KR102638206B1 - Biological indicator for confirming sterilization of airtight space by vaporized hydrogen peroxide - Google Patents
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Abstract
본 발명은 살균이나 멸균 공정을 실시할 때 멸균이 적절히 수행되었는지를 확인하고 검증하는데 사용가능한 증기화 과산화수소에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 과산화수소를 첨가한 배지에서 내생포자를 생성하는 균주를 배양하고, 생성된 내생포자를 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 이용하여 저항성 내생포자만을 분리하는 것을 특징으로 하는 증기화 과산화수소(vaporized hydrogen peroxide)에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제 및 1) 상기 저항성 내생포자를 제조한 후, 이를 섬유(fiber)나 스테인레스 스틸 디스크(stainless steel disk)에 넣고 건조하는 단계; 및 2) 상기 건조된 내생포자를 함유한 섬유나 스테인레스 스틸 디스크를 가스가 통과할 수 있는 포장지에 무균적으로 포장하는 단계;를 포함하는 생물학적 지시제의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 생물학적 지시제는 특별히 밀폐된 공간 멸균에 사용하는 것으로 저항성이 강하고 균일성 있는 포자를 사용함으로써 생산 배치마다 균일성을 유지할 수 있는 장점이 있다.The present invention relates to a biological indicator for confirming sterilization of a confined space by vaporized hydrogen peroxide that can be used to confirm and verify whether sterilization has been properly performed when carrying out a sterilization or sterilization process, and to a method for producing the same. More specifically, it relates to a method of producing the same Vaporized hydrogen peroxide, characterized in that strains producing endospores are cultivated in a medium supplemented with and only resistant endospores are isolated from the generated endospores using density gradient centrifugation. A biological indicator for confirming sterilization of a closed space by 1) preparing the resistant endospores, placing them on a fiber or a stainless steel disk and drying them; and 2) aseptically packaging the dried endospore-containing fiber or stainless steel disk in a packaging paper through which gas can pass. The biological indicator of the present invention is specifically used for sterilization of closed spaces and has the advantage of maintaining uniformity for each production batch by using highly resistant and uniform spores.
Description
본 발명은 증기화 과산화수소에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 내생포자를 이용하여 무균실이나 무균상태를 유지해야하는 멸균제품(예, 주사제, 점안제, 수액제 등)을 생산하는 공간을 멸균할 때, 상기 멸균이 정상적으로 수행되었는지를 확인 검증하는 용도로 사용하는 생물학적 지시제 제조에 관한 것이다.The present invention relates to a biological indicator for confirming sterilization of a confined space by vaporized hydrogen peroxide. More specifically, it relates to a biological indicator that uses endospores to produce sterilized products (e.g. injections, eye drops, infusions, etc.) that must be maintained in a sterile room or in a sterile condition. This relates to the manufacture of biological indicators used to confirm and verify whether the sterilization has been performed normally when sterilizing a production space.
멸균이나 살균과정이 효과적으로 수행되었는지를 검증 또는 확인하기 위하여, 즉 멸균 과정의 유효성(effectiveness)을 평가 및/또는 측정하기 위해 생물학적 지시제(indicator; 인디케이터)를 사용한다.Biological indicators are used to verify or confirm whether the sterilization or sterilization process has been performed effectively, that is, to evaluate and/or measure the effectiveness of the sterilization process.
구체적으로, 일반적인 생물학적 지시제는 연구를 진행하는 과정 중의 멸균 과정에 대하여 높은 내성을 갖는 조정된(calibrated) 미생물 집단을 포함한다. 멸균 과정에 노출 후, 생물학적 지시제는 임의의 생존력 있는 잔존 미생물의 성장을 촉진하기 위해 배양 배지 내에서 배양된다. 자체-완비(Self-contained) 생물학적 지시제는 상기 지시제 내에 배양 배지를 포함하는데, 일반적으로 깨지기 쉬운 유리병(vial) 안에 포함한다. 포자 스트립(strip) 생물학적 지시제는 모니터링된 멸균 과정을 거친 후 별개 용기에 담겨져 있는 배양 배지와 합쳐진다. 성장 배지의 색깔 변화 또는 탁도에 의해 설명되는, 연이은 미생물 생장이 멸균 과정이 유효하지 않았음을 나타내 주는 지표가 된다.Specifically, common biological indicators include calibrated populations of microorganisms that are highly resistant to sterilization processes during research. After exposure to the sterilization process, the biological indicator is cultured in a culture medium to promote the growth of any viable remaining microorganisms. Self-contained biological indicators contain culture medium within the indicator, typically in a fragile vial. The spore strip biological indicator undergoes a monitored sterilization process and is then combined with the culture medium contained in a separate container. Continued microbial growth, as demonstrated by color change or turbidity of the growth medium, is an indicator that the sterilization process was not effective.
세균 내생포자가 일반적으로 생물학적 지시제로서 선호되는데, 이는 상기 세균 내생포자가 대부분의 다른 유형의 미생물보다 멸균 과정에 더 내성이 있는 것으로 인정되기 때문이다. 즉, 세균 내생포자를 사멸시키는 멸균 과정이 오염을 일으키는 임의의 기타 미생물도 사멸시킬 것으로 추정된다는 사실에 기인한다.Bacterial endospores are generally preferred as biological indicators because they are recognized as being more resistant to sterilization procedures than most other types of microorganisms. That is, it is due to the fact that the sterilization process that kills bacterial endospores is assumed to also kill any other microorganisms that cause contamination.
내생포자는 세균이 생존하기 힘든 극한 환경에서 살아남고자 스스로 생성하는 특수한 물체의 하나로 주로 그람 양성균에서 발생한다. 대체로 영양분이 부족한 상황에서 생성되며, 이렇게 생성된 내생포자로 수 년에서 수 세기를 견딜 수 있고 주변 환경이 세균 생장에 유리해 지면 다시 영양세포(Vegetative cell)로 분화 할 수 있는 특징을 지닌다. 즉, 내생포자는 열, 강한 화학 물질 그리고 방사선에 강한 저항성을 가지고 있으며 생존 구조의 기능을 가지고 있어 세포가 생존하기 힘든 영양분 고갈 또는 건조 상태를 극복할 수 있으므로 세균의 생명주기(Life cycle)에서 휴지기(Interphase)로 볼 수 있다.Endospores are a type of special object that bacteria produce to survive in extreme environments where it is difficult to survive. They mainly occur in Gram-positive bacteria. They are generally produced in situations where nutrients are lacking, and the endospores produced in this way can endure for several years to centuries and have the characteristic of being able to differentiate into vegetative cells again when the surrounding environment becomes favorable for bacterial growth. In other words, endospores have strong resistance to heat, strong chemicals, and radiation, and have the function of a survival structure, so they can overcome nutrient depletion or dry conditions in which cells cannot survive, thus entering the resting phase in the bacterial life cycle. It can be viewed as (Interphase).
세균 내생포자의 선택은 평가되어야 할 멸균 양상, 멸균 유형, 및 기술에 좌우된다. 예를 들면, 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) 포자는 이들 지시제 포자가 산화 화학에 매우 내성을 나타내기 때문에 습열, 과초산, 과산화수소, 및 액체와 증기 양 상태의 기타 과산화 화합물을 이용하는 멸균 시스템을 모니터하는데 사용된다. 유사하게, 바실러스 서브틸리(Bacillus subtilis) 포자는 에틸렌옥사이드 멸균, 건열 멸균 시스템을 모니터하는데 사용된다.The choice of bacterial endospores depends on the sterilization modality, type of sterilization, and technique to be evaluated. For example, Geobacillus stearothermophilus spores can be sterilized using moist heat, peracetic acid, hydrogen peroxide, and other peroxidizing compounds in both liquid and vapor states because these indicator spores are highly resistant to oxidizing chemicals. Used to monitor the system. Similarly, Bacillus subtilis spores are used to monitor ethylene oxide sterilization and dry heat sterilization systems.
미생물은 일반적으로 스트립 또는 디스크와 같은 캐리어 또는 기재 상에서 지지된다. 상기 기재는 멸균 과정과 호환될 수 있는 물질로 만들어지며 멸균 평가에 영향을 끼칠 수 있는 첨가물(additives)을 포함하지 않는다. 여과지, 크로마토그래피지, 블로터지, 유리섬유, 폴리머 플라스틱, 세라믹, 스테인리스 강철, 및 금속산화물 (metaloxide articles)과 같은 물질이 종종 기재 또는 캐리어로 사용된다.Microorganisms are generally supported on a carrier or substrate such as a strip or disk. The substrate is made of materials compatible with sterilization processes and does not contain additives that may affect the sterilization evaluation. Materials such as filter paper, chromatography paper, blotter paper, glass fiber, polymer plastics, ceramics, stainless steel, and metaloxide articles are often used as substrates or carriers.
보조적인 수단으로 화학적 지시제도 함께 사용하는 것이 일반적이다. 화학적 지시제는 멸균공정을 완료한 직후 육안으로 판별이 가능하다는 장점이 있지만 엄밀하게 멸균이 되었는지는 확인이 불가능하다. 따라서 반드시 생물학적 지시제를 사용하여 멸균을 확인하여야 한다. 지오바실러스 스테아로서모필러스(G.stearothermophilus)의 포자는 산화성 물질이나 습열에 저항성을 나타내기 때문에 습열 멸균이나 증기화 과산화수소 멸균과정을 검증 및 확인하는 용도로 사용하고 있다.It is common to use chemical indicators as an auxiliary means. Chemical indicators have the advantage of being able to be visually identified immediately after completing the sterilization process, but it is impossible to strictly confirm whether sterilization has occurred. Therefore, sterilization must be confirmed using a biological indicator. Since the spores of Geobacillus stearothermophilus ( G.stearothermophilus ) are resistant to oxidizing substances or moist heat, they are used to verify and confirm moist heat sterilization or vaporized hydrogen peroxide sterilization processes.
이에, 본 발명자들은 증기화 과산화수소에 의한 멸균시에 이를 확인하기 위한 지오바실러스 스테아로서모필러스의 내생포자를 이용한 생물학적 지시제를 보다 개량하기 위한 방안을 고민하던 중, 보다 저항성이 있으며 균일한 특성을 가진 내생포자의 제조과정을 개발하고 이를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, while the present inventors were considering ways to further improve a biological indicator using endospores of Geobacillus stearothermophilus to confirm it during sterilization by vaporized hydrogen peroxide, they developed a more resistant and uniform characteristic. The present invention was completed by developing and confirming the manufacturing process of endospores.
본 발명의 목적은 균일하면서도 저항성 내생포자를 함유한 증기화 과산화수소에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide a biological indicator for confirming sterilization of a confined space by vaporized hydrogen peroxide containing uniform and resistant endospores and a method for producing the same.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 과산화수소를 첨가한 배지에서 내생포자를 생성하는 균주를 배양하고, 생성된 내생포자를 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 이용하여 저항성 내생포자만을 분리하는 것을 특징으로 하는 증기화 과산화수소(vaporized hydrogen peroxide)에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention involves culturing a strain that produces endospores in a medium supplemented with hydrogen peroxide and isolating only resistant endospores from the generated endospores using density gradient centrifugation. A biological indicator for confirming sterilization of confined spaces by vaporized hydrogen peroxide is provided.
또한, 본 발명은 1) 상기 저항성 내생포자를 제조한 후, 이를 섬유(fiber)나 스테인레스 스틸 디스크(stainless steel disk)에 넣고 건조하는 단계; 및 2) 상기 건조된 내생포자를 함유한 섬유나 스테인레스 스틸 디스크를 가스가 통과할 수 있는 포장지에 무균적으로 포장하는 단계;를 포함하는 생물학적 지시제의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the following steps: 1) preparing the resistant endospores, placing them on a fiber or a stainless steel disk and drying them; and 2) aseptically packaging the dried endospore-containing fiber or stainless steel disk in a packaging paper through which gas can pass.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 과산화수소를 첨가한 배지에서 내생포자를 생성하는 균주를 배양하고, 생성된 내생포자를 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 이용하여 저항성 내생포자만을 분리하는 것을 특징으로 하는 증기화 과산화수소(vaporized hydrogen peroxide)에 의한 밀폐 공간의 멸균 확인용 생물학적 지시제를 제공한다.The present invention provides a vaporized hydrogen peroxide (H2 peroxide) method, which involves culturing a strain producing endospores in a medium containing hydrogen peroxide and isolating only resistant endospores from the resulting endospores using density gradient centrifugation. Provides a biological indicator for confirming sterilization of confined spaces by vaporized hydrogen peroxide.
본 발명의 생물학적 지시제에 있어서, 상기 내생포자는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)s), 바실러스 서브틸리스 글로비지 (Bacillus subtilis globigii)), 클로스트리디움 스포로게네스 (Clostridium sporogenes), 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus), 바실러스 서큐란스 (Bacillus circulans), 바실러스 아트로파에우스 (Bacillus atrophaeus) 및 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus)로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상인 것이 바람직하고, 바실러스 아트로파에우스, 지오바실러스 스테아로서모필러스 또는 이의 조합인 것이 보다 바람직하다.In the biological indicator of the present invention, the endospores are Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis s), Bacillus subtilis globigii ( Bacillus subtilis globigii )), Clostridium sporogenes ( Clostridium sporogenes ), Bacillus It is preferable that it is at least one species selected from the group consisting of Bacillus cereus , Bacillus circulans , Bacillus atrophaeus and Geobacillus stearothermophilus , and Bacillus atro More preferably, it is Paeus, Geobacillus stearothermophilus, or a combination thereof.
또한, 본 발명의 생물학적 지시제에 있어서, 상기 저항성 내생포자는 높은 온도와 과산화수소를 함유한 배지에서 배양하여 제조된 것이 바람직하고, 상기 저항성 내생포자는 영양세포(vegetative cell), 일반 포자 및 기타 불순물로부터 순수하게 분리되는 것이 바람직하다.In addition, in the biological indicator of the present invention, the resistant endospores are preferably prepared by culturing in a medium containing high temperature and hydrogen peroxide, and the resistant endospores include vegetative cells, general spores, and other impurities. It is desirable to be separated purely from.
또한, 본 발명의 생물학적 지시제에 있어서, 상기 밀도구배 원심분리는 설탕, 글리세롤, 리노그리핀 및 퍼콜로 구성된 군중에서 선택된 1종 이상을 매체로 사용하는 것이 바람직하고, 상기 밀도구배 원심분리에 사용되는 매체는 50% 내지 100%의 연속 밀도 구배를 이용하는 것이 보다 바람직하다.In addition, in the biological indicator of the present invention, the density gradient centrifugation preferably uses at least one selected from the group consisting of sugar, glycerol, linogriffin, and percoll as a medium, and the density gradient centrifugation used in the density gradient centrifugation It is more desirable for the medium to use a continuous density gradient of 50% to 100%.
또한, 본 발명은 1) 상기 저항성 내생포자를 제조한 후, 이를 섬유(fiber)나 스테인레스 스틸 디스크(stainless steel disk)에 넣고 건조하는 단계; 및 2) 상기 건조된 내생포자를 함유한 섬유나 스테인레스 스틸 디스크를 가스가 통과할 수 있는 포장지에 무균적으로 포장하는 단계;를 포함하는 생물학적 지시제의 제조 방법을 제공한다.In addition, the present invention includes the following steps: 1) preparing the resistant endospores, placing them on a fiber or a stainless steel disk and drying them; and 2) aseptically packaging the dried endospore-containing fiber or stainless steel disk in a packaging paper through which gas can pass.
생물학적 지시제는 살아있는 생물체를 사용하여 멸균을 수행할 때 생물체가 사멸하면 멸균이 성공적으로 이루어졌고 생물체가 생존하면 불완전한 멸균이 되었다고 판별하는 용도로 사용한다. 멸균시에 멸균하고자 하는 공간 내에 생물학적 지시제를 벽면에 붙여놓고 멸균을 실시한 후 상기 지시제를 수거하여 포자의 생존 여부를 포자가 성장할 수 있는 배양액에서 배양하여 확인한다.Biological indicators are used to determine that when sterilization is performed using a living organism, if the organism dies, sterilization has been successful, and if the organism survives, sterilization has been incomplete. During sterilization, a biological indicator is attached to the wall in the space to be sterilized, sterilization is performed, the indicator is collected, and the survival of the spores is confirmed by culturing them in a culture medium in which the spores can grow.
지시제에 사용하는 생물체로는 미생물, 미생물포자, 내열성효소 등이 있다. 그 중에서 내생포자가 가장 많이 이용되고 있다. 내생포자는 생존력이 매우 강하므로 포자가 사멸하면 다른 일반적인 미생물이나 병원성 세균은 모두 사멸한다고 유추할 수 있다.Organisms used as indicators include microorganisms, microbial spores, and heat-resistant enzymes. Among them, endospores are the most widely used. Since endospores have very strong survival, it can be inferred that when the spores die, all other common microorganisms or pathogenic bacteria die.
본 발명은 특별히 저항성이 있는 내생포자의 생성 조건 및 포자형성과 관련하여 생산성 향상에 관한 내용을 포함한다.The present invention specifically includes information on improving productivity in relation to the production conditions and sporulation of resistant endospores.
생물학적 지시제에 사용하는 내생포자는 화학물질이나 열(heat) 등에 강한 저항성을 갖는데 이러한 포자를 생성하는 대포적인 균은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아트로파에우스 (Bacillus atrophaeus), 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus) 등이 주로 사용된다. 이러한 균으로부터 내생포자를 효율적으로 생산하기 위하여 포자생성(spolulation) 용 배지의 영양조건, pH, 배양 온도 등을 검토하여 저항성이 크면서도 포자의 수도 많이 생산하도록 하는 것이다. 아울러, 본 발명의 생물학적 지시제에 사용되는 내생포자는 배지 속에 과산화수소를 소량 첨가하여 내성을 갖도록 유도하여 저항성이 큰 포자를 형성한다.Endospores used in biological indicators have strong resistance to chemicals or heat, and the common bacteria that produce these spores are Bacillus subtilis , Bacillus atrophaeus , and Geo. Bacillus stearothermophilus ( Geobacillus stearothermophilus ), etc. are mainly used. In order to efficiently produce endospores from these bacteria, the nutritional conditions, pH, and culture temperature of the spore production (spolulation) medium are reviewed to ensure high resistance and a large number of spores. In addition, the endospores used in the biological indicator of the present invention are induced to become resistant by adding a small amount of hydrogen peroxide to the medium to form highly resistant spores.
생성시킨 포자에는 세포 부스러기(debis)나 영양 세포도 함께 섞여 있어서 그대로 사용하는데 문제가 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 세포 부스러기나 영양세포를 포자로부터 분리하는 것이 필요하다. 또한 포자도 저항성을 갖고 있는 포자와 그렇지 못한 포자를 분리하여 깨끗하고 저항성이 큰 포자만을 분리하여 지시제에 사용해야 생산시 마다 균일한(consistant) 제품을 생산할 수 있다.The generated spores are mixed with cell debris (debis) and vegetative cells, so there is a problem in using them as is. To solve this problem, it is necessary to separate cell debris or vegetative cells from spores. In addition, spores must be separated into resistant and non-resistant spores, and only clean, highly resistant spores must be separated and used as an indicator to produce a consistent product each time.
저항성포자로 부터 일반포자 그리고 세포 부스러기(debis), 영양세포를 분리하기 위하여 밀도구배 원심분리(density gradient centrifugation)를 사용한다. 밀도 구배용 매체로는 설탕(sucrose), 글리세롤(glycerol), 리노그라핀(rinograffin), 퍼콜(Percoll)을 사용한다. 매체의 농도는 50%에서 100%사이에서 사용한다. 이렇게 분리한 포자는 광학현미경이나 전자현미경으로 그 순도를 확인한다.Density gradient centrifugation is used to separate normal spores, cell debris, and vegetative cells from resistant spores. Sucrose, glycerol, rinograffin, and Percoll are used as media for density gradients. The concentration of the medium is between 50% and 100%. The purity of the spores separated in this way is checked using an optical microscope or an electron microscope.
이상과 같이, 본 발명의 생물학적 지시제는 특별히 밀폐된 공간 멸균에 사용하는 것으로 저항성이 강하고 균일성 있는 포자를 사용함으로써 생산 배치마다 균일성을 유지할 수 있는 장점이 있다.As described above, the biological indicator of the present invention is specifically used for sterilization of closed spaces and has the advantage of maintaining uniformity for each production batch by using highly resistant and uniform spores.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .
<실시예 1> 지오바실러스 스테아로써모필러스 내생포자의 제조<Example 1> Preparation of Geobacillus stearothermophilus endospores
높은 열저항성을 지닌 내생 포자를 형성할 수 있는 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Geobacillus sterarothermophilus) 표준균주(ATCC 12980)를 대상균으로 선정하여 Tryptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, MI, USA)에 접종한 후 55℃에서 48시간 동안 1차 배양하였다. Geobacillus sterarothermophilus standard strain (ATCC 12980), which can form endospores with high heat resistance, was selected as the target bacteria and inoculated into Tryptic soy broth (TSB, Difco, Detroit, MI, USA). Afterwards, primary culture was performed at 55°C for 48 hours.
상기 배양 후, 동일배지에 10μM 내지 10 mM까지 과산화수소를 첨가하고, 7일 동안 2차 배양하였다. 상기 배양액을 증류수로 충분히 세척한 후, 15 ml 플라스틱 튜브(Becton Diskinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 옮긴 후 3,000× g에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 따라내 제거한 후 15분 동안 100℃에서 배양하는 열충격(heat shock)으로 내생포자를 생성시켰다. 상대비 현미경으로 비굴절 내생포자를 관찰함으로써 내생포자가 생성된 것을 확인하였다. After the culture, hydrogen peroxide was added from 10 μM to 10 mM to the same medium, and secondary culture was performed for 7 days. The culture was thoroughly washed with distilled water, transferred to a 15 ml plastic tube (Becton Diskinson, Franklin Lakes, NJ, USA), and centrifuged at 3,000 × g for 15 minutes. After removing the supernatant, endospores were generated by heat shock incubation at 100°C for 15 minutes. It was confirmed that endospores were produced by observing non-refractive endospores under a relative contrast microscope.
<실시예 2> 내생포자의 분리<Example 2> Isolation of endospores
상기 실시예 1에서 얻은 내생포자를 반복된 원심분리(5,000× g, 10분)로 영양세포로부터 분리한 후, 이를 탈이온수로 4~5번 반복하여 세척하여 내생포자를 분리하였다. 상기 세척된 세포를 현미경으로 검사하여 95% 이상 포자를 함유하고 있음을 확인하였다.The endospores obtained in Example 1 were separated from the vegetative cells by repeated centrifugation (5,000 × g, 10 minutes), and then washed 4 to 5 times with deionized water to separate the endospores. The washed cells were examined under a microscope and confirmed to contain more than 95% spores.
<실시예 3> 밀도구배 원심분리에 의한 내생포자의 분리<Example 3> Isolation of endospores by density gradient centrifugation
상기 실시예 2에서 분리한 내생포자를 수크로스가 함유된 트리스 완충액(이하, ‘완충액’이라 칭함)에 재용해시키고 글리세롤 밀도구배 원심분리를 실시하였다. 글리세롤을 TS완충액으로 50(w/v)%에서 100%가 되도록 만들고 실시예 2의 내생포자 함유된 부유액을 글리세롤 gradient 위에 올려 놓고에 3,000× g에서 30분 동안 원심분리를 실시하였다. 원심분리후 아래쪽에 형성되어 있는 내생포자층(밀도 1.13 내지 1.15)을 분리한 다음, TS완충액으로 5회 세척하여 글리세롤을 제거하였다. 정제된 내생포자는 스펙트로포터미터의 흡광도를 이용하여 그 함량을 측정하고, 전자현미경으로 그 순도를 확인하였다.The endospores isolated in Example 2 were redissolved in Tris buffer containing sucrose (hereinafter referred to as ‘buffer’) and subjected to glycerol density gradient centrifugation. Glycerol was adjusted from 50 (w/v)% to 100% with TS buffer, and the suspension containing the endospores of Example 2 was placed on a glycerol gradient and centrifuged at 3,000 × g for 30 minutes. After centrifugation, the endospore layer (density 1.13 to 1.15) formed at the bottom was separated and washed five times with TS buffer to remove glycerol. The content of purified endospores was measured using the absorbance of a spectrophotometer, and the purity was confirmed using an electron microscope.
그리고 나서, 상기 정제된 내생포자를 스테인레스스틸 디스크에 넣고 건조시킨 후, 무균적으로 포장하였다.Then, the purified endospores were placed in a stainless steel disk, dried, and then aseptically packaged.
<실시예 4 및 실시예 5> 생물학적 지시제의 기능 확인<Example 4 and Example 5> Confirmation of function of biological indicator
상기 실시예 3에서 제조한 내생포자를 생물학적 지시제로 이용하여 그 기능을 확인하였다. The endospores prepared in Example 3 were used as biological indicators to confirm their function.
구체적으로, 동일한 규격의 밀폐 용기를 300 ppm 이상 농도의 증기화된 과산화수소로 15분 동안 멸균시켰다. 이때, 상기 용기의 한 쪽 벽면에 Tryptic soy agar 배지에 상기 실시예 3의 내생포자를 접종하였다(실시예 4). Specifically, a closed container of the same standard was sterilized with vaporized hydrogen peroxide at a concentration of 300 ppm or more for 15 minutes. At this time, the endospores of Example 3 were inoculated into Tryptic soy agar medium on one wall of the container (Example 4).
한편 300 ppm이상 농도 대신에 50 ppm 농도의 증기화된 과산화수소로 15분 동안 멸균시킨 점을 제외하고는 실시예 4와 동일하게 실험을 수행하였다(실시예 5). Meanwhile, the experiment was performed in the same manner as Example 4, except that it was sterilized for 15 minutes with vaporized hydrogen peroxide at a concentration of 50 ppm instead of at a concentration of 300 ppm or more (Example 5).
그리고 나서, 멸균 완료 후 실시예 4와 5에서 함께 배양된 내생포자를 Tryptic soy agar 배지에 접종한 후 59℃에서 48시간 동안 배양하였다. 그 결과, 실시예 5에서는 균주의 콜로니가 형성되어 지오바실러스 스테아로써모필러스가 영양세포로 증식됨을 확인될 수 있는 반면, 실시예 4의 균주에서는 전혀 콜로니가 형성되지 않았다. Then, after completion of sterilization, the endospores cultured together in Examples 4 and 5 were inoculated into Tryptic soy agar medium and cultured at 59°C for 48 hours. As a result, it was confirmed that in Example 5, colonies of the strain were formed and Geobacillus stearothermophilus proliferated into vegetative cells, whereas in the strain of Example 4, no colonies were formed at all.
이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.Above, the present invention has been described in detail with preferred embodiments, but the present invention is not limited to the above embodiments, and various modifications may be made by those skilled in the art within the scope of the technical idea of the present invention. This is possible.
Claims (8)
A strain that produces endospores is cultured in a medium containing hydrogen peroxide, and the resulting endospores are subjected to density gradient centrifugation to purify the endospores of the endospore layer formed in the lower layer of the centrifugation at a density of 1.13 to 1.15. A biological indicator for confirming sterilization of confined spaces by vaporized hydrogen peroxide, characterized in that it separates only spores.
The method of claim 1, wherein the endospores are Bacillus subtilis , Bacillus subtilis globigii , Clostridium sporogenes , and Bacillus cereus . , Bacillus circulans, Bacillus atrophaeus , and Geobacillus stearothermophilus .
The biological indicator according to claim 2, wherein the endospores are Bacillus atropaeus, Geobacillus stearothermophilus, or a combination thereof.
The biological indicator according to claim 1, wherein the isolated endospores are prepared by culturing in a medium containing hydrogen peroxide at high temperature.
The biological indicator according to claim 4, wherein the isolated endospores are separated purely from vegetative cells, general spores, and other impurities.
The biological indicator according to claim 1, wherein the density gradient centrifugation uses at least one selected from the group consisting of sugar, glycerol, linogriffin, and percoll as a medium.
The biological indicator according to claim 6, wherein the medium used for density gradient centrifugation uses a continuous density gradient of 50% to 100%.
2) 상기 건조된 내생포자를 함유한 섬유나 스테인레스 스틸 디스크를 가스가 통과할 수 있는 포장지에 무균적으로 포장하는 단계;를 포함하는 생물학적 지시제의 제조 방법.1) After preparing the resistant endospores of paragraph 1, placing them on a fiber or stainless steel disk and drying them; and
2) Aseptically packaging the dried endospore-containing fiber or stainless steel disk in a packaging paper through which gas can pass.
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| J Hosp Infect,80(1):41-5. (2011.12.01.) |
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