KR102631862B1 - Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay - Google Patents
Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay Download PDFInfo
- Publication number
- KR102631862B1 KR102631862B1 KR1020210183728A KR20210183728A KR102631862B1 KR 102631862 B1 KR102631862 B1 KR 102631862B1 KR 1020210183728 A KR1020210183728 A KR 1020210183728A KR 20210183728 A KR20210183728 A KR 20210183728A KR 102631862 B1 KR102631862 B1 KR 102631862B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- sample
- pad
- development
- strip
- medium
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 238000003556 assay Methods 0.000 title 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 title 1
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 78
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims abstract description 36
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims description 19
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 16
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 15
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 7
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims description 7
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 116
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 59
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 24
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 19
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 19
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 18
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 18
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 15
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 15
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 8
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 7
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 6
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 3
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- -1 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBVSIAHUTXHQTD-UHFFFAOYSA-N 2-n-(4-bromophenyl)-1,3,5-triazine-2,4-diamine Chemical compound NC1=NC=NC(NC=2C=CC(Br)=CC=2)=N1 UBVSIAHUTXHQTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLDHEUZGFKACJH-ZRUFZDNISA-K Amaranth Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C12=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(O)=C1\N=N\C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C12 WLDHEUZGFKACJH-ZRUFZDNISA-K 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000037847 SARS-CoV-2-infection Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003570 air Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- UQWIHFJXDRNUDP-UHFFFAOYSA-N chembl1206007 Chemical compound COC1=CC(S(O)(=O)=O)=C(C)C=C1N=NC1=C(O)C=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=C12 UQWIHFJXDRNUDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000012732 erythrosine Nutrition 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000576 food coloring agent Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 239000004054 semiconductor nanocrystal Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004154 testing of material Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- UJMBCXLDXJUMFB-UHFFFAOYSA-K trisodium;5-oxo-1-(4-sulfonatophenyl)-4-[(4-sulfonatophenyl)diazenyl]-4h-pyrazole-3-carboxylate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=NN(C=2C=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)C(=O)C1N=NC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 UJMBCXLDXJUMFB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
- G01N33/54386—Analytical elements
- G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
- G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
- B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
- B01L3/5023—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures with a sample being transported to, and subsequently stored in an absorbent for analysis
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L9/00—Supporting devices; Holding devices
- B01L9/52—Supports specially adapted for flat sample carriers, e.g. for plates, slides, chips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
- B01L2300/069—Absorbents; Gels to retain a fluid
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L2300/00—Additional constructional details
- B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
- B01L2300/0887—Laminated structure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
본원은 면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상을 위한 방법을 개시한다. 본원에 따른 방법은 검출이 필요한 시료 및 크로마토그래피 전개를 위한 완충액을 별도의 위치에서 순차적으로 적용하여, 시료에 포함된 표적 분석물의 검출감도 향상된다. 본원에 따른 방법은 항원 항체 결합 기반의 인비트로 검출에서 위음성을 크게 낮출 수 있다.The present application discloses a method for improving the sensitivity of immunochromatographic tests. In the method according to the present application, the sample requiring detection and the buffer for chromatography development are sequentially applied at separate locations, thereby improving the detection sensitivity of the target analyte contained in the sample. The method according to the present application can significantly reduce false negatives in in vitro detection based on antigen-antibody binding.
Description
본원 면역크로마토그래피 방식의 생물학적 물질 검사의 감도를 향상시킬 수 있는 기술과 관련된 것이다.It is related to a technology that can improve the sensitivity of biological material testing using immunochromatography.
일반적으로 측방 유동형 (lateral flow) 또는 딥스틱 형태 등으로 구현되는 면역 크로마토그래피 기반의 진단 시약은 1980년대에 처음 개발된 이래, 사람 및 동물의 감염병 진단, 식품 검사, 환경 시료 분석 등의 광범위한 분야에서 널리 활용되고 있다 (Wong & Tse, Lateral Flow Immunoassay, 2009). 가장 잘 알려진 예는 임신 진단 시약이다. 이러한 시약은 간편하고 휴대성이 있다. 뇨를 샘플패드에 적시면 5분 이내에 결과 창을 통해 검사선과 대조선의 색띠를 보고 결과를 판정할 수 있다. 또한 감염병 진단에서는 혈액, 혈청, 혈장, 비인두, 비강 검체와 같은 시료가 사용된다. Immunochromatography-based diagnostic reagents, generally implemented in lateral flow or dipstick form, were first developed in the 1980s and have been used in a wide range of fields such as diagnosis of infectious diseases in humans and animals, food testing, and environmental sample analysis. It is widely used (Wong & Tse, Lateral Flow Immunoassay, 2009). The best-known example is pregnancy diagnostic reagents. These reagents are convenient and portable. When urine is wetted on the sample pad, the results can be judged by looking at the color bands of the test and control lines through the result window within 5 minutes. Additionally, samples such as blood, serum, plasma, nasopharyngeal, and nasal samples are used in the diagnosis of infectious diseases.
이러한 면역 크로마토그래피 기술은 항원-항체 반응 원리에 근거를 두고 있다. 예를 들면 검출자 항체는 골드입자 (20-40nm) 또는 라텍스 입자 (100~ 300nm)에 컨쥬게이션되고, 분석물질의 종류에 따라 항체 또는 항원은 니트로셀룰로오스 멤브레인 (10 ~ 15um 공극)에 일정한 양으로 분주 되어 고정된다. 분석물질은 생물학적 시료 내에 있는 병원체의 단백질 (예: 코로나-19 유래의 단백질 또는 항원) 또는 병원체 감염 후 체내 면역반응으로 생성된 항체 (IgM, IgA, IgG 등)일 수 있다. This immunochromatography technique is based on the principle of antigen-antibody reaction. For example, the detector antibody is conjugated to gold particles (20-40nm) or latex particles (100-300nm), and depending on the type of analyte, the antibody or antigen is conjugated to a nitrocellulose membrane (10-15um pores) in a certain amount. It is busy and fixed. The analyte may be a protein of a pathogen in a biological sample (e.g., protein or antigen derived from COVID-19) or an antibody (IgM, IgA, IgG, etc.) produced by the body's immune response after infection with a pathogen.
최근 COVID-19 감염증의 원인인 SARS-CoV-2 바이러스는 핵산 기반의 PCR 검사로 검출되고 있다. 반면 면역 크로마토그래피 방식의 항원-항체 기반의 검사는 신속성 및 편리성에도 불구하고 PCR 검사와 비교하여 상대적으로 낮은 감도로 인한 위음성의 문제로 사용이 제한적이다. Recently, the SARS-CoV-2 virus, the cause of COVID-19 infection, has been detected using nucleic acid-based PCR tests. On the other hand, despite the speed and convenience of immunochromatography-based antigen-antibody testing, its use is limited due to the problem of false negatives due to relatively low sensitivity compared to PCR testing.
따라서 이러한 면역 크로마토그래피 기반의 검사의 감도를 높이는 기술의 개발이 필요하다. Therefore, there is a need to develop technology to increase the sensitivity of these immunochromatography-based tests.
본원은 항원-항체 반응 기반의 면역크로마토그래피를 이용한 시료 중의 표적 분석물 검출의 감도를 향상시키는 방법을 제공하고자 한다.The present application seeks to provide a method for improving the sensitivity of detection of target analytes in samples using immunochromatography based on antigen-antibody reaction.
한 양태에서 본원은 시료 중의 표적 분석물을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 방법에서, 상기 표적 분석물의 검출 감도를 향상시키는 방법으로, 상기 방법은 기존의 방법인 시료와 전개 완충액을 혼합하여 샘플 패드에 적하하는 대신에, 시료와 전개 완충액을 혼합하지 않고, 각각 전개용 매질과 샘플 패드에 순차적으로 적하하는 것을 특징으로 한다. In one aspect, the present application is a method of improving the detection sensitivity of the target analyte in an immunochromatography method for detecting a target analyte in a sample, which is a conventional method of mixing a sample and a development buffer and dropping them on a sample pad. Instead, the sample and development buffer are not mixed, but are sequentially added dropwise to the development medium and sample pad, respectively.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 면역 크로마토그래피에 사용되는 검사 스트립을 제공하는 단계로, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하며, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자, 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자가 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 부착되어 있고, 상기 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질에 상기 시료를 적하하는 단계; 및 상기 시료 적하 후에, 상기 샘플패드에, 상기 스트립에서의 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함한다. In one embodiment, the method according to the present disclosure includes providing a test strip for use in immunochromatography, wherein the strip includes a developing medium, a sample pad, and an absorbent pad, and both ends of the developing medium are each of the above It is in contact with one end of the sample pad and one end of the absorption pad, so that the development medium is located between the sample pad and the absorption pad, and the development medium is capable of specific binding to the target analyte. A capturer and a control material are attached in order at regular intervals, the capturer is attached in a direction close to the sample pad, and the sample is dropped into a development medium in front of the captor attachment site; And after dropping the sample, dropping a development buffer for chromatography development on the strip onto the sample pad.
일 구현예에서 본원에 따른 방법에서 상기 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다. In one embodiment, in the method according to the present disclosure, the strip further comprises a conjugation pad, the conjugation pad being positioned between the sample pad and the deployment medium.
다른 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 시료가 적하되는 상기 전개용 매질 상의 위치는 색소로 표시될 수 있으며, 상기 색소는 상기 크로마토그래피 전개와 함께 이동한다. In another embodiment, the location on the developing medium where the sample used in the method of the present application is dropped may be indicated by a dye, and the dye moves along with the chromatographic development.
다른 구현예에서 본원의 방법에 사용되는 스트립은 지지대를 추가로 포함하며, 상기 샘플 패드, 상기 전개용 매질 및 상기 흡수 패드는 상기 지지대 상에 위치한다. In another embodiment, the strip used in the method herein further comprises a support, wherein the sample pad, the spreading medium and the absorbent pad are positioned on the support.
다른 양태에서 본원은 본원에 개시된 방법에 사용되는 스트립을 제공하며, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소이다. In another aspect, the disclosure provides a strip for use in the methods disclosed herein, the strip comprising a developing medium, a sample pad, and an absorbent pad, wherein both ends of the developing medium each have one end of the sample pad and It is in contact with one end of the absorption pad, and the development medium is located between the sample pad and the absorption pad, and the development medium contains a certain number of capturers and control substances capable of specific binding to the target analyte. They are attached in order at intervals, the captor is located in a direction close to the sample pad, and includes a sample dropping site marked with a dye in front of the captor attachment site on the development medium, and the dye is used for chromatographic development. It is a water-soluble pigment that can move in any direction.
일 구현예에서 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다. In one embodiment, the strip on which the method according to the present disclosure is used further comprises a conjugation pad, the conjugation pad being positioned between the sample pad and the development medium.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 스트립을 수용하기 위한 하우징으로, 상기 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함하여 구성된다. In another aspect, the present disclosure also provides a housing for accommodating a strip according to the disclosure, the housing comprising a first window for dropping a buffer solution onto a sample pad of the strip, a second window for dropping a sample, and capture and control substances. and a third window for detecting a reaction at the attachment site.
본원에 따른 면역 크로마토그래피 검사의 감도 향상 방법은 검출이 필요한 시료 및 크로마토그래피 전개를 위한 완충액을 별도의 위치에서 순차적으로 적용하여, 시료에 포함된 표적 분석물의 검출 감도가 향상된다. 본원에 따른 방법은 항원 항체 결합 기반의 인비트로 검출의 가장 큰 단점인 위음성을 크게 낮출 수 있다.In the method for improving the sensitivity of immunochromatographic tests according to the present application, the sample requiring detection and the buffer for chromatographic development are sequentially applied at separate locations, thereby improving the detection sensitivity of the target analyte contained in the sample. The method according to the present application can greatly reduce false negatives, which is the biggest disadvantage of in vitro detection based on antigen-antibody binding.
도 1a는 본원의 일 구현예에 따른 방법의 면역크로마토그래피에 사용될 수 있는 스트립의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 본원의 방법에 따른 전개 완충액 및 시료 적하 부위를 표시하였다.
도 1b는 본원의 일 구현예에 따른 방법의 면역크로마토그래피에 사용될 수 있는 스트립의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 여기에 기존 방법에 따른 전개 완충액 및 시료 적하 부위를 표시하였다.
도 2는 본원에 따른 시료 적하 방법 (①)과 기존의 적하 방법(②)을 적용한 면역크로마토그래피로 분석물로서 일본 뇌염바이러스 IgM항체를 검사한 결과이다. 저농도의 분석물은 본원에 따른 적하 방법은 양성인 반면, 기존의 방법은 음성으로 검출되었다. 이는 기존 방법에 의한 결과는 상대적으로 낮은 감도에 의한 위음성임을 나타낸다.
도 3은 시료 적하 부위가 색소로 표시된 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스크립의 일 구현예이다.
도 4는 본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 스트립을 수용할 수 있는 하우징의 일 구현예로서, 상기 하우징은 크로마토그래피 전개용 완충액 적하를 위한 창 및 시료 적하용 창이 별도로 구비되어 있다.
도 5는 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립의 구체적 예를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본원에 따른 방법이 사용될 수 있는 딥스틱 형태의 스트립 및 사용예를 도식적으로 나타낸 것이다.Figure 1a schematically shows the structure of a strip that can be used in immunochromatography of the method according to an embodiment of the present application, and indicates the development buffer and sample loading site according to the method of the present application.
Figure 1b schematically shows the structure of a strip that can be used for immunochromatography in a method according to an embodiment of the present application, where the development buffer and sample loading site according to the existing method are indicated.
Figure 2 shows the results of testing Japanese encephalitis virus IgM antibody as an analyte by immunochromatography using the sample dropping method (①) according to the present invention and the existing dropping method (②). Low-concentration analytes were detected as positive by the dropping method according to the present application, whereas they were detected as negative by the existing method. This indicates that the results from the existing method are false negatives due to relatively low sensitivity.
Figure 3 is an embodiment of a scrip that can be used in the method according to the present disclosure in which the sample loading site is marked with a dye.
Figure 4 is an embodiment of a housing that can accommodate a strip that can be used in the method according to the present application, and the housing is separately provided with a window for dropping a buffer for chromatography development and a window for dropping a sample.
Figure 5 schematically shows a specific example of a strip in which the method according to the invention is used.
Figure 6 schematically shows a dipstick-shaped strip and an example of use in which the method according to the present disclosure can be used.
본원은 시료 중 특정 표적 분석물의 검출을 위한 크로마토그래피 분석에 있어서, 시료 적하 (loading) 부위, 전개 완충액과의 혼합 여부 및 적하 시기를 기존과 달리함으로써 특정 표적 분석물의 검출 감도를 향상시킬 수 있다는 발견에 근거한 것이다. The present invention discovered that in chromatography analysis for the detection of a specific target analyte in a sample, the detection sensitivity of a specific target analyte can be improved by changing the sample loading site, mixing with the development buffer, and loading time from the existing method. It is based on.
이에 한 양태에서 본원은 시료 중의 표적 분석물을 검출하기 위한 면역 크로마토그래피 방법에서 상기 표적 분석물의 검출 감도를 향상시키는 방법에 관한 것이다. In one aspect, the present application relates to a method for improving the detection sensitivity of a target analyte in an immunochromatography method for detecting the target analyte in a sample.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 면역 크로마토그래피에 사용되는 측방유동 분석용 스트립을 제공하는 단계; 상기 스트립의 제 1 위치에 분석이 필요한 표적 분석물을 포함하는 시료를 적하하는 단계; 및 상기 시료 적하 후에, 상기 스트립의 제 2 위치에 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함하며, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 제 1 위치는 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 앞에 일정 간격을 두고 위치하며, 상기 제 2 위치는 샘플 패드 상에 위치한다. In one embodiment, the method according to the present disclosure includes providing a strip for lateral flow analysis used in immunochromatography; Dropping a sample containing a target analyte requiring analysis onto a first position of the strip; and after dropping the sample, dropping a development buffer for chromatographic development into a second position of the strip, wherein the strip includes a development medium, a sample pad, and an absorbent pad, and the amount of the development medium is The ends are in contact with one end of the sample pad and one end of the absorption pad, respectively, so that the development medium is located between the sample pad and the absorption pad, and the development medium contains the target analyte and a specific A capturer and a control material capable of binding are attached in order at regular intervals, the capturer is located in a direction close to the sample pad, and the first position is at a certain distance in front of the capturer on the development medium. and the second position is located on the sample pad.
본원에서 사용된 용어 "시료" 또는 검체는 표적 분석물을 포함하는 분석대상 물질을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 시료는 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 있는 물질, 예를 들면 각 종 고형 조직/세포, 혈액, 타액, 소변, 땀, 체모 또는 이로부터 추출된 물질 등을 포함하며, 또는 주위 환경(예로, 대기, 토양, 물 등)으로부터 수집된 물질 등 다양한 물질을 포함한다. 예로는 이로 제한하는 것은 아니나, 혈액, 뇨, 타액 등을 포함하며, 혈액은 전혈, 혈장, 혈청이나 소정의 처리(예를 들면 응고 방지)가 이루어진 혈액, 혈장, 혈청 등이 이에 해당될 수 있다. 조직 또는 세포의 추출물은 예를 들면 탄수화물, 지질, 핵산, 단백질 등으로부터 선택된다. 상기 분석대상물은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니나, 각 종 질환과 연관된 마커, 예를 들면 바이러스 병원체 (HIV, HCV, SARS-CoV-2, dengue virus, Japanese encephalitis virus 등)의 단백질 또는 이에 대응하여 생성된 사람 항체, 염증 질환의 마커 (CRP, PCT), 종양표지자 (PSA, AFP CA-125 등), 호르몬 (Cortisol, progesterone 등) 등을 포함한다. As used herein, the term "sample" or sample refers to an analyte material containing a target analyte, and the sample that can be used in the present invention is a liquid or liquid-like fluid material, such as various types of solid tissues/cells, It includes blood, saliva, urine, sweat, body hair or substances extracted therefrom, or various substances such as substances collected from the surrounding environment (e.g., air, soil, water, etc.). Examples include, but are not limited to, blood, urine, saliva, etc., and blood may include whole blood, plasma, serum, or blood that has undergone a predetermined treatment (e.g., anti-coagulation). . The extract of tissue or cells is selected from, for example, carbohydrates, lipids, nucleic acids, proteins, etc. The analyte is, for example, but not limited to, markers associated with various diseases, for example, proteins of viral pathogens (HIV, HCV, SARS-CoV-2, dengue virus, Japanese encephalitis virus, etc.), or proteins corresponding thereto. It includes generated human antibodies, markers of inflammatory diseases (CRP, PCT), tumor markers (PSA, AFP CA-125, etc.), hormones (Cortisol, progesterone, etc.).
본원에서 사용된 용어 "분석물"은 시료 중의 검출 또는 분석 대상 화합물로, 표적 분석물 또는 표적 이라고도 하며 단백질 또는 핵산을 포함하는 것이다. 본원에서 단백질은 폴리펩타이드 및 펩타이드를 포함하는 것이며, 기능적으로는 항체, 항원, 병원성 바이러스 또는 박테리아 유래의 특정 단백질을 포함한다. 일 구현예에서는 SARS-CoV-2 감염으로 인한 항체 또는 SARS-CoV-2 유래의 스파이크와 같은 단백질을 포함한다. 또한 본원에서 용어 "핵산"은 지놈 DNA, cDNA 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 화학합성 DNA 및 RNA를 포함한다. As used herein, the term “analyte” refers to a compound to be detected or analyzed in a sample, and is also referred to as a target analyte or target and includes a protein or nucleic acid. Proteins herein include polypeptides and peptides, and functionally include antibodies, antigens, and specific proteins derived from pathogenic viruses or bacteria. In one embodiment, it includes antibodies resulting from SARS-CoV-2 infection or proteins such as spikes derived from SARS-CoV-2. Additionally, the term “nucleic acid” herein includes chemically synthesized DNA and RNA, including genomic DNA, cDNA, and oligonucleotides.
본원에서 시약은 상술한 분석물의 검출 및 분석에 적합한 물질로, 구체적 분석물에 따라 상이하며, 예를 들면, 상기 시약은 상기 체성분 내의 다양한 물질 예를 들면 항원 등과 반응을 일으키는 소정의 항체, 또는 크로마토그래피의 전개를 위한 완충액 등일 수 있고, 이에 한정하지 않는다. In this application, the reagent is a material suitable for the detection and analysis of the above-described analyte, and differs depending on the specific analyte. For example, the reagent is a predetermined antibody or chromatography that reacts with various substances in the body composition, such as antigens, etc. It may be a buffer solution for development of graphics, but is not limited thereto.
면역 크로마토그래피는 시료 중의 표적 분석물을 항원/항체 반응에 기반한 크로마토그래피로 검출하는 것으로, 크로마토그래피의 방식에 따라 측방유동 분석을 포함한다. 측방유동 분석은 시료에 포함된 표적 분석물, 예를 들면 특정 단백질 또는 핵산을 정량 또는 정성적으로 검출하는 방법으로, 예를 들면 일정한 서열의 핵산에 교잡하는 올리고뉴클레오타이드 또는 특정 항체 및/또는 항원이 특정 위치에 결합되어 있는 나이트로셀룰로스 막(전개용 매질)을 포함하는 스트립에서 크로마토그래피 방법으로 시료를 이동시켜 서열 특이적 교잡반응 또는 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 표적 분석물을 검출하는 방법이다. 예를 들면 대한민국 공개 특허공보 제2003-0065341호, 제2011-0007699호, 제2011-0127386호, 및 등록공보 제1149357호 등에 기재된 것을 참조할 수 있다. Immunochromatography is the detection of target analytes in a sample by chromatography based on antigen/antibody reaction, and includes lateral flow analysis depending on the chromatographic method. Lateral flow analysis is a method of quantitatively or qualitatively detecting target analytes, such as specific proteins or nucleic acids, contained in a sample. For example, oligonucleotides or specific antibodies and/or antigens hybridizing to nucleic acids of a certain sequence. This is a method of detecting target analytes in the sample through sequence-specific hybridization or antigen-antibody reaction by moving the sample through chromatography on a strip containing a nitrocellulose membrane (development medium) bound to a specific position. For example, reference may be made to those described in Korean Patent Publication Nos. 2003-0065341, 2011-0007699, 2011-0127386, and Registration Publication No. 1149357.
예를 들면 일 구현예에서 본원의 방법이 적용될 수 있는 측방유동 스트립은 일 구현예에서 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 액체의 흐름이 형성될 수 있도록 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 포획자는 샘플패드에 가까이 위치한다. 스트립에 포함된 전개용 매질은 그 자체가 지지대가 될 수 있다. For example, in one embodiment, a lateral flow strip to which the method of the present disclosure can be applied includes a spreading medium, a sample pad, and an absorbent pad, and the spreading medium is between the sample pad and the absorbent pad. is located, both ends of the development medium are in contact with one end of the absorbent pad and one end of the sample pad, respectively, so that a flow of liquid can be formed, and the capture and control materials are placed at regular intervals in the development medium. are attached in order, and the capturer is located close to the sample pad. The deployment medium included in the strip can itself be a support.
예를 들면 다른 구현예에서 본원의 방법이 적용될 수 있는 측방유동 스트립은 지지대, 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 지지대는 상기 전개용 매질, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드를 지지하며, 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드는 서로 겹치지 않도록 상기 지지대의 양 단부에 각 각 위치되어 있으며, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 흡수 패드의 한 단부 및 상기 샘플 패드의 한 단부와 액체 흐름이 형성될 수 있도록 접해 있으며, 상기 전개용 매질에는 포획자 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 포획자는 샘플패드에 가까이 위치한다. For example, in another embodiment, a lateral flow strip to which the method of the present disclosure can be applied includes a support, a spreading medium, a sample pad, and an absorbent pad, wherein the support supports the spreading medium, the sample pad, and the absorbent pad. The sample pad and the absorption pad are located at both ends of the support so as not to overlap each other, the development medium is located between the sample pad and the absorption pad, and both ends of the development medium are located between the sample pad and the absorption pad. Each is in contact with one end of the absorbent pad and one end of the sample pad so that a liquid flow can be formed, and a capturer and a control material are attached to the developing medium in order at regular intervals, and the capturer is attached to the sample pad. Located close to the pad.
또한 크로마토그래피 분석 수단으로, 측방유동에 사용되는 스트립 및 이에 포함된 각 구성은 예를 들면 대한민국 공개 특허공보 제2011-0046833호에 개시된 바와 같은 측방유동 분석용 스트립을 참조할 수 있다. 예를 들어 전개용 매질은 통상적으로 크로마토그래피 매질을 일컫는 것으로 바람직하게는 액체 시료, 분석물, 특히 생물학적 시료에 포함된 단백질 또는 핵산이 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 부착된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 사용될 수 있다. 일반적으로 전개용 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하는 다공성 물질이다. 전개용 매질의 예로는 측방이동에 사용될 수 있는 예컨대 셀룰로스, 나이트로셀룰로스, 폴리에테르설폰, 폴리비닐리딘, 플루오라이드, 나일론, 하전나일론 및 폴리테트라플루오로에틸렌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서 전개용 매질은 나이트로셀룰로스이다. 나이트로셀룰로스를 사용하는 경우에, 구멍의 직경은 전형적으로 5 μm ~ 15μm이다. 다른 구현예에서 입자형태의 표지물질을 사용할 경우, 구멍의 크기는 입자 직경의 약 10배 이상이 되어야 한다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. 또한 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자와 공유결합을 가능하게 할 수 있다. Additionally, as a means of chromatographic analysis, the strip used for lateral flow and each component included therein may refer to, for example, a strip for lateral flow analysis as disclosed in Korean Patent Publication No. 2011-0046833. For example, the development medium generally refers to a chromatography medium, and preferably, a liquid sample, an analyte, especially a protein or nucleic acid contained in a biological sample moves rapidly by capillary force to reach the captor attached thereon. Anything that can be used can be used. Generally, a developing chromatographic medium is a porous material that moves through an aqueous medium in response to capillary forces. Examples of spreading media include, but are not limited to, those that can be used for lateral transfer, such as cellulose, nitrocellulose, polyethersulfone, polyvinylidine, fluoride, nylon, charged nylon, and polytetrafluoroethylene. In one embodiment, the developing medium is nitrocellulose. When using nitrocellulose, the diameter of the pores is typically 5 μm to 15 μm. In another embodiment, when a labeling material in particle form is used, the size of the hole should be about 10 times or more than the particle diameter. The materials exemplified above can be used alone or in combination with other materials. Another example is ceramic materials. Additionally, the chromatography medium can be multifunctional or modified to be multifunctional to enable covalent bonding with the captor.
본원 도 1 내지 도 4를 참조하면, 본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 포획자 (T)를 포함한다. 본원에서 용어 "포획자"는 시료 중의 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 물질로서, 표적 분석물이 항원 또는 항체와 같은 단백질인 경우, 각각 상응하는 항체 또는 항원일 수 있고, 표적 분석물이 핵산인 경우 서열 특이적 결합을 할 수 있는 상보적 핵산을 포함한다. 포획자는 전개용 매질을 통해 이동하는 표적 분석물을 이러한 특이적 결합 반응에 의해 선택적으로 포획할 수 있으며, 검사선 (Test Line)이라고도 한다. 상기 포획자는 전개용 매질 상에 공유 또는 비공유적 결합으로 부착될 수 있으며, 부착이란, 상기 전개 매질의 이동상이 이동하더라도 같이 이동하지 않고 고정된 자리 위치한 상태를 말한다. 일 구현예에서 상기 포획자는 전개용 매질에 비공유 결합으로 부착되어 있다. 항원 또는 항체를 포함하는 단백질 또는 핵산을 예를 들면 나이트로셀룰로스와 같은 다공성 막에 부착하는 방법은 공지되어 있다. 이러한 포획자는 예를 들면 나이트로셀룰로스 막에 선폭 약 1mm 이하로 분주 될 수 있으나 이러한 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. 구체적 수치는 사용하는 전개용 매질의 종류의 따라 달라질 수 있다. 적어도 하나의 포획자가 스트립으로 사용되는 전개용 매질 상의 소정의 위치에 위치하며, 분석을 위해 양성 또는 음성 대조군용 포획자를 포함할 수 있다. 1-4 herein, the strip used in the method according to the present application includes a capturer (T). As used herein, the term “captor” refers to a substance that can specifically bind to a target analyte in a sample. If the target analyte is a protein such as an antigen or antibody, it may be a corresponding antibody or antigen, respectively, and the target analyte may be a protein such as an antigen or antibody. In the case of this nucleic acid, it includes a complementary nucleic acid capable of sequence-specific binding. The capturer can selectively capture the target analyte moving through the development medium through this specific binding reaction, and is also called a test line. The captor may be attached to the development medium through a covalent or non-covalent bond, and attachment refers to a state in which it is positioned in a fixed position without moving with the mobile phase of the development medium. In one embodiment, the captor is non-covalently attached to the development medium. Methods for attaching proteins or nucleic acids containing antigens or antibodies to porous membranes such as nitrocellulose are known. These capturers can, for example, be dispensed onto a nitrocellulose membrane with a line width of about 1 mm or less, but use beyond this range is not excluded. Specific values may vary depending on the type of development medium used. At least one capturer is located at a predetermined position on the development medium used as a strip, and may include a positive or negative control capturer for analysis.
본원 도 1 내지 도 4를 참조하면, 본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 크로마토그래피 전개 방향으로 포획자 부착 부위에서 일정 간격 떨어진 지점에 대조선 (Control Line, C)이라고도 불리는 대조군 또는 대조물질을 포함한다. 대조선에는 분석물질 및 포획자와 전혀 관련이 없는 물질(항체 또는 항원)이 부착되어 있고 컨쥬게이션 패드에는 이 대조선에 부착된 물질과 결합하는 물질(항체 또는 항원)이 금입자와 결합되어 있다. Referring to FIGS. 1 to 4 of the present application, the strip used in the method according to the present application includes a control or reference material, also called a control line (C), at a certain distance from the capture site in the direction of chromatography development. . A substance (antibody or antigen) completely unrelated to the analyte and the capturer is attached to the control line, and a substance (antibody or antigen) that binds to the substance attached to the control line is bound to the gold particle on the conjugation pad.
상술한 스트립의 검사선 및 대조선은 선폭 약 1mm 이하로 분주 될 수 있으나 이러한 범위를 벋어나는 것을 제외하는 것은 아니다. The inspection and control lines of the above-described strip may be divided into a line width of about 1 mm or less, but lines beyond this range are not excluded.
본원 도 1 내지 도 6을 참조하면, 본원에 따른 방법에서 혈청과 같은 시료는 기존의 방법과 달리 스트립의 샘플 패드가 아닌, 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질 상의 소정의 위치에 적하된다. Referring to FIGS. 1 to 6 , in the method according to the present application, a sample such as serum is dropped at a predetermined location on the deployment medium in front of the captor attachment site, not on the sample pad of the strip, unlike the existing method.
본원의 도 1 내지 도 6을 참조하면, 본원에서 시료가 적하되는 소정의 위치는 포획자 부착 부위 전방의 포획자 부착 부위로부터 일정 간격 떨어진 위치이다. 시료가 적하되는 위치는 검사 스트립의 폭 (통상적으로 약 4 mm ~ 5mm) 및 전개용 매질의 공극 (10μm ~ 15μm), 및 전개용 매질에 적하할 시료의 양 등을 고려하여 조절하여야 한다. 포획자 부착부위 전방에 시료를 적하하는 경우, 전개용 매질에 적하된 시료가 이동하여 포획자 (본 실시예를 예로 들면 일본뇌염바이러스의 단백질)가 부착된 부위 (T, 검사선)에 도달하여 항원-항체 반응 (human anti-Japanese encephalitis virus antibody와 바이러스 단백질 간의 결합반응)이 일어나는 것이다. 이 점이 시료를 먼저 포획자-금입자 컨쥬게이트와 반응시키는 전통적인 기존의 방식과 가장 큰 차별적 특징으로 이로 인해 감도가 향상된다. 이어서 샘플패드쪽에서 전개 완충액을 적하하면 컨쥬게이션 패드에 포함되어 있던, 본 실시예를 예로 들면 검출자 항체 (goat anti-human IgM antibody)-금입자 결합체가, 전개용 매질쪽으로 이동하여 항원-항체 결합체가 형성된 포획자 선에 도달하게 된다. 일 구현예에서 본 실시예 1에 개시된 바와 같이, 검사 스트립의 폭이 4mm, 전개용 매질의 공극이 12μm이고 시료의 양을 약 3㎕ ~ 5u㎕ 적용하고자 할 때에는 시료 적하부위를 포획자 부착부위(검사선, T)에서 약 4-5mm 떨어진 곳에 위치하였을 때에 감도향상을 위한 최적의 조건인 것으로 확인되었다. Referring to FIGS. 1 to 6 of the present application, the predetermined position where the sample is dropped is a position at a certain distance from the capturer attachment site in front of the capturer attachment site. The location where the sample is dropped should be adjusted considering the width of the test strip (typically about 4 mm to 5 mm), the pores of the development medium (10 μm to 15 μm), and the amount of sample to be dropped into the development medium. When dropping a sample in front of the captor attachment site, the sample dropped into the development medium moves and reaches the site (T, test line) where the captor (in this example, a protein of the Japanese encephalitis virus) is attached. An antigen-antibody reaction (binding reaction between human anti-Japanese encephalitis virus antibody and viral protein) occurs. This is the biggest differentiating feature from the traditional method of first reacting the sample with the capturer-gold particle conjugate, which improves sensitivity. Then, when the development buffer is added dropwise from the sample pad, the detector antibody (goat anti-human IgM antibody)-gold particle conjugate contained in the conjugation pad, for example in this example, moves toward the development medium and forms an antigen-antibody conjugate. It reaches the formed captor line. In one embodiment, as disclosed in Example 1, the width of the test strip is 4 mm, the pores of the development medium are 12 μm, and when the amount of sample is to be applied in the range of about 3 μl to 5 u μl, the sample drop site is connected to the captor attachment site. It was confirmed that the optimal conditions for improving sensitivity were located approximately 4-5 mm away from (test line, T).
또한, 전개용 매질에 시료의 양을 과도하게 (10㎕ 이상) 적하였을 때에는 전개용 매질의 너무 젖어 있어서 샘플패드에 전개완충액을 적하하였을 때에 골드입자-검출자 항체 결합체가 전개막을 잘 흐르지 못하는 문제가 발생하여 검사가 이루어지지 않을 수 있다. 따라서 적용되는 시료의 양은 스트립의 폭과 전개막의 공극을 고려하여 결정하여야 한다. In addition, when an excessive amount of sample (more than 10㎕) is added dropwise to the developing medium, the developing medium is too wet and the gold particle-detector antibody conjugate does not flow well through the developing membrane when the developing buffer is added dropwise to the sample pad. may occur and inspection may not be performed. Therefore, the amount of sample applied must be determined considering the width of the strip and the pores of the developing film.
따라서 당업자라면 본원 발명의 실시예를 포함하여 개시된 내용을 근거로 검사 스트립의 폭 및 전개용 매질의 공극 및 전개용 매질에 적하할 시료의 양을 적절히 고려하여 본원에 따른 방법의 시료 적하 부위를 결정할 수 있을 것이다. Therefore, a person skilled in the art will determine the sample dropping site for the method according to the present invention by appropriately considering the width of the test strip, the pores of the developing medium, and the amount of the sample to be dropped into the developing medium, based on the disclosure including the embodiments of the present invention. You will be able to.
일 구현예에서 본원에 따른 시료 적하 부위는 스트립의 전개용 매질상에 선폭 약 1mm 이하의 식용색소 등으로 표시될 수 있다. 적색 제 2호, 적색 제3호, 적섹 제 40호, 적색 제 102호, 황색 제 4호, 황색 제 5호, 녹색 제 3호, 청색 제 1호, 청색 제2호 등이 사용될 수 있다. In one embodiment, the sample drop site according to the present application may be marked with food coloring with a line width of about 1 mm or less on the strip development medium. Red No. 2, Red No. 3, Red No. 40, Red No. 102, Yellow No. 4, Yellow No. 5, Green No. 3, Blue No. 1, Blue No. 2, etc. can be used.
본원에 따른 방법에 사용되는 스트립은 컨쥬게이션 패드를 추가로 포함할 수 있다. 일예로 도 5를 참조하면 컨쥬게이션 패드는 항체 또는 항원과 같은 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 표지된 검출입자를 포함한다. 검출입자로는 다양한 비드 예를 들면, 폴리스티렌 미세구, 라텍스입자, 나노골드입자, 콜로이드성 골드입자, 금속입자, 자성입자, 형광입자, 및 반도체 나노크리스탈 등을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기 표적 분석물에 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 표지된 검출입자는 특이적 반응에 의해 분석물과 결합하고 이는 다시 전개용 매질의 포획자와 결합하고, 이러한 복합체는 검출장치를 통해 검출될 수 있다. 예를 들면 샌드위치 방식으로 검출을 하기 위해, 전개막의 검사선에 포획자로서 시료의 항원을 검출할 수 있는 항체가 부착되고, 컨쥬게이션 패드에도 상기 시료의 항원을 검출할 수 있는 항체가 접합된 비드를 포함한다. 또는 간접적 방식으로 검출하기 위해, 시료에서 검출하고자하는 분석 표적물이 항체인 경우, 전개막에는 항원이 부착되고 컨쥬게이션 패드에는 anti- species 항체 (IgA, IgG, IgM, IgE)가 접합된 비드를 포함한다. 컨쥬게이션 패드에 포함된 이러한 비드는 샘플패드에 적용된 완충액으로 인한 모세관력에 따라 이동하여 포획자 (검사선) 및 대조선의 물질과 결합할 수 있다. The strip used in the method according to the present disclosure may further comprise a conjugation pad. As an example, referring to FIG. 5, the conjugation pad includes detection particles labeled with a substance that can specifically bind to a target analyte such as an antibody or antigen. Detection particles include, but are not limited to, various beads such as polystyrene microspheres, latex particles, nano-gold particles, colloidal gold particles, metal particles, magnetic particles, fluorescent particles, and semiconductor nanocrystals. Detection particles labeled with a substance capable of specifically binding to the target analyte bind to the analyte through a specific reaction, which in turn binds to the capturer of the development medium, and this complex can be detected through a detection device. You can. For example, to detect using the sandwich method, an antibody capable of detecting the antigen of the sample is attached to the test line of the developing membrane as a capturer, and an antibody capable of detecting the antigen of the sample is also conjugated to the conjugation pad. Contains beads. Or, for indirect detection, if the analysis target to be detected in the sample is an antibody, beads with an antigen attached to the developing membrane and an anti-species antibody (IgA, IgG, IgM, IgE) conjugated to the conjugation pad are used. Includes. These beads included in the conjugation pad can move according to the capillary force caused by the buffer applied to the sample pad and bind to the substances of the capturer (test line) and control line.
일 구현예에서 본원에 따른 방법은 도 6와 같은 딥스틱 형태로 전개 완충액이 적용되는 면역크로마토그래피에도 적용될 수 있다. 이 경우 시료는 위에 설명한 바와 같이 적용되고, 스트립의 샘플패드의 일 말단을 완충액에 담그면 흡수패드 방향으로 모세관력이 발생한다. In one embodiment, the method according to the present disclosure can also be applied to immunochromatography in which a developing buffer is applied in the form of a dipstick as shown in FIG. 6. In this case, the sample is applied as described above, and when one end of the sample pad of the strip is immersed in the buffer solution, capillary force is generated in the direction of the absorbent pad.
다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법이 사용되는 스트립에 관련된 것이다. 일 구현예에서 본원에 따른 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드 및 흡수 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소이다. In another aspect the invention relates to a strip in which the method according to the invention is used. In one embodiment, the strip according to the present disclosure includes a developing medium, a sample pad, and an absorbent pad, and both ends of the developing medium are in contact with one end of the sample pad and one end of the absorbent pad, respectively, The development medium is located between the sample pad and the absorption pad. Captors and control substances capable of specific binding to the target analyte are attached in order at regular intervals to the development medium, and the capture The ruler is located in a direction close to the sample pad, and includes a sample dropping site marked with a dye in front of the captor attachment site on the development medium, and the dye is a water-soluble dye that can move in the direction of chromatography development.
일 구현예에서 본원에 따른 스트립은 컨주게이션 패드를 추가로 포함하며, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치한다. In one embodiment, the strip according to the present disclosure further comprises a conjugation pad, the conjugation pad being located between the sample pad and the deployment medium.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 방법이 적용될 수 있는 스트립을 수용하기 위한 하우징에 관한 것이다. 도 4를 참조하면 일 구현예에서 이러한 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함한다. 상기 제 2 창은 본원에 따른 방법에 의한 시료 적하부위에 상응하는 위치이다. 일 구현예에서 특히 전개 완충액을 파이펫과 같은 도구를 이용해서 적용하는 방식의 스트립에 특히 사용될 수 있다. In another aspect the invention relates to a housing for accommodating a strip to which the method according to the invention can be applied. Referring to FIG. 4, in one embodiment, this housing includes a first window for dropping a buffer solution on the sample pad of the strip, a second window for dropping a sample, and a reaction at the site where the capture and control materials are attached. Includes a third window for detection. The second window is a position corresponding to the sample dropping site according to the method according to the present application. In one embodiment, it can be particularly used in strips where the development buffer is applied using a tool such as a pipette.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Below, examples are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are provided only for easier understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1- 일본뇌염 IgM항체 검사키트 제작 Example 1 - Production of Japanese encephalitis IgM antibody test kit
1.1 Goat anti-Human IgM antibody와 금 입자 결합체 제조1.1 Manufacture of Goat anti-Human IgM antibody and gold particle conjugate
항체-금 입자 결합체의 제조를 위해 Goat anti-Human IgM antibody를 3차 증류수에 2mg/mL의 농도로 희석하였다. 이 항체용액을 40 nm 직경의 금 입자 용액 (pH 8.0 ~ pH 8.8) 1mL 당 6.0ug~12.0ug을 첨가하여 상온에서 10 ~ 30분간 교반하며 반응시켰다. 이 용액에 Blocker 용액 (10% BSA or 1% PEG 6,000)을 최종 농도 0.02% ~ 0.1%가 되도록 넣어주고 5 ~ 10분 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 항체-금 입자 결합체를 원심 분리하여 침전시킨 후, 2mM borate buffer (pH 8.0 ~ pH 8.8, 0.01% NaN3 포함)에 현탁하여 냉장에서 보관하였다. To prepare the antibody-gold particle conjugate, goat anti-human IgM antibody was diluted in distilled water to a concentration of 2 mg/mL. 6.0ug to 12.0ug of this antibody solution per 1mL of 40 nm diameter gold particle solution (pH 8.0 to pH 8.8) was added and reacted with stirring at room temperature for 10 to 30 minutes. Blocker solution (10% BSA or 1% PEG 6,000) was added to this solution to a final concentration of 0.02% to 0.1% and reacted for 5 to 10 minutes. After the reaction was completed, the antibody-gold particle conjugate was precipitated by centrifugation, suspended in 2mM borate buffer (pH 8.0 ~ pH 8.8, containing 0.01% NaN3), and stored in a refrigerator.
1.2 항체-금 입자 컨쥬게이션 패드 제조1.2 Preparation of antibody-gold particle conjugation pad
실시예 1에서 제조된 [Goat anti-Human IgM antibody-금 입자 결합체]를 sucrose (4% ~10%), TritonX-100 (0.1% ~ 0.5%)가 포함된 Tris 기반의 용액(20-100mM Tris-Cl, pH 8.0 ~ 8.8)에 혼합하여 최종 OD526-532 값을 5.0 ~ 6.0 로 하여 폴리에스테르 재질의 섬유 (10mm X 300mm)에 고르게 적신 후 40℃ ~ 50℃ 온도에서 건조시켜 건쥬게이션 패드를 제조하였다. [Goat anti-Human IgM antibody-gold particle conjugate] prepared in Example 1 was added to a Tris-based solution (20-100mM Tris) containing sucrose (4% to 10%) and TritonX-100 (0.1% to 0.5%). -Cl, pH 8.0 ~ 8.8), adjust the final OD 526-532 value to 5.0 ~ 6.0, wet it evenly on polyester fiber (10mm Manufactured.
1.3 나이트로셀룰로스 막 (전개용 매질) 위에 단백질 고정1.3 Protein immobilization on nitrocellulose membrane (deployment medium)
분주기를 이용하여 나이트로셀룰로스 막 (공극 12μm) 표면에 1.5 mg/mL ~ 2.0 mg/mL의 일본뇌염바이러스 피막단백질(검사선)과 0.8 mg/mL ~ 1.2 mg/mL의 rabbit anti-goat IgG 항체 (대조선)를 1.0 mm 폭의 선 형태로 분주하였다. 분주한 후, 나이트로셀룰로오스 막을 37℃ ~ 50℃ 에서 2 ~ 3시간 동안 건조시켜 고정하였다. Using a dispenser, apply 1.5 mg/mL to 2.0 mg/mL of Japanese encephalitis virus envelope protein (test line) and 0.8 mg/mL to 1.2 mg/mL of rabbit anti-goat IgG on the surface of a nitrocellulose membrane (pore 12μm). Antibody (control line) was dispensed in the form of a 1.0 mm wide line. After dispensing, the nitrocellulose membrane was dried and fixed at 37°C to 50°C for 2 to 3 hours.
1.4 샘플패드 전처리1.4 Sample pad preprocessing
샘플패드에 적하된 시료가 항체-금 입자 결합체와 반응한 후 나이트로셀룰로스 막을 통해 원활하게 전개될 수 있도록 샘플패드를 Tween-20 (0.1% ~ 1.0%)가 포함된 Tris 기반의 완충용액 (20-100mM Tris-Cl, pH 7.5 ~ 8.5)에 충분히 적신 후 30℃ ~ 40℃ 온도에서 완전히 건조시켰다.To ensure that the sample loaded on the sample pad reacts with the antibody-gold particle conjugate and then spreads smoothly through the nitrocellulose membrane, the sample pad is filled with a Tris-based buffer solution (20%) containing Tween-20 (0.1% ~ 1.0%). -100mM Tris-Cl, pH 7.5 ~ 8.5) and then completely dried at a temperature of 30℃ ~ 40℃.
1.5 전개완충액 제조1.5 Preparation of development buffer
검체전개를 보조하는 전개완충액은 Tris를 (20mM ~ 100mM, pH 7.5 ~ 8.5) 기반으로 하여 Triton X-100 (0.1% ~ 1%), Tween- 20 (0.1% ~ 1.0%) 및 보존제 (아지드화나트륨 0.01% ~ 0.1%)를 포함하여 제조하였다. The development buffer that assists in sample development is based on Tris (20mM ~ 100mM, pH 7.5 ~ 8.5) and contains Triton It was prepared containing 0.01% to 0.1% sodium chloride.
1.6 진단 키트의 조립1.6 Assembly of the diagnostic kit
[항체-금 입자 결합체]가 함유된 컨쥬게이션 패드와 샘플 패드를 나이트로셀룰로스 막에 중첩되도록 부착하고 검체 패드 반대편의 나이트로셀룰로스 막에는 모세관 현상을 통해 상기 복합체가 원활히 전개될 수 있도록 흡수패드를 중첩하여 부착하였다. 이렇게 제조한 진단용 스트립 (60mm x 4.0mm)을 검사선(T) 및 대조선(C)이 표기된 플라스틱 재질의 케이스에 넣고 조립하여 진단키트를 제조하였다The conjugation pad containing the [antibody-gold particle conjugate] and the sample pad were attached so as to overlap the nitrocellulose membrane, and an absorbent pad was placed on the nitrocellulose membrane on the other side of the sample pad to allow the complex to spread smoothly through capillary action. It was attached by overlapping. A diagnostic kit was manufactured by placing the diagnostic strip (60 mm
실시예 2. 본 발명에 따른 방법 및 기존 방법의 검출 효능 비교 Example 2. Comparison of detection efficacy of the method according to the present invention and the existing method
기존 방식 원리를 설명하면 다음과 같다. 일본뇌염 검출이 필요한 사람 혈청(혈장) 10㎕를 검체 투입구에 적하하고 이어서 전개완충액을 100㎕을 동일한 투입구에 적하한다. 이어 시료 용액은 골드 컨쥬게이트 패드 쪽으로 이동한다. 여기서 시료 안에 있는 human IgM 항체는 골드컨쥬게이트 패드에 건조되어 있는 goat anti-human IgM 항체에 결합한다. 이어 골드입자-항체 복합체는 전개막으로 계속 이동하게 된다. 시료 내에 anti-Japanese encephalitis virus IgM 항체가 존재한다면 상기 복합체가 포획자 (일본뇌염바이러스 항원)가 고착된 검사선 (T)을 지날 때, [금입자 + goat anti-human IgM + human IgM +일본뇌염바이러스항원]복합체가 생성되고 검사선에 계속해서 쌓이게 된 복합체는 빨간색으로 보이게 된다. 남은 복합체는 계속해서 전개막을 따라 대조선 (C, anti-goat IgG antibody가 고착됨)에 이르게 된다. 여기에서 [금입자 + goat anti-human IgM + anti-goat IgG antibody]복합체가 생성되고 대조선에 계속해서 쌓이게 된 복합체는 빨간색으로 보이게 된다. 따라서 검사선과 대조선 모두에서 빨간색이 보이면 양성으로, 대조선에서만 빨간색이 보이면 음성으로 판정한다. The principle of the existing method is explained as follows. 10㎕ of human serum (plasma) required for detection of Japanese encephalitis is dropped into the specimen inlet, and then 100㎕ of development buffer is dropped into the same inlet. The sample solution then moves toward the gold conjugate pad. Here, the human IgM antibody in the sample binds to the goat anti-human IgM antibody dried on the gold conjugate pad. Then, the gold particle-antibody complex continues to move to the developing membrane. If anti-Japanese encephalitis virus IgM antibody is present in the sample, when the complex passes the test line (T) where the capturer (Japanese encephalitis virus antigen) is fixed, [gold particle + goat anti-human IgM + human IgM + Japanese encephalitis Viral antigen] complex is created and the complex that continues to accumulate on the test line appears in red. The remaining complex continues along the developed membrane to the control line (C, where anti-goat IgG antibody is fixed). Here, a [gold particle + goat anti-human IgM + anti-goat IgG antibody] complex is created, and the complex that continues to accumulate on the control line appears in red. Therefore, if red is visible on both the test line and the control line, it is judged positive, and if red is visible only on the control line, it is judged negative.
기존의 방법과 본원에 따른 방법에 따른 성능을 비교하기 위해 실시예 1에서 제작한 진단 키트에 일본뇌염 환자 혈청을 본원의 방법인 1) 나이트로셀룰로스 막에 직접 적하한 후, 전개완충액을 샘플패드 홀에 적하하였고, 기존이 방법대로 2)검체를 샘플패드 쪽 홀에 적하하여 패드에 스며들게 한 후에 전개완충액을 동일한 홀에 적하하는 방식으로 검사하여 두 방식 간 검사선의 진하기 (검출 감도)를 비교하였다. In order to compare the performance of the existing method and the method according to the present application, the serum of a Japanese encephalitis patient was directly added dropwise to the nitrocellulose membrane in the diagnostic kit produced in Example 1 according to our method 1), and then the development buffer was added to the sample pad. It was dropped into the hole, and as with the existing method, 2) the sample was dropped into the hole on the sample pad side, allowed to permeate the pad, and then the developing buffer was dropped into the same hole to compare the thickness of the test line (detection sensitivity) between the two methods. did.
검체는 일본뇌염바이러스 양성 검체로서 ELISA 법으로 양성이 확인된 검체를 사용하였다. 양성검체를 고농도, 중농도, 저농도로 나눈 후 상기에서 기술한 두 가지 방법을 적용하여 발색에 따른 민감도의 차이를 확인하였다.The sample was a Japanese encephalitis virus positive sample that was confirmed positive by ELISA method. After dividing the positive samples into high, medium, and low concentrations, the two methods described above were applied to confirm the difference in sensitivity according to color development.
본원에 따른 방법 적용을 위해 실험용 파이펫으로 검체를 3㎕ 덜어서 나이트로셀룰로스 막의 검사선 앞에 직접 적하하고 샘플패드쪽 홀에 전개완충액 100㎕를 적하하였다. 결과는 10분 후 육안으로 판독하였다. 기존 방법의 경우, 실험용 파이펫으로 검체를 10㎕ 덜어서 샘플패드쪽 홀에 적하하고 시료가 패드에 스며들면 동일한 홀에 전개완충액 100㎕를 적하하였다. 검사 결과는 10분 후 육안으로 판정하였다. 검사선 (T) 및 대조선 (C)이 모두 붉은색으로 변하면 양성, 대조선 (C)만 붉은색으로 변하면 음성으로 판정하였다. To apply the method according to the present application, 3㎕ of sample was taken with a laboratory pipette and dropped directly in front of the test line of the nitrocellulose membrane, and 100㎕ of development buffer was added dropwise to the hole on the sample pad side. The results were read visually after 10 minutes. In the case of the existing method, 10㎕ of sample was taken with a laboratory pipette and dropped into the hole on the sample pad. When the sample penetrated the pad, 100㎕ of development buffer was dropped into the same hole. The test results were judged visually after 10 minutes. If both the test line (T) and control line (C) turned red, it was judged positive, and if only the control line (C) turned red, it was judged negative.
도 2에 나타난 바와 같이, 실험 결과, 본 발명에서 제시한 검사방법은 전통적인 방식에 비해 더 적은 양의 검체를 사용함에도 불구하고 검출감도가 월등히 높은 것으로 나타났다. 특히 양성 저농도의 검체를 시험했을때에 본 발명에 따른 방법으로는 양성결과를, 전통적인 방식으로 시험했을때에는 음성결과를 보였다. 이는 본원에 따른 방법은 감도를 향상시켜 위음성 문제를 해결할 수 있음을 나타내는 것이다. As shown in Figure 2, the experimental results showed that the test method proposed in the present invention had a significantly higher detection sensitivity despite using a smaller amount of sample than the traditional method. In particular, when a sample with a low positive concentration was tested, a positive result was obtained by the method according to the present invention, and a negative result was obtained when tested by the traditional method. This indicates that the method according to the present application can solve the false negative problem by improving sensitivity.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.Although the exemplary embodiments of the present application have been described in detail above, the scope of the rights of the present application is not limited thereto, and various modifications and improvements made by those skilled in the art using the basic concept of the present application defined in the following claims are also included in the scope of the rights of the present application. belongs to
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다. All technical terms used in the present invention, unless otherwise defined, are used with the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art in the field related to the present invention. The contents of all publications incorporated by reference herein are hereby incorporated by reference.
Claims (7)
상기 면역 크로마토그래피에 사용되는 검사 스트립을 제공하는 단계로, 상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드, 흡수 패드 및 컨쥬게이션 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하며, 상기 전개용 매질에는 상기 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자, 및 대조군 물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자가 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 부착되어 있고, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치하고,
상기 포획자 부착 부위 전방의 전개용 매질에 상기 시료를 적하하는 단계; 및
상기 시료 적하 후에, 상기 샘플패드에, 상기 스트립에서의 크로마토그래피 전개를 위한 전개 완충액을 적하하는 단계를 포함하는, 방법.
In an immunochromatographic method for detecting a target analyte in a sample, a method of improving the detection sensitivity of the target analyte includes:
A step of providing a test strip used in immunochromatography, wherein the strip includes a development medium, a sample pad, an absorption pad, and a conjugation pad, and both ends of the development medium are each attached to one side of the sample pad. It is in contact with an end and one end of the absorption pad, so that the development medium is located between the sample pad and the absorption pad, and the development medium includes a capture agent capable of specific binding to the target analyte, and control materials are attached in order at regular intervals, the capturer is attached in a direction close to the sample pad, and the conjugation pad is located between the sample pad and the development medium,
Dropping the sample onto a development medium in front of the captor attachment site; and
After dropping the sample, dropping a development buffer for chromatography development on the strip onto the sample pad.
상기 시료가 적하되는 상기 전개용 매질 상의 위치는 색소로 표시되며 상기 색소는 상기 크로마토그래피 전개와 함께 이동하는 것인, 방법.
According to claim 1,
The method wherein the location on the development medium where the sample is dropped is indicated by a dye, and the dye moves along with the chromatographic development.
상기 스트립은 지지대를 추가로 포함하며, 상기 샘플 패드, 상기 전개용 매질 및 상기 흡수 패드는 상기 지지대 상에 위치하는 것인, 방법.
According to claim 1,
The method of claim 1 , wherein the strip further includes a support, and the sample pad, the spreading medium, and the absorbent pad are positioned on the support.
상기 스트립은 전개용 매질, 샘플 패드, 흡수 패드 및 컨쥬게이션 패드를 포함하며, 상기 전개용 매질의 양 단부는 각 각 상기 샘플 패드의 한 단부 및 상기 흡수 패드의 한 단부와 접해 있어, 상기 전개용 매질은 상기 샘플 패드 및 상기 흡수 패드의 사이에 위치하고, 상기 컨쥬게이션 패드는 상기 샘플 패드와 상기 전개용 매질 사이에 위치하고,
상기 전개용 매질에는 표적 분석물과 특이적 결합을 할 수 있는 포획자 및 대조물질이 일정 간격을 두고 순서대로 부착되어 있으며, 상기 포획자는 상기 샘플 패드에 근접한 방향에 위치하며, 상기 전개용 매질 상의 상기 포획자 부착 부위 전방에는 색소로 표시된 시료 적하 부위를 포함하며, 상기 색소는 크로마토그래피 전개 방향으로 이동할 수 있는 수용성 색소인, 스트립. A strip used in the method according to claim 1, 3 or 4, comprising:
The strip includes a development medium, a sample pad, an absorption pad, and a conjugation pad, and both ends of the development medium are in contact with one end of the sample pad and one end of the absorption pad, respectively, The medium is located between the sample pad and the absorption pad, and the conjugation pad is located between the sample pad and the development medium,
A capturer and a control material capable of specific binding to the target analyte are sequentially attached to the development medium at regular intervals, and the capturer is located in a direction close to the sample pad, on the development medium. A strip comprising a sample loading site marked with a dye in front of the captor attachment site, wherein the dye is a water-soluble dye that can move in the direction of chromatography development.
상기 하우징은 상기 스트립의 샘플 패드에 완충액을 적하하기 위한 제 1 창, 시료를 적하하기 위한 제 2 창, 및 포획자 및 대조군 물질이 부착된 부위에서의 반응을 검출하기 위한 제 3 창을 포함하는 것인, 하우징. A housing for accommodating the strip according to claim 5,
The housing includes a first window for dropping a buffer on the sample pad of the strip, a second window for dropping a sample, and a third window for detecting the reaction at the site where the capture and control substances are attached. One thing, housing.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210183728A KR102631862B1 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210183728A KR102631862B1 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230094506A KR20230094506A (en) | 2023-06-28 |
| KR102631862B1 true KR102631862B1 (en) | 2024-01-30 |
Family
ID=86994266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210183728A KR102631862B1 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102631862B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116577498B (en) * | 2023-07-13 | 2023-09-12 | 济南玖方生物科技有限公司 | Application of sample pad for detecting HIV antibody in urine, test strip and sample pad treatment fluid |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101332336B1 (en) * | 2013-05-07 | 2013-11-22 | (주)래피젠 | Prozone effect-preventable immunochromatographic strip and a kit comprising the same |
| JP2015135351A (en) * | 2009-04-09 | 2015-07-27 | アークレイ株式会社 | Specimen analysis tool, manufacturing method of specimen analysis tool, and liquid permeability reduction suppressing method |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100560174B1 (en) | 2002-01-31 | 2006-03-13 | 바디텍메드 주식회사 | Lateral flow quantitative assay method and strip and package therefor |
| WO2014178274A1 (en) * | 2013-05-02 | 2014-11-06 | エコー電気株式会社 | Liquid-testing implement |
-
2021
- 2021-12-21 KR KR1020210183728A patent/KR102631862B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015135351A (en) * | 2009-04-09 | 2015-07-27 | アークレイ株式会社 | Specimen analysis tool, manufacturing method of specimen analysis tool, and liquid permeability reduction suppressing method |
| KR101332336B1 (en) * | 2013-05-07 | 2013-11-22 | (주)래피젠 | Prozone effect-preventable immunochromatographic strip and a kit comprising the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20230094506A (en) | 2023-06-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020233741B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US10379121B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US7344893B2 (en) | Immuno-gold lateral flow assay | |
| US7632687B2 (en) | Hybrid phase lateral flow assay | |
| JP4270751B2 (en) | Neutralization of polycations in whole blood chromatography devices | |
| US8962260B2 (en) | Method and device for combined detection of viral and bacterial infections | |
| US20110229913A1 (en) | Method for Amplification of Signal in Immunochromatographic Assay and Immunochromatographic Kit Using the Method | |
| JP2010512537A (en) | Indirect lateral flow sandwich assay | |
| WO2005029073A2 (en) | Chromatographic assay device and methods | |
| KR20060109595A (en) | Improved lateral flow immunoassay and device therefor | |
| US7749776B2 (en) | Liquid flow assays utilising a combined detection and control zone | |
| JP2009517632A (en) | Improved target ligand detection | |
| KR102631862B1 (en) | Method of enhancing the signal intensity in immunochromatographic assay | |
| JP4980944B2 (en) | Immunological measurement method | |
| JP4109245B2 (en) | Analysis apparatus and analysis method | |
| WO2021226364A1 (en) | Sample concentration and detection systems and methods | |
| JP2001033453A (en) | Measuring method for ligand | |
| JP7369017B2 (en) | Analyte detection sensitization method using colloidal particles |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |