KR102625169B1 - interferon protein loaded pulmonary surfactant nanoparticles for inhalation delivery and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 인터페론 단백질이 결합된 복합체는,
생체 내 투여시 인터페론 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 폐포 내에 존재하는 폐 계면활성제 막과 효율적으로 융합되어, 복합체에 결합된 인터페론 단백질을 주변 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있다.A complex in which an interferon protein is bound to a liposome prepared with a lung surfactant provided in one aspect of the present invention,
When administered in vivo, the structure of the interferon protein is not damaged and not only can it be selectively delivered to the lung while preserving its original form and function, but it can also efficiently fuse with the pulmonary surfactant membrane present in the alveoli to form a complex complex. It can efficiently deliver interferon proteins bound to surrounding cells, and has low toxicity and excellent structural stability.
Description
본 발명은 음전하를 띠는 인터페론 단백질을 폐 내로 깊숙이 전달하기 위해 생체친화적인 폐 계면활성제입자와 양전하를 띠는 프로타민 단백질을 활용해 입자화 시키는 방법을 최적화하는 발명이다. 음전하를 띠는 인터페론 단백질을 탑재하기 위해 양전하를 띠는 프로타민을 매개로 입자와 전하간 인력으로 결합하고자 했는데, 그 이유는 인터페론 단백질 구조를 훼손하지 않으면서 본래 인터페론 단백질 형태를 보존한 상태로 전달하고자 하기 때문이다.The present invention optimizes a particleization method using biocompatible pulmonary surfactant particles and positively charged protamine protein to deliver negatively charged interferon protein deep into the lungs. In order to load the negatively charged interferon protein, we attempted to combine the particles with charge-to-charge attraction through the positively charged protamine. The reason was to deliver the original form of the interferon protein while preserving it without damaging the interferon protein structure. Because it does.
매년 폐질환 환자 증가량이 대폭 증가하고 있으며, 폐질환 환자 전체 중 호흡기성 바이러스 감염에 걸린 환자가 사망률이 가장 높은 부류에 속한다. 이에, 폐를 선택적으로 표적하여 약물이나 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래의 형태와 기능을 보존한 상태로 전달할 수 있는 전달체가 요구되고 있다.The number of patients with lung disease is increasing significantly every year, and among all patients with lung disease, those with respiratory viral infections have the highest mortality rate. Accordingly, there is a need for a delivery system that can selectively target the lungs and deliver drugs or proteins while preserving their original form and function without damaging their structure.
특히, 호흡기성 감염을 유발하는 바이러스중 인플루엔자 및 코로나 바이러스는 주로 폐포 영역(alveolar region)에 있는 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)을 감염시키는 경우가 많아서 면역강화제 및 항바이러스제를 폐포 영역에 특히, 타입 II 폐포 세포에 효율적으로 전달하는 기술이 필요하다.In particular, among viruses that cause respiratory infections, influenza and coronaviruses often infect type II alveolar cells in the alveolar region, so immunostimulants and antivirals are especially effective in the alveolar region. , technology for efficient delivery to type II alveolar cells is needed.
상기 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)는 폐 계면활성제(Pulmonary surfactant)를 분비 및 저장하는 기능을 수행하며, 상기 폐 계면활성제는 호흡하는 과정에서 폐의 장력을 조절하는 역할을 수행한다. 폐 계면활성제는 지질(lipid)과 막 단백질(membrane protein)로 구성되어 있다(비특허문헌, Eur Respir J. 1999 Jun;13(6):1455-76).The alveolar type II cell functions to secrete and store pulmonary surfactant, and the pulmonary surfactant plays a role in regulating lung tension during breathing. Pulmonary surfactant is composed of lipid and membrane protein (non-patent literature, Eur Respir J. 1999 Jun;13(6):1455-76).
이러한 폐 계면활성제를 사용하여, 인터페론 단백질을 폐포에 전달할 경우, 폐포 내 폐 계면활성제막과의 융합을 통하여 인터페론 단백질을 폐포내 장기간 유지시킬 수 있을 뿐만 아니라, 폐 계면활성제를 분비 및 저장하는 기능을 수행하는 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)에 인터페론 단백질을 효과적으로 표적할 수 있을 것이라 예상되어, 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 인터페론 단백질을 결합한 복합체를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.When this type of pulmonary surfactant is used to deliver interferon protein to the alveoli, not only can the interferon protein be maintained in the alveoli for a long period of time through fusion with the pulmonary surfactant membrane within the alveoli, but it also has the function of secreting and storing pulmonary surfactant. As it was expected that interferon proteins could be effectively targeted to alveolar type II cells, the present invention was completed by preparing a complex combining interferon proteins with liposomes made from pulmonary surfactant.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 폐(lung)로의 선택적인 인터페론 단백질 전달을 위한 인터페론 단백질 전달용 조성물을 제공하는 것이다.The purpose of one aspect of the present invention is to provide a composition for delivering interferon proteins for selective delivery of interferon proteins to the lungs.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 폐로의 선택적인 인터페론 단백질 전달을 위한 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for producing a composition for delivering interferon protein to the lungs.
상기 목적을 달성하기 위하여,In order to achieve the above purpose,
본 발명의 일 측면은,One aspect of the present invention is,
폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 인터페론(interferon) 단백질이 결합된 복합체를 함유하는, 인터페론 단백질 전달용 조성물을 제공한다.Provided is a composition for delivering interferon proteins, which contains a complex of interferon proteins bound to liposomes made from pulmonary surfactant.
또한, 본 발명의 다른 일 측면은,In addition, another aspect of the present invention is,
폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;Preparing a first solution in which a lung surfactant is dissolved;
상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;Forming a lipid film by drying the solution in which the prepared lung surfactant is dissolved;
상기 형성된 지질막에, 인터페론 단백질이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 인터페론 단백질이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는,Hydrating the formed lipid membrane with a second solution containing dissolved interferon protein to prepare a complex in which the interferon protein is bound to a liposome prepared with lung surfactant; Including,
인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.A method for producing a composition for delivering interferon protein is provided.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에 인터페론 단백질이 결합된 복합체는, 생체 내 투여시 인터페론 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 인터페론 단백질 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을뿐만 아니라, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있다.In one aspect of the present invention, a complex in which an interferon protein is bound to a liposome prepared with a pulmonary surfactant provides a complex that preserves the original form and function of the interferon protein without damaging the structure of the interferon protein when administered in vivo. Not only can it be selectively delivered to the lungs, it has low toxicity and excellent structural stability.
도 1은 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)를 활용한 인터페론 단백질의 탑재방법 모식도를 나타내는 도면이다.
도 2는 초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각기 50μg, 5mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:0, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 <실시예 1>에서 제조한 인터페론 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자(즉, Surf-Pro-IFNL 입자)의 TEM 이미지를 나타내는 도면이다.
도 4는 in vivo 실험에 사용한 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 나타내는 도면이다.
도 5는 상기 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 사용한 흡입 일정을 나타내는 모식도이다.
도 6은 IAV(Influenza A Virus) 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스로부터 추출한 기관지폐포세척액(BALF) 내 IAV의 존재에 의해, 세포사멸이 발생하는지 여부를 비교 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 시간 경과에 따른 체중 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 적출한 마우스의 폐에서 검출되는 IAV PA mRNA 발현량을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 H&E 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 동안의 폐 내 바이러스 감염 정도를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 동안의 인터페론 자극 유전자(Interferon stimulated gene) IFN-λ 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 동안의 인터페론 자극 유전자(Interferon stimulated gene) CXCL10 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 동안의 인터페론 자극 유전자(Interferon stimulated gene) Mx1 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 1 is a schematic diagram showing a method of loading interferon protein using pulmonary surfactant.
Figure 2 shows the amount of protamine based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP), with the amounts of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant fixed at 50 μg and 5 mg, respectively, 1:0, 1:1, 1:5, and 1: This is a diagram showing the results of measuring the green fluorescent protein (GFP) loading rate and particle size and charge while increasing the molar ratio to 10 and 1:20.
Figure 3 is a diagram showing a TEM image of lung surfactant-based particles (i.e., Surf-Pro-IFNL particles) bound with interferon protein prepared in <Example 1>.
Figure 4 is a diagram showing the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment used in the in vivo experiment.
Figure 5 is a schematic diagram showing the suction schedule using the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment.
Figure 6 shows a comparative evaluation of whether cell death occurs due to the presence of IAV in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) extracted from mice that inhaled IAV (Influenza A Virus) alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together. This is a drawing showing the results.
Figure 7 is a diagram showing the results of Western blot analysis performed on mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, and lungs were removed 7 days later.
Figure 8 is a diagram showing the results of evaluating body weight changes over time in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
Figure 9 is a diagram showing the results of evaluating the level of IAV PA mRNA expression detected in the lungs of mice inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, excised after 7 days.
Figure 10 is a diagram showing the results of H&E analysis performed on mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, and lungs were removed 7 days later.
Figure 11 is a diagram showing the results of evaluating the degree of viral infection in the lungs for 7 days in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
Figure 12 is a diagram showing the results of evaluating changes in the interferon stimulated gene (IFN-λ) over 7 days in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
Figure 13 is a diagram showing the results of evaluating changes in the interferon stimulated gene CXCL10 over 7 days in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
Figure 14 is a diagram showing the results of evaluating changes in the interferon stimulated gene Mx1 over 7 days in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.Meanwhile, the embodiments of the present invention may be modified into various other forms, and the scope of the present invention is not limited to the embodiments described below. Additionally, the embodiments of the present invention are provided to more completely explain the present invention to those with average knowledge in the relevant technical field.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.Furthermore, “including” a certain element throughout the specification means that other elements may be further included, rather than excluding other elements, unless specifically stated to the contrary.
본 발명의 일 측면은,One aspect of the present invention is,
폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에,In liposomes made from pulmonary surfactant,
인터페론(interferon) 단백질이 결합된 복합체를 함유하는,Containing a complex to which interferon proteins are bound,
인터페론 단백질 전달용 조성물을 제공한다.A composition for delivering interferon protein is provided.
상기 리포좀에 인터페론 단백질이 결합되는 것은, 리포좀의 내부에 결합 및/또는 봉입되는 것일 수 있고, 리포좀의 외부에 결합되는 것일 수도 있다. 본 발명의 실시예에서는, 인터페론 단백질로 인터페론-람다 2/3(interferon-lambda 2/3)를 사용하였다.Binding of the interferon protein to the liposome may mean binding and/or encapsulation inside the liposome, or binding to the outside of the liposome. In an example of the present invention, interferon-lambda 2/3 (interferon-lambda 2/3) was used as the interferon protein.
상기 폐 계면활성제는 생체 유래(소 또는 돼지 등)의 폐 계면활성제일 수 있으며, 본 발명은 실시예를 통해 폐 계면활성제를 이용하여 인터페론 단백질 전달용 조성물을 제조하였다. 상기 폐 계면활성제는 생체 유래의 폐 계면활성제에 한정되는 것은 아니라, 생체 유래의 폐 계면활성제를 모사(mimic)한 것을 포함할 수 있으며, 합성, 반-합성(즉, 개질된 천연) 폐 계면활성제를 포함할 수 있다.The pulmonary surfactant may be a pulmonary surfactant of biological origin (bovine or porcine, etc.), and in the present invention, a composition for interferon protein delivery was prepared using the pulmonary surfactant through examples. The pulmonary surfactant is not limited to a bio-derived pulmonary surfactant, but may include a mimic of a bio-derived pulmonary surfactant, and may include synthetic, semi-synthetic (i.e., modified natural) pulmonary surfactant. may include.
상기 생체 유래 폐 계면활성제를 모사한 계면활성제, 또는 합성 또는 반-합성 폐 계면활성제는 생체 유래 폐 계면활성제와 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90% 이상의 단백질 상동성을 갖는 것을 포함한다.The surfactant mimicking the bio-derived pulmonary surfactant, or the synthetic or semi-synthetic pulmonary surfactant, is 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% of the bio-derived pulmonary surfactant. %, or having a protein homology of 90% or more.
상기 리포좀에 결합되는 인터페론 단백질은, 양전하를 띠는 단백질을 매개로 리포좀에 결합되며, 상기 양전하를 띠는 단백질로는 프로타민(protamine), 히스톤 단백질(histone), 리소자임(lysozyme) 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 FDA 승인을 받은 프로타민을 사용할 수 있다. 프로타민은 프로타민 1, 프로타민 2, 또는 이들의 혼합물을 제한 없이 사용할 수 있다.The interferon protein bound to the liposome is bound to the liposome through a positively charged protein, and protamine, histone protein, lysozyme, etc. can be used as the positively charged protein. , Preferably, FDA-approved protamine can be used. Protamine may be used without limitation, such as protamine 1, protamine 2, or a mixture thereof.
상기 리포좀에 봉입되는 인터페론 단백질은, 음전하를 띠는 단백질인 것이 바람직하다. 음전하를 띠는 인터페론 단백질을 탑재하기 위해 양전하를 띠는 프로타민을 링커로 사용한 것인데, 그 이유는, 단백질 구조를 훼손하지 않으면서 본래 단백질 형태를 보존한 상태로 전달하고자 하기 위함이다.The interferon protein encapsulated in the liposome is preferably a negatively charged protein. In order to load the negatively charged interferon protein, the positively charged protamine was used as a linker. The reason is to deliver the protein in a state that preserves its original form without damaging the protein structure.
상기 인터페론 단백질 전달용 조성물은, 리포좀에 결합된 인터페론 단백질을 폐(lung)로 선택적으로 전달할 수 있으며, 이는 리포좀을 이루는 폐 계면활성제와, 폐에 존재하는 세포와의 상호작용에 의한 것이다.The composition for delivering interferon proteins can selectively deliver interferon proteins bound to liposomes to the lungs, and this is due to the interaction between the lung surfactant forming the liposomes and the cells present in the lungs.
보다 구체적으로, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)일 수 있다. 즉, 상기 폐 계면활성제는 포유류의 폐로부터 수집된 포유류 폐 계면활성제를 포함할 수 있다. 이때 포유류란 사람일 수 있고, 사람을 제외한 동물, 구체적으로 돼지나 소일 수 있다.More specifically, the pulmonary surfactant may be a lipid-protein complex produced by type II alveolar cells. That is, the pulmonary surfactant may include mammalian pulmonary surfactant collected from the lungs of mammals. In this case, mammals can be either humans or animals other than humans, specifically pigs or cows.
일반적으로 천연 폐 계면활성제는 상기 타입 II 폐포 세포(alveolar type II cell)에서 분비되고 저장되므로, 폐 계면활성제 기반인 리포좀은 타입 II 폐포 세포를 효율적으로 표적하여 결합된 인터페론 단백질을 전달할 수 있다.In general, natural pulmonary surfactant is secreted and stored in the type II alveolar cells (alveolar type II cells), so liposomes based on pulmonary surfactant can efficiently target type II alveolar cells and deliver the bound interferon protein.
상기 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)에서 지질이라는 용어는, 일반적으로 양친매성인 천연 발생이거나, 합성 또는 반-합성(즉, 개질된 천연) 화합물을 의미한다. 지질은 전형적으로 친수성 성분과 소수성 성분을 포함한다. 예시적인 지질에는 인지질, 지방산, 지방 알코올, 중성 지방, 포스파디드, 오일, 당지질, 지방족 알코올, 왁스, 테르펜 및 스테로이드가 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. "반-합성(또는 개질된 천연)"이라는 어구는 어떠한 방법으로 화학적으로 개질된 천연 화합물을 나타낸다.The term lipid in the above lipid-protein complex refers to a naturally occurring, synthetic or semi-synthetic (i.e. modified natural) compound that is generally amphipathic. Lipids typically contain hydrophilic and hydrophobic components. Exemplary lipids include, but are not limited to, phospholipids, fatty acids, fatty alcohols, neutral fats, phosphadides, oils, glycolipids, aliphatic alcohols, waxes, terpenes, and steroids. The phrase “semi-synthetic (or modified natural)” refers to a natural compound that has been chemically modified in some way.
인지질의 예에는 천연 및/또는 합성 인지질이 포함된다.Examples of phospholipids include natural and/or synthetic phospholipids.
사용될 수 있는 인지질에는 포스파티딜콜린(포화 및 불포화), 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜이노시톨, 스핑고지질, 디아실글리세라이드, 카르디올리핀, 세라마이드 및 세레브로사이드 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 예시적인 인지질에는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC), 디라우릴 포스파티딜콜린(DLPC) (C12:0), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) (C14:0), 디스테아로일 포스파티딜콜린(DSPC), 디피타노일 포스파티딜콜린, 노나데카노일 포스파티딜콜린, 아라키도일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) (C18:1), 디팔미톨레오일 포스파티딜콜린(C16:1), 리노레오일 포스파티딜콜린(C18:2), 미리스토일 팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 스테로일 미리스토일 포스파티딜콜린(SMPC), 스테로일 팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일 팔미토올레오일 포스파티딜콜린(PPoPC), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 디미리스토일포스파티딜에탄올아민(DMPE), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(DSPE), 디올레오일 포스파티딜글리세롤(DOPG), 팔미토일올레오일 포스파티딜글리세롤(POPG), 디팔미토일 포스파티딜글리세롤(DPPG), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일 포스파티딜글리세롤(DSPG), 디미리스토일포스파티딜세린(DMPS), 디스테아로일포스파티딜세린(DSPS), 팔미토일올레오일 포스파티딜세린(POPS), 대두 레시틴, 난황 레시틴, 스핑고미엘린, 포스파티딜이노시톨, 디포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티드산 및/또는 달걀 포스파티딜콜린(EPC)이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.Phospholipids that may be used include phosphatidylcholine (saturated and unsaturated), phosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidic acid, phosphatidylinositol, sphingolipids, diacylglycerides, cardiolipin, ceramides, and cerebrosides. However, it is not limited to this. Exemplary phospholipids include dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), dilauryl phosphatidylcholine (DLPC) (C12:0), dimyristoyl phosphatidylcholine (DMPC) (C14:0), distearoyl phosphatidylcholine (DSPC), dipytanoyl Phosphatidylcholine, nonadecanoyl phosphatidylcholine, arachidoyl phosphatidylcholine, dioleoyl phosphatidylcholine (DOPC) (C18:1), dipalmitoleoyl phosphatidylcholine (C16:1), linoleoyl phosphatidylcholine (C18:2), myristoyl Palmitoyl phosphatidylcholine (MPPC), Steroyl myristoyl phosphatidylcholine (SMPC), Steroyl palmitoyl phosphatidylcholine (SPPC), Palmitoyl oleoyl phosphatidylcholine (POPC), Palmitoyl palmitoyl phosphatidylcholine (PPoPC), Dipalmi Toyl phosphatidylethanolamine (DPPE), palmitoyl oleoyl phosphatidylethanolamine (POPE), dioleoyl phosphatidylethanolamine (DOPE), dimyristoyl phosphatidylethanolamine (DMPE), distearoyl phosphatidylethanolamine (DSPE) , dioleoyl phosphatidylglycerol (DOPG), palmitoyl oleoyl phosphatidylglycerol (POPG), dipalmitoyl phosphatidylglycerol (DPPG), dimyristoyl phosphatidylglycerol (DMPG), distearoyl phosphatidylglycerol (DSPG), Myristoylphosphatidylserine (DMPS), distearoylphosphatidylserine (DSPS), palmitoyloleoyl phosphatidylserine (POPS), soy lecithin, egg yolk lecithin, sphingomyelin, phosphatidylinositol, diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, These include, but are not limited to, phosphatidic acid and/or egg phosphatidylcholine (EPC).
지방산 및 지방 알코올의 예에는 스테롤, 팔미트산, 세틸 알코올, 라우르산, 미리스트산, 스테아르산, 피탄산 및/또는 디팔미트산 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다. 예시적인 지방산에는 팔미트산이 포함된다.Examples of fatty acids and fatty alcohols include, but are not limited to, sterols, palmitic acid, cetyl alcohol, lauric acid, myristic acid, stearic acid, phytanic acid, and/or dipalmitic acid. Exemplary fatty acids include palmitic acid.
지방산 에스테르의 예에는 메틸 팔미테이트, 에틸 팔미테이트, 이소프로필 팔미테이트, 콜레스테릴 팔미테이트, 팔미틸 팔미테이트, 나트륨 팔미테이트, 칼륨 팔미테이트 및/또는 트리팔미틴 등이 포함되지만, 이로 한정되지 않는다.Examples of fatty acid esters include, but are not limited to, methyl palmitate, ethyl palmitate, isopropyl palmitate, cholesteryl palmitate, palmityl palmitate, sodium palmitate, potassium palmitate and/or tripalmitine, etc. .
한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는데, 이 막 단백질의 존재로 인하여 타입 II 폐포세포를 선택적이고 효과적으로 표적할 수 있게 된다. 상기 막 단백질은 SP-A, SP-B, SP-C 및 SP-D로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 천연 계면활성제 폴리펩타이드, 이들의 일부분 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예시적인 펩타이드는 천연 계면활성제 폴리펩타이드의 적어도 약 1 내지 50개의 아미노산, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 절편을 포함할 수 있다. 예시적인 SP-B 폴리펩타이드는 SP-B의 적어도 약 1 내지 50개의 아미노산, 또는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 아미노산 절편을 포함할 수 있다. SP-B 펩타이드는 아미노-말단 펩타이드일 수도 있고 카르복시-말단 펩타이드일 수도 있다. 예시적인 SP-B 펩타이드는 25-아미노산 아미노 말단 펩타이드일 수 있다.Meanwhile, the pulmonary surfactant contains a membrane protein, and the presence of this membrane protein allows it to selectively and effectively target type II alveolar cells. The membrane protein may include one or more natural surfactant polypeptides selected from the group consisting of SP-A, SP-B, SP-C, and SP-D, a portion thereof, or a mixture thereof. Exemplary peptides may include at least about 1 to 50 amino acids, or fragments of 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 amino acids of a natural surfactant polypeptide. Exemplary SP-B polypeptides may comprise at least about 1 to 50 amino acids, or 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 amino acid segments of SP-B. The SP-B peptide may be an amino-terminal peptide or a carboxy-terminal peptide. An exemplary SP-B peptide may be a 25-amino acid amino terminal peptide.
다른 실시 형태에서, 상기 폐 계면활성제는 재조합적으로 생성되는 계면활성제 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 재조합 SP-A, SPB, SP-C, SP-D 또는 그의 일부분이 각종 공지된 기술을 이용하여 적합한 원핵생물 또는 진핵생물 발현 시스템에서 SP-A, SP-B, SP-C, SP-D 또는 그의 일부분을 암호화하는 DNA 서열을 발현시킴으로써 획득 가능하다. 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 단리된 핵산을 포함하도록 용이하게 적합화된 재조합벡터들, 재조합 백터들을 함유하는 숙주 세포들 및 그러한 벡터들 및 숙주 세포들을 제조하는 방법과, 이외에도 재조합 기술에 의한 인코딩된 폴리펩타이드의 생성에 있어서의 그들의 사용은 익히 공지되어 있다. 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 핵산은, 적어도 하나의 조절 서열에 작동 가능하게 연결되는 계면활성제 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에서 제공될 수 있다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택 및/또는 발현되기를 원하는 단백질의 유형과 같은 인자들에 달려 있을 수 있음이 이해되어야 한다. 벡터 카피 수, 그 카피 수의 제어 능력, 및 벡터에 의해 인코딩된 임의의 다른 단백질(예를 들어, 항생제 마커(antibiotic marker))의 발현이 고려되어야 한다. 예를 들어, 융합 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한 단백질 또는 폴리펩타이드를 생성하기 위해서, 배양으로 증식된 세포에서 키나아제 및 포스파타아제 폴리펩타이드의 발현 및 과잉발현을 야기시키는 데 대상의 핵산이 사용될 수 있다.In another embodiment, the pulmonary surfactant may comprise a recombinantly produced surfactant polypeptide. Recombinant SP-A, SPB, SP-C, SP-D, or portions thereof, can be expressed as SP-A, SP-B, SP-C, SP-D or It can be obtained by expressing the DNA sequence encoding part of it. Recombinant vectors readily adapted to contain isolated nucleic acids encoding surfactant polypeptides or portions thereof, host cells containing recombinant vectors and methods of producing such vectors and host cells, and in addition to recombinant techniques Their use in the production of encoded polypeptides is well known. A nucleic acid encoding a surfactant polypeptide, or portion thereof, can be provided in an expression vector comprising a nucleotide sequence encoding the surfactant polypeptide operably linked to at least one regulatory sequence. It should be understood that the design of an expression vector may depend on factors such as the choice of host cell to be transformed and/or the type of protein desired to be expressed. Vector copy number, the ability to control that copy number, and the expression of any other proteins encoded by the vector (e.g., antibiotic markers) should be considered. For example, nucleic acids of interest can be used to cause expression and overexpression of kinase and phosphatase polypeptides in cells grown in culture to produce proteins or polypeptides, including fusion proteins or polypeptides.
계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 발현하기 위해서, 숙주 세포들이 재조합 유전자로 형질감염(숙주 세포가 진핵세포일 경우), 또는 형질전환(숙주 세포가 원핵세포일 경우)될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 세균성 세포, 예를 들어 E. 콜리(E. coli), 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 예들에서, 숙주 세포가 사람일 경우, 그것은 살아 있는 대상에서 일 수도 있고 아닐 수도 있다. 다른 적합한 숙주 세포가 당업자들에게 공지되어 있다. 추가적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드의 발현을 최적화하도록 하기 위해서, 숙주에서는 전형적으로는 발견되지 않는 tRNA 분자들로 보충될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 최대화하는 데 적합한 다른 방법들이 당업자들에게 공지되어 있을 것이다. 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 계면활성제 폴리펩타이드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염, 또는 형질전환된 숙주 세포가 폴리펩타이드의 발현이 일어나게 하는 적절한 조건 하에서 배양될 수 있다. 폴리펩타이드는 세포들과 폴리펩타이드를 함유하는 배지의 혼합물로부터 분비되고 단리될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 세포질적으로 그대로 유지될 수 있다. 이어서, 세포가 수집되고, 용해되고, 단백질이 세포 용해물로부터 단리된다.To express a surfactant polypeptide or portion thereof, host cells can be transfected (if the host cell is a eukaryotic cell) or transformed (if the host cell is a prokaryotic cell) with a recombinant gene. The host cell can be any prokaryotic or eukaryotic cell. For example, the polypeptide can be expressed in bacterial cells, such as E. coli, insect cells, yeast, or mammalian cells. In these examples, if the host cell is human, it may or may not be from a living subject. Other suitable host cells are known to those skilled in the art. Additionally, host cells can be supplemented with tRNA molecules not typically found in the host to optimize expression of the polypeptide. Other methods suitable for maximizing expression of polypeptides will be known to those skilled in the art. Methods for producing polypeptides are well known in the art. For example, transfected with an expression vector encoding a surfactant polypeptide or a portion thereof, or transformed host cells can be cultured under appropriate conditions to allow expression of the polypeptide. Polypeptides can be secreted and isolated from a mixture of cells and medium containing the polypeptide. Alternatively, the polypeptide may remain cytoplasmically intact. The cells are then collected, lysed, and proteins are isolated from the cell lysate.
상기 계면활성제 폴리펩타이드와 계면활성제 지질은 정수압 상호작용(hydrostatic interaction)에 의해 상호작용한다. 하전된 아미노산은 지질의 극성 머리 기와 상호작용하고, 소수성 아미노산은 인지질 아실 측쇄와 상호작용한다. 예를 들어, SP-B 및 SP-C는 소수성 단백질이다. SP-B 및 SP-C 둘 모두 음이온성 지질(예를 들어, 포스파티딜글리세롤(PG))과 우선적으로 결합한다. SP-A 및 SP-D는 친수성 단백질이며, 글리세로인지질, 스핑고인지질, 스핑고당지질, 지질 A 및 리포글리칸을 포함한, 넓은 범위의 양친매성 지질들과 상호작용한다. SP-A는 DPPC와 결합한다. 예로서, SP-B 모방체인 KL4과 천연 계면활성제 중의 지질들 또는 표면 활성제 중에 포함된 지질들의 정수압 상호작용이 관찰된다. 예를 들어, KL4 펩타이드 중의 리신 잔기는 DPPC의 하전된 머리 기와 상호작용하고, 소수성 류신 잔기는 포스파티딜글리세롤의 인지질 아실 측쇄와 상호작용한다.The surfactant polypeptide and the surfactant lipid interact by hydrostatic interaction. Charged amino acids interact with the polar head groups of lipids, and hydrophobic amino acids interact with phospholipid acyl side chains. For example, SP-B and SP-C are hydrophobic proteins. Both SP-B and SP-C bind preferentially to anionic lipids (e.g., phosphatidylglycerol (PG)). SP-A and SP-D are hydrophilic proteins and interact with a wide range of amphipathic lipids, including glycerophospholipids, sphingophospholipids, sphingoglycolipids, lipid A, and lipoglycans. SP-A binds to DPPC. As an example, hydrostatic interactions between the SP-B mimetic KL4 and lipids in natural surfactants or lipids contained in surface active agents are observed. For example, the lysine residue in the KL4 peptide interacts with the charged head group of DPPC, and the hydrophobic leucine residue interacts with the phospholipid acyl side chain of phosphatidylglycerol.
한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 인터페론 단백질이 결합된 복합체의 평균 직경 범위는 특별히 제한되는 것은 아니나, 몇 가지 구체예를 들면, 100 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 120 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 140 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 160 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 180 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 200 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 220 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 240 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 100 내지 1000 nm 범위일 수 있고, 100 내지 800 nm 범위일 수 있고, 100 내지 600 nm 범위일 수 있고, 100 내지 400 nm 범위일 수 있고, 100 내지 300 nm 범위일 수 있고, 100 내지 280 nm 범위일 수 있고, 100 내지 260 nm 범위일 수 있고, 120 내지 1000 nm 범위일 수 있고, 140 내지 800 nm 범위일 수 있고, 160 내지 600 nm 범위일 수 있고, 180 내지 400 nm 범위일 수 있고, 200 내지 300 nm 범위일 수 있고, 220 내지 280 nm 범위일 수 있고, 240 내지 260 nm 범위일 수 있고, 245 내지 255 nm 범위일 수 있고, 또는 247 내지 250 nm 범위일 수 있다. 만약 직경 범위가 100 nm 미만이면 인터페론 단백질이 리포좀에 유효량만큼 결합되지 못하는 문제가 발생하고, 직경 범위가 1200 nm 초과이면 리포좀을 폐포(lung alveolus)에 전달하기 힘들 수 있다.Meanwhile, the average diameter range of the complex in which the interferon protein is bound to the liposome prepared from the pulmonary surfactant is not particularly limited, but may range from 100 to 1200 nm, for example, and may be 120 nm. may range from 140 to 1200 nm, may range from 160 to 1200 nm, may range from 180 to 1200 nm, may range from 200 to 1200 nm, may range from 220 to 1200 nm. may range from 240 to 1200 nm, may range from 100 to 1000 nm, may range from 100 to 800 nm, may range from 100 to 600 nm, may range from 100 to 400 nm, and may range from 100 to 800 nm. It may range from 300 nm, it may range from 100 to 280 nm, it may range from 100 to 260 nm, it may range from 120 to 1000 nm, it may range from 140 to 800 nm, it may range from 160 to 600 nm. and may range from 180 to 400 nm, may range from 200 to 300 nm, may range from 220 to 280 nm, may range from 240 to 260 nm, may range from 245 to 255 nm, or may range from 247 to 255 nm. It may be in the 250 nm range. If the diameter range is less than 100 nm, a problem arises in which the interferon protein cannot be bound to the liposome in an effective amount, and if the diameter range is more than 1200 nm, it may be difficult to deliver the liposome to the lung alveolus.
상기 복합체의 평균 직경은, 상기 복합체 제조시 사용하는 폐 계면활성제, 양전하를 띠는 단백질 또는 펩타이드 등의 사용량 조절과, 압출기 키트(extruder kit)를 사용하여 적절히 조절할 수 있다.The average diameter of the complex can be appropriately adjusted by controlling the amount of waste surfactant, positively charged protein or peptide used in manufacturing the complex, and using an extruder kit.
상기 인터페론 단백질 전달용 조성물은 흡입에 의해 폐로 전달될 수 있다. 흡입 장치, 예를 들어 흡입기(건조 분말 흡입기 및 정량식 흡입기를 포함함) 및 네불라이저(아토마이저로도 알려짐)가 결합된 인터페론 단백질을 폐로 전달하는데 사용될 수 있다. 예시적인 건조 분말 흡입기는 인헤일 테라퓨틱 시스템즈(Inhale Therapeutic Systems)으로부터 획득할 수 있다. 건조 분말 흡입기는 쓰리엠(3M)으로부터 획득할 수도 있다.The composition for delivering interferon protein can be delivered to the lungs by inhalation. Inhalation devices, such as inhalers (including dry powder inhalers and metered dose inhalers) and nebulizers (also known as atomizers), can be used to deliver combined interferon proteins to the lungs. Exemplary dry powder inhalers can be obtained from Inhale Therapeutic Systems. Dry powder inhalers can also be obtained from 3M.
본 발명의 다른 일 측면은,Another aspect of the present invention is,
(단계 1) 폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;(Step 1) Preparing a first solution in which lung surfactant is dissolved;
(단계 2) 상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;(Step 2) drying the solution in which the prepared lung surfactant is dissolved to form a lipid film;
(단계 3) 상기 형성된 지질막에, 인터페론 단백질이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 인터페론 단백질이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는,(Step 3) hydrating the formed lipid membrane with a second solution containing dissolved interferon protein to prepare a complex in which the interferon protein is bound to a liposome prepared with lung surfactant; Including,
인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 제공한다.A method for producing a composition for delivering interferon protein is provided.
이하, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.Hereinafter, the method for manufacturing the composition for interferon protein delivery provided by one aspect of the present invention will be described in detail step by step.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 1은 폐 계면활성제가 용해된 제1 용액을 준비하는 단계이다. 폐 계면활성제의 용해를 위해 사용하는 용매 종류로는, 폐 계면활성제를 용이하게 용해시킬 수 있는 용매라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 일 구체예로는 클로로포름, 메탄올 등의 단독, 또는 조합하여 사용할 수 있다. 폐 계면활성제 고유의 특성으로 인하여 추후 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀은 폐에 존재하는 세포와의 상호작용에 의해 폐를 선택적으로 표적할 수 있는 효과가 발생한다. 한편, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질과 단백질로 구성된 복합체(lipid-protein complex)이고, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는 것이 바람직하다. 일 측면에서, 상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 인터페론 단백질이 결합된 복합체는 타입 II 폐포세포를 표적할 수 있다.In the method for producing a composition for interferon protein delivery provided in one aspect of the present invention, step 1 is a step of preparing a first solution in which lung surfactant is dissolved. The type of solvent used to dissolve the waste surfactant can be used without limitation as long as it can easily dissolve the waste surfactant. One specific example is chloroform, methanol, etc., which can be used alone or in combination. . Due to the unique properties of lung surfactant, liposomes later manufactured from lung surfactant have the effect of selectively targeting the lung through interaction with cells present in the lung. Meanwhile, the pulmonary surfactant is a lipid-protein complex produced in type II alveolar cells, and the pulmonary surfactant is a membrane It is preferable to include protein (membrane protein). In one aspect, a complex in which an interferon protein is bound to a liposome prepared from the pulmonary surfactant can target type II alveolar cells.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 2는 상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계이다.In the method for producing a composition for interferon protein delivery provided in one aspect of the present invention, step 2 is a step of drying the solution in which the lung surfactant is dissolved to form a lipid film.
지질막을 형성시키는 방법은 통상적으로 공지된 방법을 채용하여 수행할 수 있으며, 일 구체예로는 상기 폐 계면활성제가 용해된 용액을 유리 바이알에 넣고 상온에서 건조시켜 지질막을 형성시킬 수 있다.The method of forming a lipid film can be performed by employing a commonly known method. In one specific example, a solution in which the lung surfactant is dissolved is placed in a glass vial and dried at room temperature to form a lipid film.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법에 있어서, 단계 3은 상기 형성된 지질막에, 인터페론 단백질이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시켜, 인터페론 단백질이 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 결합된 복합체를 제조하는 단계이다.In the method for producing a composition for delivering interferon protein provided in one aspect of the present invention, step 3 is a liposome in which the formed lipid membrane is treated with a second solution in which the interferon protein is dissolved to hydrate the formed lipid membrane, and the interferon protein is produced as a lung surfactant. This is the step of manufacturing a complex bound to.
이때, 상기 형성된 지질막에, 인터페론 단백질이 용해된 제2 용액을 처리해 수화시키는 단계에서, 양전하를 띠는 단백질이 용해된 제3 용액을 함께 처리하여, 리포좀에 결합되는 인터페론 단백질이, 양전하를 띠는 단백질을 매개로 리포좀에 결합될 수 있게 유도하는 것이 바람직하다.At this time, in the step of treating and hydrating the formed lipid membrane with the second solution in which the interferon protein is dissolved, the third solution in which the positively charged protein is dissolved is also treated, so that the interferon protein bound to the liposome is positively charged. It is desirable to induce binding to the liposome through a protein.
전술한 바와 같이, 인터페론 단백질은 음전하를 띠므로, 지질막의 수화 단계에서 양전하를 띠는 단백질이 용해된 제3 용액을 함께 처리하면, 양전하를 띠는 단백질을 매개로, 인터페론 단백질이 폐 계면활성제로 형성되는 리포좀 내·외부에 안정하게 결합될 수 있다(도 1). 이렇게, 인터페론 단백질이 폐 계면활성제로 형성되는 리포좀 내부 및/또는 외부에 안정하게 결합되면, 생체 내 투여시 인터페론 단백질 구조가 훼손되지 않으면서 본래 인터페론 단백질 형태를 보존한 상태로 폐에 전달될 수 있다.As mentioned above, since the interferon protein has a negative charge, when the third solution in which the positively charged protein is dissolved is treated together in the hydration step of the lipid membrane, the interferon protein is converted into a lung surfactant through the positively charged protein. It can be stably bound inside and outside the formed liposome (Figure 1). In this way, if the interferon protein is stably bound to the inside and/or outside of the liposome formed with pulmonary surfactant, the interferon protein structure is not damaged when administered in vivo and can be delivered to the lungs with the original form of the interferon protein preserved. .
본 발명의 일 측면은 음전하를 띠는 인터페론 단백질을 폐 내로 깊숙이 전달하기 위해 생체친화적인 폐 계면활성제입자와 양전하를 띠는 프로타민 단백질을 활용해 입자화 시키는 방법을 최적화하는 발명이며, 이 최적화는 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때 폐 계면활성제, 인터페론 단백질, 양전하를 띠는 단백질의 사용량을 아래와 같이 특정함으로써 달성될 수 있다.One aspect of the present invention is an invention that optimizes a method of particleizing the negatively charged interferon protein using biocompatible pulmonary surfactant particles and the positively charged protamine protein to deliver the negatively charged interferon protein deep into the lungs, and this optimization is achieved by optimizing the interferon protein. This can be achieved by specifying the amount of lung surfactant, interferon protein, and positively charged protein used when performing the method of manufacturing the composition for protein delivery as follows.
보다 구체적으로,More specifically,
상기 인터페론 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때,When carrying out the method for producing the composition for delivering interferon protein,
인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 80 내지 120 중량부만큼 사용함과 동시에, 인터페론 단백질 1 몰 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 1 내지 10 몰 비율 만큼 사용하는 것이 바람직하다.It is preferable to use 80 to 120 parts by weight of lung surfactant based on 1 part by weight of interferon protein, and at the same time, it is preferable to use 1 to 10 molar ratio of positively charged protein based on 1 mole of interferon protein.
폐 계면활성제의 경우,For lung surfactant,
더욱 바람직하게는 상기 인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 85 내지 115 중량부만큼 사용할 수 있고,More preferably, 85 to 115 parts by weight of lung surfactant can be used based on 1 part by weight of the interferon protein,
더욱 바람직하게는 상기 인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 90 내지 110 중량부만큼 사용할 수 있고,More preferably, 90 to 110 parts by weight of lung surfactant can be used based on 1 part by weight of the interferon protein,
더욱 바람직하게는 상기 인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 95 내지 105 중량부만큼 사용할 수 있고, 또는More preferably, 95 to 105 parts by weight of lung surfactant can be used based on 1 part by weight of the interferon protein, or
가장 바람직하게는 상기 인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용할 수 있다.Most preferably, 100 parts by weight of lung surfactant can be used based on 1 part by weight of the interferon protein.
본 발명의 일 실시예에서는 인터페론 단백질을 10μg만큼, 폐 계면활성제는 1mg만큼 사용하여 복합체를 제조하였다. 즉, 실시예에서는 인터페론 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용한 것이다.In one example of the present invention, a complex was prepared using 10 μg of interferon protein and 1 mg of lung surfactant. That is, in the example, 100 parts by weight of lung surfactant was used based on 1 part by weight of interferon protein.
이와 동시에,At the same time,
양전하를 띠는 단백질의 경우,For proteins with a positive charge,
더욱 바람직하게는 인터페론 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 2 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,More preferably, 2 to 10 moles of positively charged protein can be used based on 1 mole of interferon protein,
더욱 바람직하게는 인터페론 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 4 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,More preferably, 4 to 10 moles of positively charged protein can be used based on 1 mole of interferon protein,
더욱 바람직하게는 인터페론 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 6 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고,More preferably, 6 to 10 moles of positively charged protein can be used based on 1 mol of interferon protein,
더욱 바람직하게는 인터페론 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 8 내지 10 몰만큼 사용할 수 있고, 또는More preferably, 8 to 10 moles of positively charged protein can be used based on 1 mol of interferon protein, or
가장 바람직하게는 인터페론 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질을 10 몰만큼 사용할 수 있다.Most preferably, 10 moles of positively charged protein can be used based on 1 mol of interferon protein.
본 발명의 일 실시예에 있어서,In one embodiment of the present invention,
봉입대상 단백질 사용량을 50μg으로, 폐 계면활성제 사용량을 5mg으로 고정할 때, 봉입대상 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질 사용량을 다양하게 변화시킴에 따라 변화하는 봉입대상 단백질 로딩 효율, 크기, Zeta potential 결과가 도 2에 입증되어 있으며, 도 2의 그래프상 x축에서의 비율이 봉입대상 단백질 1 몰(mol) 기준으로 양전하를 띠는 단백질의 사용 몰(mol)을 의미한다. 도 2의 결과는 인터페론 단백질과 비교하여 분자량과 Zeta potential이 매우 유사한 GFP를 봉입대상 단백질로 사용해 얻은 결과이다. 도 2로부터, 1:10 몰 비율 초과일 때부터 탑재율이 오히려 낮아졌을뿐만 아니라, 입자의 크기가 비정상적으로 뭉치는 경향을 보였고, 입자의 전하가 변동하면서 불안정한 형태를 보였다. 따라서, 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 프로타민을 10몰 만큼 사용하는 것이, 결합효율(%) 측면에서 바람직함을 확인하였다. 후술하는 표 1에서 확인 가능하듯이, 초록형광단백질은 인터페론 람다 2/3 단백질과 유사하게 음전하를 띄고있고 분자량도 유사하기 때문에, 인터페론 람다 2/3 단백질을 탑재할 경우도 해당 수치에서 우수한 결합효율(%)이 달성될 것임을 알 수 있다.When the amount of protein to be encapsulated is fixed to 50 μg and the amount of lung surfactant to be used is fixed to 5 mg, the loading efficiency of protein to be encapsulated changes as the amount of positively charged protein used is varied based on 1 mole (mol) of protein to be encapsulated, The size and Zeta potential results are shown in Figure 2, and the ratio on the x-axis of the graph in Figure 2 means the mole (mol) of positively charged protein used based on 1 mole (mol) of protein to be encapsulated. The results in Figure 2 are obtained using GFP, which has a very similar molecular weight and Zeta potential compared to the interferon protein, as the encapsulation target protein. From Figure 2, not only did the loading rate decrease when the molar ratio exceeded 1:10, but the particle size tended to agglomerate abnormally, and the particle charge fluctuated, showing an unstable form. Therefore, it was confirmed that it is preferable in terms of binding efficiency (%) to use 10 moles of protamine based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP). As can be seen in Table 1 described later, the green fluorescent protein has a negative charge similar to the interferon lambda 2/3 protein and has a similar molecular weight, so even when loaded with the interferon lambda 2/3 protein, the binding efficiency is excellent at the corresponding value. It can be seen that (%) will be achieved.
종합하여, 봉입대상 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용하면서, 봉입대상 단백질 1 몰 기준으로 프로타민 단백질을 1 내지 10 몰만큼 사용하여, 인터페론 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하는 것이 바람직함을 확인하였다.In total, 100 parts by weight of lung surfactant is used based on 1 part by weight of protein to be encapsulated, and 1 to 10 moles of protamine protein are used based on 1 mole of protein to be encapsulated, resulting in lung surfactant-based particles bound to interferon protein. It was confirmed that it is desirable to manufacture.
한편, 상기 수화 단계는 지질막이 용이하게 수화될 수 있는 조건이라면 제한 없이 수행할 수 있다. 일 구체예로, 상기 수화는 30 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 35 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 40 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 45 내지 90℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 80℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 70℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 60℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 50℃ 온도에서 수행할 수 있고, 30 내지 45℃ 온도에서 수행할 수 있고, 35 내지 55℃ 온도에서 수행할 수 있고, 40 내지 50℃ 온도에서 수행할 수 있고, 또는 45℃ 온도에서 수행할 수 있다.Meanwhile, the hydration step can be performed without limitation as long as the conditions allow the lipid membrane to be easily hydrated. In one embodiment, the hydration may be performed at a temperature of 30 to 90°C, may be performed at a temperature of 35 to 90°C, may be performed at a temperature of 40 to 90°C, and may be performed at a temperature of 45 to 90°C. and can be performed at a temperature of 30 to 80°C, can be performed at a temperature of 30 to 70°C, can be performed at a temperature of 30 to 60°C, can be performed at a temperature of 30 to 50°C, and can be performed at a temperature of 30 to 45°C. It may be carried out at a temperature of 35 to 55° C., it may be carried out at a temperature of 40 to 50° C., or it may be carried out at a temperature of 45° C.
또한, 상기 수화 단계를 수행한 후, 복합체의 직경을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 압출기 키트를 사용하여 복합체의 직경을 조절하였으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.In addition, after performing the hydration step, a step of adjusting the diameter of the composite may be further included. In one embodiment of the present invention, the diameter of the composite was adjusted using an extruder kit, but it is not particularly limited thereto.
상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에, 인터페론 단백질이 결합된 복합체의 평균 직경 범위는 특별히 제한되는 것은 아니나, 몇 가지 구체예를 들면, 100 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 120 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 140 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 160 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 180 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 200 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 220 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 240 내지 1200 nm 범위일 수 있고, 100 내지 1000 nm 범위일 수 있고, 100 내지 800 nm 범위일 수 있고, 100 내지 600 nm 범위일 수 있고, 100 내지 400 nm 범위일 수 있고, 100 내지 300 nm 범위일 수 있고, 100 내지 280 nm 범위일 수 있고, 100 내지 260 nm 범위일 수 있고, 120 내지 1000 nm 범위일 수 있고, 140 내지 800 nm 범위일 수 있고, 160 내지 600 nm 범위일 수 있고, 180 내지 400 nm 범위일 수 있고, 200 내지 300 nm 범위일 수 있고, 220 내지 280 nm 범위일 수 있고, 240 내지 260 nm 범위일 수 있고, 245 내지 255 nm 범위일 수 있고, 또는 247 내지 250 nm 범위일 수 있다. 만약 직경 범위가 100 nm 미만이면 인터페론 단백질이 리포좀에 유효량만큼 결합되지 못하는 문제가 발생하고, 직경 범위가 1200 nm 초과이면 리포좀을 폐포에 전달하기 힘들 수 있다.The average diameter range of the complex in which the interferon protein is bound to the liposome prepared from the pulmonary surfactant is not particularly limited, but may range from 100 to 1200 nm, for example, and 120 to 1200 nm. may range from 140 to 1200 nm, may range from 160 to 1200 nm, may range from 180 to 1200 nm, may range from 200 to 1200 nm, may range from 220 to 1200 nm, and , may range from 240 to 1200 nm, may range from 100 to 1000 nm, may range from 100 to 800 nm, may range from 100 to 600 nm, may range from 100 to 400 nm, and may range from 100 to 300 nm. may range from 100 to 280 nm, may range from 100 to 260 nm, may range from 120 to 1000 nm, may range from 140 to 800 nm, may range from 160 to 600 nm, may range from 180 to 400 nm, may range from 200 to 300 nm, may range from 220 to 280 nm, may range from 240 to 260 nm, may range from 245 to 255 nm, or may range from 247 to 250 nm. It may be a range. If the diameter range is less than 100 nm, a problem arises in which the interferon protein cannot be bound to the liposome in an effective amount, and if the diameter range is more than 1200 nm, it may be difficult to deliver the liposome to the alveoli.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)로 제조되는 리포좀에 인터페론 단백질이 결합된 복합체는, 생체 내 투여시 인터페론 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 인터페론 단백질 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을뿐만 아니라, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있으며, 이는 후술하는 실시예, 실험예에 의해 뒷받침된다.In one aspect of the present invention, a complex in which an interferon protein is bound to a liposome prepared with a pulmonary surfactant provides a complex that preserves the original form and function of the interferon protein without damaging the structure of the interferon protein when administered in vivo. Not only can it be selectively delivered to the lungs, it has low toxicity and excellent structural stability, which is supported by the examples and experimental examples described later.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples and experimental examples.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.However, the examples and experimental examples described below only specifically illustrate the present invention from one aspect, and the present invention is not limited thereto.
<실시예 1> 인터페론 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자 제조<Example 1> Preparation of lung surfactant-based particles bound to interferon protein
폐 계면활성제가 강한 음전하를 띄고, 인터페론 단백질이 약한 음전하를 띄기 때문에, 중간 연결체로 양전하를 띠는 프로타민(protamine) 단백질을 활용해 인터페론 단백질과 폐 계면활성제간의 결합을 유도한다.Since the lung surfactant has a strong negative charge and the interferon protein has a weak negative charge, the positively charged protamine protein is used as an intermediate linker to induce binding between the interferon protein and the lung surfactant.
구체적인 실험과정은 다음과 같다.The specific experimental process is as follows.
(1) 클로로포름(chloroform)과 메탄올을 2:1(v:v)의 부피비로 혼합한 용액에, 폐 계면활성제 가루(제조사: Mitsubishi / 제품명: Surfacten)를 10 mg/ml 농도로 용해시켜, 폐 계면활성제 용액을 준비한 후, 말린다.(1) Waste surfactant powder (manufacturer: Mitsubishi / product name: Surfacten) was dissolved at a concentration of 10 mg/ml in a solution of chloroform and methanol mixed at a volume ratio of 2:1 (v:v). After preparing the surfactant solution, dry it.
(2) 프로타민(protamine, Sigma-Aldrich에서 구매, CAS Number 53597-25-4, MDL number MFCD00132091) 단백질 5 mg과, 인터페론 람다 2/3(interferon lambda 2/3) 50μg을 각각 증류수 또는 PBS 1 ml에 용해시켜 프로타민 단백질 용액과 인터페론 람다 2/3 용액을 준비한다. 이때, 실험을 위해서 상기 인터페론 람다 2/3을 초록형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)로 대체할 수 있다.(2) 5 mg of protamine (purchased from Sigma-Aldrich, CAS Number 53597-25-4, MDL number MFCD00132091) and 50 μg of interferon lambda 2/3 in 1 ml of distilled water or PBS, respectively. Prepare protamine protein solution and interferon lambda 2/3 solution by dissolving in . At this time, for the experiment, the interferon lambda 2/3 can be replaced with green fluorescent protein (GFP).
(3) 상기 (1)에서 형성된 5 mg의 지질막(lipid film)에, 인터페론 람다 2/3과 프로타민이 1:10 몰 비로 혼합될 수 있도록, 상기 (2)에서 제조한 프로타민 단백질 용액과 인터페론 람다 2/3 용액을 폐 계면활성제 지질막에 처리한다.(3) The protamine protein solution and interferon lambda prepared in (2) above are mixed in 5 mg of the lipid film formed in (1) above, so that 2/3 interferon lambda and protamine can be mixed at a 1:10 molar ratio. Apply 2/3 solution to the waste surfactant lipid membrane.
(4) 45℃ 이상 온도의 핫 플레이트(hot plate)에서 혼합하여 폐 계면활성제 지질막을 수화시켰다. 이때, 20초 가량 vortexing한다.(4) The waste surfactant lipid film was hydrated by mixing on a hot plate at a temperature of 45°C or higher. At this time, vortex for about 20 seconds.
(5) 수화 과정에서 만들어지는 입자는 압출기 키트(Avanti Extrusion kit)를 사용하여 평균 400 nm 사이즈로 입자화한다. 이 과정에서 프로타민 단백질과 인터페론 단백질이 폐 계면활성제 기반 입자 내부 및/또는 외부에 결합된다.(5) The particles produced during the hydration process are converted into particles with an average size of 400 nm using an extruder kit (Avanti Extrusion kit). In this process, protamine proteins and interferon proteins are bound to the inside and/or outside of lung surfactant-based particles.
(6) 이후, 100 kDa 막을 이용한 투석(dialysis) 기법을 통해, 폐 계면활성제 입자에 결합하지 못한 인터페론 단백질을 제거하였다.(6) Afterwards, the interferon protein that did not bind to the lung surfactant particles was removed through dialysis using a 100 kDa membrane.
도 1에 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)를 활용한 인터페론 단백질의 탑재방법 모식도를 나타내었다.Figure 1 shows a schematic diagram of the loading method of interferon protein using pulmonary surfactant.
한편, 전술한 바와 같이, 실험을 위해서 상기 인터페론 람다 2/3을 초록형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)로 대체할 수 있는데, 그 이유는, 초록형광단백질이 형광을 띄고있어 정량적인 면에서 확인이 유리하고, 인터페론 람다 2/3 단백질과 유사하게 음전하를 띄고있기 때문이다.Meanwhile, as described above, for the experiment, the interferon lambda 2/3 can be replaced with green fluorescent protein (GFP), because the green fluorescent protein is fluorescent and can be confirmed quantitatively. This is because it is advantageous and has a negative charge similar to the interferon lambda 2/3 protein.
초록형광단백질은 약 26.9 kDa 분자량 크기를 갖고 있고, DLS(Dynamic light scattering) 장비를 통해 전하를 측정해 보았을 때 약 -5 내지 -7 mV의 음전하를 띄고있다. 해당 내용을 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.The green fluorescent protein has a molecular weight of about 26.9 kDa, and has a negative charge of about -5 to -7 mV when the charge is measured using DLS (Dynamic light scattering) equipment. The contents are summarized in Table 1 below.
한편, 실험적 측면에서의 확인을 위해, 상기 인터페론 람다 2/3을 대체한 초록형광단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)의 최대 결합효율(%)을 달성하기 위하여, 폐 계면활성제와 프로타민의 사용량을 다양하게 조절하며, 전술한 과정을 통해 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조해보았다.Meanwhile, for experimental confirmation, the amounts of lung surfactant and protamine used were varied in order to achieve the maximum binding efficiency (%) of Green Fluorescent Protein (GFP), which replaced interferon lambda 2/3. We manufactured protein-bound lung surfactant-based particles through the above-described process by adjusting the results to a certain degree.
보다 구체적으로, 비율 최적화를 위해, 입자 제조시 사용하는 초록형광단백질(GFP) 양과 폐 계면활성제의 양을 50μg, 5mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 변화시켜 보았다. 즉, 모델 단백질인 초록형광단백질(GFP) 양을 50μg으로 고정한 상태에서, 폐 계면활성제 양을 5mg으로 고정하고, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 몰 대비 1배 (1:1 mol/mol)에서 20배 (1:20 mol/mol)까지 구분하여 사용하였다.More specifically, to optimize the ratio, the amount of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant used in particle production were fixed at 50 μg and 5 mg, and the amount of protamine was varied. In other words, the amount of green fluorescent protein (GFP), a model protein, is fixed at 50 μg, the amount of lung surfactant is fixed at 5 mg, and the amount of protamine is 1 times the mole of green fluorescent protein (GFP) (1:1 mol/mol). It was used up to 20 times (1:20 mol/mol).
<실험예 1> 폐 계면활성제와 프로타민 사용량에 따른, 결합대상 단백질 초록형광단백질(GFP)의 탑재율(%) 변화 평가<Experimental Example 1> Evaluation of changes in loading rate (%) of the binding target protein green fluorescent protein (GFP) according to the amount of lung surfactant and protamine used
상기 <실시예 1>에서 투석(dialysis) 기법을 통해 입자 속 결합되지 못한 단백질을 제거하기 전과 후 초록형광단백질(GFP) 형광을 통한 입자 내 결합된 단백질의 양 비교를 통해, 탑재율(%) 변화를 평가하였다. 전술한 바와 같이, 초록형광단백질(GFP) 양은 인터페론 단백질과 동일하게 50μg 으로 고정하였다.Change in loading rate (%) by comparing the amount of protein bound in the particle through green fluorescent protein (GFP) fluorescence before and after removing the unbound protein in the particle through the dialysis technique in <Example 1>. was evaluated. As described above, the amount of green fluorescent protein (GFP) was fixed at 50 μg, the same as the interferon protein.
초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각각 50μg, 5mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:0, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 DLS로 측정해 살펴보았다.With the amounts of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant fixed at 50 μg and 5 mg, respectively, the amount of protamine was 1:0, 1:1, 1:5, 1:10, 1 based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP). : While increasing the molar ratio to 20, the green fluorescent protein (GFP) loading rate and particle size and charge were measured by DLS.
그 결과를 도 2에 나타내었다.The results are shown in Figure 2.
도 2는 초록형광단백질(GFP)과 폐 계면활성제 양을 각기 50μg, 5mg으로 고정한 상태에서, 프로타민 양을 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 1:0, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20 몰 비율로 늘려가면서 초록형광단백질(GFP) 탑재율과 입자의 크기 및 전하를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 2 shows the amount of protamine based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP), with the amounts of green fluorescent protein (GFP) and lung surfactant fixed at 50 μg and 5 mg, respectively, 1:0, 1:1, 1:5, and 1: This is a diagram showing the results of measuring the green fluorescent protein (GFP) loading rate and particle size and charge while increasing the molar ratio to 10 and 1:20.
도 2에 나타낸 바와 같이,As shown in Figure 2,
1:10 몰 비율 초과일 때부터 탑재율이 오히려 낮아졌을뿐만 아니라, 입자의 크기가 비정상적으로 뭉치는 경향을 보였고, 입자의 전하가 변동하면서 불안정한 형태를 보였다. 따라서, 초록형광단백질(GFP) 1몰 기준 프로타민을 10몰 만큼 사용하는 것이, 결합효율(%) 측면에서 바람직함을 확인하였다. 상기 표 1에서 확인한 바와 같이, 초록형광단백질은 인터페론 람다 2/3 단백질과 유사하게 음전하를 띄고있고 분자량도 유사하기 때문에, 인터페론 람다 2/3 단백질을 탑재할 경우도 해당 수치에서 우수한 결합효율(%)이 달성될 것임을 알 수 있다.When the molar ratio exceeded 1:10, not only did the loading rate decrease, but the particle size tended to agglomerate abnormally, and the particle charge fluctuated, showing an unstable form. Therefore, it was confirmed that it is preferable in terms of binding efficiency (%) to use 10 moles of protamine based on 1 mole of green fluorescent protein (GFP). As confirmed in Table 1 above, the green fluorescent protein has a negative charge similar to the interferon lambda 2/3 protein and has a similar molecular weight, so even when loaded with the interferon lambda 2/3 protein, it has excellent binding efficiency (%) at the corresponding value. ) can be seen to be achieved.
종합하여, 봉입대상 단백질(GFP) 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용하면서, 봉입대상 단백질(GFP) 1 몰 기준으로 프로타민 단백질을 1 내지 10 몰만큼, 특히 10 몰만큼 사용하여, <실시예 1>의 단백질이 봉입된 폐 계면활성제 기반 입자를 제조하는 것이 바람직함을 확인하였다.In total, 100 parts by weight of lung surfactant is used based on 1 part by weight of the protein to be encapsulated (GFP), and 1 to 10 moles of protamine protein are used, especially 10 moles, based on 1 mole of the protein to be encapsulated (GFP). , it was confirmed that it is desirable to produce lung surfactant-based particles encapsulated with the protein of <Example 1>.
<실험예 2> Surf-Pro-IFNL 입자의 물리적 성질 및 이미지 평가<Experimental Example 2> Physical properties and image evaluation of Surf-Pro-IFNL particles
상기 <실시예 1>에서 제조한 인터페론 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자(즉, Surf-Pro-IFNL 입자)의 물리적 성질과 크기를 평가하였다. 본 실험에서 분석한 Surf-Pro-IFNL는 상기 <실시예 1>의 (3) 단계에서 인터페론 람다 2/3과 프로타민이 1:10 몰 비로 혼합될 수 있도록 조절하여 제조한 입자이다.The physical properties and size of the interferon protein-bound lung surfactant-based particles (i.e., Surf-Pro-IFNL particles) prepared in <Example 1> were evaluated. Surf-Pro-IFNL analyzed in this experiment is a particle prepared in step (3) of <Example 1> by adjusting interferon lambda 2/3 and protamine to be mixed at a 1:10 molar ratio.
상기 <실시예 1>에서 제조한 Surf-Pro-IFNL 입자는 DLS 장비를 활용해 크기와 표면전하를 측정하였고, TEM 샘플은 아래와 같이 준비하였다.The size and surface charge of the Surf-Pro-IFNL particles prepared in <Example 1> were measured using DLS equipment, and TEM samples were prepared as follows.
- 1 mg/ml Surf-Pro-IFNL 입자를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)와 1:1 부피비로 섞어 입자를 고정한다.- Mix 1 mg/ml Surf-Pro-IFNL particles with 4% paraformaldehyde in a 1:1 volume ratio to fix the particles.
- Copper mesh grid에 입자를 올리고 30분간 상온에서 배양(incubate) 한다.- Place the particles on the copper mesh grid and incubate at room temperature for 30 minutes.
- 증류수로 3번 세척한다.- Wash 3 times with distilled water.
- 2% 포스포텅스텐산(phosphotungstic acid, PTA) 용액을 10분간 처리한다.- Treat with 2% phosphotungstic acid (PTA) solution for 10 minutes.
- 남은 용액은 여과지(filter paper)를 활용해 수분을 완전히 제거한다.- Completely remove moisture from the remaining solution using filter paper.
그 결과를 하기 표 2와 도 3에 나타내었다.The results are shown in Table 2 and Figure 3 below.
도 3은 <실시예 1>에서 제조한 인터페론 단백질이 결합된 폐 계면활성제 기반 입자(즉, Surf-Pro-IFNL 입자)의 TEM 이미지를 나타내는 도면이다.Figure 3 is a diagram showing a TEM image of lung surfactant-based particles (i.e., Surf-Pro-IFNL particles) bound with interferon protein prepared in <Example 1>.
상기 표 2와 도 3에 나타낸 바와 같이,As shown in Table 2 and Figure 3 above,
Surf-Pro-IFNL 입자는 약 250 nm 크기를 보이며, -30 mV의 전하를 갖는다.Surf-Pro-IFNL particles are approximately 250 nm in size and have a charge of -30 mV.
이는 도 3의 TEM 이미지에서도 재차 확인이 가능하다.This can be confirmed again in the TEM image of Figure 3.
<실험예 3> Surf-Pro-IFNL 입자 내 Interferon lambda (IFNL) 탑재율 평가<Experimental Example 3> Evaluation of interferon lambda (IFNL) loading rate in Surf-Pro-IFNL particles
상기 <실시예 1>의 (3) 단계에서 인터페론 람다 2/3과 프로타민이 1:10 몰 비로 혼합될 수 있도록 조절하여 제조한 입자 내 인터페론 람다 2/3의 탑재율을, ELISA kit를 활용해 측정하였다.The loading ratio of interferon lambda 2/3 in the particles prepared by adjusting interferon lambda 2/3 and protamine to be mixed at a 1:10 molar ratio in step (3) of <Example 1> was measured using an ELISA kit. did.
그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.The results are shown in Table 3 below.
상기 표 3에 나타낸 바와 같이,As shown in Table 3 above,
ELISA kit를 활용해 인터페론 람다 2/3의 양을 측정한 결과, 모델 단백질인 GFP 때와 마찬가지로 약 30%의 탑재율, 즉 16μg/ml 농도의 단백질이 탑재되었음을 확인할 수 있다.As a result of measuring the amount of interferon lambda 2/3 using an ELISA kit, it was confirmed that the protein was loaded at a concentration of about 30%, or 16 μg/ml, as in the case of GFP, a model protein.
<실험예 4> 호흡기 바이러스 및 Surf-Pro-IFNL 입자 흡입 in vivo 평가<Experimental Example 4> In vivo evaluation of respiratory viruses and Surf-Pro-IFNL particle inhalation
호흡기 바이러스 및 Surf-Pro-IFNL 입자 흡입에 따른 동물 모델에서의 IFNL 전달 유효성을 평가하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.The following experiment was performed to evaluate the effectiveness of IFNL delivery in animal models following respiratory virus and Surf-Pro-IFNL particle inhalation.
4-1. 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ)를 사용한 흡입 방법4-1. Inhalation method using a mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ)
도 4의 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 사용하여, 도 5와 같이 마우스 모델에 호흡기 바이러스 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 흡입하였다. 도 4는 in vivo 실험에 사용한 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 나타내는 도면이고, 도 5는 흡입 일정을 나타내는 모식도이다.Using the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment shown in Figure 4, respiratory viruses and Surf-Pro-IFNL particles were inhaled into the mouse model as shown in Figure 5. Figure 4 is a diagram showing the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment used in the in vivo experiment, and Figure 5 is a schematic diagram showing the suction schedule.
흡입 전달 과정은 다음과 같다.The inhalation delivery process is as follows.
(1) IAV(Influenza A Virus)군 마우스와 IAV+L(P)군 마우스를 상기 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 사용하여, IAV(7.3×107 pfu/ml 농도)로 감염시킨다. 이때, 마리당 400 ㎕ 양으로 감염시킨다.(1) IAV (Influenza A Virus) group mice and IAV+L(P) group mice were infected with IAV (concentration of 7.3×10 7 pfu/ml) using the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment. At this time, each animal is infected in an amount of 400 ㎕.
(2) 상기 <실시예 1>에서 제조한 Surf-Pro-IFNL 입자도 상기 마우스 네뷸라이저(inExpose, SCIREQ) 장비를 사용해 흡입 전달시킨다. Surf-Pro-IFNL 입자 농도는 1 mg/ml 농도로, 마리당 400 ㎕ 양을 흡입시킨다. 이때, 입자는 투석 과정을 거치지 않은 형태로 흡입 전달을 진행하였다.(2) Surf-Pro-IFNL particles prepared in <Example 1> are also delivered by inhalation using the mouse nebulizer (inExpose, SCIREQ) equipment. The Surf-Pro-IFNL particle concentration is 1 mg/ml, and 400 ㎕ per animal is inhaled. At this time, the particles were delivered by inhalation in a form that did not undergo a dialysis process.
4-2. 플라크(Plaque) 분석 (바이러스 정량 분석)4-2. Plaque analysis (viral quantitative analysis)
하기 과정을 통해 플라크 분석(바이러스 정량 분석)을 수행하였다.Plaque analysis (viral quantitative analysis) was performed through the following process.
(1) MDCK 세포(Madin-darby canine kidney cell)을 6 well plate에 하나의 well 당 7×105으로 시딩(seeding)한다.(1) MDCK cells (Madin-darby canine kidney cells) are seeded at 7×10 5 per well in a 6 well plate.
(2) 세포가 포화(confluence)를 이루면, 기존 배지를 제거한 후, 각 세포에 상기 4-1의 마우스에서 추출한 기관지폐포세척액(BALF)를 102 농도로 감염시킨다. (PBS + BALF + 1% FBS)(2) When the cells reach confluence, the existing medium is removed, and then each cell is infected with bronchoalveolar lavage fluid (BALF) extracted from the mouse in 4-1 above at a concentration of 10 2 . (PBS + BALF + 1% FBS)
(3) 쉐이커(Shaker)를 이용하여 2시간 동안 상온에서 흔들어준다.(3) Shake at room temperature for 2 hours using a shaker.
(4) 1.5% 아가로스 + 2× MEM + 1× MEM + 페니실린/스트렙토마이신 + 트립신을 섞어 준비해 둔다.(4) Prepare a mixture of 1.5% agarose + 2× MEM + 1× MEM + penicillin/streptomycin + trypsin.
(5) 2시간 후, 각 well의 샘플을 흡입(suction)한 후, 준비해둔 아가로스를 오버레이(overlay)한다.(5) After 2 hours, suction the sample from each well and overlay the prepared agarose.
(6) 37℃ 인큐베이터에서 3 내지 4일 동안 배양한다.(6) Culture in an incubator at 37°C for 3 to 4 days.
(7) 3 내지 4일 후, 군집(colony)가 보이는 것을 확인한 후, 10% 포르말린을 well당 뿌리고 1 내지 2시간 상온에 둔다.(7) After 3 to 4 days, after confirming that colonies are visible, 10% formalin is sprinkled per well and left at room temperature for 1 to 2 hours.
(8) well 바닥이 긁히지 않게 아가로스 겔을 떼어낸다.(8) Remove the agarose gel without scratching the bottom of the well.
(9) 5% EtOH 또는 D.W에 용해된 0.5% 크리스털 바이올렛(Crystal violet) 염료로 10분 동안 염색(staining)한다.(9) Stain for 10 minutes with 0.5% crystal violet dye dissolved in 5% EtOH or D.W.
(10) 2 내지 3차례 세척한 후, 플라크(Plaque)를 카운팅한다.(10) After washing 2 to 3 times, plaque is counted.
그 결과를 도 6에 나타내었다.The results are shown in Figure 6.
도 6은 IAV(Influenza A Virus) 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스로부터 추출한 기관지폐포세척액(BALF) 내 IAV의 존재에 의해, 세포사멸이 발생하는지 여부를 비교 평가한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 6 shows a comparative evaluation of whether cell death occurs due to the presence of IAV in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) extracted from mice that inhaled IAV (Influenza A Virus) alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together. This is a drawing showing the results.
도 6에 나타낸 바와 같이,As shown in Figure 6,
바이러스가 감염된 BALF 용액을 처리한 IAV 군들은 바이러스 때문에 세포사멸이 이루어져 세포 수가 확연히 줄어듦을 알 수 있다(세포 생존 = 보라색).It can be seen that in the IAV group treated with the virus-infected BALF solution, cell death occurred due to the virus and the number of cells was clearly reduced (cell survival = purple).
반면, IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 같이 처리한 마우스로부터 추출한 BALF 용액을 처리한 IVA + Surf-Pro-IFNL 군들은 바이러스가 인터페론에 의해 그 양이 줄어들어, 결과적으로 배양된 세포를 거의 죽이지 못했음을 알 수 있다. 즉, Surf-Pro-IFNL 입자를 통해 마우스 내부로 흡입 전달된 인터페론이 항바이러스 기능을 원활히 하였음을 확인할 수 있다.On the other hand, in the IVA + Surf-Pro-IFNL group treated with BALF solution extracted from mice treated with IAV and Surf-Pro-IFNL particles, the amount of virus was reduced by interferon, and as a result, it hardly killed the cultured cells. can be seen. In other words, it can be confirmed that the interferon delivered into the mouse through Surf-Pro-IFNL particles facilitated the antiviral function.
4-3. 웨스턴 블롯(Western blot) 분석4-3. Western blot analysis
IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.For mice inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, lungs were removed 7 days later and Western blot analysis was performed.
웨스턴 블롯 분석 과정은 다음과 같다.The Western blot analysis process is as follows.
(1) 10% 겔 제조 (running gel과 stacking gel 각 조성에 맞게 제조한다)(1) Preparation of 10% gel (produce according to each composition of running gel and stacking gel)
(2) 샘플 준비: 200㎕ 1× RIPA buffer에 마우스로부터 적출한 폐를 넣고 초음파 파쇄 후 원심분리하고, sup을 걷어 샘플을 준비한다.(2) Sample preparation: Place the lung extracted from the mouse in 200㎕ 1× RIPA buffer, ultrasonically disrupt, centrifuge, and remove the sup to prepare the sample.
(3) Solution 용액을 사용하여 단백질을 정량하여 25μg의 농도로 맞춰준다.(3) Quantify the protein using solution and adjust the concentration to 25μg.
(4) 겔에 단백질 샘플을 ladder와 함께 걸어준다. (4) Hang the protein sample on the gel with a ladder.
(5) 70V 1시간 후, 100V 2시간 30분 정도 전기 영동한다.(5) After 1 hour at 70V, electrophoresis is performed at 100V for 2 hours and 30 minutes.
(6) 단백질을 membrane에 transfer 시킨다. (70~80V 1시간 30분 내지 2시간)(6) Transfer the protein to the membrane. (70~80V 1 hour 30 minutes to 2 hours)
(7) Membrane에 NP(nucleoprotein) 항체(1:10000)를 붙이고 4℃에서 하룻밤 동안 흔들어준다. (shaker 사용)(7) Attach NP (nucleoprotein) antibody (1:10000) to the membrane and shake at 4℃ overnight. (using shaker)
(8) TBS-T로 10분×3차례 세척한다. (TBS-T: 1× TBS + 0.05% 트윈 20)(8) Wash with TBS-T for 10 minutes x 3 times. (TBS-T: 1× TBS + 0.05% Tween 20)
(9) 2차 항체를 붙인다. (1:5000 / 1시간)(9) Attach secondary antibody. (1:5000 / 1 hour)
(10) TBS-T로 10분×5차례 세척한다.(10) Wash with TBS-T for 10 minutes x 5 times.
(11) West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate를 검출(detection)한 후, 암실에서 현상한다.(11) After detecting West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate, develop in a dark room.
그 결과를 도 7에 나타내었다.The results are shown in Figure 7.
도 7은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 7 is a diagram showing the results of Western blot analysis performed on mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, and lungs were removed 7 days later.
도 7에 나타낸 바와 같이,As shown in Figure 7,
IAV 군과 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입 전달시킨 마우스 군의 폐를 적출하고 조직을 갈아준 뒤 IAV의 nucleoprotein (NP)를 측정해 바이러스의 양을 확인해본 결과, Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입 전달시켰을 때 상대적으로 낮은 바이러스 양이 검출됨을 확인할 수 있다.The lungs of the mouse group that were inhaled and delivered with the IAV group and Surf-Pro-IFNL particles were removed, the tissue was ground, and the amount of virus was confirmed by measuring the nucleoprotein (NP) of the IAV. As a result, the Surf-Pro-IFNL particles It can be confirmed that a relatively low amount of virus is detected when delivered together by inhalation.
4-4. 흡입 전달에 따른 마우스 체중 변화 및 IAV PA mRNA 발현량 평가4-4. Evaluation of mouse body weight change and IAV PA mRNA expression level following inhalation delivery
IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 시간 경과에 따른 체중 변화와 7일 후 적출한 마우스의 폐에서 검출되는 IAV PA mRNA 발현량을 평가하였다.In mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, body weight changes over time and the level of IAV PA mRNA expression detected in the lungs of mice excised after 7 days were evaluated.
그 결과를 도 8 및 도 9에 나타내었다.The results are shown in Figures 8 and 9.
도 8은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 시간 경과에 따른 체중 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 8 is a diagram showing the results of evaluating body weight changes over time in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together.
도 9는 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 적출한 마우스의 폐에서 검출되는 IAV PA mRNA 발현량을 평가한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 9 is a diagram showing the results of evaluating the level of IAV PA mRNA expression detected in the lungs of mice inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, excised after 7 days.
도 8에 나타낸 바와 같이,As shown in Figure 8,
IAV 감염 마우스의 경우 3일째를 기점으로 몸무게가 줄어드는 것을 알 수 있다. 즉 바이러스 폐감염으로 인한 몸무게 감소를 보인다. 하지만 인터페론이 탑재된 입자를 같이 처리한 경우에는 몸무게 변화가 확인되지 않는다. 즉 주입된 바이러스가 인터페론으로 인해 제대로 감염을 이루지 못함을 의미한다. In the case of IAV-infected mice, it can be seen that body weight decreases starting from the third day. In other words, weight loss occurs due to viral lung infection. However, when interferon-loaded particles were treated together, no change in body weight was observed. This means that the injected virus does not properly infect due to interferon.
또한, 도 9에 나타낸 바와 같이,Additionally, as shown in Figure 9,
IAV 군과 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 처리한 군의 페를 적출하고 조직을 갈아 준 뒤 PA gene을 qPCR 과정을 통해 확인해 보면 IAV 감염군만 높은 PA gene을 확인할 수 있다. 하지만, 입자를 처리하면 인터페론때문에 항바이러스 효과가 증가하므로 바이러스 증식을 막을 수 있음을 알 수 있다.When the lungs of the IAV group and the group treated with Surf-Pro-IFNL particles were extracted, the tissue was ground, and the PA gene was checked through a qPCR process, only the IAV-infected group could be confirmed to have a high PA gene. However, it can be seen that processing the particles increases the antiviral effect due to interferon, thereby preventing virus proliferation.
4-5. H&E 분석4-5. H&E analysis
IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 H&E 분석을 수행하였다.For mice inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, lungs were removed 7 days later and H&E analysis was performed.
그 결과를 도 10에 나타내었다.The results are shown in Figure 10.
도 10은 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 후 폐를 적출하여 H&E 분석을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.Figure 10 is a diagram showing the results of H&E analysis performed on mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together, and lungs were removed 7 days later.
도 10에 나타낸 바와 같이,As shown in Figure 10,
가장 왼쪽의 정상 쥐의 폐에서는 바이러스 감염을 전혀 확인할 수 없지만 IAV를 감염시키게 되면(가운데) 바이러스감염으로 인해 폐 세포들 사이사이에 compact한 양상을 확인할 수 있다. IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시켰을 때에는 정상 폐와 유사하게 바이러스 감염 정도를 거의 확인할 수 없다.Viral infection cannot be confirmed at all in the lungs of the normal mouse on the left, but when infected with IAV (middle), a compact pattern can be seen between lung cells due to viral infection. When IAV and Surf-Pro-IFNL particles are inhaled together, the degree of viral infection can hardly be confirmed, similar to normal lungs.
4-6. qPCR - 바이러스 감염(virus infection) 확인4-6. qPCR - Confirmation of virus infection
바이러스 모델 대조군 (IAV), 바이러스 모델에 인터페론만 처리한 군 (IAV+IFN), 바이러스 모델에 인터페론이 탑재된 나노입자를 처리한 군 (IAV+IFN nano)를 시기별 바이러스 번식도, 인터페론의 양, 인터페론 자극 유전자의 양을 각기 확인하였다.The virus model control group (IAV), the group in which the virus model was treated with interferon only (IAV+IFN), and the group in which the virus model was treated with interferon-loaded nanoparticles (IAV+IFN nano), the virus reproduction rate and amount of interferon by period. , the amount of interferon-stimulated genes was confirmed.
qPCR_(PA gene, CXCL10, MX1) 분석은 하기 과정으로 수행하였다.qPCR_(PA gene, CXCL10, MX1) analysis was performed using the following process.
(1) RNA 추출을 위해 1.5ml 튜브에 500㎕ TRIZOL을 분주한 후, 마우스 폐 조직을 넣고 초음파 분쇄하여 조직을 갈아준다.(1) For RNA extraction, dispense 500㎕ TRIZOL into a 1.5ml tube, then add mouse lung tissue and grind the tissue by ultrasonic pulverization.
(2) 당류나 기타 물질 제거를 위해 클로로포름 200㎕를 넣고 10분 동안 잘 흔들어 준다.(2) To remove sugars or other substances, add 200㎕ of chloroform and shake well for 10 minutes.
(3) 13000rpm 4℃ 15분 동안 원심분리한다.(3) Centrifuge at 13000 rpm at 4°C for 15 minutes.
(4) 상층액만 따서 새 튜브에 옮긴 후 이소프로판올을 500㎕ 추가하여 10분 동안 잘 흔들어 준다. 이때, 얼음에 위치시켜놓으면 펠렛이 잘 보이게 된다. 이때, 이소프로판올은 RNA를 농축시키고 침전시켜 펠렛 형태로 확인할 수 있도록 하는 역할을 수행한다.(4) Take only the supernatant and transfer it to a new tube, then add 500㎕ of isopropanol and shake well for 10 minutes. At this time, if you place it on ice, the pellet will be clearly visible. At this time, isopropanol serves to concentrate and precipitate RNA so that it can be confirmed in pellet form.
(5) 13000rpm 4℃ 10분 동안 원심분리한다.(5) Centrifuge at 13000 rpm at 4°C for 10 minutes.
(6) 침전된 펠렛을 확인한 후, 용액을 따라 버리고, 70% EtOH 500㎕를 넣고 tapping 해준다. (세척 단계)(6) After checking the precipitated pellet, pour out the solution, add 500㎕ of 70% EtOH, and tap. (Washing step)
(7) 13000rpm 4℃ 10분 동안 원심분리한다.(7) Centrifuge at 13000 rpm at 4°C for 10 minutes.
(8) 용액은 따라버리고, 1분 정도 원심분리 후, 남아있는 EtOH을 최대한 깨끗하게 제거해준다.(8) Discard the solution, centrifuge for about 1 minute, and remove any remaining EtOH as cleanly as possible.
(9) 10 내지 15분 정도 건조 하여 잔여 EtOH을 제거해준다. 이때, 너무 건조하게 되면 펠렛 용해도가 감소하기 때문에 주의해야한다.(9) Dry for 10 to 15 minutes to remove residual EtOH. At this time, care must be taken because if it is too dry, the solubility of the pellet will decrease.
(10) RNase를 비활성화하는 DEPC treated water를 30㎕ 넣어 RNA를 용해시킨다. (RNA 추출)(10) Add 30㎕ of DEPC treated water, which inactivates RNase, to dissolve RNA. (RNA extraction)
(11) Nanodrop 측정 후 RNA 농도를 1μg으로 맞춰준다.(11) After measuring Nanodrop, set the RNA concentration to 1μg.
(12) 1μg의 농도로 맞춰진 RNA + randomhexamer + dNTP + 10× buffer + Rnase inhibitor + Rtase(Reverse Transcriptase)를 넣고 cDNA 합성을 시작한다. 이때, cDNA 합성 시 Thermal Cycler 기계를 사용한다.(12) Add RNA + randomhexamer + dNTP + 10× buffer + Rnase inhibitor + Rtase (Reverse Transcriptase) at a concentration of 1 μg and start cDNA synthesis. At this time, a thermal cycler machine is used when synthesizing cDNA.
(13) Running 후 3차 auto D.W를 이용하여 1/5로 희석하여 cDNA를 setting한다. (cDNA합성)(13) After running, set the cDNA by diluting it to 1/5 using the 3rd auto D.W. (cDNA synthesis)
(14) 40 사이클로 qPCR 측정하여 PA gene과 Interferon stimulated gene인 CXCL10, MX1을 확인한다.(14) Check the PA gene and interferon stimulated genes CXCL10 and MX1 by qPCR at 40 cycles.
그 결과를 도 11 내지 도 14에 나타내었다.The results are shown in Figures 11 to 14.
도 11 내지 도 14는 IAV 단독, 또는 IAV 및 Surf-Pro-IFNL 입자를 함께 흡입시킨 마우스를 대상으로, 7일 동안의 폐 내 바이러스 감염과 인터페론 자극 유전자(Interferon stimulated gene) 레벨 변화를 평가한 결과를 나타내는 도면이다.Figures 11 to 14 show the results of evaluating viral infection in the lungs and changes in interferon stimulated gene levels for 7 days in mice that inhaled IAV alone or IAV and Surf-Pro-IFNL particles together. This is a drawing showing .
도 11 내지 도 14에 나타낸 바와 같이,As shown in Figures 11 to 14,
IAV 군의 경우 3일차때부터 높은 바이러스 번식을 확인할 수 있는데 나머지 2군에서는 인터페론 단백질로 인해 현저히 낮은 번식율을 보인다.In the case of the IAV group, high virus reproduction can be confirmed from the third day, but the remaining two groups show a significantly low reproduction rate due to interferon protein.
인터페론의 양 자체는 IAV+IFN보다 IAV+IFN(nano) 군이 더 빠르게 증가하는 데, 이는 폐 내부까지 입자를 통해 더 많은 인터페론이 전달되었기 때문이다.The amount of interferon itself increased faster in the IAV+IFN (nano) group than in the IAV+IFN group, because more interferon was delivered through particles to the inside of the lungs.
인터페론 자극 유전자인 CXCL10과 Mx1의 경우 나노입자를 통해 전달해주었을 때 훨씬 빠르고 높은 발현을 보였다. 그 이유는, 추가적인 인터페론 단백질을 폐에 안정적으로 전달하였기 때문이다. CXCL10과 Mx1의 발현으로 인해 면역능이 상승되게 되면 항바이러스 기능이 상승하는데, 나노입자를 통해 전달된 군에서 가장 빠르고 높은 단백질 발현량을 보임으로써 나노입자를 통해 단백질을 전달해주었을 때 더욱 효과적임을 확인하였다.The interferon-stimulated genes CXCL10 and Mx1 showed much faster and higher expression when delivered through nanoparticles. The reason is that the additional interferon protein was stably delivered to the lungs. When the immune function is increased due to the expression of CXCL10 and Mx1, the antiviral function increases. The group delivered through nanoparticles showed the fastest and highest protein expression, confirming that protein delivery through nanoparticles was more effective. did.
이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 폐 계면활성제로 제조되는 리포좀에 인터페론 단백질이 결합된 복합체는,From this, the complex in which the interferon protein is bound to the liposome prepared with the lung surfactant provided in one aspect of the present invention is,
생체 내 투여시 인터페론 단백질의 구조가 훼손되지 않으면서 본래 형태와 기능을 보존한 상태로 폐(lung)에 선택적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 폐포 내에 존재하는 폐 계면활성제 막과 효율적으로 융합되어, 복합체에 결합된 인터페론 단백질을 주변 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 독성이 적고 구조 안정성이 우수한 효과가 있음을 알 수 있다.When administered in vivo, the structure of the interferon protein is not damaged and not only can it be selectively delivered to the lung while preserving its original form and function, but it can also efficiently fuse with the pulmonary surfactant membrane present in the alveoli to form a complex complex. It can be seen that the interferon protein bound to can be efficiently delivered to surrounding cells and has low toxicity and excellent structural stability.
Claims (15)
상기 폐 계면활성제는 타입 II 폐포세포(type II alveolar cells)에서 생성되는 지질단백질 복합체(lipoprotein complex)이고,
상기 지질단백질 복합체는 SP-B 또는 SP-C의 막 단백질과 DPPC 또는 PG의 인지질을 포함하며,
상기 인터페론 람다 단백질은 프로타민을 매개로 리포좀과 전하간 인력으로 결합되는 것을 특징으로 하는,
인터페론 람다 단백질 전달용 조성물.
Liposomes made of pulmonary surfactant; interferon lambda protein; And a complex containing protamine;
The pulmonary surfactant is a lipoprotein complex produced in type II alveolar cells,
The lipoprotein complex includes membrane proteins of SP-B or SP-C and phospholipids of DPPC or PG,
The interferon lambda protein is characterized in that it is bound to the liposome through charge-to-charge attraction mediated by protamine.
Composition for delivering interferon lambda protein.
상기 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물은, 인터페론 람다 단백질을 폐(lung)로 선택적으로 전달하기 위한 것인, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물.
According to paragraph 1,
The composition for delivering interferon lambda protein is a composition for delivering interferon lambda protein selectively to the lung.
상기 폐 계면활성제(pulmonary surfactant)는, 막 단백질(membrane protein)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물.
According to paragraph 1,
The pulmonary surfactant is a composition for delivering interferon lambda protein, characterized in that it contains a membrane protein.
상기 복합체의 평균 직경 범위는 100 내지 1200 nm인 것을 특징으로 하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물.
According to paragraph 1,
A composition for delivering interferon lambda protein, characterized in that the average diameter range of the complex is 100 to 1200 nm.
상기 준비한 폐 계면활성제가 용해된 용액을 건조시켜 지질막(lipid film)을 형성시키는 단계;
상기 형성된 지질막에, 인터페론 람다 단백질이 용해된 제2 용액 및 프로타민이 용해된 제3 용액을 함께 처리해 수화시켜, 상기 인터페론 람다 단백질이 상기 프로타민을 매개로 상기 폐 계면활성제로 이루어지는 리포좀과 전하간 인력으로 결합된 복합체를 제조하는 단계; 를 포함하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법.
It is a pulmonary surfactant that is a lipoprotein complex produced in type II alveolar cells. The lipoprotein complex includes membrane proteins of SP-B or SP-C and phospholipids of DPPC or PG. Preparing a first solution in which a lung surfactant is dissolved;
Forming a lipid film by drying the solution in which the prepared lung surfactant is dissolved;
The formed lipid membrane is hydrated by treating it with a second solution in which interferon lambda protein is dissolved and a third solution in which protamine is dissolved, so that the interferon lambda protein is mediated by the protamine and the electric charge attraction between the liposome made of the lung surfactant. preparing a bound complex; A method for producing a composition for delivering interferon lambda protein, comprising:
상기 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때,
인터페론 람다 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 80 내지 120 중량부만큼 사용함과 동시에, 인터페론 람다 단백질 1 몰 기준으로 프로타민을 1 내지 10 몰 비율 만큼 사용하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법.
According to clause 10,
When performing the method for producing the composition for delivering the interferon lambda protein,
A method for producing a composition for delivering interferon lambda protein, wherein 80 to 120 parts by weight of lung surfactant is used based on 1 part by weight of interferon lambda protein, and protamine is used in an amount of 1 to 10 moles based on 1 mole of interferon lambda protein.
상기 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법을 수행할 때,
인터페론 람다 단백질 1 중량부 기준으로 폐 계면활성제를 100 중량부만큼 사용함과 동시에, 인터페론 람다 단백질 1 몰 기준으로 프로타민을 10 몰 비율 만큼 사용하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법.
According to clause 10,
When performing the method for producing the composition for delivering the interferon lambda protein,
A method for producing a composition for delivering interferon lambda protein, using 100 parts by weight of lung surfactant based on 1 part by weight of interferon lambda protein, and using protamine at a ratio of 10 mole based on 1 mole of interferon lambda protein.
상기 수화는 30 내지 90℃ 온도에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법.
According to clause 10,
A method for producing a composition for delivering interferon lambda protein, characterized in that the hydration is performed at a temperature of 30 to 90 ° C.
수화 단계를 수행한 후, 복합체의 직경을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인터페론 람다 단백질 전달용 조성물의 제조방법.According to clause 10,
A method for producing a composition for delivering interferon lambda protein, further comprising the step of adjusting the diameter of the complex after performing the hydration step.
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- 2021-03-22 KR KR1020210036341A patent/KR102625169B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Int. J. Molecular Medicine, 2016, Vol.37, pp.1345-1354.* |
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