KR102632081B1

KR102632081B1 - 곰팡이 독소 억제용 조성물

Info

Publication number: KR102632081B1
Application number: KR1020210179565A
Authority: KR
Inventors: 윤성환; 김희경
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2024-01-31
Also published as: KR20230090632A

Abstract

본 발명은 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

곰팡이 독소 억제용 조성물{COMPOSITION INHIBITTING MYCOTOXIN}

본 발명은 곰팡이 독소 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물에 관한 것이다.

곰팡이독소(mycotoxin)는 작물의 농산물 및 식품 내 오염 곰팡이가 생산하는 저분자 독성 이차대사산물로서 사람이나 동물에 피부 독성, 소화·순환기관의 출혈, 설사 뿐만 아니라 암 발생에 이르기까지 여러 중독증(mycotoxicoses)을 일으킨다. 이러한 독성 곰팡이에 의한 작물의 병해 발생과 독소오염 농산물·식품 섭취로 인한 사람과 가축의 중독증 피해는 매년 전 세계적으로 꾸준히 발생하고 있다. 전 세계적으로 농식품산업 분야에서 곰팡이독소 오염에 따른 경제적 손실은 점점 커지고 있으며, 미국의 경우 연간 4억-16억불의 손실을 추정하고 있다.

대표적인 곰팡이독소로는 농식품의 저장 및 유통 단계에서 오염되는 Aspergillus 와 Penicillium속 곰팡이에 의해 생성되는 아플라톡신(aflatoxin), 오크라톡신(ochratoxin), 파툴린(patulin)과 농작물의 생육 과정부터 생성되어 농식품에 축적되는 Fusarium속 곰팡이 독소인 트라이코쎄신(trichothecenes), 제랄레논(zearalenone), 푸모니신(fumonisin) 등이 있다.

이 중 Fusarium 곰팡이 독소는 우리나라와 같은 온대지방의 곡물에서 자주 발생하기 때문에 국내 농식품 산업 및 국민보건위생의 관점에서 농식품 내 오염의 중요성이 점점 대두되고 있다. Fusarium 곰팡이독소를 생성하는 주요 종인 붉은곰팡이(Fusarium graminearum)는 전 세계적으로 분포하는 자낭균 곰팡이로서 현재 계통발생학적으로 최소 15 종 이상으로 구성된 거대한 종복합체 (Species complex)로 분류되어 있다.

붉은곰팡이의 대표적인 곰팡이독소 중 하나인 트라이코쎄신계 독소는 약 200여종이 알려져 있으며, 이중 데옥시니발레논 [deoxynivalenol (DON)], 니발레논 [nivalenol (NIV)], T-2 독소 등이 곡물에서 가장 흔히 발생한다. 이 독소는 주로 붉은곰팡이(F. graminearum) 뿐만 아니라 근연종인 F. culmorum, F. poae, F. crookwellense, F. sporotrichioides 등에 의해 각종 맥류, 옥수수 등에서 주로 생성되며, 사람과 가축에 피부독성, 소화기관 및 순환기관에서의 출혈, 설사, 구토, 신경장애, 사료섭취 거부 등을 일으킨다.

지금까지 곡물 내 트라이코쎄신 독소 오염의 저감화 전략으로 미생물에 의한 독소 분해, 열처리, 세척, 독소흡착제/분해제 처리 등이 시도되었으나, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 살균제 살포를 통한 작물 내 붉은곰팡이의 생육저해와 이에 따른 곰팡이독소 생성 억제이다.

하지만 이 방법은 붉은곰팡이 집단에 선택압으로 작용하여 살균제 내성 곰팡이의 출현을 유도하여 살균제의 항균 효과를 감소시킬 뿐 아니라 살균제의 과다 살포에 따른 생태계 피해를 초래하고 있다. 이에 따라 붉은곰팡이의 생육은 저해하지 않은채 독소생성능만 특이적으로 감소시킬 수 있는 천연물의 탐색이 새로운 대안으로 대두되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물을 제공한다.

하나의 예에서, 상기 꾸지뽕 추출물은 클로로포름 추출물일 수 있고, 하나의 바람직한 예에서, 상기 꾸지뽕 추출물은 화학식 1의 물질일 수 있다.

<화학식 1>

본 발명은 상기 꾸지뽕 추출물을 포함하는 조성물을 포함하는 식품 보존제를 제공한다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물은 곰팡이의 생육은 저해하지 않으면서 독소 생성능만 특이적으로 감소시킬 수 있어, 살균제 내성 곰팡이의 출현을 방지하면서 독소 억제로 인한 항균 효과를 유지할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 FLTRI6 reporter 균주를 활용한 DON 생합성 억제 식물추출물의 탐색 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 실험예 1의 주요 식물 추출물의 DON 생합성 억제 정도를 나타내는 그래프이다.
도 3은 꾸지뽕 추출물의 희석 정도에 따른 DON 생합성 억제 정도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 꾸지뽕 추출물의 희석 정도에 따른 균사 건물량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 꾸지뽕 추출 용매별 DON 생합성 억제 정도를 나타내는 그래프이다.
도 6은 꾸지뽕 T2-2 분획물의 EI-MS 분석 결과 그래프이다.

꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata Bureau)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하며, 한국, 일본, 중국 등 동아시아 전역에 널리 분포되어있는 낙엽 소교목 또는 관목이다. 꾸지뽕나무 잎과 열매는 식품원료로 사용되며, 잎, 열매를 포함한 줄기 등 다른 부위는 약용으로도 사용되고 있다. 꾸지뽕나무 추출물은 항염증, 항고혈압, 항당뇨, 항산화, 항미생물활성 등이 알려져 있지만, 현재까지 독성물질 저해에 대한 효능은 보고된 바가 없다.

본 발명에 있어서 용어 "꾸지뽕"은 꾸지뽕 나무를 의미하는 것으로, "꾸지뽕"과 "꾸지뽕나무"는 동일한 의미인 것으로 해석한다.

본 발명에 있어서 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 모두 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매일 수 있다.

본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, 디메틸 포름아미드(dimethyl formamide; DMFO) 및 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 추출용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액인 것일 수 있으며, 예를 들어, 50%(v/v)의 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서 비극성 용매는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매 및/또는 분획용매는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.

따라서, 본 발명의 꾸지뽕 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가 적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 꾸지뽕 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과 막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 꾸지뽕 추출물에 포함되는 것이다.

본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 꾸지뽕 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물에 포함된 꾸지뽕 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

붉은곰팡이 DON(deoxynivalenol) 생합성 유전자 발현 reporter 균주

본 연구에서 사용한 붉은곰팡이 FLTRI6 균주는 미국 Kansas 주립대 Robert L. Bowden 박사로부터 분양받은 PH-1을 기반으로 본 연구진이 제작하였다 [Kim H-K et al. 2013. PLoS ONE 8(7): e68441. doi:10.1371/journal.pone.0068441]. PH-1 균주는 붉은곰팡이 집단 (Fusarium gramineraum species complex) 중 F. graminearum 종에 속하며, 곰팡이독소인 DON과 제랄레논을 고생산하는 균주로서 유성분화능력과 기주식물에 대한 병원성이 높다. PH-1 균주의 DON 생합성에 필수적인 Tri 유전자군에 존재하는 경로 특이 전사조절인자인 Tri6 유전자의 promoter 추정부위(약 1.8 kb)와 반딧불이 루시페라아제 (luciferase) 유전자(FLUC)의 Open Reading Frame(ORF)를 single-joint PCR 방법으로 융합하여 곰팡이 형질전환용 벡터에 삽입한 후 PH-1 균주의 유전체에 삽입시켜 새로운 형질전환체 FLTRI6 균주를 제작하였다. Tri6 유전자는 “붉은곰팡이 유전체 데이터베이스 (http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/MultiHome.html)에서 'FGSG_03536.3'의 ID 로 검색할 수 있다. 이와 같은 luciferase reporter 균주인 FLTRI6를 활용하면 붉은곰팡이 내 DON 독소 생성 여부를 기존의 화학적 기기분석 방법이 아닌 DON 생합성 유전자의 전사 수준에서 luciferase 활성도 측정을 통해 빠르고 간편하게 정량적으로 확인할 수 있다.

<실험예 1>

상기 방식으로 확보한 FLTRI6 균주의 포자(2.5×10⁵/㎖)를 DON 생성 유도 조건인 Agmatine 첨가 액체배지(20ml)에 접종한 후 일주일 동안 정치배양 후 균 배양체로부터 cell free lysate 추출 후 luminometer를 이용하여 luminescence를 측정하였다. 이때 FLTRI6 균주의 포자 접종 전 Agmatine 액체배지에 다양한 식물의 메탄올 추출물(200㎕)을 첨가하여 식물 추출물에 의한 FLTRI6 균주 내 DON 생합성 활성도 억제 효과를 검정하였다.

FLTRI6 검정균주를 활용하여 자생식물의 메탄올 추출물 130종의 효능을 탐색한 결과, 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata)을 포함한 여러 식물추출물의 억제효과가 확인되었다. 꾸지뽕나무 잎 추출물이 무처리구에 비교하여 12배 이상, 제주조릿대 잎줄기와 조개풀, 도깨비부채 지상부, 까마귀머루 잎·줄기, 개쑥부쟁이, 왕고들빼지 추출물이 5배 정도 억제 효과를 보였다. 주요 식물추출물에 의한 DON 독소 생합성 유전자 발현 억제 효과를 도 2와 같이 나타내었다.

<실험예 2>

실험예 1에서 사용한 꾸지뽕 추출물 원액, 1/10 희석액, 1/100 희석액을 각각 실험예 1과 같은 방법으로 처리하여 luminescence 측정 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 꾸지뽕 추출물의 희석 정도가 높을수록 DON 발현 억제 효과가 떨어지는 것을 확인할 수 있다. 따라서 꾸지뽕 내 존재하는 특정 유효성분에 의해 FLTRI6 균주의 Tri6 유전자 발현이 억제되는 것으로 추정할 수 있다.

<실험예 3>

꾸지뽕 추출물 첨가 배지에서 배양한 FLTRI6 균주의 균체를 동결건조하여 무게를 측정한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참조하면, 추출물 희석 정도와 균사 성장과는 큰 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있다. 이를 통해, 꾸지뽕 추출물은 붉은곰팡이 FLTRI6 균주의 균사 생육에는 큰 영향을 끼치지 않고 DON 생합성 조절 유전자인 Tri6 유전자 발현만을 특이적으로 억제하는 것을 확인할 수 있다.

<실험예 4>

꾸지뽕 추출물의 다양한 유기용매(n-hexane, ethylacetate, chroloform, buthyl alcohol, water, methanol) 분획을 화보하여 각 분획의 Tri6 유전자 발현 억제 효과를 도 5에 나타내었다.

도 5를 참조하면, chloroform을 용매로 사용한 추출물 분획의 억제 효과(약 48배)가 메탄올(약 20배) 추출물을 포함한 다른 유기용매 추출물보다 가장 우수한 것을 확인할 수 있다.

<실험예 5>

상기 실험예 4에서 확인된 꾸지뽕의 chloroform(CHCl₃) 추출물을 prep-FPLC를 활용하여 총 9종의 분획물(F1 ~ F9)로 추가 분획한 후, DON 생합성 억제효과를 검정한 결과를 <표 1>에 나타내었다.

표 1을 참조하면, F6 분획물의 억제 효과가 대조구에 비해 9.2배로 가장 높게 나타났다. 또한, F6 분획물의 농도를 1/10로 감소시킨 경우 억제율도 대략 1/10 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있다.

분획	평균 luciferase 활성도	억제율
FLTRI6	79,403	-
F1	86,149	0.9
F2	91,449	0.9
F3	81,806	1.0
F4	100,527	0.8
F5	93,081	0.9
F6	8,591	9.2
F7	48,288	1.6
F8	111,316	0.7
F9	95,844	0.8
F6_1/10	50,099	1.6

<실험예 6>

상기 F6 분획물을 추가로 분획하여 총 5종의 분획물(T1 ~ T5)에 의한 DON 생합성 억제 효과를 검정한 결과 T2 분획의 억제율이 우수하게 나타났다. Prep-FPLC 분석 결과, T2 분획에 두 종류(T2-1 및 T2-2)의 화합물이 존재함을 확인하였으며, 그 중 T2-2 분획의 억제율이 우수하였다(표 2).

분획	평균 luciferase 활성도	억제율
FLTRI6	32,729	-
T1	32,846	1.0
T2-1	4,185	7.8
T2-2	1,410	23.2
T3	28,361	1.2

<실험예 7>

상기 T2-2 분획에 존재하는 화합물의 화학 구조 동정을 위하여 전자충돌 질량분석법(EI-MS)을 수행하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 화합물 Mass spectrum의 데이터베이스 검색을 통해 화합물이 분자량 438.255의 화학식 1의 물질(Iron, (2,2'-bipyridine-N,N')carbonyl[(2,3,4,5-.eta.)-diethyl 2,4-hexadienedioate])인 것으로 동정되었다.

<화학식 1>

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 도면을 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 꾸지뽕 추출물을 유효성분으로 포함하는 곰팡이 독소 억제용 조성물을 이용하면, 살균제 내성을 가지지 않으면서 독소를 억제할 수 있어, 곡물이나 식품의 보존제로 사용될 수 있다.

Claims

삭제
삭제
화학식 1의 물질인 것을 특징으로 하는 곰팡이 독소 억제용 조성물.
<화학식 1>
제3항의 조성물을 포함하는 식품 보존제.