비한다.Samples G2# to Sample G5# have similar physical properties to sample G1#.
실시예 5: 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 고정에 대한 모니터링Example 5: Monitoring of immobilization of black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor
샘플 G1#를 전형적인 대표 샘플로 취하여 BP-티로시나아제/GC 바이오센서의 고정을 모니터링하였다.Sample G1# was taken as a typical representative sample to monitor the immobilization of BP-tyrosinase/GC biosensor.
순환 전압 전류법(CV)에 의해 [Fe(CN)6]4-/3- 용액에서 GC 전극의 개질 과정을 모니터링하였다. 도 4는 [Fe(CN)6]4-/3- 용액 중 베어 GC 전극, 티로시나아제/GC 전극 및 흑린-티로시나아제/GC 전극(곡선 a, 곡선 b 및 곡선 c)의 CV 신호이다. 베어 전극에서 [Fe(CN)6]4-/3-의 변화로 인해(곡선 a), 음극 피크와 양극 피크 사이의 피크 간격이 약 65 mV이다. 결과는 베어 전극이 아주 깨끗하고 전기 화학적 산화반응 과정이 가역적인 단일 전자 전이 과정임을 보여준다. 티로시나아제/GC 전극의 응답 신호(곡선 b)는 [Fe(CN)6]4-/3- 용액에서 현저히 약해졌다. 이는 주로 GC 전극 표면을 덮고 있는 낮은 전도도의 티로시나아제 때문이다. 흑린 및 티로시나아제를 GC 전극에 고정한 후, 응답 신호가 현저히 강해졌다. 이는 주로 높은 전도도의 흑린이([Fe(CN)6]4-/3-)과 GC 전극 사이의 전자 이동도를 높였기 때문이다. 결과는 흑린 및 티로시나아제가 GC 전극에 성공적으로 고정되었음을 보여준다.The reforming process of the GC electrode in [Fe(CN) 6 ] 4-/3- solution was monitored by cyclic voltammetry (CV). Figure 4 shows the CV signals of bare GC electrode, tyrosinase/GC electrode, and black phosphorus-tyrosinase/GC electrode (curve a, curve b, and curve c) in [Fe(CN) 6 ] 4-/3- solution. . Due to the change in [Fe(CN) 6 ] 4-/3- at the bare electrode (curve a), the peak gap between the cathodic and anodic peaks is approximately 65 mV. The results show that the bare electrode is very clean and the electrochemical oxidation process is a reversible single-electron transition process. The response signal of the tyrosinase/GC electrode (curve b) was significantly weakened in the [Fe(CN) 6 ] 4-/3- solution. This is mainly due to the low conductivity tyrosinase covering the GC electrode surface. After fixing black phosphorus and tyrosinase to the GC electrode, the response signal became significantly stronger. This is mainly because the electron mobility between the high conductivity black phosphorus ([Fe(CN) 6 ] 4-/3- ) and the GC electrode was increased. The results show that black phosphorus and tyrosinase were successfully immobilized on the GC electrode.
샘플 G2# ~ 샘플 G5#는 샘플 G1#과 유사한 CV 곡선도를 구비한다.Samples G2# to Sample G5# have CV curves similar to sample G1#.
실시예 6: 흑린-티로시나아제/GC 전극으로 결정한 비스페놀 AExample 6: Bisphenol A determined by black phosphorus-tyrosinase/GC electrode
비스페놀 A(식 I)는 사용량이 가장 큰 산업용 화학물질 중 하나로서, 폴리카보네이트 및 에폭시수지의 생산 원료이다. 그 생식 및 발달 독성으로 인해, 미국에서는 영아용 젖병에 BPA를 사용하는 것이 금지되어 있다. 이러한 이유로 본 실시예에서는 BPA를 연구 대상으로 선정하고, 흑린 기반 티로시나아제 바이오센서를 사용하여 유기 용매 중 BPA를 모니터링하였다. 이 시스템에서 유기 용매에 대한 비스페놀 A의 용해도는 물에 대한 용해도보다 훨씬 더 높다. 추가적인 이점은 유기 용매에 대한 공동 기질 산소의 용해도가 물에 대한 용해도보다 40 배 높다는 것이다. 이전 결과를 바탕으로 본문에서는 클로로포름을 용매로 선택하고 0.5 % 아세트산(pH 5.0)을 클로로포름에 첨가하여 고정된 티로시나아제를 활성화하였다.Bisphenol A (Formula I) is one of the most widely used industrial chemicals and is a raw material for the production of polycarbonate and epoxy resin. Because of its reproductive and developmental toxicity, BPA is banned from use in infant feeding bottles in the United States. For this reason, in this example, BPA was selected as a research object, and BPA in organic solvents was monitored using a black phosphorus-based tyrosinase biosensor. In this system, the solubility of bisphenol A in organic solvents is much higher than its solubility in water. An additional advantage is that the solubility of co-substrate oxygen in organic solvents is 40 times higher than its solubility in water. Based on previous results, chloroform was selected as the solvent in the main text, and 0.5% acetic acid (pH 5.0) was added to chloroform to activate the immobilized tyrosinase.
[식 I][Formula I]
티로시나아제 바이오센서가 응답하는 작동 전위는 도 5에서 검사할 수 있다. 전위가 0에서 -0.2 V로 떨어질 경우, 응답 전류가 빠르게 증가한다. 우수한 신호 대 배경 특성을 얻기 위해, 인가 전위로 -0.15 V를 선택하였다. 이런 낮은 전위는 전기 활성 종의 잠재적인 간섭을 최소화할 수 있다. 도 6A는 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서(곡선 a), 티로시나아제/GC 바이오센서(곡선 b) 및 베어 GC 바이오센서(곡선 c)가 지속적인 교반 조건에서 연속적으로 첨가되는 BPA에 대한 전류 응답(-0.15 V)이다. 티로시나아제가 없는 흑린/GC 바이오센서는 BPA에 대해 응답이 없다. 티로시나아제/GC 바이오센서 및 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서는 1 μmol L-1 BPA를 첨가한 후 뚜렷한 전류 신호를 관찰할 수 있고, 5 초 이내에 95 % 정상 전류에 도달할 수 있다. 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 빠른 응답은 BPA가 유기 용매로부터 고정된 티로시나아제로 빠르게 확산되었기 때문일 수 있다. 도 6B는 BPA 농도에 대한 이런 바이오센서의 응답 신호의 검정 곡선이다. 결과는 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서가 높은 전도도와 큰 비표면적을 가지며, 티로시나아제/GC 바이오센서보다 더 큰 응답 신호를 나타낸다는 것을 보여준다. 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 감도는 38.8 mA M-1로 2.7 mA M-1의 감도를 가지는 티로시나아제/GC 바이오센서보다 10 배 이상 높다. 흑린 기반 티로시나아제의 선형 범위는 5×10-8 내지 1×10-6 mol L-1이고 상관 계수는 0.9993 이다. 잡음은 약 2.5 × 10-11 A이고 감지 한계는 약 10 nmol L-1(신호 대 잡음비, S/N＝3)이다.The action potentials to which the tyrosinase biosensor responds can be examined in Figure 5. When the potential drops from 0 to -0.2 V, the response current increases rapidly. To obtain good signal-to-background characteristics, -0.15 V was chosen as the applied potential. These low potentials can minimize potential interference from electroactive species. Figure 6A shows the current for BPA added continuously to the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor (curve a), tyrosinase/GC biosensor (curve b), and bare GC biosensor (curve c) under constant agitation. The response is (-0.15 V). The tyrosinase-free black phosphorus/GC biosensor has no response to BPA. The tyrosinase/GC biosensor and black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor can observe distinct current signals after adding 1 μmol L -1 BPA, and reach 95% steady-state current within 5 seconds. The fast response of the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor may be due to the rapid diffusion of BPA from the organic solvent into the immobilized tyrosinase. Figure 6B is a calibration curve of the response signal of this biosensor to BPA concentration. The results show that the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor has high conductivity and a large specific surface area, and exhibits a larger response signal than the tyrosinase/GC biosensor. The sensitivity of the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor is 38.8 mA M -1 , which is more than 10 times higher than that of the tyrosinase/GC biosensor, which has a sensitivity of 2.7 mA M -1 . The linear range of black phosphorus-based tyrosinase is 5×10 -8 to 1×10 -6 mol L -1 and the correlation coefficient is 0.9993. The noise is about 2.5 × 10 -11 A and the detection limit is about 10 nmol L -1 (signal-to-noise ratio, S/N = 3).
흑린 티로시나아제/GC 바이오센서의 분석 성능을 기타 티로시나아제 바이오센서와 비교하였다(표 2). 표 2에서 볼 수 있듯이 모든 바이오센서 중에서 흑린 티로시나아제/GC 바이오센서의 잡음이 가장 낮았다. 이는 주로 물 용매의 낮은 안정성 생성물(o-퀴논)로 인해 티로시나아제를 억제하고 용액과 티로시나아제 사이의 기질 및 생성물의 이동을 제한하는 다환 방향족 탄화수소 안료의 신속한 중합으로 이어진다. 결과는 수용액에서 바이오센서의 배경 잡음 전류가 연속적인 반응에 따라 매우 빠르게 증가한다는 것을 보여준다. 그러나 본 연구에서 비스페놀 A는 빠른 중합없이 유기 용매에서 안정적인 o-퀴논으로 정량적으로 전환될 수 있으며, 생성물에 많은 양의 o-퀴논이 포함되어 있어도 낮은 배경 잡음 전류가 발생한다. 위와 같은 이유로 이런 바이오센서 중 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서는 감도가 가장 높지는 않지만 검출 한계가 가장 낮다. 결과는 구축된 바이오센서가 BPA의 초고감도 및 신속한 검출을 위한 이상적인 후보임을 보여준다.The analytical performance of the black phosphorus tyrosinase/GC biosensor was compared with other tyrosinase biosensors (Table 2). As shown in Table 2, among all biosensors, the black phosphorus tyrosinase/GC biosensor had the lowest noise. This leads to rapid polymerization of polycyclic aromatic hydrocarbon pigments, which inhibit tyrosinase and limit the transfer of substrates and products between solution and tyrosinase, mainly due to the low stability of the product (o-quinone) in water solvent. The results show that the background noise current of the biosensor in aqueous solution increases very rapidly with successive reactions. However, in this study, bisphenol A can be quantitatively converted to stable o-quinone in organic solvents without rapid polymerization, resulting in low background noise current even if the product contains a large amount of o-quinone. For the above reasons, among these biosensors, the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor does not have the highest sensitivity, but has the lowest detection limit. The results show that the constructed biosensor is an ideal candidate for ultrasensitive and rapid detection of BPA.
실시예 7: 샘플 분석에서 재현성, 안정성 및 적용Example 7: Reproducibility, stability and application in sample analysis
반복 가능성은 흑린 티로시나아제/GC 바이오센서의 또 다른 매력적인 특징이다. 1 μmol L-1 BPA의 8회 반복 측정은 상대 표준 편차(RSD)가 0.5 %인 매우 반복 가능한 암페어 피크를 생성하였다(도 7). 이는 제조의 재현성이 허용 가능하다는 것을 보여준다. 1 μmol L-1 BPA에 대한 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 응답을 180회 연속 측정하여, 이가 유기 용매에서의 장기 안정성을 연구하였다. 사용하지 않을 때는 흑린 티로시나아제/GC 바이오센서를 클로로포름으로 포화시켜 4 ℃ 냉장고에 냉장 보관하였다. 180 일 보관 후에도 여전히 65 %를 초과하는 초기 전류 응답을 유지하였다.Repeatability is another attractive feature of the black phosphorus tyrosinase/GC biosensor. Eight replicate measurements of 1 μmol L -1 BPA produced highly repeatable amperage peaks with a relative standard deviation (RSD) of 0.5% (Figure 7). This shows that the reproducibility of manufacturing is acceptable. The response of the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor to 1 μmol L -1 BPA was measured 180 times in succession to study its long-term stability in divalent organic solvents. When not in use, the black phosphorus tyrosinase/GC biosensor was saturated with chloroform and stored refrigerated in a refrigerator at 4°C. The initial current response still exceeded 65% after 180 days of storage.
흑린 티로시나아제/GC 바이오센서의 우수한 센싱 성능은 다음 요인에 기인할 수 있다. 2D 재료의 큰 표면적은 GC 전극의 활성 표면적을 크게 증가시킬 수 있다. 흑린의 높은 전도도는 유기 용매에서 GC 전극의 표면과 BPA 사이의 전자 이동 속도를 높일 수 있다. 적층(layer-by-layer, LBL) 구조는 BPA가 유기 용매와 고정된 티로시나아제 사이에서 쉽게 이동할 수 있는 넓은 공간을 제공하고(도 8A 참조), DTBQ 새로운 전해질로서 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서의 신호를 증폭할 수 있다(도 8B 참조). The excellent sensing performance of the black phosphorus tyrosinase/GC biosensor can be attributed to the following factors. The large surface area of 2D materials can greatly increase the active surface area of GC electrodes. The high conductivity of black phosphorus can increase the electron transfer rate between the surface of the GC electrode and BPA in organic solvents. The layer-by-layer (LBL) structure provides a large space for BPA to easily move between the organic solvent and the immobilized tyrosinase (see Figure 8A), and the black phosphorus-tyrosinase/GC DTBQ as a new electrolyte The signal from the biosensor can be amplified (see Figure 8B).
이 밖에, 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서는 지역 슈퍼마켓에서 구입한 플라스틱 제품에서 침출된 BPA를 측정하는데 사용된다. 이런 플라스틱 제품을 클로로포름으로 포화시키고 전자레인지로 30 분 동안 가열하였다. 증발 및 농축 후 바이오센서를 사용하여 지정량의 얻은 용액에 대한 전류 분석을 수행하였다. 그 결과 BPA는 하나의 플라스틱 병 샘플에만 존재하는 것으로 나타났으며 그 농도는 20 μg g-1로 계산되었다. 결과는 GC-MS에 의해 확인되었으며 기체 크로마토그래피-질량 분석의 결과와 일치했다. 이런 바이오센서를 사용하여 다른 잠재적인 공존 가소제 간섭(예: 프탈산에스테르)을 확인하였다. 이들은 티로시나아제의 기질이 아니기 때문에 응답 신호가 없다. 또한 일반적으로 사용되는 유기 용매(아세토니트릴, ㅍㅍ) 및 무기 이온(Na+, Cl-, Ca2+))은 바이오센서의 선택성에 영향을 주지 않는다. 결과는 개발된 바이오센서가 공존하는 화학 물질에서 비스페놀 A를 선택적으로 측정하는데 잠재적이고 효과적인 도구임을 보여준다.Additionally, the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor is used to measure BPA leached from plastic products purchased from a local supermarket. These plastic products were saturated with chloroform and heated in a microwave oven for 30 minutes. After evaporation and concentration, current analysis was performed on a specified amount of the obtained solution using a biosensor. As a result, BPA was found to be present only in one plastic bottle sample, and its concentration was calculated to be 20 μg g -1 . The results were confirmed by GC-MS and were consistent with the results of gas chromatography-mass spectrometry. These biosensors were used to identify other potential coexisting plasticizer interferences (e.g., phthalate esters). Since they are not substrates for tyrosinase, there is no response signal. Additionally, commonly used organic solvents (acetonitrile, ㅍㅍ) and inorganic ions (Na + , Cl - , Ca 2+ )) do not affect the selectivity of the biosensor. The results show that the developed biosensor is a potential and effective tool for selectively measuring bisphenol A in coexisting chemicals.
현재 연구에서는 화학적 개질을 통해 안정적인 흑린을 제조하고 그 재료를 바이오 센싱 플랫폼으로 사용하며, 신규 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서를 구축하고 이런 센서를 개발하여 비스페놀 A의 빠르고 선택적인 검출을 수행할 수 있다. 이런 바이오센서는 BPA의 농도에 대해 의존적으로 응답하고, 낮은 검출 한계 및 높은 선택성을 구비한다. 이런 바이오센서는 유기 용매에서 장기 안정성을 유지하고 BPA와 플라스틱 병을 성공적으로 구별해낼 수 있다. 이는 환경 BPA의 장기적인 모니터링에 유용한 조기 경고 도구이다.In the current study, we prepared stable black phosphorus through chemical modification, used the material as a biosensing platform, constructed a novel black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor, and developed such a sensor to perform rapid and selective detection of bisphenol A. You can. These biosensors respond dependently on the concentration of BPA and have low detection limits and high selectivity. These biosensors maintain long-term stability in organic solvents and can successfully distinguish between BPA and plastic bottles. This is a useful early warning tool for long-term monitoring of environmental BPA.
앞에서 BPA를 예로 들어 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서가 환경 분석물에 대한 검출을 보여주었고, 같은 원리에 의해 흑린-티로시나아제/GC 바이오센서는 기타 환경 분석물의 검출에도 사용될 수 있다. 마찬가지로, BPA 검출 실시예와 유사하게, 티로시나아제가 없는 흑린/GC 바이오센서는 환경 분석물에 응답이 없다.Previously, using BPA as an example, the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor was shown to detect environmental analytes, and by the same principle, the black phosphorus-tyrosinase/GC biosensor can also be used to detect other environmental analytes. Likewise, similar to the BPA detection example, the tyrosinase-free black phosphorus/GC biosensor is unresponsive to environmental analytes.
상술한 내용은 본 발명의 일부 실시예일 뿐이고 본 발명에 대한 어떠한 한정도 아니다. 비록 본 발명은 바람직한 실시예를 바탕으로 설명하였으나 본 발명을 한정하기 위한 의도가 아니며, 본 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명의 기술방안의 범위를 벗어나지 않고 상기 개시된 기술내용을 이용하여 진행한 약간의 변동 또는 수정은 모두 등가 실시 사례에 속하며 본 발명의 기술방안의 범위에 속한다.The above-described contents are only some embodiments of the present invention and do not constitute any limitation to the present invention. Although the present invention has been described based on preferred embodiments, it is not intended to limit the present invention, and a person skilled in the art may make some progress using the technical content disclosed above without departing from the scope of the technical solution of the present invention. Any changes or modifications belong to equivalent implementation examples and fall within the scope of the technical solution of the present invention.
Claims (10)
오일 베스에서 130 ℃ ~ 150 ℃로 가열하고 온도를 20 ~ 30분 동안 유지하는 단계;
0.5~1 : 2~20 : 0.3~1.5의 질량비로 흑린 용액을 티로시나아제 및 키토산과 혼합하여 티로시나아제 변형 흑린을 얻는 단계를 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 티로시나아제 변형 흑린의 제조 방법.Putting the flake substrate on which black phosphorus is placed in a container and sealing it;
heating to 130°C to 150°C in an oil bath and maintaining the temperature for 20 to 30 minutes;
A method for producing tyrosinase-modified black phosphorus, comprising at least the step of obtaining tyrosinase-modified black phosphorus by mixing the black phosphorus solution with tyrosinase and chitosan at a mass ratio of 0.5-1:2-20:0.3-1.5.
상기 방법은,
흑린 용액을 티로시나아제 및 키토산과 혼합하는 단계 전에, 90 ℃ ~ 120 ℃에서 아미노 알칸 또는 아미노 방향족 탄화수소를 이용하여 상기 흑린을 logp 값이 2보다 큰 유기 용매 중 적어도 하나에 옮기는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 티로시나아제 변형 흑린의 제조 방법.According to paragraph 1,
The method is:
Before mixing the black phosphorus solution with tyrosinase and chitosan, it further comprises the step of transferring the black phosphorus to at least one of the organic solvents with a logp value greater than 2 using an amino alkane or amino aromatic hydrocarbon at 90 ° C to 120 ° C. A method for producing tyrosinase modified black phosphorus, characterized in that:
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2018/118881 WO2020113362A1 (en) | 2018-12-03 | 2018-12-03 | Tryrosinase-modified black phosphate and application thereof in biosensor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20210088699A KR20210088699A (en) | 2021-07-14 |
| KR102641277B1 true KR102641277B1 (en) | 2024-02-29 |
Family
ID=70974063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020217017963A KR102641277B1 (en) | 2018-12-03 | 2018-12-03 | Tyrosinase modified black phosphorus and its application in the field of biosensors |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102641277B1 (en) |
| WO (1) | WO2020113362A1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102680547A (en) | 2011-03-11 | 2012-09-19 | 中国科学院理化技术研究所 | Electrode for testing phenolic materials in water and preparing method and application thereof |
| CN106018851A (en) | 2016-05-23 | 2016-10-12 | 济南大学 | Method for preparing steroid immunosensor based on sheet black phosphorus and application |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104807869B (en) * | 2015-05-18 | 2017-05-10 | 哈尔滨理工大学 | Manufacturing and integration method for two-dimensional nanomaterial-based biosensor |
| CN106053557B (en) * | 2016-05-23 | 2018-10-26 | 济南大学 | A kind of preparation method of the human fibroblastic growth factor immunosensor based on sheet black phosphorus |
| CN106267201B (en) * | 2016-08-26 | 2018-05-01 | 深圳先进技术研究院 | A kind of black phosphorus of polymer wrapped and preparation method and application |
-
2018
- 2018-12-03 WO PCT/CN2018/118881 patent/WO2020113362A1/en active Application Filing
- 2018-12-03 KR KR1020217017963A patent/KR102641277B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102680547A (en) | 2011-03-11 | 2012-09-19 | 中国科学院理化技术研究所 | Electrode for testing phenolic materials in water and preparing method and application thereof |
| CN106018851A (en) | 2016-05-23 | 2016-10-12 | 济南大学 | Method for preparing steroid immunosensor based on sheet black phosphorus and application |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20210088699A (en) | 2021-07-14 |
| WO2020113362A1 (en) | 2020-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zehani et al. | Highly sensitive electrochemical biosensor for bisphenol A detection based on a diazonium-functionalized boron-doped diamond electrode modified with a multi-walled carbon nanotube-tyrosinase hybrid film | |
| Kong et al. | Molecularly imprinted sensor based on electropolmerized poly (o-phenylenediamine) membranes at reduced graphene oxide modified electrode for imidacloprid determination | |
| Chirizzi et al. | A novel nonenzymatic amperometric hydrogen peroxide sensor based on CuO@ Cu2O nanowires embedded into poly (vinyl alcohol) | |
| Liang et al. | Signal-on electrochemiluminescence of biofunctional CdTe quantum dots for biosensing of organophosphate pesticides | |
| Ahmad et al. | A highly sensitive nonenzymatic sensor based on Fe2O3 nanoparticle coated ZnO nanorods for electrochemical detection of nitrite | |
| Zhang et al. | Simultaneous electrochemical determination of dopamine, ascorbic acid and uric acid using poly (acid chrome blue K) modified glassy carbon electrode | |
| Niu et al. | A novel electrochemical sensor of bisphenol A based on stacked graphene nanofibers/gold nanoparticles composite modified glassy carbon electrode | |
| Ku et al. | Highly selective dopamine electrochemical sensor based on electrochemically pretreated graphite and nafion composite modified screen printed carbon electrode | |
| Qu et al. | Sensitive amperometric biosensor for phenolic compounds based on graphene–silk peptide/tyrosinase composite nanointerface | |
| Hu et al. | Multi-wall carbon nanotube-polyaniline biosensor based on lectin–carbohydrate affinity for ultrasensitive detection of Con A | |
| Wisitsoraat et al. | Graphene–PEDOT: PSS on screen printed carbon electrode for enzymatic biosensing | |
| Li et al. | Electropolymerized molecular imprinting on gold nanoparticle-carbon nanotube modified electrode for electrochemical detection of triazophos | |
| Zhang | Direct electrochemistry of cytochrome c at ordered macroporous active carbon electrode | |
| Meibodi et al. | Amperometric urea biosensor based on covalently immobilized urease on an electrochemically polymerized film of polyaniline containing MWCNTs | |
| Wang et al. | A sandwich-type phenolic biosensor based on tyrosinase embedding into single-wall carbon nanotubes and polyaniline nanocomposites | |
| Park et al. | A novel glucose biosensor using bi-enzyme incorporated with peptide nanotubes | |
| Jin et al. | Electrochemical behavior and adsorptive stripping voltammetric determination of quercetin at multi-wall carbon nanotubes-modified paraffin-impregnated graphite disk electrode | |
| Chokkareddy et al. | A novel electrode architecture for monitoring rifampicin in various pharmaceuticals | |
| Wang et al. | A selective voltammetric method for detecting dopamine at quercetin modified electrode incorporating graphene | |
| Gong et al. | Efficient stripping voltammetric detection of organophosphate pesticides using NanoPt intercalated Ni/Al layered double hydroxides as solid-phase extraction | |
| Aneesh et al. | Electrochemically synthesized partially reduced graphene oxide modified glassy carbon electrode for individual and simultaneous voltammetric determination of ascorbic acid, dopamine and uric acid | |
| Pham et al. | Electrochemical characterization of a single-walled carbon nanotube electrode for detection of glucose | |
| Reybier et al. | The use of polyethyleneimine for fabrication of potentiometric cholinesterase biosensors | |
| Oztekin et al. | Electrochemical copper (II) sensor based on self-assembled 4-amino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidine monohydrate | |
| Liu et al. | Ultrasensitive detection of ferulic acid using poly (diallyldimethylammonium chloride) functionalized graphene-based electrochemical sensor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right |