KR102623418B1 - Nanoparticles-loaded hydrogel microbead and preparing method of the same - Google Patents
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Abstract
본원은 하이드로겔 및 나노입자를 포함하는 마이크로비드에 있어서, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에 위치하고, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것인, 마이크로비드를 제공한다.The present application provides a microbead containing a hydrogel and nanoparticles, wherein the nanoparticles are located inside the hydrogel, and the nanoparticles can move freely inside the hydrogel.
Description
본원은 나노입자가 탑재된 하이드로겔 마이크로비드 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.This application relates to hydrogel microbeads loaded with nanoparticles and a method of manufacturing the same.
표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 현상이란 금속 박막 표면에서 일어나는 전자들의 집단적 진동에 의하여 발생한 표면 플라즈몬 파(surface plasmon wave)가 금속과 이에 인접한 유전물질의 경계면을 따라 진행하는 표면전자기파로 여기 되어 공명 흡수 효과가 일어나는 현상이다. 이는 금속 표면에서 발생하는 유전체(dielectric constant)의 물리적 변화, 즉 농도, 두께 굴절률 변화를 정밀하게 측정할 수 있기 때문에 나노 수준의 계면 현상을 분석하는 신호변환기법의 일환으로 물질을 정량적으로 분석하기 위한 다양한 센서들이 고안되고 있다.The surface plasmon resonance (SPR) phenomenon is a surface plasmon wave generated by the collective vibration of electrons on the surface of a metal thin film, which is excited as a surface electromagnetic wave that travels along the interface between the metal and the dielectric material adjacent to it. This is a phenomenon in which the resonance absorption effect occurs. This is a method for quantitatively analyzing materials as part of a signal conversion technique that analyzes nano-level interfacial phenomena because it can precisely measure physical changes in the dielectric constant that occur on the metal surface, that is, changes in concentration, thickness, and refractive index. Various sensors are being designed.
특히 이러한 표면 플라즈몬 파가 금속 나노입자에서 발생할 경우 나노입자 표면에서 국소 표면 플라즈몬 파로 나타나며, 이러한 현상에 의하여 나노입자 용액이 가시광선 하에서 특이한 색을 나타내므로, 대상 물질 측정에 의한 표면의 미세한 변화를 색 변화로 쉽게 검출 할 수 있기 때문에 표식자(labeling)없이 바이오센서 또는 화학센서로 활용될 수 있다.In particular, when these surface plasmon waves occur in metal nanoparticles, they appear as localized surface plasmon waves on the surface of the nanoparticle. Due to this phenomenon, the nanoparticle solution exhibits a unique color under visible light, so the color can be used to detect minute changes in the surface by measuring the target material. Because changes can be easily detected, they can be used as biosensors or chemical sensors without labeling.
그러나 종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우, 색 대비 및 명도차가 작은 유채색에서 유채색으로 변화하는 시스템을 갖고 있기 때문에, 어떠한 환경 조건 하에서 또는 어떠한 특정 분석 물질과 반응하였는지를 파악하는데 어려움이 있다. 즉, 기존의 금속 나노입자들의 경우 색 대비 및 명도차가 크지 않아서 즉각적인 색변화 여부를 파악하고 모니터링하기 매우 어려운 한계가 있다.However, in the case of color sensors using conventional nanoparticles, since they have a system that changes from chromatic color to chromatic color with small color contrast and brightness difference, it is difficult to determine under what environmental conditions or with what specific analyte it reacted. In other words, in the case of existing metal nanoparticles, the color contrast and brightness difference are not large, so it is very difficult to determine and monitor immediate color change.
또한, 종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우 용액 플랫폼으로 사용자가 직접 사용하기에 휴대성이 떨어지는 문제점이 있고, 액상 상태에서 작동되기에 샘플이 마르는 등 장기 보관성이 낮으며, 외부 환경에 매우 민감하여 센서의 상태가 쉽게 변할 수 있어 안정성이 낮은 문제점이 있다.In addition, in the case of color sensors using conventional nanoparticles, there is a problem of poor portability for users to use directly as a solution platform, and because they operate in a liquid state, long-term storage is low, such as samples drying out, and they are very susceptible to external environments. There is a problem with low stability because it is sensitive and the state of the sensor can easily change.
이와 관련하여, 기판 형태, 예를 들어, 종이, 하이드로겔 등의 소재에 입자를 코팅하여 센서로 응용하려는 연구가 진행되고 있으나, 낮은 안정성, 낮은 분산성, 낮은 센싱 효율 및 낮은 민감도 등의 한계를 보이고 있다.In this regard, research is being conducted to apply sensors by coating particles on substrates such as paper and hydrogel, but these methods have limitations such as low stability, low dispersibility, low sensing efficiency, and low sensitivity. It is showing.
본원의 배경이 되는 기술인 대한민국 공개특허 제 10-2011-0065231 호는 금 나노입자 및 생체분자 산화효소가 캡슐화된 알지네이트 매트릭스를 이용한 생체분자 검출방법에 관한 것으로서, 구체적으로 금 나노입자 및 생체분자 산화효소가 캡슐화된 알지네이트 매트릭스를 이용한 생체분자 검출 방법; 및 상기 금 나노입자 및 생체분자 산화효소가 캡슐화된 알지네이트 매트릭스를 포함하는 생체분자 검출용 바이오센서에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 알지네이트 매트릭스 내에서 생체분자 산화에 의해 발생하는 환원물질을 이용하여 금 나노입자 성장 반응을 유도한 뒤, 성장된 금 나노입자를 통해 생체분자를 검출하는 것을 특징으로 하는, 금 나노입자 및 생체분자 산화효소가 캡슐화된 알지네이트 매트릭스를 이용한 생체분자 검출 방법; 및 상기 금 나노입자 및 생체분자 산화효소가 캡슐화된 알지네이트 매트릭스를 포함하는 생체분자 검출용 바이오센서에 관한 것이다. 그러나, 하이드로겔 및 나노입자를 포함하는 마이크로비드에 있어서, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에 위치하고, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것인 마이크로비드에 대해서는 언급하지 않고 있다.Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0065231, which is the background technology of this application, relates to a biomolecule detection method using an alginate matrix encapsulated with gold nanoparticles and biomolecule oxidase, and specifically, gold nanoparticles and biomolecule oxidase. Biomolecule detection method using an encapsulated alginate matrix; And it relates to a biosensor for detecting biomolecules comprising an alginate matrix in which the gold nanoparticles and biomolecule oxidase are encapsulated. More specifically, it relates to a biosensor for detecting biomolecules using a reducing substance generated by oxidation of biomolecules in the alginate matrix. A method for detecting biomolecules using an alginate matrix encapsulated with gold nanoparticles and biomolecule oxidase, which is characterized by inducing a nanoparticle growth reaction and then detecting biomolecules through the grown gold nanoparticles; and a biosensor for detecting biomolecules comprising an alginate matrix in which the gold nanoparticles and biomolecule oxidase are encapsulated. However, in the case of microbeads containing hydrogels and nanoparticles, the nanoparticles are located inside the hydrogel, and the nanoparticles are free to move within the hydrogel, and there is no mention of microbeads.
본원은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 나노입자가 탑재된 하이드로겔 마이크로비드 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.The purpose of the present application is to solve the problems of the prior art described above and to provide a hydrogel microbead loaded with nanoparticles and a method for manufacturing the same.
또한, 본원은 상기 마이크로비드를 포함하는 센서를 제공하는 것을 목적으로 한다.Additionally, the present application aims to provide a sensor containing the microbeads.
다만, 본원의 실시예가 이루고자 하는 기술적 과제는 상기된 바와 같은 기술적 과제들로 한정되지 않으며, 또 다른 기술적 과제들이 존재할 수 있다.However, the technical challenges sought to be achieved by the embodiments of the present application are not limited to the technical challenges described above, and other technical challenges may exist.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, 하이드로겔 및 나노입자를 포함하는 마이크로비드에 있어서, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에 위치하고, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것인, 마이크로비드를 제공한다.As a technical means for achieving the above-described technical problem, the first aspect of the present application is a microbead containing a hydrogel and nanoparticles, wherein the nanoparticles are located inside the hydrogel, and the nanoparticles are located within the hydrogel. It provides microbeads that can move freely inside.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include functionalized biomolecules or chemical molecules capable of recognizing the analyte to be detected on the surface, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the biomolecule or chemical molecule is an antibody, antibody fragment, genetically engineered antibody, single chain antibody, receptor protein, binding protein, enzyme, inhibitor protein, lectin, cell adhesion protein, oligonucleotide, polynucleotide. , nucleic acids, aptamers, and combinations thereof, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be mounted inside the hydrogel rather than fixed to the hydrogel, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔의 크기는 200 ㎛ 내지 3,500 ㎛ 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the size of the hydrogel may be 200 ㎛ to 3,500 ㎛, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로비드는 3 차원 구조인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the microbead may have a three-dimensional structure, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 고분자에 의해 코팅된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include those coated with a polymer, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자는 폴리바이닐피롤리돈(Polyvinyl Pyrrolidone, PVP), 폴리바이닐 알코올(Polyvinyl Alcohol, PVA), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PAAm), 알키드(Alkyds), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 폴리에틸렌 폴리바이닐 메틸 에테르(Polyethylene Polyvinyl Methyl Ether) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the polymer is polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyacrylamide (PAAm), alkyds, polyethylene glycol ( It may include, but is not limited to, one selected from the group consisting of Polyethylene Glycol, Polyethylene Polyvinyl Methyl Ether, and combinations thereof.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자는 1 μM 내지 200 μM 의 농도로 상기 마이크로비드에 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the polymer may be included in the microbeads at a concentration of 1 μM to 200 μM, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔은 알긴산(Alginate), 캐라지난(Carrageenan), 한천(Agar), 젤라틴(Gelatin), 카세인(Casein), 알부민(Albumin), 식물 전분(Starch), 아라비아고무(Gum Arabic), 로커스트콩검(Locust Bean Gum), 잔탄검(Xanthan Gum), 트라가칸스검(Tragacanth Gum), 카펙틴(Karpectine), 카복시 메틸 셀룰로오스(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 메틸셀룰로오스(Methyl Cellulose, MC), 에틸 셀룰로오스(Ethyl Cellulose, EC), 하이드록스에틸 셀룰로오스(Hydroxethyl Cellulose, HEC), 셀루아세테이트 프탈레이트(Celluacetate Phthalate, CAP), 스테아릴셀룰로오스(Stearyl Cellulose), 전분 유도체(Starch Derivatives), 인산화 전분(Starch Phosphate), 시아노 에틸화 전분(Cyano Ethylated Starch), 카복시 메틸 전분(Carboxy Methyl Starch, CMS), 하이드록시 에틸화 전분(Hydroxy Ethylated Starch) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the hydrogel is alginate, Carrageenan, Agar, Gelatin, Casein, Albumin, Plant Starch, Arabian Gum Arabic, Locust Bean Gum, Xanthan Gum, Tragacanth Gum, Karpectine, Carboxy Methyl Cellulose (CMC), Methylcellulose ( Methyl Cellulose (MC), Ethyl Cellulose (EC), Hydroxethyl Cellulose (HEC), Celluacetate Phthalate (CAP), Stearyl Cellulose, Starch Derivatives , Phosphorylated Starch (Starch Phosphate), Cyano Ethylated Starch (Cyano Ethylated Starch), Carboxy Methyl Starch (CMS), Hydroxy Ethylated Starch (Hydroxy Ethylated Starch), and combinations thereof. It may include, but is not limited to this.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 카드뮴(Cd) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles are from the group consisting of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), cadmium (Cd), and combinations thereof. It may include selected ones, but is not limited thereto.
또한, 본원의 제 2 측면은, 하이드로겔 전구체 용액 및 나노입자를 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계, 상기 혼합 용액을 가교 용액 상에 적하하는 단계 및 상기 가교 용액 내에서 가교 반응이 진행되어 하이드로겔 내부에 나노입자가 탑재된 마이크로비드가 형성되는 단계를 포함하고, 상기 적하 시 전압을 가하여 상기 혼합 용액이 마이크로 크기의 액적 상태로 상기 가교 용액 내에 적하되는 것인, 마이크로비드의 제조 방법을 제공한다.In addition, the second aspect of the present application includes preparing a mixed solution by mixing a hydrogel precursor solution and nanoparticles, dropping the mixed solution onto a crosslinking solution, and performing a crosslinking reaction within the crosslinking solution to form a hydrogel. It provides a method for producing microbeads, comprising the step of forming microbeads with nanoparticles loaded therein, and applying a voltage during the dropping to drop the mixed solution into the crosslinking solution in the form of micro-sized droplets. .
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include functionalized biomolecules or chemical molecules capable of recognizing the analyte to be detected on the surface, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the biomolecule or chemical molecule is an antibody, antibody fragment, genetically engineered antibody, single chain antibody, receptor protein, binding protein, enzyme, inhibitor protein, lectin, cell adhesion protein, oligonucleotide, polynucleotide. , nucleic acids, aptamers, and combinations thereof, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be freely movable within the hydrogel, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be mounted inside the hydrogel rather than fixed to the hydrogel, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 고분자에 의해 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be coated with a polymer, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔 전구체 용액 및 상기 나노입자의 부피비는 1:1 내지 3:1 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the volume ratio of the hydrogel precursor solution and the nanoparticles may be 1:1 to 3:1, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가교 용액은 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 인산칼슘(Ca3(PO4)2), 탄산칼슘(CaCO3) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the crosslinking solution consists of calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), calcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), calcium carbonate (CaCO 3 ), and combinations thereof. It may include those selected from the group, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 적하하는 단계는 정전기 액적발생기(Electrostatic Droplet Generator)를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the dropping step may be performed using an electrostatic droplet generator, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 정전기 액적발생기에 0 kV 초과 20 kV 이하의 전압이 가해지면서 상기 마이크로 크기의 액적이 형성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the micro-sized droplets may be formed when a voltage of more than 0 kV and less than 20 kV is applied to the electrostatic droplet generator, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 액적은 0.01 mL/min 내지 0.5 mL/min 의 속도로 상기 가교 용액 상에 적하되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the droplets may be dropped onto the cross-linking solution at a rate of 0.01 mL/min to 0.5 mL/min, but are not limited thereto.
또한, 본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 마이크로비드를 포함하는 센서를 제공한다.Additionally, a third aspect of the present application provides a sensor including microbeads according to the first aspect of the present application.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 센서는 색 변화 및 형광(fluorescence), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR), 표면 강화 라만 분광(SERS) 현상에 의한 빛의 세기 변화를 검출할 수 있는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the sensor detects changes in light intensity due to color change and fluorescence, fluorescence resonance energy transfer (FRET), localized surface plasmon resonance (LSPR), and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) phenomena. It may include something that can be detected, but is not limited thereto.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본원을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.The above-described means of solving the problem are merely illustrative and should not be construed as intended to limit the present application. In addition to the exemplary embodiments described above, additional embodiments may be present in the drawings and detailed description of the invention.
전술한 본원의 과제 해결 수단에 의하면, 본원에 따른 나노입자가 탑재된 하이드로겔 마이크로비드는 마이크로비드 내에서 나노입자가 아무런 제약 없이 자유롭게 움직일 수 있음으로써, 높은 안정성을 가지면서도 반응 효율 및 반응 시간을 비약적으로 향상시킨 마이크로비드를 제공할 수 있다.According to the above-described means of solving the problem of the present application, the hydrogel microbead loaded with nanoparticles according to the present application allows the nanoparticles to move freely without any restrictions within the microbead, thereby maintaining high stability and improving reaction efficiency and reaction time. We can provide dramatically improved microbeads.
구체적으로, 본원에 따른 마이크로비드는 종래의 방법과 같이 비드 또는 하이드로겔 표면에 센서로서 이용되는 나노 입자를 고정 시키는 것이 아닌, 나노입자와 하이드로겔 마이크로비드의 물리화학적 작용을 분자 동역학으로 계산함으로써, 서로 간의 반응을 최소화하는 조건의 마이크로비드를 제공할 수 있다. 이에, 하이드로겔 마이크로비드 내부에 나노입자가 고정된 것이 아닌, 단순히 탑재된 새로운 형태의 마이크로비드를 제공함으로써, 본원에 따른 마이크로비드 내의 나노입자는 아무런 제약 없이 자유롭게 움직일 수 있는 장점이 있다.Specifically, the microbeads according to the present application do not fix nanoparticles used as sensors on the surface of beads or hydrogels as in the conventional method, but by calculating the physicochemical actions of nanoparticles and hydrogel microbeads using molecular dynamics, Microbeads can be provided under conditions that minimize reactions between them. Accordingly, by providing a new type of microbead in which the nanoparticles are simply mounted, rather than fixed, inside the hydrogel microbead, there is an advantage that the nanoparticles in the microbead according to the present application can move freely without any restrictions.
또한, 종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우 나노입자의 안정성이 이온 농도(ionic strength)에 따라 크게 변하기 때문에 혈액 등과 같은 체액이나 식품, 폐수, 바닷물 등과 같이 이온 농도가 크게 높은 환경에서 사용하기 어려운 문제점이 있었으나, 본원에 따른 마이크로비드는 마이크로 크기의 하이드로겔 비드 내에 나노입자가 탑재되어 있기 때문에, 기존의 액상 센서에 비해 나노입자가 높은 안정성을 가질 수 있으며, 곧 여러 조건에서 또한 본래의 나노입자 센서의 색을 유지할 수 있다. 따라서, 혈액 내에서도 안정한 마이크로비드를 제공할 수 있다.In addition, in the case of color sensors using conventional nanoparticles, the stability of the nanoparticles varies greatly depending on the ionic strength, making it difficult to use them in environments with very high ionic concentrations, such as body fluids such as blood, food, wastewater, and seawater. Although there were problems, the microbeads according to the present invention have nanoparticles mounted within micro-sized hydrogel beads, so the nanoparticles can have higher stability compared to existing liquid sensors, and soon the original nanoparticles can be used under various conditions as well. The color of the sensor can be maintained. Therefore, stable microbeads can be provided even in blood.
또한, 본원에 따른 마이크로비드 내의 나노입자는 표면에 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있을 수 있다. 예를 들어, 항체가 기능화된 나노입자를 하이드로겔 기반의 비드에 탑재하여 특정한 항원과 반응 시 색깔이나 광학 신호의 변화가 일어나는 센서를 제공할 수 있으며, 이는 항체가 기능화된 나노입자의 안정성을 크게 향상시킬 수 있을 뿐만이 아니라 나노입자 센서가 고체화 됨으로써 다루는 것이 용이해지며, 하이드로겔의 크기를 수 mm 미만으로 작게 함으로써 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높여 반응 효율 및 속도를 크게 높일 수 있는 장점이 있다.Additionally, nanoparticles within microbeads according to the present application may have biomolecules or chemical molecules functionalized on their surfaces. For example, antibody-functionalized nanoparticles can be mounted on hydrogel-based beads to provide a sensor that changes color or optical signal when reacting with a specific antigen, which greatly increases the stability of antibody-functionalized nanoparticles. Not only can this be improved, but the solidification of the nanoparticle sensor makes it easier to handle, and by reducing the size of the hydrogel to less than a few mm, the size of the surface area to volume can be dramatically increased, which has the advantage of greatly increasing reaction efficiency and speed. .
또한, 본원에 따른 마이크로비드는 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높였기 때문에 고농도의 나노입자를 마이크로비드 내에 탑재할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 자유롭게 움직일 수 있는 나노입자가 마이크로비드 내에 고농도로 탑재되어 있기 때문에, 특정 검출 물질의 존재 하에 나노입자의 응집을 수초 내에 빠르게 유도할 수 있는 장점이 있다. 이에, 반응 효율 및 반응 시간을 비약적으로 향상시킬 수 있으므로, 뚜렷한 색 변화를 통한 육안 분석이 가능한 센서로서 유용하게 활용될 수 있다.In addition, the microbead according to the present application has the advantage of being able to load a high concentration of nanoparticles into the microbead because the size of the surface area compared to the same volume has been dramatically increased. Therefore, because freely movable nanoparticles are loaded in a high concentration within the microbeads, there is an advantage in that aggregation of nanoparticles can be quickly induced within a few seconds in the presence of a specific detection substance. Accordingly, since reaction efficiency and reaction time can be dramatically improved, it can be usefully used as a sensor capable of visual analysis through clear color changes.
또한, 본원에 따른 마이크로비드는 3 차원 구조를 가짐으로써 기존의 액상센서에 비하여 외부 물질을 필터링할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 고농도의 이온 용액 내에서도 나노입자의 응집이 없으며 장기간 동안 입자의 특성 변화 없이 보관이 가능한 안정성 높은 마이크로비드를 제공할 수 있다. 이에, 매우 높은 농도의 이온과 단백질 등이 섞여 특정 검출 물질만 센싱 하는 것이 어려웠던 혈액 및 폐수 등에서도 나노입자의 응집 없이 작동 및 보관이 가능하여, 특정 검출 물질을 실시간으로 센싱 할 수 있는 장점이 있다. In addition, the microbead according to the present application has an advantage in that it can filter out external substances compared to existing liquid sensors by having a three-dimensional structure. Therefore, it is possible to provide highly stable microbeads that do not cause aggregation of nanoparticles even in high-concentration ionic solutions and can be stored for a long period of time without changing the properties of the particles. Accordingly, it can be operated and stored without agglomeration of nanoparticles even in blood and wastewater, where it is difficult to sense only specific detection substances due to the mixing of ions and proteins at very high concentrations, and has the advantage of being able to sense specific detection substances in real time. .
또한, 본원에 따른 마이크로비드는 3 차원 구조를 가지는 고분자 구조체이기 때문에, 다양한 화학적 분자 및 생체분자를 기능화 시킬 수 있으며 고감도 센서 및 비표지 방식의 검출 센서로서도 유용하게 활용될 수 있다.In addition, since the microbead according to the present application is a polymer structure with a three-dimensional structure, it can functionalize various chemical molecules and biomolecules and can also be usefully used as a highly sensitive sensor and a label-free detection sensor.
또한, 본원에 따른 마이크로비드는 수분 흡수율이 좋은 알긴산 하이드로겔 내부에 나노입자를 탑재시켰기 때문에, 마이크로비드가 건조되고 오랜 시간이 지난 뒤에도 건조된 하이드로겔 마이크로비드가 수분을 흡수하면 본래의 성질 및 기능을 회복할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 장기간 보관 및 사용이 가능한 마이크로비드를 제공할 수 있는 장점이 있다.In addition, since the microbeads according to the present invention have nanoparticles mounted inside alginate hydrogel with good moisture absorption rate, even after a long time after the microbeads are dried, when the dried hydrogel microbeads absorb moisture, their original properties and functions are lost. It has the advantage of being able to recover. Therefore, there is an advantage in providing microbeads that can be stored and used for a long time.
또한, 종래의 하이드로겔를 사용한 색 센서의 경우 벌크 사이즈로 사용되었으나, 본원에 따른 마이크로비드의 제조 방법은 고전압의 정전기 액적발생기를 사용하여 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높인 수백 μm 크기의 하이드로겔 기반의 마이크로비드를 제공할 수 있다.In addition, in the case of color sensors using conventional hydrogels, they were used in bulk size, but the manufacturing method of microbeads according to the present application uses a high-voltage electrostatic droplet generator to dramatically increase the size of the surface area compared to the same volume, producing hydrogels of hundreds of μm in size. Gel-based microbeads can be provided.
본원에 따른 센서는 고농도의 나노입자를 탑재한 하이드로겔 마이크로비드를 포함함으로써, 높은 안정성을 가지면서도 반응 효율 및 반응 시간이 비약적으로 향상된 센서로서 활용될 수 있다. 이에, 높은 반응효율 및 빠른 센싱 시간을 가지므로, 뚜렷한 색 변화를 통한 육안 분석이 가능한 센서로서 유용하게 활용될 수 있다.The sensor according to the present application includes hydrogel microbeads loaded with a high concentration of nanoparticles, so it can be used as a sensor with high stability and dramatically improved reaction efficiency and reaction time. Accordingly, since it has high response efficiency and fast sensing time, it can be usefully used as a sensor capable of visual analysis through clear color changes.
또한, 본원에 따른 센서는 3 차원 구조를 가지는 마이크로비드를 포함함으로써, 외부 물질을 필터링할 수 있으므로, 매우 높은 농도의 이온과 단백질 등이 섞여 특정 검출 물질만 센싱 하는 것이 어려웠던 혈액 및 폐수 등에서도 나노입자의 응집없이 작동 및 보관이 가능하여, 특정 검출 물질을 실시간으로 센싱 할 수 있기 때문에 다양한 환경에서도 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.In addition, the sensor according to the present invention contains microbeads with a three-dimensional structure, so it can filter external substances, so it can filter out nanomaterials even in blood and wastewater, where it is difficult to sense only specific detection substances due to the mixing of very high concentrations of ions and proteins. It has the advantage of being able to be used stably in a variety of environments because it can be operated and stored without particle agglomeration and can sense specific detection substances in real time.
또한, 본원에 따른 센서는 3 차원 구조를 가지는 마이크로비드를 포함함으로써, 다양한 화학적 분자 및 생체분자를 기능화 시킬 수 있기 때문에 고감도 센서 및 비표지 방식의 검출 센서로서 의료용, 군사용, 우주항공, 자동차, 화학 및 에너지 산업 등 다양한 분야에서 폭넓게 활용될 수 있는 장점이 있다.In addition, the sensor according to the present invention is capable of functionalizing various chemical molecules and biomolecules by containing microbeads with a three-dimensional structure, and is therefore a highly sensitive sensor and label-free detection sensor for medical, military, aerospace, automotive, and chemical applications. It has the advantage of being widely used in various fields such as the energy industry and others.
다만, 본원에서 얻을 수 있는 효과는 상기된 바와 같은 효과들로 한정되지 않으며, 또 다른 효과들이 존재할 수 있다.However, the effects that can be obtained herein are not limited to the effects described above, and other effects may exist.
도 1 은 본원의 구현예에 따른 마이크로비드의 작동 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2 는 본원의 실시예 및 비교예에 따른 나노입자의 제타전위를 측정한 그래프이다.
도 3 은 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 고분자 농도에 따른 반응성을 나타낸 그래프이다.
도 4 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 전압에 따른 크기를 측정한 이미지이다.
도 5 는 본원의 실시예 및 비교예에 따른 마이크로비드의 응집 속도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6 은 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 안정성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7 은 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 장기간 보관 가능성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8 은 본원의 실시예에 따른 나노입자의 제타전위에 따른 반응성을 측정한 그래프이다.
도 9 는 본원의 실시예에 따른 나노입자의 제타전위에 따른 반응성을 측정한 그래프이다.
도 10 은 본원의 일 실험예에 따른 금 나노입자의 안정성을 실험한 결과이다.
도 11 의 (A) 및 (B)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 금 나노입자의 안정성 실험 결과이며, (C)는 본원의 일 실시예에 따른 마이크로비드의 안정성 실험 결과이다.
도 12 의 (A)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 나노입자의 항원과의 반응 결과이며, (B)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 나노입자가 탑재된 마이크로비드의 항원과의 반응 결과이며, (C)는 본원의 일 실험예에 따른 크기가 큰 하이드로겔의 항원과의 반응 결과이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the operating principle of microbeads according to an embodiment of the present application.
Figure 2 is a graph measuring the zeta potential of nanoparticles according to examples and comparative examples of the present application.
Figure 3 is a graph showing the reactivity of microbeads according to an example of the present application according to polymer concentration.
Figure 4 is an image measuring the size of microbeads according to the voltage according to an embodiment of the present application.
Figure 5 is a graph showing the results of measuring the aggregation speed of microbeads according to the examples and comparative examples herein.
Figure 6 is a graph showing the results of measuring the stability of microbeads according to an example of the present application.
Figure 7 is a graph showing the results of measuring the long-term storage potential of microbeads according to an example of the present application.
Figure 8 is a graph measuring the reactivity according to zeta potential of nanoparticles according to an example of the present application.
Figure 9 is a graph measuring the reactivity according to zeta potential of nanoparticles according to an example of the present application.
Figure 10 shows the results of testing the stability of gold nanoparticles according to an experimental example herein.
11 (A) and (B) are the results of a stability test of gold nanoparticles functionalized with antibodies according to an example of the present application, and (C) are the results of a stability test of microbeads according to an example of the present application.
Figure 12 (A) is the result of reaction between antibody-functionalized nanoparticles according to an example of the present application and an antigen, and (B) is a microbead loaded with antibody-functionalized nanoparticles according to an example of the present application. This is the result of the reaction with the antigen, and (C) is the result of the reaction with the antigen of the large-sized hydrogel according to an experimental example herein.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.Below, with reference to the attached drawings, embodiments of the present application will be described in detail so that those skilled in the art can easily implement them. However, the present application may be implemented in various different forms and is not limited to the embodiments described herein. In order to clearly explain the present application in the drawings, parts that are not related to the description are omitted, and similar reference numerals are assigned to similar parts throughout the specification.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "전기적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. Throughout this specification, when a part is said to be “connected” to another part, this includes not only the case where it is “directly connected,” but also the case where it is “electrically connected” with another element in between. do.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에", "상부에", "상단에", "하에", "하부에", "하단에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.Throughout this specification, when a member is said to be located “on”, “above”, “at the top”, “below”, “at the bottom”, or “at the bottom” of another member, this means that a member is located on another member. This includes not only cases where they are in contact, but also cases where another member exists between two members.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification of the present application, when a part is said to “include” a certain element, this means that it may further include other elements rather than excluding other elements, unless specifically stated to the contrary.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 본원 명세서 전체에서, "~ 하는 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.As used herein, the terms “about,” “substantially,” and the like are used to mean at or close to a numerical value when manufacturing and material tolerances inherent in the stated meaning are presented, and to aid understanding of the present application. It is used to prevent unscrupulous infringers from unfairly exploiting disclosures in which precise or absolute figures are mentioned. Additionally, throughout the specification herein, “a step of” or “a step of” does not mean “a step for.”
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.Throughout this specification, the term "combination thereof" included in the Markushi format expression means a mixture or combination of one or more components selected from the group consisting of the components described in the Markushi format expression, It means including one or more selected from the group consisting of.
본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B" 의 기재는, "A, B, 또는, A 및 B" 를 의미한다.Throughout this specification, description of “A and/or B” means “A, B, or A and B.”
이하, 본원의 나노입자가 탑재된 하이드로겔 마이크로비드 및 이의 제조 방법에 대하여 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the hydrogel microbeads loaded with nanoparticles of the present application and their manufacturing method will be described in detail with reference to embodiments, examples, and drawings. However, the present application is not limited to these embodiments, examples, and drawings.
상기한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본원의 제 1 측면은, 하이드로겔 및 나노입자를 포함하는 마이크로비드에 있어서, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에 위치하고, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것인, 마이크로비드를 제공한다.As a technical means for achieving the above-described technical problem, the first aspect of the present application is a microbead containing a hydrogel and nanoparticles, wherein the nanoparticles are located inside the hydrogel, and the nanoparticles are located within the hydrogel. It provides microbeads that can move freely inside.
도 1 은 본원의 구현예에 따른 마이크로비드의 작동 원리를 나타낸 모식도이다.Figure 1 is a schematic diagram showing the operating principle of microbeads according to an embodiment of the present application.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include functionalized biomolecules or chemical molecules capable of recognizing the analyte to be detected on the surface, but are not limited thereto.
본원에 따른 마이크로비드 내의 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있을 수 있다. 예를 들어, 항체가 기능화된 나노입자를 하이드로겔 기반의 비드에 탑재하여 특정한 항원과 반응 시 색깔이나 광학 신호의 변화가 일어나는 센서를 제공할 수 있으며, 이는 항체가 기능화된 나노입자의 안정성을 크게 향상시킬 수 있을 뿐만이 아니라 나노입자 센서가 고체화 됨으로써 다루는 것이 용이해지며, 하이드로겔의 크기를 수 mm 미만으로 작게 함으로써 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높여 반응 효율 및 속도를 크게 높일 수 있는 장점이 있다.Nanoparticles within microbeads according to the present application may have biomolecules or chemical molecules functionalized on their surfaces that can recognize the analyte to be detected. For example, antibody-functionalized nanoparticles can be mounted on hydrogel-based beads to provide a sensor that changes color or optical signal when reacting with a specific antigen, which greatly increases the stability of antibody-functionalized nanoparticles. Not only can this be improved, but the solidification of the nanoparticle sensor makes it easier to handle, and by reducing the size of the hydrogel to less than a few mm, the size of the surface area to volume can be dramatically increased, which has the advantage of greatly increasing reaction efficiency and speed. .
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the biomolecule or chemical molecule is an antibody, antibody fragment, genetically engineered antibody, single chain antibody, receptor protein, binding protein, enzyme, inhibitor protein, lectin, cell adhesion protein, oligonucleotide, polynucleotide. , nucleic acids, aptamers, and combinations thereof, but are not limited thereto.
상기 바이오분자 또는 화학분자가 인식할 수 있는 검출하고자 하는 분석물은, 예를 들어, 아미노산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 글리코프로테인, 리포프로테인, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 핵산, 당, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 지방산, 지질, 호르몬, 대사산물, 사이토카인, 케모카인, 수용체, 신경전달물질, 항원, 알레르겐, 항체, 기질, 대사산물, 보조인자, 억제제, 약물, 약학물, 영양물, 프리온, 독소, 독물, 폭발물, 살충제, 화학무기제, 생체유해성 제제, 방사선동위원소, 비타민, 헤테로사이클릭 방향족 화합물, 발암물질, 돌연변이유발요인, 마취제, 암페타민, 바르비투레이트, 환각제, 폐기물 또는 오염물일 수 있다. 또한, 분석물이 핵산일 경우 상기 핵산은 유전자, 바이러스 RNA 및 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 포유동물 DNA, cDNA, mRNA, RNA 및 DNA 단편, 올리고뉴클레오티드, 합성 올리고뉴클레오티드, 개질된 올리고뉴클레오티드, 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산, 자연적 핵산, 합성 핵산 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Analytes to be detected that can be recognized by the biomolecule or chemical molecule include, for example, amino acids, peptides, polypeptides, proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, nucleic acids, sugars, Carbohydrates, oligosaccharides, polysaccharides, fatty acids, lipids, hormones, metabolites, cytokines, chemokines, receptors, neurotransmitters, antigens, allergens, antibodies, substrates, metabolites, cofactors, inhibitors, drugs, pharmaceuticals , nutrients, prions, toxins, poisons, explosives, pesticides, chemical weapons, biohazardous agents, radioisotopes, vitamins, heterocyclic aromatic compounds, carcinogens, mutagens, anesthetics, amphetamines, barbiturates, hallucinogens, It may be waste or contaminant. Additionally, when the analyte is a nucleic acid, the nucleic acid may include genes, viral RNA and DNA, bacterial DNA, fungal DNA, mammalian DNA, cDNA, mRNA, RNA and DNA fragments, oligonucleotides, synthetic oligonucleotides, modified oligonucleotides, single It may include, but is not limited to, those selected from the group consisting of stranded and double-stranded nucleic acids, natural nucleic acids, synthetic nucleic acids, and combinations thereof.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 나노입자는 하이드로겔 상에 고정된 것이 아니며, 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be mounted inside the hydrogel rather than fixed to the hydrogel, but are not limited thereto. Therefore, the nanoparticles are not fixed on the hydrogel and can move freely within the hydrogel.
종래의 하이드로겔에 나노입자를 기능화하여 개발된 센서의 경우 나노입자의 움직임에 제한되기에 색 변화를 육안 분석이 아닌 형광 및 라만 염료(dye)를 통해서만 분석할 수 있다는 문제점이 있으며, 뚜렷한 색 변화를 구현하기 위해서는 반드시 2 가지 이상의 입자를 사용해야 한다는 한계점이 있다.In the case of sensors developed by functionalizing nanoparticles in conventional hydrogels, there is a problem in that color changes can only be analyzed through fluorescence and Raman dyes rather than visual analysis because the movement of nanoparticles is limited, and there is a clear color change. In order to implement, there is a limitation that two or more types of particles must be used.
반면, 본원에 따른 마이크로비드는 종래의 방법과 같이 비드 또는 하이드로겔 표면에 센서로서 이용되는 나노 입자를 고정 시키는 것이 아닌, 나노입자와 하이드로겔 마이크로비드의 물리화학적 작용을 분자 동역학으로 계산함으로써, 서로 간의 반응을 최소화하는 조건의 마이크로비드를 제공할 수 있다. On the other hand, the microbead according to the present application does not fix nanoparticles used as sensors on the surface of the bead or hydrogel as in the conventional method, but calculates the physical and chemical actions of nanoparticles and hydrogel microbeads using molecular dynamics, so that they interact with each other. Microbeads can be provided under conditions that minimize liver reaction.
하이드로겔 내의 나노입자의 경우, 나노입자의 크기 및 모양, 그리고 나노입자가 가지고 있는 전위 등 다양한 변수를 고려해야 한다. 더욱이, 액상 상태의 나노입자와는 다르게 하이드로겔 내의 나노입자의 경우, 나노입자-나노입자 간 상호작용뿐만 아니라 나노입자-하이드로겔 간 상호작용 또한 주요 변수로 작용하므로, 이를 고려하고 계산하는 것은 하이드로겔 내부에서 나노입자의 움직임을 제어하는데 매우 중요한 의미를 갖는다.In the case of nanoparticles in a hydrogel, various variables such as the size and shape of the nanoparticles and the potential possessed by the nanoparticles must be considered. Moreover, unlike nanoparticles in the liquid state, in the case of nanoparticles in a hydrogel, not only the nanoparticle-nanoparticle interaction but also the nanoparticle-hydrogel interaction acts as a major variable, so it is important to consider and calculate this in the hydrogel. It is very important in controlling the movement of nanoparticles inside the gel.
본원에 따른 마이크로비드는 나노입자-나노입자 간 및 나노입자와-하이드로겔 간의 상호작용을 계산하기 위해 서로간의 반데르 발스힘(Van der waals force) 및 정전기의(electrostatic) 영향을 계산하였다. 특히 후술할 나노입자의 안정성을 보장해주는 고분자층 및 하이드로겔 간의 삼투성(Osmotic) 및 탄력성(Elastic)을 Oshima theory 로 계산하는 XDLVO(extended DLVO) 식을 상미분방정식으로 계산하여 다양한 고분자층과 이온강도(Ionic strength)의 영향이 나노입자의 안정성에 미치는 이론적인 수치를 계산하였다.For the microbeads according to the present application, Van der Waals force and electrostatic influence on each other were calculated to calculate interactions between nanoparticles and nanoparticles and between nanoparticles and hydrogels. In particular, the XDLVO (extended DLVO) equation, which calculates the osmotic and elastic properties between the polymer layer and the hydrogel, which guarantees the stability of the nanoparticles, which will be described later, using Oshima theory, is calculated using ordinary differential equations, and various polymer layers and ions are calculated using ordinary differential equations. The theoretical value of the effect of ionic strength on the stability of nanoparticles was calculated.
후술하겠지만, 하이드로겔(제타전위: -4 mV) 내에 나노입자를 탑재하는 경우, 나노입자의 제타전위 값이 중성이거나 중성에 가까운 음의 값을 갖는 경우(제타전위 -20 mV 내지 0 mV)에 나노입자가 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하고, 이에 따라, 검지물질에 쉽게 반응함으로써 하이드로겔 내부에서의 반응성 또한 증가한다.As will be described later, when nanoparticles are mounted in a hydrogel (zeta potential: -4 mV), when the zeta potential value of the nanoparticles is neutral or has a negative value close to neutral (zeta potential -20 mV to 0 mV) Nanoparticles can move freely inside the hydrogel, and thus easily react to the detection material, thereby increasing the reactivity within the hydrogel.
따라서, 하이드로겔 마이크로비드 내부에 나노입자가 고정된 것이 아닌, 단순히 탑재시킨 새로운 형태의 마이크로비드를 제공함으로써, 본원에 따른 마이크로비드 내의 나노입자는 중성에 가까운 제타전위 값을 가지므로 아무런 제약 없이 자유롭게 움직일 수 있는 장점이 있다.Therefore, by providing a new type of microbead in which the nanoparticles are not fixed inside the hydrogel microbead, but are simply mounted, the nanoparticles in the microbead according to the present application have a zeta potential value close to neutral and can be freely used without any restrictions. It has the advantage of being able to move.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔의 크기는 200 ㎛ 내지 3,500 ㎛ 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the size of the hydrogel may be 200 ㎛ to 3,500 ㎛, but is not limited thereto.
예를 들어, 상기 하이드로겔의 크기는 300 ㎛ 내지 400 ㎛ 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the size of the hydrogel may be 300 ㎛ to 400 ㎛, but is not limited thereto.
종래의 하이드로겔를 사용한 색 센서의 경우 벌크 사이즈로 사용되어 검지물질과 반응하는 시간이 비교적 늦은 한계점이 있었다.In the case of color sensors using conventional hydrogels, there was a limitation in that they were used in bulk size and had a relatively slow reaction time with the detection material.
후술하겠지만, 본원에 따른 마이크로비드는 고전압의 정전기 액적발생기를 사용하여 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높인 수백 μm 크기의 하이드로겔 기반의 마이크로비드를 제공할 수 있는 장점이 있다. 이에 따라, 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높였기 때문에 고농도의 나노입자를 마이크로비드 내에 탑재할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 자유롭게 움직일 수 있는 나노입자가 마이크로비드 내에 고농도로 탑재되어 있기 때문에, 특정 검출 물질의 존재 하에 나노입자의 응집을 수초 내에 빠르게 유도할 수 있는 장점이 있다. 이에, 반응 효율 및 반응 시간을 비약적으로 향상시킬 수 있으므로, 뚜렷한 색 변화를 통한 육안 분석이 가능한 센서로서 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.As will be described later, the microbead according to the present application has the advantage of providing hydrogel-based microbeads of hundreds of μm in size, which dramatically increase the size of the surface area compared to the same volume by using a high-voltage electrostatic droplet generator. Accordingly, there is an advantage in that a high concentration of nanoparticles can be loaded into the microbeads because the size of the surface area compared to the same volume has been dramatically increased. Therefore, since freely movable nanoparticles are loaded in a high concentration within the microbeads, there is an advantage in that aggregation of nanoparticles can be quickly induced within a few seconds in the presence of a specific detection substance. Accordingly, reaction efficiency and reaction time can be dramatically improved, so it has the advantage of being useful as a sensor capable of visual analysis through clear color changes.
또한, 종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우 나노입자의 안정성이 이온 농도(ionic strength)에 따라 크게 변하기 때문에 혈액 등과 같은 체액이나 식품, 폐수, 바닷물 등과 같이 이온 농도가 크게 높은 환경에서 사용하기 어려운 문제점이 있다. In addition, in the case of color sensors using conventional nanoparticles, the stability of the nanoparticles varies greatly depending on the ionic strength, making it difficult to use them in environments with very high ionic concentrations, such as body fluids such as blood, food, wastewater, and seawater. There is a problem.
반면, 본원에 따른 마이크로비드는 마이크로 크기의 하이드로겔 비드 내에 나노입자가 탑재되어 있기 때문에, 기존의 액상 센서에 비해 나노입자가 높은 안정성을 가질 수 있으며, 곧 여러 조건에서 또한 본래의 나노입자 센서의 색을 유지할 수 있다. 따라서, 혈액 내에서도 안정한 마이크로비드를 제공할 수 있는 장점이 있다.On the other hand, since the microbead according to the present application has nanoparticles mounted within a micro-sized hydrogel bead, the nanoparticles can have higher stability compared to existing liquid sensors, and soon, under various conditions, they can be as stable as the original nanoparticle sensor. Color can be maintained. Therefore, there is an advantage in providing stable microbeads even in blood.
또한, 종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우, 색 대비 및 명도차가 작은 유채색에서 유채색으로 변화하는 시스템을 갖고 있기 때문에, 어떠한 환경 조건 하에서 또는 어떠한 특정 분석 물질과 반응하였는지를 파악하는데 어려움이 있다. 즉, 기존의 금속 나노입자들의 경우 색 대비 및 명도차가 크지 않아서 즉각적인 색변화 여부를 파악하고 모니터링하기 매우 어려운 한계가 있다.In addition, in the case of color sensors using conventional nanoparticles, since they have a system that changes from chromatic color to chromatic color with small color contrast and brightness difference, it is difficult to determine under what environmental conditions or with what specific analyte it reacted. In other words, in the case of existing metal nanoparticles, the color contrast and brightness difference are not large, so it is very difficult to determine and monitor immediate color change.
반면, 본원에 따른 마이크로비드는 하이드로겔의 크기를 수백 μm 크기로 줄임으로써, 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높였기 때문에 고농도의 나노입자를 마이크로비드 내에 탑재할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 자유롭게 움직일 수 있는 나노입자가 마이크로비드 내에 고농도로 탑재되어 있기 때문에, 특정 검출 물질의 존재 하에 나노입자의 응집을 수초 내에 빠르게 유도할 수 있는 장점이 있다. 이에, 반응 효율 및 반응 시간을 비약적으로 향상시킬 수 있으므로, 뚜렷한 색 변화를 통한 육안 분석이 가능한 센서로서 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.On the other hand, the microbead according to the present application has the advantage of being able to load a high concentration of nanoparticles into the microbead because the size of the hydrogel is reduced to hundreds of μm, thereby dramatically increasing the size of the surface area compared to the same volume. Therefore, because freely movable nanoparticles are loaded in a high concentration within the microbeads, there is an advantage in that aggregation of nanoparticles can be quickly induced within a few seconds in the presence of a specific detection substance. Accordingly, reaction efficiency and reaction time can be dramatically improved, so it has the advantage of being useful as a sensor capable of visual analysis through clear color changes.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 마이크로비드는 3 차원 구조인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the microbead may have a three-dimensional structure, but is not limited thereto.
본원에 따른 마이크로비드는 3 차원 구조를 가짐으로써 기존의 액상센서에 비하여 외부 물질을 필터링할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 고농도의 이온 용액 내에서도 나노입자의 응집이 없으며 장기간 동안 입자의 특성 변화 없이 보관이 가능한 안정성 높은 마이크로비드를 제공할 수 있다. 이에, 매우 높은 농도의 이온과 단백질 등이 섞여 특정 검출 물질만 센싱 하는 것이 어려웠던 혈액 및 폐수 등에서도 나노입자의 응집없이 작동 및 보관이 가능하여, 특정 검출 물질을 실시간으로 센싱 할 수 있는 장점이 있다. The microbead according to the present application has the advantage of being able to filter out external substances compared to existing liquid sensors by having a three-dimensional structure. Therefore, it is possible to provide highly stable microbeads that do not cause aggregation of nanoparticles even in high-concentration ionic solutions and can be stored for a long period of time without changing the properties of the particles. Accordingly, it can be operated and stored without agglomeration of nanoparticles even in blood and wastewater, where it is difficult to sense only specific detection substances due to the mixing of very high concentrations of ions and proteins, and has the advantage of being able to sense specific detection substances in real time. .
또한, 본원에 따른 마이크로비드는 3 차원 구조를 가지는 고분자 구조체이기 때문에, 다양한 화학적 분자 및 생체분자를 기능화 시킬 수 있으며, 고감도 센서 및 비표지 방식의 검출 센서로서도 유용하게 활용될 수 있다.In addition, since the microbead according to the present application is a polymer structure with a three-dimensional structure, it can functionalize various chemical molecules and biomolecules, and can also be usefully used as a highly sensitive sensor and a label-free detection sensor.
예를 들어, 상기 3 차원 구조는 구 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. For example, the three-dimensional structure may have a spherical shape, but is not limited thereto.
본원에 따른 마이크로비드가 구 형태의 3 차원 구조를 가지는 경우, 반응물질이 사방에서 비드의 내부까지 확산되는데 걸리는 시간이 동일한 장점이 있다. 또한, 정육면체, 육면체 등의 다각형 형태를 제작하는 것에 비하여 제조 과정의 용이성 및 편의성이 높은 장점이 있다.When the microbead according to the present application has a spherical three-dimensional structure, there is an advantage that the time it takes for the reactant to diffuse from all directions to the inside of the bead is the same. In addition, compared to manufacturing polygonal shapes such as cubes and hexahedrons, there is an advantage in that the manufacturing process is easy and convenient.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 고분자에 의해 코팅된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include those coated with a polymer, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자는 폴리바이닐피롤리돈(Polyvinyl Pyrrolidone, PVP), 폴리바이닐 알코올(Polyvinyl Alcohol, PVA), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PAAm), 알키드(Alkyds), 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol), 폴리에틸렌 폴리바이닐 메틸 에테르(Polyethylene Polyvinyl Methyl Ether) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the polymer is polyvinyl pyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyacrylamide (PAAm), alkyds, polyethylene glycol ( It may include, but is not limited to, one selected from the group consisting of Polyethylene Glycol, Polyethylene Polyvinyl Methyl Ether, and combinations thereof.
나노입자가 고분자로 코팅되면 나노입자의 안정성을 올려줌과 동시에 하이드로겔의 구조체가 가진 카르복실 그룹과의 정전기적 상호작용을 줄일 수 있다. 따라서, 고분자가 코팅된 나노입자의 경우, 하이드로겔 내부에서 자유롭게 움직일 수 있다.When nanoparticles are coated with a polymer, the stability of the nanoparticles can be increased and the electrostatic interaction with the carboxyl group of the hydrogel structure can be reduced. Therefore, in the case of polymer-coated nanoparticles, they can move freely inside the hydrogel.
또한, 상술하였듯이, 하이드로겔(제타전위: -4 mV) 내에 나노입자를 탑재하는 경우, 나노입자의 제타전위 값이 중성이거나 중성에 가까운 음의 값을 갖는 경우(제타전위 -20 mV 내지 0 mV)에 나노입자가 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하고, 이에 따라, 검지물질에 쉽게 반응함으로써 하이드로겔 내부에서의 반응성 또한 증가한다.In addition, as described above, when nanoparticles are mounted in a hydrogel (zeta potential: -4 mV), when the zeta potential value of the nanoparticles is neutral or has a negative value close to neutral (zeta potential -20 mV to 0 mV) ), the nanoparticles can move freely inside the hydrogel, and accordingly, the reactivity within the hydrogel also increases by easily reacting to the detection material.
따라서, 나노입자가 고분자로 코팅되면 나노입자의 제타전위 값을 중성으로 변화시켜 나노입자의 이동성 및 반응성을 증가시킬 수 있는 장점이 있다.Therefore, when nanoparticles are coated with a polymer, there is an advantage in that the mobility and reactivity of nanoparticles can be increased by changing the zeta potential value of the nanoparticles to neutral.
예를 들어, 상기 고분자는 폴리바이닐피롤리돈 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. For example, the polymer may be polyvinylpyrrolidone, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 고분자는 약 1 μM 내지 약 200 μM 의 농도로 상기 마이크로비드에 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to one embodiment of the present application, the polymer may be included in the microbeads at a concentration of about 1 μM to about 200 μM, but is not limited thereto.
고분자의 농도가 약 200 μM 보다 높으면 나노입자와 검출 물질과의 반응을 저해할 수 있으므로, 이러한 고농도 고분자로 코팅된 나노입자는 센서로서의 역할을 수행하기가 어렵다. 고분자의 농도가 약 1 μM 보다 낮으면 나노입자의 안정성 및 자유로운 움직임을 보장할 수 없다.If the polymer concentration is higher than about 200 μM, the reaction between the nanoparticles and the detection material may be inhibited, so it is difficult for nanoparticles coated with such high concentration polymers to function as sensors. If the polymer concentration is lower than about 1 μM, the stability and free movement of the nanoparticles cannot be guaranteed.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔은 알긴산(Alginate), 캐라지난(Carrageenan), 한천(Agar), 젤라틴(Gelatin), 카세인(Casein), 알부민(Albumin), 식물 전분(Starch), 아라비아고무(Gum Arabic), 로커스트콩검(Locust Bean Gum), 잔탄검(Xanthan Gum), 트라가칸스검(Tragacanth Gum), 카펙틴(Karpectine), 카복시 메틸 셀룰로오스(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 메틸셀룰로오스(Methyl Cellulose, MC), 에틸 셀룰로오스(Ethyl Cellulose, EC), 하이드록스에틸 셀룰로오스(Hydroxethyl Cellulose, HEC), 셀루아세테이트 프탈레이트(Celluacetate Phthalate, CAP), 스테아릴셀룰로오스(Stearyl Cellulose), 전분 유도체(Starch Derivatives), 인산화 전분(Starch Phosphate), 시아노 에틸화 전분(Cyano Ethylated Starch), 카복시 메틸 전분(Carboxy Methyl Starch, CMS), 하이드록시 에틸화 전분(Hydroxy Ethylated Starch) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the hydrogel is alginate, Carrageenan, Agar, Gelatin, Casein, Albumin, Plant Starch, Arabian Gum Arabic, Locust Bean Gum, Xanthan Gum, Tragacanth Gum, Karpectine, Carboxy Methyl Cellulose (CMC), Methylcellulose ( Methyl Cellulose (MC), Ethyl Cellulose (EC), Hydroxethyl Cellulose (HEC), Celluacetate Phthalate (CAP), Stearyl Cellulose, Starch Derivatives , Phosphorylated Starch (Starch Phosphate), Cyano Ethylated Starch (Cyano Ethylated Starch), Carboxy Methyl Starch (CMS), Hydroxy Ethylated Starch (Hydroxy Ethylated Starch), and combinations thereof. It may include, but is not limited to this.
바람직하게는, 상기 하이드로겔은 알긴산 하이드로겔 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the hydrogel may be an alginate hydrogel, but is not limited thereto.
자연에서 존재하는 미역 등 갈조류에서 추출한 알긴산(Alginic acid)이라고 불리는 천연 고분자는 자연산 다당류로서, 생체 적합성이 좋고 가격이 저렴하다는 장점이 있어, 조직공학에 널리 사용되는 고분자 중 하나이다. 알긴산의 다당류는 음전하를 띄고 있기 때문에 2 가 양이온과 결합하여 계란 박스(egg-box) 구조를 형성하여 비교적 쉽게 하이드로겔을 형성할 수 있는 장점이 있다. A natural polymer called alginic acid, extracted from brown algae such as seaweed that exists in nature, is a natural polysaccharide and has the advantage of good biocompatibility and low price, so it is one of the polymers widely used in tissue engineering. Because alginic acid polysaccharide has a negative charge, it has the advantage of being able to form a hydrogel relatively easily by combining with divalent cations to form an egg-box structure.
종래의 나노입자를 사용한 색 센서의 경우 용액 플랫폼으로 사용자가 직접 사용하기에 휴대성이 떨어지는 문제점이 있고, 액상 상태에서 작동되기에 샘플이 마르는 등 장기 보관성이 낮으며, 외부 환경에 매우 민감하여 센서의 상태가 쉽게 변할 수 있어 안정성이 낮은 문제점이 있다.In the case of color sensors using conventional nanoparticles, there are problems with poor portability for users to use directly as a solution platform, and because they operate in a liquid state, long-term storage is low, such as samples drying out, and they are very sensitive to the external environment. There is a problem with low stability because the state of the sensor can easily change.
이와 관련하여, 기판 형태, 예를 들어, 종이, 하이드로겔 등의 소재에 입자를 코팅하여 센서로 응용하려는 연구가 진행되고 있으나, 액상을 함유 하고 있는 하이드로겔의 경우 샘플이 건조되면 하이드로겔의 성질을 잃어버려 내부의 나노입자의 안정성이 크게 떨어지는 문제점이 있다.In this regard, research is being conducted to apply sensors by coating particles on substrates such as paper and hydrogel. However, in the case of hydrogels containing liquid, when the sample is dried, the properties of the hydrogel change. There is a problem in that the stability of the nanoparticles inside is greatly reduced due to loss of .
반면, 본원에 따른 마이크로비드는 수분 흡수율이 좋은 알긴산 하이드로겔 내부에 나노입자를 탑재시켰기 때문에, 마이크로비드가 건조되고 오랜 시간이 지난 뒤에도 건조된 하이드로겔 마이크로비드가 수분을 흡수하면 본래의 성질 및 기능을 회복할 수 있는 장점이 있다. 따라서, 장기간 보관 및 사용이 가능한 마이크로비드를 제공할 수 있는 장점이 있다.On the other hand, since the microbeads according to the present invention have nanoparticles mounted inside alginate hydrogel with good moisture absorption rate, even after a long time after the microbeads are dried, when the dried hydrogel microbeads absorb moisture, their original properties and functions are lost. It has the advantage of being able to recover. Therefore, there is an advantage in providing microbeads that can be stored and used for a long time.
또한, 예를 들어, 아가로즈겔의 경우 크기를 비약적으로 작게 만드는 것이 힘들기 때문에 하이드로겔의 크기를 줄이는 것은 매우 중요한 의미를 갖는다. 본원에 따른 마이크로 비드는 알긴산 하이드로겔을 사용하여 하이드로겔의 크기를 수백 μm 크기로 줄임으로써, 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높였기 때문에 고농도의 나노입자를 마이크로비드 내에 탑재할 수 있는 장점이 있다.In addition, for example, in the case of agarose gel, it is difficult to drastically reduce the size, so reducing the size of the hydrogel is very important. The microbead according to the present invention uses alginate hydrogel to reduce the size of the hydrogel to several hundred μm, thereby dramatically increasing the size of the surface area compared to the same volume, so it has the advantage of being able to load a high concentration of nanoparticles into the microbead. there is.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 구리(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 카드뮴(Cd) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. According to one embodiment of the present application, the nanoparticles are from the group consisting of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), cadmium (Cd), and combinations thereof. It may include selected ones, but is not limited thereto.
예를 들어, 상기 나노입자는 금 나노입자 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the nanoparticles may be gold nanoparticles, but are not limited thereto.
금 나노입자는 높은 굴절율을 가지며, 평균 입경을 쉽게 조절할 수 있다. 또한, 상기 금 나노입자는 넓은 표면적으로 인해 상평형 및 반응속도론의 통상적 제한을 용이하게 극복할 수 있고, 풍부한 생물학적 물질과 활성 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 금 나노입자 자체에서 국소 표면 플라즈몬 공명(Localized Surface Plasmon Resonance, LSPR)이 일어나기 때문에, 표면 플라즈몬 공명 신호가 증폭되어 마이크로비드의 센싱 민감도가 대폭 향상될 수 있다. Gold nanoparticles have a high refractive index, and the average particle diameter can be easily adjusted. In addition, the gold nanoparticles can easily overcome typical limitations in phase equilibrium and reaction kinetics due to their large surface area, and can form active complexes with abundant biological substances. In addition, because Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) occurs in the gold nanoparticle itself, the surface plasmon resonance signal can be amplified and the sensing sensitivity of the microbead can be greatly improved.
또한, 본원의 제 2 측면은, 하이드로겔 전구체 용액 및 나노입자를 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계, 상기 혼합 용액을 가교 용액 상에 적하하는 단계 및 상기 가교 용액 내에서 가교 반응이 진행되어 하이드로겔 내부에 나노입자가 탑재된 마이크로비드가 형성되는 단계를 포함하고, 상기 적하 시 전압을 가하여 상기 혼합 용액이 마이크로 크기의 액적 상태로 상기 가교 용액 내에 적하되는 것인, 마이크로비드의 제조 방법을 제공한다.In addition, the second aspect of the present application includes preparing a mixed solution by mixing a hydrogel precursor solution and nanoparticles, dropping the mixed solution onto a crosslinking solution, and performing a crosslinking reaction within the crosslinking solution to form a hydrogel. It provides a method for producing microbeads, comprising the step of forming microbeads with nanoparticles loaded therein, and applying a voltage during the dropping to drop the mixed solution into the crosslinking solution in the form of micro-sized droplets. .
본원의 제 2 측면의 마이크로비드의 제조 방법에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 2 측면에 동일하게 적용될 수 있다. Regarding the method for manufacturing microbeads of the second aspect of the present application, detailed description of parts overlapping with the first aspect of the present application has been omitted. However, even if the description is omitted, the content described in the first aspect of the present application is the same as the second aspect of the present application. The same can be applied to the side.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may include functionalized biomolecules or chemical molecules capable of recognizing the analyte to be detected on the surface, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the biomolecule or chemical molecule is an antibody, antibody fragment, genetically engineered antibody, single chain antibody, receptor protein, binding protein, enzyme, inhibitor protein, lectin, cell adhesion protein, oligonucleotide, polynucleotide. , nucleic acids, aptamers, and combinations thereof, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be freely movable within the hydrogel, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be mounted inside the hydrogel rather than fixed to the hydrogel, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 나노입자는 고분자에 의해 코팅된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the nanoparticles may be coated with a polymer, but are not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔 전구체 용액 및 상기 나노입자의 부피비는 약 1:1 내지 약 3:1 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the volume ratio of the hydrogel precursor solution and the nanoparticles may be about 1:1 to about 3:1, but is not limited thereto.
바람직하게는, 상기 하이드로겔 전구체 용액 및 상기 나노입자의 부피비는 약 2:1 인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Preferably, the volume ratio of the hydrogel precursor solution and the nanoparticles may be about 2:1, but is not limited thereto.
하이드로겔 전구체 용액의 비율이 너무 낮으면 하이드로겔이 형성되지 않고, 나노 입자의 비율이 너무 낮으면 색 변화가 육안으로 감지되기 어려워 색 센서로서의 역할을 수행하기가 어렵다.If the ratio of the hydrogel precursor solution is too low, the hydrogel is not formed, and if the ratio of nanoparticles is too low, the color change is difficult to detect with the naked eye, making it difficult to function as a color sensor.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 가교 용액은 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 인산칼슘(Ca3(PO4)2), 탄산칼슘(CaCO3) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the crosslinking solution consists of calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), calcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), calcium carbonate (CaCO 3 ), and combinations thereof. It may include those selected from the group, but is not limited thereto.
하이드로겔 전구체 용액의 가교 반응을 통해 하이드로겔을 형성하기 위해서, 가교 용액은 2가 양이온 또는 3 가 양이온을 포함한 용액이어야 한다.In order to form a hydrogel through a crosslinking reaction of a hydrogel precursor solution, the crosslinking solution must be a solution containing divalent cations or trivalent cations.
예를 들어, 상기 가교 용액은 염화칼슘을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.For example, the crosslinking solution may contain calcium chloride, but is not limited thereto.
가교 용액으로 염화칼슘을 이용하는 경우, 형성되는 하이드로겔이 투명한 상태가 되기 때문에, 색 센서로서 사용되는 경우, 육안으로 쉽고 빠르게 내부의 나노입자의 색 변화를 확인할 수 있는 센서로서 유용하게 활용될 수 있는 장점이 있다.When calcium chloride is used as a cross-linking solution, the hydrogel formed becomes transparent, so when used as a color sensor, it can be useful as a sensor that can easily and quickly check the color change of the nanoparticles with the naked eye. There is.
또한, 염화칼슘은 가교용액으로 사용되는 탄산칼슘 및 황산칼슘 등 다른 염에 비해 높은 이온화도를 지니기 때문에 하이드로겔 합성 시 매우 빠른 속도로 가교반응을 일으켜 합성 시간이 짧은 장점이 있다.In addition, calcium chloride has a higher ionization degree than other salts such as calcium carbonate and calcium sulfate, which are used as cross-linking solutions, so it has the advantage of causing a cross-linking reaction at a very high speed when synthesizing hydrogels, resulting in a short synthesis time.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 적하하는 단계는 정전기 액적발생기(Electrostatic Droplet Generator)를 이용하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the dropping step may be performed using an electrostatic droplet generator, but is not limited thereto.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 정전기 액적발생기에 약 0 kV 초과 약 20 kV 이하의 전압이 가해지면서 상기 마이크로 크기의 액적이 형성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the micro-sized droplets may be formed when a voltage of more than about 0 kV and less than about 20 kV is applied to the electrostatic droplet generator, but is not limited thereto.
고압 전원(high voltage power supply)의 전압은 마이크로비드의 크기를 결정하는 주요 원인 중 하나이다. 즉, 전압은 하이드로겔 전구체 용액 및 나노입자 혼합 용액이 마이크로 크기의 액적 상태로 상기 가교 용액 내에 적하되는데 작용하는 직접적인 힘이다. 따라서, 전압이 크면 클수록 혼합 용액을 빠르게 적하시킬 수 있고, 이는 마이크로비드의 크기를 작게 만들 수 있다.The voltage of the high voltage power supply is one of the main factors that determines the size of microbeads. In other words, the voltage is a direct force that acts to drop the hydrogel precursor solution and nanoparticle mixed solution into the crosslinking solution in the form of micro-sized droplets. Therefore, the higher the voltage, the faster the mixed solution can be dropped, which can make the size of the microbeads smaller.
종래의 하이드로겔를 사용한 색 센서의 경우 벌크 사이즈로 사용되었으나, 본원에 따른 마이크로비드의 제조 방법은 고전압의 정전기 액적발생기를 사용하여 동일 부피 대비 표면적의 크기를 비약적으로 높인 수백 μm 크기의 하이드로겔 기반의 마이크로비드를 제공할 수 있는 장점이 있다.In the case of color sensors using conventional hydrogels, bulk sizes were used, but the manufacturing method of microbeads according to the present application uses a high-voltage electrostatic droplet generator to dramatically increase the size of the surface area compared to the same volume. It is based on hydrogels of hundreds of μm in size. There is an advantage in providing microbeads.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 액적은 0.01 mL/min 내지 0.5 mL/min 의 속도로 상기 가교 용액 상에 적하되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the droplets may be dropped onto the cross-linking solution at a rate of 0.01 mL/min to 0.5 mL/min, but are not limited thereto.
또한, 본원의 제 3 측면은, 본원의 제 1 측면에 따른 마이크로비드를 포함하는 센서를 제공한다.Additionally, a third aspect of the present application provides a sensor including microbeads according to the first aspect of the present application.
본원의 제 3 측면의 센서에 대하여, 본원의 제 1 측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 그 설명이 생략되었더라도 본원의 제 1 측면에 기재된 내용은 본원의 제 3 측면에 동일하게 적용될 수 있다.Regarding the sensor of the third aspect of the present application, detailed description of parts overlapping with the first aspect of the present application has been omitted. However, even if the description is omitted, the content described in the first aspect of the present application is the same as the third aspect of the present application. It can be applied.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 센서는 색 변화 및 형광(fluorescence), 형광 공명 에너지 전달(FRET), 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR), 표면 강화 라만 분광(SERS) 현상에 의한 빛의 세기 변화를 검출할 수 있는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present application, the sensor detects light intensity changes due to color change and fluorescence, fluorescence resonance energy transfer (FRET), localized surface plasmon resonance (LSPR), and surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) phenomena. It may include something that can be detected, but is not limited thereto.
본원에 따른 센서는 고농도의 나노입자를 탑재한 하이드로겔 마이크로비드를 포함함으로써, 높은 안정성을 가지면서도 반응 효율 및 반응 시간이 비약적으로 향상된 센서로서 활용될 수 있다. 이에, 높은 반응효율 및 빠른 센싱 시간을 가지므로, 뚜렷한 색 변화를 통한 육안 분석이 가능한 센서 등으로 폭넓게 활용될 수 있다.The sensor according to the present application includes hydrogel microbeads loaded with a high concentration of nanoparticles, so it can be used as a sensor with high stability and dramatically improved reaction efficiency and reaction time. Accordingly, because it has high response efficiency and fast sensing time, it can be widely used as a sensor capable of visual analysis through clear color changes.
또한, 본원에 따른 센서는 3 차원 구조를 가지는 마이크로비드를 포함함으로써, 외부 물질을 필터링할 수 있으므로, 매우 높은 농도의 이온과 단백질 등이 섞여 특정 검출 물질만 센싱 하는 것이 어려웠던 혈액 및 폐수 등에서도 나노입자의 응집없이 작동 및 보관이 가능하여, 특정 검출 물질을 실시간으로 센싱 할 수 있기 때문에 다양한 환경에서도 안정적으로 사용할 수 있는 장점이 있다.In addition, the sensor according to the present invention contains microbeads with a three-dimensional structure, so it can filter external substances, so it can filter out nanomaterials even in blood and wastewater, where it is difficult to sense only specific detection substances due to the mixing of very high concentrations of ions and proteins. It has the advantage of being able to be used stably in a variety of environments because it can be operated and stored without particle agglomeration and can sense specific detection substances in real time.
또한, 본원에 따른 센서는 3 차원 구조를 가지는 마이크로비드를 포함함으로써, 다양한 화학적 분자 및 생체분자를 기능화 시킬 수 있기 때문에 고감도 센서 및 비표지 방식의 검출 센서로서 의료용, 군사용, 우주항공, 자동차, 화학 및 에너지 산업 등 다양한 분야에서 폭넓게 활용될 수 있는 장점이 있다.In addition, the sensor according to the present invention is capable of functionalizing various chemical molecules and biomolecules by containing microbeads with a three-dimensional structure, and is therefore a highly sensitive sensor and label-free detection sensor for medical, military, aerospace, automotive, and chemical applications. It has the advantage of being widely used in various fields such as the energy industry and others.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. The present invention will be described in more detail through the following examples. However, the following examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present application.
[실시예 1-1] 고분자가 코팅된 나노입자(AuNP@PVP)의 제조[Example 1-1] Preparation of polymer-coated nanoparticles (AuNP@PVP)
초순수를 용매로 하여, 각각, PVP 20 μM 의 용액 25 ml 및 13 nm 크기의 직경을 가지는 금 나노입자 6.1 nM 의 용액 25 ml 를 부피비 1:1 로 혼합하여 고분자가 코팅된 나노입자(AuNP@PVP)를 제조하였다.Using ultrapure water as a solvent, 25 ml of a solution of 20 μM PVP and 25 ml of a solution of 6.1 nM gold nanoparticles with a diameter of 13 nm were mixed at a volume ratio of 1:1 to produce polymer-coated nanoparticles (AuNP@PVP). ) was prepared.
[실시예 1-2] 마이크로비드의 제조 [Example 1-2] Preparation of microbeads
초순수를 용매로 하여, 각각, PVP 20 μM 의 용액 25 ml 및 13 nm 크기의 직경을 가지는 금 나노입자 6.1 nM 의 용액 25 ml 를 부피비 1:1 로 혼합한 뒤, 암실에서 24 h 보관하였다.Using ultrapure water as a solvent, 25 ml of a solution of 20 μM PVP and 25 ml of a solution of 6.1 nM gold nanoparticles with a diameter of 13 nm were mixed at a volume ratio of 1:1 and stored in the dark for 24 h.
이어서, 원심분리기를 이용하여 워싱(washing)하여 여분의 PVP 를 제거하여, 금 나노입자 12.2 nM 를 포함하는 상기 PVP 가 코팅된 금 나노입자 용액 1 ml 를 5 ml 주사기(syringe pump)에 넣어서 준비하였다.Next, excess PVP was removed by washing using a centrifuge, and 1 ml of the PVP-coated gold nanoparticle solution containing 12.2 nM of gold nanoparticles was prepared by adding it to a 5 ml syringe pump. .
이어서, 초순수를 용매로 하여 2 ml 의 알지네이트 1.5% 용액을 5 ml 주사기(syringe pump)에 넣어서 준비하였다.Next, 2 ml of 1.5% alginate solution was prepared by using ultrapure water as a solvent in a 5 ml syringe pump.
이어서, 상기 두 주사기를 syringe luer 를 이용하여 연결하였다. 연결된 두 주사기를 서로 펌핑하여 알지네이트-금 나노입자 혼합 용액을 제조하였다.Next, the two syringes were connected using a syringe luer. An alginate-gold nanoparticle mixed solution was prepared by pumping two connected syringes together.
이어서, 상기 혼합 용액을 5 ml 주사기(syringe pump)에 넣은 후, 고전압 정전기 액적발생기를 이용하여 12 kV 의 전압을 가하여 혼합 용액을 0.1 ml/min 의 속도로 100 mM 의 CaCl2 용액 상에 적하시켜 나노입자가 탑재된 하이드로겔 마이크로비드를 제조하였다.Next, the mixed solution was placed in a 5 ml syringe pump, and a voltage of 12 kV was applied using a high-voltage electrostatic droplet generator to drop the mixed solution onto the 100 mM CaCl 2 solution at a rate of 0.1 ml/min. Hydrogel microbeads loaded with nanoparticles were manufactured.
[실시예 2-1] 항체가 기능화된 나노입자(AuNP@Antibody)의 제조[Example 2-1] Preparation of antibody-functionalized nanoparticles (AuNP@Antibody)
금나노입자 표면에 항체를 기능화 하기 위해 우선적으로 금 나노입자 표면에 polyvinylpolypyrrolidone(PVP)을 코팅한 다음 Tween20을 추가적으로 코팅하였다.To functionalize the gold nanoparticle surface with an antibody, polyvinylpolypyrrolidone (PVP) was first coated on the gold nanoparticle surface, and then Tween20 was additionally coated.
이어서, 상기 나노입자에 16-Mercaptohexadecanoic acid (MHA)를 기능화(1 시간)한 후, 원심분리기 11,000 rcf, 30분 조건으로 세 번 세척하였다.Subsequently, the nanoparticles were functionalized with 16-Mercaptohexadecanoic acid (MHA) (1 hour) and then washed three times in a centrifuge at 11,000 rcf for 30 minutes.
이어서, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC) 및 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 MES buffer에서 준비하고 세척된 금 나노입자와 1시간동안 반응시켰다.Subsequently, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) were prepared in MES buffer and reacted with the washed gold nanoparticles for 1 hour.
이어서, 아플라톡신 항체 (aflatoxin B1 antibody)를 EDC/NHS 반응된 금 나노입자와 한 시간 동안 반응시켰다.Subsequently, aflatoxin B1 antibody was reacted with the EDC/NHS-reacted gold nanoparticles for one hour.
이어서, blocking agent인 Tween 20을 첨가하고 다시 한 시간 동안 반응시킨 후, 원심분리기 11,000 rcf, 30분 조건으로 세 번 세척하였다. Next, Tween 20, a blocking agent, was added and reacted for another hour, and then washed three times in a centrifuge at 11,000 rcf for 30 minutes.
세척 후 PBS buffer에 분산시켜 금나노입자를 준비했다.After washing, gold nanoparticles were prepared by dispersing them in PBS buffer.
[실시예 2-2] 마이크로 비드의 제조[Example 2-2] Preparation of microbeads
먼저, 알지네이트 1.5 % 용액 및 항체가 기능화된 나노입자(AuNP@Antibody)를 2:1의 부피비로 혼합한다. 이때 나노입자의 농도는 12.2 nM이다. First, a 1.5% alginate solution and antibody-functionalized nanoparticles (AuNP@Antibody) are mixed at a volume ratio of 2:1. At this time, the concentration of nanoparticles was 12.2 nM.
이어서, 알지네이트와 혼합된 항체가 기능화된 금 나노입자 샘플을 5 mL 주사기에 넣은 후 100 mM의 CaCl2 용액에 주사기 주입기(syringe pump)를 이용하여 0.1 mL/min의 속도로 반응시킨다.Next, the antibody-functionalized gold nanoparticle sample mixed with alginate is placed in a 5 mL syringe and reacted in 100 mM CaCl 2 solution at a rate of 0.1 mL/min using a syringe pump.
[비교예 1] 시트르산염이 코팅된 나노입자(AuNP@citrate)의 제조[Comparative Example 1] Preparation of citrate-coated nanoparticles (AuNP@citrate)
2 ml 의 초순수 용매에 HAuCl4 33.979 mg 를 혼합하여, 50 mM 의 용액을 준비하였다.A 50 mM solution was prepared by mixing 33.979 mg of HAuCl 4 in 2 ml of ultrapure solvent.
이어서, 상기 50 mM 용액에 초순수 용매 98 ml 를 첨가하여 1 mM 의 용액 100 ml 를 준비하였다.Next, 98 ml of ultrapure solvent was added to the 50 mM solution to prepare 100 ml of a 1 mM solution.
이어서, 상기 1 mM 용액에 금 전구체를 첨가하였다. 그 후, 핫플레이트를 이용하여 100℃ 내지 110℃ 의 온도 범위에서 가열하였다. 5 분 후, 환원제로 시트르산염을 첨가하였다.Subsequently, a gold precursor was added to the 1 mM solution. Afterwards, it was heated in a temperature range of 100°C to 110°C using a hot plate. After 5 minutes, citrate was added as reducing agent.
반응이 종료된 후, 용액을 상온에서 식혀 액상 상태의 금 나노입자를 제조하였고, 비교예로서 사용하였다.After the reaction was completed, the solution was cooled at room temperature to prepare liquid gold nanoparticles, which were used as a comparative example.
[비교예 2] 액상 상태의 나노입자의 제조 [Comparative Example 2] Preparation of nanoparticles in liquid state
2 ml 의 초순수 용매에 HAuCl4 33.979 mg 를 혼합하여, 50 mM 의 용액을 준비하였다.A 50 mM solution was prepared by mixing 33.979 mg of HAuCl 4 in 2 ml of ultrapure solvent.
이어서, 상기 50 mM 용액에 초순수 용매 98 ml 를 첨가하여 1 mM 의 용액 100 ml 를 준비하였다.Next, 98 ml of ultrapure solvent was added to the 50 mM solution to prepare 100 ml of a 1 mM solution.
이어서, 상기 1 mM 용액에 금 전구체를 첨가하였다. 그 후, 핫플레이트를 이용하여 100℃ 내지 110℃ 의 온도 범위에서 가열하였다. 5 분 후, 환원제를 첨가하였다.Subsequently, a gold precursor was added to the 1 mM solution. Afterwards, it was heated in a temperature range of 100°C to 110°C using a hot plate. After 5 minutes, reducing agent was added.
반응이 종료된 후, 용액을 상온에서 식혀 액상 상태의 금 나노입자를 제조하였고, 비교예로서 사용하였다.After the reaction was completed, the solution was cooled at room temperature to prepare liquid gold nanoparticles, which were used as a comparative example.
[실험예 1] [Experimental Example 1]
도 2 의 (A) 는 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 및 비교예 1(AuNP@citrate)에 따른 나노입자의 DTT 농도에 따른 색 변화를 나타낸 그래프이다.Figure 2 (A) is a graph showing the color change according to the DTT concentration of nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) and Comparative Example 1 (AuNP@citrate) of the present application.
구체적으로, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 나노입자 100 μL 를 아가로즈겔 1.5% 50 μL 와 혼합하여 겔을 제작하였다.Specifically, a gel was produced by mixing 100 μL of nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) with 50 μL of 1.5% agarose gel.
이어서, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 나노입자 액체 150 μL(in solution) 및 상기 겔(in agarose gel)을 각각 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)의 존재 하에 반응시킨 후, UV-VIS 를 이용하여 extinction 값을 분석하였다.Next, 150 μL (in solution) of the nanoparticle liquid according to Example 1-1 (AuNP@PVP) and the gel (in agarose gel) were reacted in the presence of 1,4-dithiothreitol (DTT), a detection substance, respectively. , extinction values were analyzed using UV-VIS.
이를 통하여, 5 x 10-6 M 및 10 x 10-6 M 의 DTT 존재 하에서 실시예 1(AuNP@PVP) 의 현저한 색상 변화를 확인할 수 있었다. 또한, DTT 농도가 증가함에 따라 R(대조표준 대비 반응한 extinction ratio 의 변화 값) 값이 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 나노입자의 제타전위가 하이드로겔에서 나노입자의 이동 및 응집에 영향을 미치는 중요한 요인 중 하나임을 시사하는 것이다.Through this, a significant color change of Example 1 (AuNP@PVP) was confirmed in the presence of 5 x 10 -6 M and 10 x 10 -6 M of DTT. In addition, it was confirmed that as the DTT concentration increased, the value of R (change in extinction ratio in response to the reference standard) increased. This suggests that the zeta potential of nanoparticles is one of the important factors affecting the movement and aggregation of nanoparticles in hydrogels.
도 2 의 (B) 는 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 및 비교예 1(AuNP@citrate)에 따른 나노입자의 제타전위를 측정한 그래프이다.Figure 2 (B) is a graph measuring the zeta potential of nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) and Comparative Example 1 (AuNP@citrate) of the present application.
구체적으로, 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP(w/o NaCl)), 실시예 1-1 을 300 mM 염화나트륨 용액에 넣은 용액(AuNP@PVP(w/ NaCl)) 및 비교예 1(AuNP@citrate)의 제타전위를 제타사이저(Malvern Zetasizer Nano-ZS90, UK)를 이용하여 측정하였다.Specifically, Example 1-1 of the present application (AuNP@PVP(w/o NaCl)), a solution of Example 1-1 in 300 mM sodium chloride solution (AuNP@PVP(w/ NaCl)), and Comparative Example 1 ( The zeta potential of AuNP@citrate) was measured using a Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano-ZS90, UK).
이를 통하여, 하이드로겔(제타전위: -4 mV) 내에 나노입자를 탑재하는 경우, 나노입자의 제타전위 값이 중성이거나 중성에 가까운 음의 값을 갖는 (제타전위 -20 mV 내지 0 mV) 것을 확인할 수 있었다. 이는 나노입자가 중성에 가까운 제타전위 값을 가지는 경우, 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하고, 이에 따라, 검지물질에 쉽게 반응함으로써 하이드로겔 내부에서의 반응성 또한 증가함을 시사하는 것이다.Through this, it can be confirmed that when nanoparticles are loaded into the hydrogel (zeta potential: -4 mV), the zeta potential value of the nanoparticles is neutral or has a negative value close to neutral (zeta potential -20 mV to 0 mV). I was able to. This suggests that when nanoparticles have a zeta potential value close to neutral, they can move freely inside the hydrogel and, accordingly, easily react to the detection material, thereby increasing the reactivity within the hydrogel.
또한, 염화 나트륨의 경우 용액에서 이온화하여 존재하며 이때 각각의 나트륨 이온과 염화 이온의 경우 전하 값을 가지고 있는 나노입자와 반응을 하게 된다. 즉, 음의 전하값을 가진 금나노입자(AuNP@PVP)는 나트륨 이온과 반응하여 입자 표면에서 상호작용을 하게 되고 이 경우 나노입자의 실질적인 제타전위값이 변함을 확인할 수 있었다. 이는, 추가적인 고분자나 화학처리를 하지 않더라도 제타전위를 조절할 수 있으며, 제타전위에 따른 나노입자의 거동 및 반응성을 외부 변수 없이 정확히 확인할 수 있음을 시사하는 것이다.In addition, sodium chloride exists ionized in a solution, and at this time, each sodium ion and chloride ion react with nanoparticles that have a charge value. In other words, gold nanoparticles (AuNP@PVP) with a negative charge value react with sodium ions and interact on the particle surface, and in this case, it was confirmed that the actual zeta potential value of the nanoparticles changed. This suggests that the zeta potential can be adjusted even without additional polymer or chemical treatment, and the behavior and reactivity of nanoparticles according to the zeta potential can be accurately confirmed without external variables.
[실험예 2][Experimental Example 2]
도 3 은 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 고분자 농도에 따른 반응성을 나타낸 그래프이다. Figure 3 is a graph showing the reactivity of microbeads according to an example of the present application according to polymer concentration.
구체적으로, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 반응속도 및 반응도를 육안(도 3 의 (A)) 및 US-VIS(도 3 의 (B)) 를 이용하여 측정하였다.Specifically, the microbeads according to the examples of the present application were reacted with 1,4-dithiothreitol (DTT), a detection substance, and the reaction rate and reactivity were measured visually (Figure 3 (A)) and US-VIS (Figure 3 (B) )) was measured using .
이를 통하여, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드에 포함된 고분자가 코팅된 나노입자의 경우, 하이드로겔 내부에서 자유롭게 움직일 수 있으므로 높은 반응속도 및 반응도를 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 고분자가 하이드로겔의 구조체가 가진 카르복실 그룹과의 정전기적 상호작용을 줄여준다는 점을 시사하는 것이다.Through this, it was confirmed that the polymer-coated nanoparticles included in the microbeads according to the examples of the present application have high reaction rate and reactivity because they can move freely inside the hydrogel, which means that the polymer is the structure of the hydrogel. This suggests that it reduces the electrostatic interaction with the carboxyl group.
또한, 동일 시간 대비 높은 반응비을 보이는 고분자의 농도가 10 μM 임을 확인할 수 있었다. 이는, 고분자의 농도가 약 200 μM 보다 높으면 나노입자와 검출 물질과의 반응을 저해할 수 있으므로, 이러한 고농도 고분자로 코팅된 나노입자는 센서로서의 역할을 수행하기가 어렵고, 고분자의 농도가 약 1 μM 보다 낮으면 나노입자의 안정성 및 자유로운 움직임을 보장할 수 없으므로, 최적의 고분자 농도를 찾는 것이 중요함을 시사하는 것이다.In addition, it was confirmed that the concentration of the polymer showing a high reaction ratio compared to the same time was 10 μM. This is because if the polymer concentration is higher than about 200 μM, the reaction between the nanoparticles and the detection material can be inhibited, so it is difficult for nanoparticles coated with such a high concentration of polymer to perform their role as a sensor, and the polymer concentration is about 1 μM. If it is lower, the stability and free movement of nanoparticles cannot be guaranteed, suggesting that it is important to find the optimal polymer concentration.
[실험예 3][Experimental Example 3]
도 4 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 전압에 따른 크기를 측정한 이미지이다. Figure 4 is an image measuring the size of microbeads according to the voltage according to an embodiment of the present application.
구체적으로, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 크기를 육안(도 4 의 (A)) 및 광학 현미경(Optical microscope)(도 4 의 (B))으로 측정하였다.Specifically, the size of the microbeads according to the examples herein was measured with the naked eye (Figure 4 (A)) and an optical microscope (Figure 4 (B)).
이를 통하여, 고압 전원(high voltage power supply)의 전압 크기에 따라 마이크로비드의 크기를 조절할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 12 kV 의 전압을 가한 경우 300 μm 내지 400 μm 의 매우 작은 크기의 마이크로비드가 제조되는 것을 확인할 수 있었다.Through this, it was confirmed that the size of the microbeads could be adjusted depending on the voltage level of the high voltage power supply. In addition, it was confirmed that when a voltage of 12 kV was applied, very small microbeads of 300 μm to 400 μm were produced.
[실험예 4][Experimental Example 4]
도 5 는 본원의 실시예 및 비교예에 따른 마이크로비드의 응집 속도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. Figure 5 is a graph showing the results of measuring the aggregation speed of microbeads according to the examples and comparative examples herein.
구체적으로, 도 5 의 (A) 및 도 5 의 (B) 는 본원의 비교예를 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 반응속도 및 반응도를 육안(도 5 의 (A)) 및 US-VIS(도 5 의 (B)) 를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 이미지이고, 도 5 의 (C) 및 도 5 의 (D) 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 반응속도 및 반응도를 육안(도 5 의 (C)) 및 US-VIS(도 5 의 (D)) 를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 이미지이다.Specifically, Figures 5(A) and 5(B) show the reaction rate and reactivity by reacting the comparative example of the present application with the detection material, 1,4-dithiothreitol (DTT), by visual observation (Figure 5(A)). and US-VIS (FIG. 5(B)), and FIGS. 5(C) and 5(D) show microbeads according to an example of the present application as the detection material. This image shows the results of reaction with 4-dithiothreitol (DTT) and measurement of reaction rate and reactivity using the naked eye (Figure 5(C)) and US-VIS (Figure 5(D)).
이를 통하여, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드 내부의 나노입자가 액상 상태의 나노입자인 비교예와 유사한 수준으로 빠른 속도로 검출 물질과 반응하여 응집하는 것을 확인할 수 있었다.Through this, it was confirmed that the nanoparticles inside the microbeads according to the examples of the present application reacted and aggregated with the detection substance at a fast rate similar to the comparative example, which was nanoparticles in a liquid state.
[실험예 5][Experimental Example 5]
도 6 의 (A) 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 안정성을 육안으로 측정한 결과를 나타낸 이미지이고, 도 6 의 (B) 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 안정성을 US-VIS 를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 6 (A) is an image showing the results of visually measuring the stability of microbeads according to an example of the present application, and Figure 6 (B) is an image showing the stability of the microbead according to an example of the present application using US-VIS. This is a graph showing the measurement results using this method.
구체적으로, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 혈액 내에서 1 h 동안 보관한 후, PBS 버퍼로 세척하여 육안 및 US-VIS 를 이용하여 안정성을 측정하였다. 이어서, 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 육안 및 US-VIS 를 이용하여 반응성을 측정하였다.Specifically, the microbeads according to the examples herein were stored in blood for 1 h, then washed with PBS buffer and their stability was measured visually and using US-VIS. Next, it was reacted with the detection substance, 1,4-dithiothreitol (DTT), and its reactivity was measured using the naked eye and US-VIS.
이를 통하여, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드는 매우 높은 농도의 이온과 단백질 등이 섞여 특정 검출 물질만 센싱 하는 것이 어려웠던 혈액에서도 특정 검출 물질인 DDT 와 정상적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 마이크로비드가 나노입자를 보호함으로써 나노입자가 혈액 내에서도 높은 안정성을 가짐을 시사하는 것이다.Through this, it was confirmed that the microbeads according to the examples of the present application react normally with a specific detection substance, DDT, even in blood, where it was difficult to sense only a specific detection substance due to a very high concentration of ions and proteins mixed together. This suggests that the nanoparticles have high stability even in the blood as the microbeads protect the nanoparticles.
[실험예 6][Experimental Example 6]
도 7 은 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 장기간 보관 가능성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.Figure 7 is a graph showing the results of measuring the long-term storage potential of microbeads according to an example of the present application.
구체적으로, 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 동결 건조 시켜 하이드로겔의 성질을 잃게하였다. 6 개월 후, 동결 건조한 마이크로비드를 PBS 버퍼에 담군 후, 마이크로비드가 본래의 성질을 회복하는지 육안 및 US-VIS 를 이용하여 측정하였다. 이어서, 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 육안 및 US-VIS 를 이용하여 반응성을 회복하는지 측정하였다.Specifically, the microbeads according to the examples herein were freeze-dried to lose their hydrogel properties. Six months later, the freeze-dried microbeads were immersed in PBS buffer, and then it was measured visually and using US-VIS to see whether the microbeads recovered their original properties. Next, it was reacted with 1,4-dithiothreitol (DTT), a detection substance, to determine whether reactivity was restored using the naked eye and US-VIS.
도 7 의 (A) 및 도 7 의 (B) 는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 반응성을 육안(도 7 의 (A)) 및 US-VIS(도 7 의 (B)) 를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 이미지이고, 도 7 의 (C) 및 도 7 의 (D) 는 6 개월 동안 동결 건조시켰던 본원의 실시예에 따른 마이크로비드를 PBS 버퍼에 담군 후, 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)와 반응시켜 반응성을 회복하는지를 육안(도 7 의 (C)) 및 US-VIS(도 7 의 (D)) 를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 이미지이다.Figure 7 (A) and Figure 7 (B) show the reactivity of microbeads according to an example of the present application with 1,4-dithiothreitol (DTT), a detection substance, by visual observation (Figure 7 (A)) and US. -This is an image showing the results of measurement using VIS (FIG. 7(B)), and FIGS. 7(C) and 7(D) show microbeads according to an example of the present application that were freeze-dried for 6 months. After immersion in the PBS buffer, recovery of reactivity was measured by visual observation ((C) of Figure 7) and US-VIS ((D) of Figure 7) by reacting with the detection substance 1,4-dithiothreitol (DTT). This is an image showing the results.
이를 통하여, 마이크로비드가 건조되고 오랜 시간이 지난 뒤에도 건조된 하이드로겔 마이크로비드가 수분을 흡수하면 본래의 성질을 회복하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 하이드로겔 내부의 나노입자 또한 특정 검출 물질인 DDT 와 정상적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 본원의 실시예에 따른 마이크로비드의 나노입자 보관 능력이 매우 우수하여, 마이크로비드의 장기간 보관 및 사용이 가능함을 시사하는 것이다.Through this, it was confirmed that even after a long time after the microbeads were dried, the dried hydrogel microbeads recovered their original properties when they absorbed moisture. In addition, it was confirmed that the nanoparticles inside the hydrogel also reacted normally with DDT, a specific detection substance. This suggests that the nanoparticle storage capacity of the microbeads according to the examples herein is very excellent, allowing long-term storage and use of the microbeads.
[실험예 7][Experimental Example 7]
도 8 은 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 에 따른 나노입자의 제타전위에 따른 반응성을 측정한 그래프이다.Figure 8 is a graph measuring the reactivity according to zeta potential of nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) of the present application.
구체적으로, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 6.1 nM 나노입자 2 mL 를 각각 60 μM, 300 μM, 600 μM, 1,000 μM 의 PAA(polyacrylic acid) 2 mL 와 혼합한 후, 12 시간 동안 반응시켰다(AuNP@PAA).Specifically, 2 mL of 6.1 nM nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) were mixed with 2 mL of PAA (polyacrylic acid) of 60 μM, 300 μM, 600 μM, and 1,000 μM, respectively, for 12 hours. It was reacted (AuNP@PAA).
이어서, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 6.1 nM 나노입자 2 mL 를 각각 200 μM, 600 μM, 1,000 μM PA(polyallylamine) 2 mL 와 혼합한 후, 12 시간 동안 반응시켰다(AuNP@PA).Next, 2 mL of 6.1 nM nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) were mixed with 2 mL of 200 μM, 600 μM, and 1,000 μM PA (polyallylamine), respectively, and reacted for 12 hours (AuNP@PA ).
상기 9.15 nM 의 AuNP@PAA 및 AuNP@PA 100 μL 를 원심분리기를 이용하여 세척한 후, 버퍼(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 및 아가로즈겔(1.5 %)과 혼합하였다. 이어서, 100℃ 까지 가열한 후, 식혀서 샘플을 서서히 굳혔다.The 9.15 nM AuNP@PAA and 100 μL of AuNP@PA were washed using a centrifuge and then mixed with buffer (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) and agarose gel (1.5%). Then, after heating to 100°C, the sample was gradually solidified by cooling.
이어서, 상기 샘플을 각각 검출 물질인 1,4-dithiothreitol (DTT)의 존재 하에 반응시킨 후, UV-VIS 를 이용하여 반응성을 측정하였다.Subsequently, the samples were each reacted in the presence of 1,4-dithiothreitol (DTT), a detection substance, and then the reactivity was measured using UV-VIS.
이를 통하여, 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 에 따른 나노입자 표면에 PAA 및 PA 를 코팅하여 제타전위의 차이를 부여하고, 이를 제타전위 -4 mV 아가로즈겔에 첨가하여 제타전위에 따른 검지물질(DTT)과의 반응성 차이를 확인할 수 있었다.Through this, PAA and PA were coated on the surface of the nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) of the present application to give a difference in zeta potential, and this was added to an agarose gel with a zeta potential of -4 mV to change the zeta potential. Differences in reactivity with the detection substance (DTT) could be confirmed.
DTT 농도 10 μM 에서부터 나노입자들이 응집되는 것을 확인할 수 있었으며, 이때 전위차에 따른 나노입자들의 반응성 차이를 확인하여 나노입자의 제타전위 값이 중성이거나 중성에 가까운 음의 값을 갖는 경우 금 나노입자의 반응성이 가장 좋은 것을 확인할 수 있었다. 이는 cryo-TEM 데이터를 통해서도 확인할 수 있었으며 동일한 조건일 때 중성에 가까운 제타전위 값을 가질수록 반응한 나노입자의 개수가 더욱 많은 것을 확인할 수 있었다. 이는 나노입자가 중성에 가까운 제타전위 값을 가지는 경우, 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하고, 이에 따라, 검지물질에 쉽게 반응함으로써 하이드로겔 내부에서의 반응성 또한 증가함을 시사하는 것이다.It was confirmed that nanoparticles aggregated from a DTT concentration of 10 μM. At this time, the difference in reactivity of nanoparticles according to the potential difference was confirmed, and if the zeta potential value of the nanoparticles was neutral or had a negative value close to neutral, the reactivity of the gold nanoparticles was confirmed. I was able to confirm this was the best one. This could also be confirmed through cryo-TEM data, and under the same conditions, the closer the zeta potential value was to neutral, the greater the number of reacted nanoparticles. This suggests that when nanoparticles have a zeta potential value close to neutral, they can move freely inside the hydrogel and, accordingly, easily react to the detection material, thereby increasing the reactivity within the hydrogel.
[실험예 8][Experimental Example 8]
도 9 는 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 에 따른 나노입자의 제타전위에 따른 반응성을 측정한 그래프이다.Figure 9 is a graph measuring the reactivity according to zeta potential of nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) of the present application.
구체적으로, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 6.1 nM 나노입자 2 mL 를 각각 60 μM, 300 μM, 600 μM, 1,000 μM 의 PAA(polyacrylic acid) 2 mL 와 혼합한 후, 12 시간 동안 반응시켰다(AuNP@PAA).Specifically, 2 mL of 6.1 nM nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) were mixed with 2 mL of PAA (polyacrylic acid) of 60 μM, 300 μM, 600 μM, and 1,000 μM, respectively, for 12 hours. It was reacted (AuNP@PAA).
이어서, 실시예 1-1(AuNP@PVP)에 따른 6.1 nM 나노입자 2 mL 를 각각 200 μM, 600 μM, 1,000 μM PA(polyallylamine) 2 mL 와 혼합한 후, 12 시간 동안 반응시켰다(AuNP@PA).Next, 2 mL of 6.1 nM nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) were mixed with 2 mL of 200 μM, 600 μM, and 1,000 μM PA (polyallylamine), respectively, and reacted for 12 hours (AuNP@PA ).
상기 9.15 nM 의 AuNP@PAA 및 AuNP@PA 100 μL 를 원심분리기를 이용하여 세척한 후, 버퍼(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 및 아가로즈겔(1.5 %)과 혼합하였다. 이어서, 100℃ 까지 가열한 후, 식혀서 샘플을 서서히 굳혔다.The 9.15 nM AuNP@PAA and 100 μL of AuNP@PA were washed using a centrifuge and then mixed with buffer (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) and agarose gel (1.5%). Then, after heating to 100°C, the sample was gradually solidified by cooling.
이어서, 20 μM DTT 용액 및 NaCl(각각 0 mM, 2 mM, 4 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM, 100 mM)을 각각 75 μL 혼합하여 검지물질을 준비하였다.Next, a detection material was prepared by mixing 75 μL of 20 μM DTT solution and NaCl (0 mM, 2 mM, 4 mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM, and 100 mM, respectively).
이어서, 상기 샘플을 각각 상기 검지물질의 존재 하에 반응시킨 후, UV-VIS 를 이용하여 반응성을 측정하였다.Subsequently, each of the samples was reacted in the presence of the detection material, and then the reactivity was measured using UV-VIS.
이를 통하여, PAA 및 PA 를 코팅하여 제타전위를 조절한 본원의 실시예 1-1(AuNP@PVP) 에 따른 나노입자에 추가적으로 염화나트륨(NaCl) 처리를 하면 동일한 샘플의 제타전위 값을 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 염화 나트륨의 경우 용액에서 이온화하여 존재하며 이때 각각의 나트륨 이온과 염화 이온이 전하값을 가진 금나노입자 (AuNP@PAA 또는 AuNP@PA)와 입자 표면에서 상호 작용하여 나노입자의 제타전위 값이 변하는 것을 확인할 수 있었다.Through this, it was found that the zeta potential value of the same sample can be adjusted by additionally treating the nanoparticles according to Example 1-1 (AuNP@PVP) of the present application, whose zeta potential was adjusted by coating PAA and PA, with sodium chloride (NaCl). I was able to confirm. Specifically, in the case of sodium chloride, it exists ionized in solution, and at this time, each sodium ion and chloride ion interacts with gold nanoparticles (AuNP@PAA or AuNP@PA) with a charge value on the particle surface to increase the zeta potential of the nanoparticle. I was able to confirm that the value was changing.
따라서, 매우 높은 음의 전하값을 띄는 샘플도 NaCl 농도가 높아질수록 중성의 값까지 변화하는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 따른 반응성 또한 육안 및 그래프 결과로 확인할 수 있었다.Therefore, it was confirmed that even samples with a very high negative charge value changed to a neutral value as the NaCl concentration increased, and the resulting reactivity could also be confirmed visually and through graph results.
[실험예 9] 나노입자의 기능화 시 안정성 실험[Experimental Example 9] Stability test upon functionalization of nanoparticles
금 나노입자의 표면에 항체를 기능화하는 과정 중 안정성이 저해될 가능성이 매우 높기 때문에, 우선적으로 금 나노입자의 안정성을 향상시킬 수 있는 polyvinylpyrrolidone (PVP)를 코팅하였다. Since there is a very high possibility that the stability of the gold nanoparticle surface will be impaired during the process of functionalizing the antibody, polyvinylpyrrolidone (PVP), which can improve the stability of the gold nanoparticle, was first coated.
그러나, PVP만 사용할 경우 기능화에 필수적으로 사용되는 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA)를 기능화 할 때 금 나노입자의 안정성이 크게 저해되는 것을 확인할 수 있었고, 이를 해결하기 위해 추가적으로 나노입자의 안정성을 높여줄 수 있는 Tween20을 코팅하였다.However, when only PVP was used, it was confirmed that the stability of gold nanoparticles was greatly impaired when functionalizing 16-mercaptohexadecanoic acid (MHA), which is essential for functionalization. To solve this problem, the stability of the nanoparticles could be additionally increased. It was coated with Tween20.
도 10 은 본원의 일 실험예에 따른 금 나노입자의 안정성을 실험한 결과이다.Figure 10 shows the results of testing the stability of gold nanoparticles according to an experimental example herein.
도 10 의 (A)를 참조하면, Tween 20을 코팅하지 않고 citrate 또는 PVP 만 코팅하여 MHA를 기능화할 경우, 금 나노입자의 안정성이 저해되는 것을 확인할 수 있다.Referring to (A) of FIG. 10, it can be seen that when MHA is functionalized by coating only citrate or PVP without coating with Tween 20, the stability of the gold nanoparticles is impaired.
금 나노입자의 표면에 Tween 20과 PVP를 동시에 사용할 경우 나노입자의 안정성을 유지하면서 성공적으로 기능화 되는 것을 확인할 수 있었다.It was confirmed that when Tween 20 and PVP were used simultaneously on the surface of gold nanoparticles, they were successfully functionalized while maintaining the stability of the nanoparticles.
항체를 기능화하기 위해서, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(EDC) 및 N-Hydroxysuccinimide (NHS)를 사용했다. 이때, 첨가되는 항체량을 조절하여 기능화를 진행해야 하며, 과량의 항체가 사용될 경우 나노입자의 응집이 발생할 수 있다.To functionalize the antibody, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) were used. At this time, functionalization must be performed by controlling the amount of added antibody, and if an excessive amount of antibody is used, aggregation of nanoparticles may occur.
도 10 의 (B) 를 참조하면, 과량의 항체를 사용할 경우 나노입자가 응집하는 것을 확인할 수 있었다.Referring to Figure 10 (B), it was confirmed that nanoparticles aggregated when an excessive amount of antibody was used.
[실험예 10] 안정성 실험[Experimental Example 10] Stability experiment
항체가 기능화된 금 나노입자의 경우 표면에 존재하는 항체 때문에 어느정도 안정성을 유지할 수 있으나, 고농도의 이온 용액 속에서는 항체가 기능화 되었더라도 안정성에 영향을 받으며 응집 현상이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.In the case of gold nanoparticles functionalized with antibodies, they can maintain some stability due to the antibodies present on the surface, but in high concentration ion solutions, even if the antibodies were functionalized, stability was affected and aggregation phenomenon occurred.
도 11 의 (A) 및 (B)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 금 나노입자의 안정성 실험 결과이며, (C)는 본원의 일 실시예에 따른 마이크로비드의 안정성 실험 결과이다.11 (A) and (B) are the results of a stability test of gold nanoparticles functionalized with antibodies according to an example of the present application, and (C) are the results of a stability test of microbeads according to an example of the present application.
도 11 의 (A) 및 (B)를 참조하면, 실시예 2-1 의 항체가 기능화된 나노입자를 사용하여 나트륨 및 칼슘 용액에서 안정성을 실험했을 시, 안정성이 유지되는 적정 농도는 나트륨 용액은 500 mM, 칼슘 용액은 50 mM까지 였으며, 그보다 더 높은 농도의 용액일 경우 (나트륨은 1 M, 칼슘은 100 mM 이상) 안정성을 유지하지 못하고 응집되는 것을 확인할 수 있었다.Referring to Figures 11 (A) and (B), when stability was tested in sodium and calcium solutions using the antibody-functionalized nanoparticles of Example 2-1, the appropriate concentration at which stability was maintained was the sodium solution. The concentration was 500mM, and the calcium solution was up to 50mM, and it was confirmed that if the solution had a higher concentration (1M for sodium, 100mM or more for calcium), stability could not be maintained and aggregation occurred.
그러나, 도 11 의 (B)를 참조하면, 실시예 2-2 의 항체가 기능화된 나노입자가 탑재된 마이크로비드의 경우 하이드로겔 내부의 나노입자가 각각 2 M 의 고농도 상태의 나트륨 용액 및 칼슘 용액에서 안정성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다.However, referring to (B) of FIG. 11, in the case of microbeads loaded with antibody-functionalized nanoparticles of Example 2-2, the nanoparticles inside the hydrogel were contained in a high concentration of 2 M sodium solution and calcium solution, respectively. It was confirmed that stability was maintained.
[실험예 11][Experimental Example 11]
항체가 기능화된 금 나노입자의 항원과의 반응성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 항체는 항원과 선택적 반응을 진행하며 나노입자간 거리를 가깝게 하여 응집을 유도할 수 있다.An experiment was conducted to confirm the reactivity of antibody-functionalized gold nanoparticles with antigens. Antibodies undergo a selective reaction with antigens and can induce aggregation by closing the distance between nanoparticles.
도 12 의 (A)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 나노입자의 항원과의 반응 결과이며, (B)는 본원의 일 실시예에 따른 항체가 기능화된 나노입자가 탑재된 마이크로비드의 항원과의 반응 결과이며, (C)는 본원의 일 실험예에 따른 크기가 큰 하이드로겔의 항원과의 반응 결과이다.Figure 12 (A) is the result of reaction between antibody-functionalized nanoparticles according to an example of the present application and an antigen, and (B) is a microbead loaded with antibody-functionalized nanoparticles according to an example of the present application. This is the result of the reaction with the antigen, and (C) is the result of the reaction with the antigen of the large-sized hydrogel according to an experimental example herein.
도 12 의 (A)를 참조하면, 실시예 2-1 의 항체(aflatoxin B1 antibody)가 기능화된 금 나노입자에 항원(aflatoxin B1)을 첨가하여 반응을 진행할 경우 용액 상에서 농도에 따라 반응이 진행됨을 확인할 수 있었다.Referring to (A) of FIG. 12, when the reaction is carried out by adding the antigen (aflatoxin B1) to the gold nanoparticles functionalized with the antibody (aflatoxin B1 antibody) of Example 2-1, the reaction proceeds depending on the concentration in the solution. I was able to confirm.
또한, 도 12 의 (B)를 참조하면, 실시예 2-2 의 마이크로비드에 항원을 첨가하여 반응을 진행할 경우 마이크로비드 내부에 존재하는 금 나노입자 역시 동일하게 반응이 일어나며 색변화 또한 동일하게 일어남을 확인할 수 있었다. In addition, referring to (B) of FIG. 12, when the reaction is carried out by adding an antigen to the microbead of Example 2-2, the gold nanoparticles present inside the microbead also undergo the same reaction and the same color change also occurs. was able to confirm.
그러나, 도 12 의 (C)를 참조하면, 크기가 큰 하이드로겔의 경우 동일한 항원 농도로 반응시키더라도 반응이 미비하며 오랜 시간이 지나도 반응의 유무를 확인하기 어려웠다.However, referring to (C) of FIG. 12, in the case of a large hydrogel, the reaction was minimal even when reacted with the same antigen concentration, and it was difficult to confirm the presence or absence of a reaction even after a long time.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.The description of the present application described above is for illustrative purposes, and those skilled in the art will understand that the present application can be easily modified into other specific forms without changing its technical idea or essential features. Therefore, the embodiments described above should be understood in all respects as illustrative and not restrictive. For example, each component described as single may be implemented in a distributed manner, and similarly, components described as distributed may also be implemented in a combined form.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.The scope of the present application is indicated by the claims described below rather than the detailed description above, and all changes or modified forms derived from the meaning and scope of the claims and their equivalent concepts should be construed as being included in the scope of the present application.
Claims (23)
나노입자;
를 포함하는 마이크로비드에 있어서,
상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에 위치하고,
상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능하며,
상기 나노입자는 고분자 및 블로킹 에이전트(blocking agent)에 의해 코팅되되,
상기 고분자는 10 μM의 농도로 상기 마이크로비드에 포함되고,
상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 또는 백금(Pt)을 포함하고,
상기 고분자는 폴리바이닐피롤리돈(Polyvinyl Pyrrolidone, PVP)을 포함하고,
상기 블로킹 에이전트는 Tween20을 포함하는 것인, 마이크로비드.
hydrogel; and
nanoparticles;
In microbeads containing,
The nanoparticles are located inside the hydrogel,
The nanoparticles can move freely inside the hydrogel,
The nanoparticles are coated with a polymer and a blocking agent,
The polymer is included in the microbeads at a concentration of 10 μM,
The nanoparticles include gold (Au), silver (Ag), or platinum (Pt),
The polymer includes polyvinyl pyrrolidone (PVP),
The blocking agent is a microbead comprising Tween20.
상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것인, 마이크로비드.
According to claim 1,
The nanoparticle is a microbead containing a surface functionalized with a biomolecule or chemical molecule capable of recognizing the analyte to be detected.
상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인,
마이크로비드.
According to claim 2,
The biomolecules or chemical molecules include antibodies, antibody fragments, genetically engineered antibodies, single-chain antibodies, receptor proteins, binding proteins, enzymes, inhibitor proteins, lectins, cell adhesion proteins, oligonucleotides, polynucleotides, nucleic acids, aptamers, and these. Comprising a selection from the group consisting of combinations,
Microbeads.
상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것인, 마이크로비드.
According to claim 1,
The nanoparticles are microbeads that are not fixed to the hydrogel but are mounted inside the hydrogel.
상기 하이드로겔의 크기는 200 ㎛ 내지 3,500 ㎛ 인 것인, 마이크로비드.
According to claim 1,
The size of the hydrogel is 200 ㎛ to 3,500 ㎛, microbeads.
상기 마이크로비드는 3 차원 구조인 것인, 마이크로비드.
According to claim 1,
The microbead is a three-dimensional structure.
상기 하이드로겔은 알긴산(Alginate), 캐라지난(Carrageenan), 한천(Agar), 젤라틴(Gelatin), 카세인(Casein), 알부민(Albumin), 식물 전분(Starch), 아라비아고무(Gum Arabic), 로커스트콩검(Locust Bean Gum), 잔탄검(Xanthan Gum), 트라가칸스검(Tragacanth Gum), 카펙틴(Karpectine), 카복시 메틸 셀룰로오스(Carboxy Methyl Cellulose, CMC), 메틸셀룰로오스(Methyl Cellulose, MC), 에틸 셀룰로오스(Ethyl Cellulose, EC), 하이드록스에틸 셀룰로오스(Hydroxethyl Cellulose, HEC), 셀루아세테이트 프탈레이트(Celluacetate Phthalate, CAP), 스테아릴셀룰로오스(Stearyl Cellulose), 전분 유도체(Starch Derivatives), 인산화 전분(Starch Phosphate), 시아노 에틸화 전분(Cyano Ethylated Starch), 카복시 메틸 전분(Carboxy Methyl Starch, CMS), 하이드록시 에틸화 전분(Hydroxy Ethylated Starch) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인, 마이크로비드.
According to claim 1,
The hydrogel is composed of alginate, carrageenan, agar, gelatin, casein, albumin, plant starch, gum Arabic, and locust bean gum. (Locust Bean Gum), Xanthan Gum, Tragacanth Gum, Karpectine, Carboxy Methyl Cellulose (CMC), Methyl Cellulose (MC), Ethyl Cellulose (Ethyl Cellulose, EC), Hydroxethyl Cellulose (HEC), Celluacetate Phthalate (CAP), Stearyl Cellulose, Starch Derivatives, Phosphorylated Starch (Starch Phosphate), Microbeads comprising one selected from the group consisting of Cyano Ethylated Starch, Carboxy Methyl Starch (CMS), Hydroxy Ethylated Starch, and combinations thereof .
하이드로겔 전구체 용액 및 상기 나노입자를 혼합하여 혼합 용액을 제조하는 단계;
상기 혼합 용액을 가교 용액 상에 적하하는 단계; 및
상기 가교 용액 내에서 가교 반응이 진행되어 하이드로겔 내부에 나노입자가 탑재된 마이크로비드가 형성되는 단계;
를 포함하고,
상기 적하 시 전압을 가하여 상기 혼합 용액이 마이크로 크기의 액적 상태로 상기 가교 용액 내에 적하되는 것을 포함하고,
상기 나노입자를 준비하는 단계는,
상기 나노입자에 고분자를 제공하여, 상기 나노입자에 상기 고분자를 코팅하는 단계; 및
상기 고분자가 코팅된 상기 나노입자에 블로킹 에이전트(blocking agent)를 제공하여, 상기 나노입자에 상기 블로킹 에이전트를 코팅하는 단계;를 포함하되,
상기 고분자는 10 μM의 농도로 상기 코팅되고,
상기 나노입자는 금(Au), 은(Ag), 또는 백금(Pt)을 포함하고,
상기 고분자는 폴리바이닐피롤리돈(Polyvinyl Pyrrolidone, PVP)을 포함하고,
상기 블로킹 에이전트는 Tween20을 포함하는, 마이크로비드의 제조 방법.
Preparing nanoparticles;
Preparing a mixed solution by mixing a hydrogel precursor solution and the nanoparticles;
Dropping the mixed solution onto the cross-linking solution; and
A cross-linking reaction proceeds in the cross-linking solution to form microbeads loaded with nanoparticles inside the hydrogel;
Including,
Including dropping the mixed solution into the crosslinking solution in the form of micro-sized droplets by applying a voltage during the dropping,
The step of preparing the nanoparticles is,
Providing a polymer to the nanoparticles and coating the nanoparticles with the polymer; and
Providing a blocking agent to the polymer-coated nanoparticles, and coating the nanoparticles with the blocking agent,
The polymer is coated at a concentration of 10 μM,
The nanoparticles include gold (Au), silver (Ag), or platinum (Pt),
The polymer includes polyvinyl pyrrolidone (PVP),
A method for producing microbeads, wherein the blocking agent includes Tween20.
상기 나노입자는 표면에 검출하고자 하는 분석물을 인식할 수 있는 바이오분자 또는 화학분자가 기능화되어 있는 것을 포함하는 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
A method of producing microbeads, wherein the nanoparticles include functionalized biomolecules or chemical molecules capable of recognizing the analyte to be detected on the surface.
상기 바이오분자 또는 화학분자는 항체, 항체 단편, 유전조작 항체, 단일 쇄 항체, 수용체 단백질, 결합 단백질, 효소, 억제제 단백질, 렉틴, 세포 유착 단백질, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 압타머 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인,
마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 13,
The biomolecules or chemical molecules include antibodies, antibody fragments, genetically engineered antibodies, single-chain antibodies, receptor proteins, binding proteins, enzymes, inhibitor proteins, lectins, cell adhesion proteins, oligonucleotides, polynucleotides, nucleic acids, aptamers, and these. Comprising a selection from the group consisting of combinations,
Method for manufacturing microbeads.
상기 나노입자는 상기 하이드로겔 내부에서 자유롭게 이동 가능한 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
A method for producing microbeads, wherein the nanoparticles can move freely inside the hydrogel.
상기 나노입자는 상기 하이드로겔에 고정되지 않고 상기 하이드로겔 내부에 탑재된 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
A method of producing microbeads, wherein the nanoparticles are not fixed to the hydrogel but are mounted inside the hydrogel.
상기 하이드로겔 전구체 용액 및 상기 나노입자의 부피비는 1:1 내지 3:1 인 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
A method for producing microbeads, wherein the volume ratio of the hydrogel precursor solution and the nanoparticles is 1:1 to 3:1.
상기 가교 용액은 염화칼슘(CaCl2), 염화마그네슘(MgCl2), 인산칼슘(Ca3(PO4)2), 탄산칼슘(CaCO3) 및 이들의 조합들로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
The cross-linking solution includes one selected from the group consisting of calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), calcium phosphate (Ca 3 (PO 4 ) 2 ), calcium carbonate (CaCO 3 ), and combinations thereof. , Method for manufacturing microbeads.
상기 적하하는 단계는 정전기 액적발생기(Electrostatic Droplet Generator)를 이용하여 수행되는 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
The dropping step is performed using an electrostatic droplet generator.
상기 정전기 액적발생기에 0 kV 초과 20 kV 이하의 전압이 가해지면서 상기 마이크로 크기의 액적이 형성되는 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 20,
A method of producing microbeads, wherein the micro-sized droplets are formed when a voltage of more than 0 kV and less than 20 kV is applied to the electrostatic droplet generator.
상기 액적은 0.01 mL/min 내지 0.5 mL/min 의 속도로 상기 가교 용액 상에 적하되는 것인, 마이크로비드의 제조 방법.
According to claim 12,
A method for producing microbeads, wherein the droplets are dropped onto the crosslinking solution at a rate of 0.01 mL/min to 0.5 mL/min.
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