KR102618948B1

KR102618948B1 - Residual tumor infiltrating lymphocytes and methods of making and using the same

Info

Publication number: KR102618948B1
Application number: KR1020197016785A
Authority: KR
Inventors: 미쉘 알. 심슨-아벨슨; 크리스토퍼 모지척; 미카엘 티. 로체
Original assignee: 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2016-11-17
Filing date: 2017-11-17
Publication date: 2023-12-27
Also published as: KR20190084101A; US20190276802A1; US20230106186A1; WO2018094167A1; US11293009B2; CN110199016A; BR112019009925A2; US20210189339A1; CA3044250A1; JP7125392B2; TW201831682A; MA46916A; US11401507B2; IL266655A; AU2017362418A1; US20210123020A1; TWI826360B; JP2022167931A; EP3541930A1; JP2019534030A

Abstract

일부 실시양태에서, 암의 치료를 위해, 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 종양 잔유물로부터 수득된 치료 유효량의 확장된 수의 종양 침윤 림프구를 전달하는 방법이 개시된다.In some embodiments, for the treatment of cancer, a method is disclosed for delivering a therapeutically effective amount of an expanded number of tumor infiltrating lymphocytes obtained from tumor remnants to a patient in need of treatment of cancer.

Description

Residual tumor infiltrating lymphocytes and methods of making and using the same

관련 출원에 대한 상호 참조Cross-reference to related applications

본 국제 출원은 2016년 11월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/423,750 및 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/460,441을 우선권 주장하며, 이들 전문은 본원에 참조로 포함된다.This International Application claims priority to U.S. Provisional Application No. 62/423,750, filed November 17, 2016, and U.S. Provisional Application No. 62/460,441, filed February 17, 2017, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

발명의 분야field of invention

종양 잔유물로부터의 종양 침윤 림프구의 확장을 위한 방법 및 조성물이 일부 실시양태에서 개시된다.Methods and compositions for expansion of tumor infiltrating lymphocytes from tumor remnants are disclosed in some embodiments.

종양 침윤 림프구 (TIL)의 입양 전달을 사용하여 거대 불응성 암을 치료하는 것은 불량한 예후를 갖는 환자를 위한 요법에 대한 강력한 접근법을 나타낸다. 문헌 [Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. 자가 TIL을 사용한 입양 T 세포 요법은 전이성 흑색종을 갖는 환자의 >25%에서 최대 55%의 객관적 반응률 및 지속적인 퇴행을 제공한다. 성공적인 면역요법을 위해 다수의 TIL이 요구되고, 상업화를 위해 강건하고 신뢰성 있는 방법이 필요하다. 이것은 세포 확장에 있어서의 기술적, 물류적 및 규제적 문제로 인해 달성해야 하는 도전과제였다. IL-2-기반 TIL 확장에 이은 "급속 확장 방법" (REP)은 그의 속도 및 효율로 인해 TIL 확장을 위한 바람직한 방법이 되었다. 문헌 [Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 절제된 종양으로부터 TIL을 생성하는 방법은 종양을 1-3 mm³ 단편으로 세절하는 단계 및 사전-급속 확장 프로토콜 (사전-REP 또는 개시) 단계에서 인터류킨 2 (IL-2)의 존재 하에 TIL을 확장시키는 단계를 포함한다. 사전-REP 단계 동안, 종양-상주 면역 세포는 이주 및 증식하고, 이들 TIL은 방사선 조사된(irradiated) 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 피더, 항-CD3 항체 (OKT-3, 무로모납) 및 IL-2를 사용한 제2 REP 방법에 적용되며, 이는 그의 수를 크게 증가시킨다. 지금까지, 모든 TIL 확장 방법은 사전-REP 방법 후 잔류 종양 단편을 폐기한다.Treating large refractory cancers using adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) represents a powerful approach to therapy for patients with poor prognosis. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393]. Adoptive T cell therapy using autologous TILs provides objective response rates of up to 55% and durable regression in >25% of patients with metastatic melanoma. Large numbers of TILs are required for successful immunotherapy, and robust and reliable methods are needed for commercialization. This was a challenge to achieve due to technical, logistical and regulatory challenges in cell expansion. The “rapid expansion method” (REP) following IL-2-based TIL expansion has become a preferred method for TIL expansion due to its speed and efficiency. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. A method of generating TILs from resected tumors involves the steps of mincing the tumor into 1-3 mm ³ fragments and expanding the TILs in the presence of interleukin 2 (IL-2) in a pre-rapid expansion protocol (pre-REP or initiation) step. It includes the step of ordering. During the pre-REP phase, tumor-resident immune cells migrate and proliferate, and these TILs are fed by irradiated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) feeders, anti-CD3 antibodies (OKT-3, muromonab), and ILs. Applies to the second REP method using -2, which significantly increases its number. To date, all TIL expansion methods discard residual tumor fragments after the pre-REP method.

절제된 종양의 직접적인 효소적 소화는 사전-REP에 대한 대안으로서 이전에 탐구되었지만, 더 적은 TIL 배양물을 생성하여, IL-2를 사용한 사전-REP 개시 방법보다 TIL을 수득하는 능력이 감소된 것으로 보고되었다. 문헌 [Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. 이러한 이유로, 소화는 암을 위한 요법으로서의 TIL의 개발에 있어서 추가로 탐구되지 않았다.Direct enzymatic digestion of resected tumors has previously been explored as an alternative to pre-REP, but was reported to produce fewer TIL cultures, reducing the ability to obtain TILs compared to the pre-REP initiation method using IL-2. It has been done. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42]. For this reason, digestion has not been further explored in the development of TILs as a therapy for cancer.

사전-REP 및 REP 방법으로부터 수득된 TIL이 지금까지의 TIL의 임상 연구에서 우세하였으며, 이는 중간 정도의 임상 반응을 제공하였으므로, 이러한 분야는, 특히 흑색종으로부터 다른 종양 유형까지 TIL 요법의 확대에 있어서 도전과제로 남아있다. 문헌 [Goff, et al., J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Rosenberg, et al., Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57]. 특정한 하위세트 (예컨대 CD8⁺ T 세포)를 선택하거나 또는 드라이버 돌연변이, 예컨대 돌연변이된 ERBB2IP 에피토프 또는 KRAS 종양유전자에서의 드라이버 돌연변이를 표적화하기 위해 확장 동안 TIL의 선택에 많은 초점이 맞추어져 왔다. 문헌 [Tran, et al., N. Engl. J. Med. 2016, 375, 2255-62; Tran, et al., Science 2014, 344, 641-45]. 그러나, 이러한 선택 접근법은, 이들이 보다 많은 임상 시험에서 효능을 나타내기 위해 개발될 수 있을 지라도, TIL 요법 수행의 지속기간, 복잡성 및 비용이 유의하게 부가되고, 상이한 유형의 암에서 TIL 요법을 광범위하게 사용하기 위한 잠재력을 제한한다. 따라서, 암 요법에서 사용하기 위한 개선된 특성을 갖는 TIL을 제공할 수 있는 방법을 개발할 긴급한 필요성이 존재한다.Since TILs obtained from pre-REP and REP methods have dominated clinical studies of TILs to date, providing moderate clinical responses, this field is particularly interested in the expansion of TIL therapy from melanoma to other tumor types. It remains a challenge. Goff, et al., J. Clin. Oncol. 2016, 34, 2389-97; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Rosenberg, et al., Clin. Cancer Res. 2011, 17, 4550-57]. Much focus has been placed on the selection of TILs during expansion to select specific subsets (e.g. CD8 ⁺ T cells) or to target driver mutations, such as a mutated ERBB2IP epitope or a driver mutation in the KRAS oncogene. Tran, et al., N. Engl. J. Med. 2016, 375, 2255-62; Tran, et al., Science 2014, 344, 641-45]. However, these optional approaches, although they could be developed to show efficacy in more clinical trials, add significantly to the duration, complexity, and cost of performing TIL therapy, and make it difficult to broadly implement TIL therapy in different types of cancer. Limits the potential for use. Therefore, there is an urgent need to develop methods that can provide TILs with improved properties for use in cancer therapy.

본 발명은, 개선된 특성을 갖는 TIL이 종양 잔유 세포에 기초한 방법으로부터 수득될 수 있고 이러한 잔유 TIL (rTIL, remnant TIL)이 정상 이주 TIL (eTIL, emigrant TIL)과 표현형상 및 기능상 구별된다는 예상외의 발견을 제공한다. 암 면역요법에서의 rTIL 및 rTIL과 eTIL의 조합의 사용은 선행 eTIL-기반 요법에 비해 유의한 장점을 제공한다.The present invention has led to the unexpected discovery that TILs with improved properties can be obtained from methods based on tumor residual cells and that these remnant TILs (rTILs, remnant TILs) are phenotypically and functionally distinct from normal migrant TILs (eTILs, emigrant TILs). provides. The use of rTILs and combinations of rTILs and eTILs in cancer immunotherapy offers significant advantages over neoadjuvant eTIL-based therapies.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(a) 환자로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 종양 조직을 수득하는 단계;(a) obtaining tumor tissue containing tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from the patient;

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 종양 잔유물 및 신생 TIL (eTIL, emergent TIL)을 제공하는 단계;(c) treating tumor tissue with first cell culture medium and interleukin 2 (IL-2) in a gas permeable container to provide tumor remnants and emergent TILs (eTILs);

(d) 적어도 복수의 eTIL을 제거하는 단계;(d) removing at least a plurality of eTILs;

(e) 소화 혼합물을 사용하여 종양 잔유물을 종양 잔유 세포로 효소적으로 소화시키는 단계; 및(e) enzymatically digesting tumor remnants into tumor remnant cells using a digestion mixture; and

(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 종양 잔유 세포를 확장시켜, 확장된 수의 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL, remnant tumor infiltrating lymphocyte)를 제공하는 단계를 포함하며,(f) Expansion of tumor residual cells in a gas permeable vessel with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody and IL-2, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( It includes the step of providing rTIL (remnant tumor infiltrating lymphocyte),

여기서 rTIL은 eTIL에 비해 감소된 수준의 T 세포 소진 마커를 발현하고, 여기서 T 세포 소진 마커는 TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, CTLA-4 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,wherein the rTIL expresses a reduced level of a T cell exhaustion marker compared to the eTIL, wherein the T cell exhaustion marker is selected from the group consisting of TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, CTLA-4, and combinations thereof.

입양 T 세포 요법을 위한 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 제조하는 방법을 포함한다.A method of producing residual tumor infiltrating lymphocytes (rTIL) for adoptive T cell therapy is included.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(c) 기체 투과성 용기에서 제1 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2)로 종양 조직을 처리하여 종양 잔유물 및 신생 TIL (eTIL)을 제공하는 단계;(c) treating tumor tissue with first cell culture medium and interleukin 2 (IL-2) in a gas permeable container to provide tumor remnants and neoplastic TILs (eTILs);

(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 종양 잔유 세포를 확장시켜, 확장된 수의 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 제공하는 단계를 포함하며,(f) Expansion of tumor residual cells in a gas permeable vessel with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody and IL-2, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( rTIL), comprising providing

여기서 rTIL은 eTIL에 비해 감소된 수준의 T 세포 소진 마커를 발현하고,Here, rTILs express reduced levels of T cell exhaustion markers compared to eTILs;

여기서 T 세포 소진 마커는 TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, CTLA-4 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,wherein the T cell exhaustion marker is selected from the group consisting of TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, CTLA-4, and combinations thereof,

여기서 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 교모세포종 종양 조직, 폐 종양 조직, 결장직장 종양 조직, 육종 종양 조직, 삼중 음성 유방 종양 조직, 자궁경부 종양 조직, 난소 종양 조직 및 급성 골수성 백혈병 골수 또는 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,Here, the tumor tissue includes melanoma tumor tissue, head and neck tumor tissue, breast tumor tissue, renal tumor tissue, pancreatic tumor tissue, glioblastoma tumor tissue, lung tumor tissue, colorectal tumor tissue, sarcoma tumor tissue, triple negative breast tumor tissue, and uterus. selected from the group consisting of cervical tumor tissue, ovarian tumor tissue, and acute myeloid leukemia bone marrow or tumor tissue,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 방사선 조사된 피더 세포는 방사선 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는 것인,wherein the irradiated feeder cells comprise irradiated allogeneic peripheral blood mononuclear cells.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 T 세포 소진 마커는 TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,wherein the T cell exhaustion marker is selected from the group consisting of TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, and combinations thereof,

여기서 IL-2는 제2 세포 배양 배지에 약 3000 IU/mL의 초기 농도로 존재하고, OKT-3 항체는 제2 세포 배양 배지에 약 30 ng/mL의 초기 농도로 존재하는 것인,wherein the IL-2 is present in the second cell culture medium at an initial concentration of about 3000 IU/mL, and the OKT-3 antibody is present in the second cell culture medium at an initial concentration of about 30 ng/mL.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 rTIL에서의 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포에서의 적어도 1종의 T 세포 소진 마커는 eTIL에 비해 적어도 10%만큼 감소되는 것인,wherein at least one T cell exhaustion marker in CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells in rTIL is reduced by at least 10% compared to eTIL.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 T 세포 소진 마커는 CD8⁺ T 세포에서의 LAG3 마커이고, 여기서 rTIL에서의 LAG3 마커는 eTIL에 비해 적어도 2배만큼 감소되는 것인,wherein the T cell exhaustion marker is a LAG3 marker on CD8 ⁺ T cells, wherein the LAG3 marker in rTIL is reduced by at least 2-fold compared to eTIL,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 T 세포 소진 마커는 CD8⁺ T 세포에서의 TIM3이고, 여기서 rTIL에서 TIM3의 발현은 eTIL에 비해 적어도 3배만큼 감소되는 것인,wherein the T cell exhaustion marker is TIM3 on CD8 ⁺ T cells, wherein the expression of TIM3 in rTIL is reduced by at least 3-fold compared to eTIL,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 T 세포 소진 마커는 CD4⁺ T 세포에서의 TIM3이고, 여기서 rTIL에서 TIM3의 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배만큼 감소되는 것인,wherein the T cell exhaustion marker is TIM3 on CD4 ⁺ T cells, wherein the expression of TIM3 in rTIL is reduced by at least 2-fold compared to eTIL,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 rTIL에서의 TIM3 마커 및 LAG3 마커는 유동 세포측정법에 의해 검출불가능한 것인,wherein the TIM3 marker and LAG3 marker in the rTIL are undetectable by flow cytometry,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 rTIL에서의 CD56⁺ 발현은 eTIL에서의 CD56⁺ 발현에 비해 적어도 3배만큼 감소되는 것인,wherein CD56 ⁺ expression in rTIL is reduced by at least 3-fold compared to CD56 ⁺ expression in eTIL,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 rTIL에서의 CD69⁺ 발현은 eTIL에서의 CD69⁺ 발현에 비해 적어도 2배만큼 감소되는 것인,wherein CD69 ⁺ expression in rTIL is reduced by at least 2-fold compared to CD69 ⁺ expression in eTIL,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 소화 혼합물은 데옥시리보뉴클레아제, 콜라게나제 및 히알루로니다제를 포함하는 것인,wherein the digestion mixture includes deoxyribonuclease, collagenase and hyaluronidase,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 제1 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인을 추가로 포함하는 것인,wherein the first cell culture medium further comprises a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인을 추가로 포함하는 것인,wherein the second cell culture medium further comprises a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof,

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(a) 암의 치료를 필요로 하는 환자로부터 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 종양 조직을 수득하는 단계;(a) obtaining tumor tissue comprising tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from a patient in need of treatment for cancer;

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인을 추가로 포함하는 것인 방법에 따라 제조되는 rTIL의 치료 유효량을 환자에게 전달하는 것을 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함한다.Here, the second cell culture medium further contains a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof. A therapeutically effective amount of rTIL prepared according to the method is administered to the patient. Includes a method of treating cancer in a patient in need thereof, comprising delivering.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(e) 소화 혼합물을 사용하여 종양 잔유물을 종양 잔유 세포로 효소적으로 소화시키는 단계;(e) enzymatically digesting tumor remnants into tumor remnant cells using a digestion mixture;

(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 종양 잔유 세포를 확장시켜, 확장된 수의 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 제공하는 단계이며,(f) Expansion of tumor residual cells in a gas permeable vessel with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody and IL-2, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( This is the step of providing rTIL),

여기서 제2 세포 배양 배지는 IL-4, IL-7, IL-15, IL-21 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 시토카인을 추가로 포함하는 것인 단계;wherein the second cell culture medium further comprises a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof;

(g) 환자에게 rTIL을 투여하기 전에 환자를 비-골수절제 림프구고갈 요법으로 치료하는 단계;(g) treating the patient with a non-myeloablative lymphodepleting therapy prior to administering the rTIL to the patient;

(h) 환자에게 치료 유효량의 rTIL을 투여하는 단계; 및(h) administering a therapeutically effective amount of rTIL to the patient; and

(i) 환자에게 rTIL을 투여한 다음 날에 시작하여 환자를 고용량 IL-2 요법으로 치료하는 단계(i) treating the patient with high-dose IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient.

를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함한다.It includes a method of treating cancer in a patient in need of treatment for cancer.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(h) 환자에게 치료 유효량의 rTIL을 투여하는 단계이며, 여기서 치료 유효량의 eTIL이 rTIL과의 혼합물로 환자에게 동시에 투여되는 것인 단계; 및(h) administering a therapeutically effective amount of rTIL to the patient, wherein a therapeutically effective amount of eTIL is simultaneously administered to the patient in a mixture with the rTIL; and

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(i) 환자에게 rTIL을 투여한 다음 날에 시작하여 환자를 고용량 IL-2 요법으로 치료하는 단계를 포함하며,(i) treating the patient with high-dose IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient,

여기서 암은 흑색종, 이중-불응성 흑색종, 난소암, 자궁경부암, 폐암, 방광암, 유방암, 두경부암, 신세포 암종, 급성 골수성 백혈병, 결장직장암, 육종, 비소세포 폐암 (NSCLC) 및 삼중 음성 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인,Here, cancer includes melanoma, double-refractory melanoma, ovarian cancer, cervical cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, head and neck cancer, renal cell carcinoma, acute myeloid leukemia, colorectal cancer, sarcoma, non-small cell lung cancer (NSCLC), and triple negative. selected from the group consisting of breast cancer,

암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 포함한다.It includes methods of treating cancer in patients in need of cancer treatment.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(g) 환자에게 rTIL을 투여하기 전에 환자를 비-골수절제 림프구고갈 요법으로 치료하는 단계이며, 여기서 비-골수절제 림프구고갈 요법은 2일 동안 60 mg/m²/일의 용량의 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25 mg/m²/일의 용량의 플루다라빈의 투여 단계를 포함하는 것인 단계;(g) treating the patient with non-myeloablative lymphodepleting therapy prior to administering rTIL to the patient, wherein the non-myeloablative lymphodepleting therapy includes cyclophospha at a dose of 60 mg/m ² /day for 2 days. comprising administering mead followed by administration of fludarabine at a dose of 25 mg/m ² /day for 5 days;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

여기서 고용량 IL-2 요법은 내성(tolerance)까지 8시간마다 15분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인,wherein the high-dose IL-2 therapy comprises 600,000 or 720,000 IU/kg of aldesleukin or a biosimilar or variant thereof administered as a 15-minute bolus intravenous infusion every 8 hours until tolerance.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 종양 잔유 세포를 확장시켜, 확장된 수의 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 제공하는 단계를 포함하며,(f) Expansion of tumor residual cells with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody and IL-2 in a gas permeable vessel, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( rTIL), comprising providing

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

(f) 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, OKT-3 항체 및 IL-2를 포함하는 제2 세포 배양 배지로 종양 잔유 세포를 확장시켜, 확장된 수의 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 제공하는 단계이며,(f) Expansion of tumor residual cells with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody and IL-2 in a gas permeable vessel, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( This is the step of providing rTIL),

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

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(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(d) eTIL을 제거하는 단계;(d) removing eTIL;

여기서 고용량 IL-2 요법은 내성까지 8시간마다 15분 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 600,000 또는 720,000 IU/kg의 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하는 것인,wherein the high-dose IL-2 therapy comprises 600,000 or 720,000 IU/kg of aldesleukin or a biosimilar or variant thereof administered as a 15-minute bolus intravenous infusion every 8 hours until tolerance.

한 실시양태에서, 본 발명은 입양 T 세포 요법을 위해 환자로부터의 종양 침윤 림프구 (TIL)를 포함하는 확장된 수의 종양 잔유 세포를 생성하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 환자로부터 종양 조직을 수득하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 종양 조직은 TIL을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양 조직을 단편화하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 기체 투과성 용기에서 세포 배양 배지 및 인터류킨 2 (IL-2) 및 다른 T 세포 성장 인자 또는 효능작용 항체로 종양 조직을 처리하여 종양 잔유물 및 확장된 수의 TIL을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 확장된 수의 TIL을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 종양 잔유물을 종양 잔유 세포로 효소적으로 소화시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양 배지, 방사선 조사된 피더 세포, 항-CD3 모노클로날 항체 (무로모납 또는 OKT-3) 및 IL-2로 종양 잔유 세포를 처리하여 확장된 수의 종양 잔유 세포를 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 종양 잔유 세포는 TIM3, LAG3, PD-1 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 마커의 감소된 수준을 발현하는 TIL을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 조직은 흑색종 종양 조직, 두경부 종양 조직, 유방 종양 조직, 신종양 조직, 췌장 종양 조직, 폐 종양 조직 및 결장직장 종양 조직으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.In one embodiment, the invention includes a method of generating expanded numbers of tumor residual cells comprising tumor infiltrating lymphocytes (TILs) from a patient for adoptive T cell therapy. In some embodiments, the methods of the invention may include obtaining tumor tissue from a patient, where the tumor tissue comprises TIL. In some embodiments, the methods of the invention may include fragmenting tumor tissue. In some embodiments, the methods of the invention treat tumor tissue with cell culture medium and interleukin 2 (IL-2) and other T cell growth factors or agonistic antibodies in a gas permeable container to remove tumor remnants and expanded numbers of TILs. It may include providing steps. In some embodiments, the methods of the invention may include removing an expanded number of TILs. In some embodiments, the methods of the invention may include enzymatic digestion of tumor remnants into tumor remnant cells. In some embodiments, the methods of the invention expand the number of tumor residual cells by treating tumor residual cells with cell culture medium, irradiated feeder cells, anti-CD3 monoclonal antibody (muromonap or OKT-3), and IL-2. It may include the step of providing tumor residual cells. In some embodiments, tumor residual cells prepared according to the methods of the invention may comprise TILs that express reduced levels of at least one marker selected from the group consisting of TIM3, LAG3, PD-1, and combinations thereof. . In some embodiments, the tumor tissue can be selected from the group consisting of melanoma tumor tissue, head and neck tumor tissue, breast tumor tissue, renal tumor tissue, pancreatic tumor tissue, lung tumor tissue, and colorectal tumor tissue.

한 실시양태에서, 본 발명은 종양의 치료를 필요로 하는 환자에서 종양을 치료하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 환자에게 치료 유효량의 확장된 수의 종양 잔유 세포를 전달하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 확장된 수의 종양 잔유 세포는 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다.In one embodiment, the invention may include a method of treating a tumor in a patient in need thereof. In some embodiments, treatment may include delivering to the patient a therapeutically effective amount of an expanded number of tumor residual cells, where the expanded number of tumor residual cells can be prepared according to any of the methods described herein.

상기 개요 뿐만 아니라 하기 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 종양 소화 용액 제조의 예시적인 다이어그램을 예시한다.
도 2는 종양 소화 절차의 예시적인 흐름도를 예시한다. 이 예에서, 2가지 소화 방법은 동시에 수행되고, 각각의 소화 방법의 효능을 비교하기 위해 설계된 2가지 별개의 사전-REP의 일부로서 개별적으로 시딩된다.
도 3은 eTIL 및 rTIL에서의 주요 마커의 차등 표현형 발현을 예시한다.
도 4는 급속 확장 전 대사 능력을 평가하기 위한 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일)-2-데옥시글루코스 (2-NBDG) (A) 및 미토트랙커(Mitotracker) (B)에 의한 eTIL 및 rTIL의 연구를 예시한다.
도 5는 eTIL 및 rTIL을 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에 대해 밤새 브레펠딘 A와 함께 CD3/CD28/4-1BB 비드로 자극한 실험의 결과를 나타낸다. PMA 및 이오노마이신을 4-5시간 동안 첨가하였다. 인터페론-γ를 세포내 유동 세포측정 분석에 의해 평가하였다 (n=3).
도 6은 (A) rTIL이 확장하고 (B) 급속 확장 동안 eTIL과 표현형상 구별된 채로 남아있다는 것을 나타내는 결과를 예시한다.
도 7은 본 발명의 rTIL을 사용하여 환자를 치료하는 예시적인 방법을 예시한다.
도 8은 본 발명의 rTIL을 사용하여 환자를 치료하는 방법의 예시적인 시간선을 예시한다.
도 9는 eTIL 및 rTIL에서의 TCRvβ 레퍼토리의 다양성 (즉, 다양성 점수)을 예시한다.
도 10은 eTIL 및 rTIL에서의 공유된 CDR3의 퍼센트를 예시한다.
도 11은 삼중 음성 유방 암종, 결장직장 암종, 폐 암종, 신암종 및 흑색종에서의 세포 증식 분석을 예시하며, 여기서 모든 5종의 종양에서의 CD4+ 또는 CD8+ 집단으로부터의 eTIL은, 셀 트레이스(Cell Trace) 염료에서의 이동 (또는 염료 희석)에 의해 입증된 바와 같이, eTIL 단독과 비교하였을 때 항-CD3 항체와 함께 rTIL과 공동-배양시 증식 능력의 증진을 나타냈다. 적색은 eTIL을 나타내고, 청색은 rTIL과 공동-배양된 경우의 eTIL을 나타낸다.
도 12는 나노스트링(Nanostring) 분석으로부터 작성된 열 지도를 예시하며, 이는 eTIL 및 rTIL에 대한 유전자 발현 프로파일이 유의하게 상이하다는 것을 나타낸다.
도 13은 나노스트링 분석으로부터 작성된 그래프를 예시하며, 이는 여러 유전자가 eTIL과 비교하여 rTIL에서 유의하게 상향조절 또는 하향조절된다는 것을 나타낸다.
도 14는 난소 암종으로부터의 eTIL과 rTIL 사이에 (3개의 eTIL/rTIL 쌍에 대해) 상위 50개의 공유된 CDR3을 나타내는 클론형 그래프를 예시한다.
도 15는 신암종으로부터의 eTIL과 rTIL 사이에 (3개의 eTIL/rTIL 쌍에 대해) 상위 50개의 공유된 CDR3을 나타내는 클론형 그래프를 예시한다.
도 16은 삼중 음성 유방 암종으로부터의 eTIL과 rTIL 사이에 (3개의 eTIL/rTIL 쌍에 대해) 상위 50개의 공유된 CDR3을 나타내는 클론형 그래프를 예시한다.
서열 목록의 간단한 설명
서열식별번호(SEQ ID NO): 1은 무로모납의 중쇄의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 2는 무로모납의 경쇄의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 3은 재조합 인간 IL-2 단백질의 아미노산 서열이다.
서역식별번호: 4는 알데스류킨의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 5는 재조합 인간 IL-4 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 6은 재조합 인간 IL-7 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 7은 재조합 인간 IL-15 단백질의 아미노산 서열이다.
서열식별번호: 8은 재조합 인간 IL-21 단백질의 아미노산 서열이다.The above summary as well as the detailed description of the invention below will be better understood when read in conjunction with the accompanying drawings.
1 illustrates an exemplary diagram of tumor digestion solution preparation.
Figure 2 illustrates an exemplary flow diagram of a tumor digestion procedure. In this example, the two digestion methods are performed simultaneously and seeded separately as part of two separate pre-REPs designed to compare the efficacy of each digestion method.
Figure 3 illustrates differential phenotypic expression of key markers in eTILs and rTILs.
Figure 4 shows 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-2-deoxyglucose (2-NBDG) (2-NBDG) ( A) and Mitotracker (B) illustrate the study of eTIL and rTIL.
Figure 5 shows the results of an experiment in which eTILs and rTILs were stimulated with CD3/CD28/4-1BB beads with brefeldin A overnight on CD4 ⁺ and CD8 ⁺ T cells. PMA and ionomycin were added for 4-5 hours. Interferon-γ was assessed by intracellular flow cytometry analysis (n=3).
Figure 6 illustrates results showing that (A) rTILs expand and (B) remain phenotypically distinct from eTILs during rapid expansion.
Figure 7 illustrates an exemplary method of treating a patient using rTILs of the invention.
Figure 8 illustrates an exemplary timeline of a method of treating a patient using rTILs of the invention.
Figure 9 illustrates the diversity (i.e. diversity score) of the TCRvβ repertoire in eTILs and rTILs.
Figure 10 illustrates the percentage of shared CDR3 in eTIL and rTIL.
Figure 11 illustrates cell proliferation analysis in triple negative breast carcinoma, colorectal carcinoma, lung carcinoma, renal carcinoma, and melanoma, where eTILs from the CD4+ or CD8+ population in all five tumors were used as cell traces (Cell Trace). Trace) showed enhanced proliferative capacity when co-cultured with rTIL with anti-CD3 antibody compared to eTIL alone, as evidenced by migration (or dye dilution) in the dye. Red represents eTIL, and blue represents eTIL when co-cultured with rTIL.
Figure 12 illustrates a heat map generated from Nanostring analysis, showing that the gene expression profiles for eTIL and rTIL are significantly different.
Figure 13 illustrates a graph generated from Nanostring analysis, showing that several genes are significantly upregulated or downregulated in rTIL compared to eTIL.
Figure 14 illustrates a clonotype graph showing the top 50 shared CDR3s (for three eTIL/rTIL pairs) between eTILs and rTILs from ovarian carcinoma.
Figure 15 illustrates a clonotype graph showing the top 50 shared CDR3s (for three eTIL/rTIL pairs) between eTILs and rTILs from renal carcinoma.
Figure 16 illustrates a clonotype graph showing the top 50 shared CDR3s (for three eTIL/rTIL pairs) between eTILs and rTILs from triple negative breast carcinoma.
Brief description of sequence listing
SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of the heavy chain of muromonap.
SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the light chain of muromonap.
SEQ ID NO: 3 is the amino acid sequence of the recombinant human IL-2 protein.
Western region identification number: 4 is the amino acid sequence of aldesleukin.
SEQ ID NO: 5 is the amino acid sequence of the recombinant human IL-4 protein.
SEQ ID NO: 6 is the amino acid sequence of the recombinant human IL-7 protein.
SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of recombinant human IL-15 protein.
SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence of the recombinant human IL-21 protein.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 참조된 모든 특허 및 공개는 그 전문이 참조로 포함된다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which this invention pertains. All patents and publications referenced herein are incorporated by reference in their entirety.

정의Justice

용어 "소진된 표현형" 및 "소진 마커"는 항원에 의한 만성 T 세포 수용체 (TCR) 자극에 반응하는 T 세포 소진에 특징적인 세포 표면 마커를 지칭한다. 소진된 표현형을 나타내는 T 세포는 억제 수용체, 예컨대 T 세포 이뮤노글로불린 및 뮤신-도메인 함유-3 (TIM3 또는 TIM-3), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3 또는 LAG-3), 이뮤노글로불린 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체 (TIGIT) 및 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1)을 발현하고, 이펙터 시토카인 생산 및 효과적인 면역 반응을 탑재하는 능력이 결여되어 있다. T 세포에서의 소진은 문헌 [Yi, et al., Immunology 2010, 129, 474-81] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.The terms “exhausted phenotype” and “exhaustion marker” refer to cell surface markers characteristic of T cell exhaustion in response to chronic T cell receptor (TCR) stimulation by antigen. T cells that display an exhausted phenotype have inhibitory receptors such as T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3 (TIM3 or TIM-3), lymphocyte-activating gene 3 (LAG3 or LAG-3), immunoglobulin, and ITIM. They express T cell immunoreceptor (TIGIT) and programmed cell death protein 1 (PD-1) domains, and lack the ability to produce effector cytokines and mount an effective immune response. Exhaustion in T cells is described in Yi, et al., Immunology 2010, 129, 474-81, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

용어 "공-투여", "공-투여하는", "와 조합되어 투여되는", "와 조합하여 투여하는", "동시" 및 "공동"은 인간 대상체에 두 활성 제약 성분 및/또는 그의 대사물이 동시에 존재하도록 인간 대상체에 대한 2종 이상의 활성 제약 성분의 투여를 포괄한다. 공-투여는 개별 조성물로의 동시 투여, 개별 조성물로의 상이한 시간에서의 투여, 또는 2종 이상의 활성 제약 성분이 존재하는 조성물로의 투여를 포함한다. 개별 조성물의 동시 투여 및 두 작용제가 존재하는 조성물로의 투여는 또한 본 발명의 방법에 포괄된다.The terms “co-administration”, “co-administering”, “administered in combination with”, “administered in combination with”, “simultaneously” and “co” refer to the ability of a human subject to administer both active pharmaceutical ingredients and/or their metabolism. It encompasses the administration of two or more active pharmaceutical ingredients to a human subject such that water is present simultaneously. Co-administration includes simultaneous administration in separate compositions, administration at different times in separate compositions, or administration in compositions in which two or more active pharmaceutical ingredients are present. Simultaneous administration of separate compositions and administration in compositions where both agents are present are also encompassed by the methods of the present invention.

용어 "생체내"는 대상체의 신체에서 일어나는 사건을 지칭한다.The term “in vivo” refers to events that occur in the body of a subject.

용어 "시험관내"는 대상체의 신체의 외부에서 일어나는 사건을 지칭한다. 시험관내 검정은 살아있는 또는 사멸한 세포가 사용되는 세포-기반 검정을 포괄하고, 또한 무손상 세포가 사용되지 않는 무세포 검정을 포괄할 수 있다.The term “in vitro” refers to events that occur outside of the subject's body. In vitro assays encompass cell-based assays in which live or dead cells are used, and can also encompass cell-free assays in which intact cells are not used.

용어 "항원"은 면역 반응을 유도하는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 제시되는 경우에 항체 또는 TCR에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항원"은 또한 T 세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가적으로 면역계에 의해 인식될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 체액성 면역 반응 또는 세포성 면역 반응을 유도하여 B 림프구 및/또는 T 림프구의 활성화로 이어질 수 있다. 일부 경우에, 이것은 항원이 Th 세포 에피토프를 함유하거나 이에 연결될 것을 필요로 할 수 있다. 항원은 또한 1개 이상의 에피토프 (예를 들어, B- 및/또는 T-에피토프)를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바람직하게는, 전형적으로 고도 특이적 및 선택적 방식으로 그의 상응하는 항체 또는 TCR과 반응할 것이고 다른 항원에 의해 유도될 수 있는 다수의 다른 항체 또는 TCR과는 그렇지 않을 것이다.The term “antigen” refers to a substance that induces an immune response. In some embodiments, the antigen is a molecule that can be bound by an antibody or TCR when presented by a major histocompatibility complex (MHC) molecule. As used herein, the term “antigen” also encompasses T cell epitopes. Antigens can additionally be recognized by the immune system. In some embodiments, the antigen may induce a humoral or cellular immune response, leading to activation of B lymphocytes and/or T lymphocytes. In some cases, this may require the antigen to contain or be linked to a Th cell epitope. An antigen may also have one or more epitopes (eg, B- and/or T-epitopes). In some embodiments, an antigen will preferably react with its corresponding antibody or TCR, typically in a highly specific and selective manner, and not with numerous other antibodies or TCRs that may be elicited by other antigens.

용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 질환 치료를 포함하나 이제 제한되지는 않는 의도된 적용을 실시하기에 충분한, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 화합물의 조합의 양을 지칭한다. 치료 유효량은 의도된 적용 (시험관내 또는 생체내), 또는 치료될 인간 대상체 및 질환 상태 (예를 들어, 대상체의 체중, 연령 및 성별), 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 달라질 수 있으며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 용어는 또한 표적 세포에서의 특정한 반응 (예를 들어, 혈소판 부착 및/또는 세포 이동의 감소)을 유도할 용량에 적용된다. 구체적 용량은 선택된 특정한 화합물, 이어질 투여 요법, 화합물이 다른 화합물과 조합되어 투여되는지의 여부, 투여 시기, 투여될 조직 및 화합물을 운반하는 물리적 전달 시스템에 따라 달라질 것이다. 치료 유효량은 "항종양 유효량" 및/또는 "종양-억제 유효량"일 수 있으며, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이의 정도, 및 환자 (대상체)의 상태에서의 개별 차이를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 세포독성 림프구 또는 rTIL을 포함하는 제약 조성물은 10⁴ 내지 10¹¹개 세포/kg 체중 (예를 들어, 10⁵ 내지 10⁶, 10⁵ 내지 10¹⁰, 10⁵ 내지 10¹¹, 10⁶ 내지 10¹⁰, 10⁶ 내지 10¹¹,10⁷ 내지 10¹¹, 10⁷ 내지 10¹⁰, 10⁸ 내지 10¹¹, 10⁸ 내지 10¹⁰, 10⁹ 내지 10¹¹, 또는 10⁹ 내지 10¹⁰개 세포/kg 체중) (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. 세포독성 림프구 또는 rTIL 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수회 투여될 수 있다. 세포독성 림프구 또는 rTIL은 면역요법에서 통상적으로 공지된 주입 기술을 사용함으로써 투여될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 319: 1676, 1988] 참조). 특정한 환자를 위한 최적 투여량 및 치료 요법은 질환의 징후에 대해 환자를 모니터링하고 이에 따라 치료를 조정함으로써 의약 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.The term “effective amount” or “therapeutically effective amount” refers to an amount of a compound or combination of compounds as described herein sufficient to effect the intended application, including but not limited to the treatment of disease. The therapeutically effective amount may vary depending on the intended application (in vitro or in vivo), or the human subject and disease state to be treated (e.g., the subject's weight, age and sex), severity of the disease state, mode of administration, etc. It can be easily determined by a person skilled in the art. The term also applies to doses that will induce a specific response in target cells (eg, reduction of platelet adhesion and/or cell migration). The specific dosage will vary depending on the particular compound selected, the dosage regimen to be followed, whether the compound is administered in combination with other compounds, the timing of administration, the tissue to be administered, and the physical delivery system carrying the compound. The therapeutically effective amount may be an “anti-tumor effective amount” and/or a “tumor-inhibitory effective amount”, and the exact amount of the composition of the present invention to be administered will depend on the age, weight, tumor size, degree of infection or metastasis, and the condition of the patient (subject). It can be decided by the doctor taking into account individual differences. Pharmaceutical compositions comprising cytotoxic lymphocytes or rTILs described herein may be used at a cell density of 10 ⁴ to 10 ¹¹ cells/kg body weight (e.g., 10 ⁵ to 10 ⁶ , 10 ⁵ to 10 ¹⁰ , 10 ⁵ to 10 ¹¹ , 10 ⁶ to 10 11 ). 10 ¹⁰ , 10 ⁶ to 10 ¹¹ , 10 ⁷ to 10 ¹¹ , 10 7 to 10 ¹⁰ , 10 ⁸ to 10 ¹¹ , 10 ⁸ to 10 ¹⁰ , ^{10 9} ^to 10 ¹¹ , or 10 ⁹ to 10 ¹⁰ cells/kg body weight ) (including all integer values within the above range). Cytotoxic lymphocyte or rTIL compositions can also be administered multiple times at these dosages. Cytotoxic lymphocytes or rTILs can be administered by using injection techniques commonly known in immunotherapy (see, e.g., Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 319: 1676, 1988). . The optimal dosage and treatment regimen for a particular patient can be readily determined by one skilled in the pharmaceutical arts by monitoring the patient for signs of disease and adjusting treatment accordingly.

본원에 사용된 용어 "치료 효과"는 인간 대상체에서의 치료적 이익 및/또는 예방적 이익을 포괄한다. 예방적 효과는 질환 또는 상태 발생의 지연 또는 제거, 질환 또는 상태의 증상 발병의 지연 또는 제거, 질환 또는 상태 진행의 저속화, 중지 또는 역전, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.As used herein, the term “therapeutic effect” encompasses therapeutic and/or prophylactic benefit in a human subject. A prophylactic effect includes delaying or eliminating the occurrence of a disease or condition, delaying or eliminating the onset of symptoms of a disease or condition, slowing, stopping, or reversing the progression of a disease or condition, or any combination thereof.

"제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 및 불활성 성분을 포함하는 것으로 의도된다. 활성 제약 성분을 위한 이러한 제약상 허용되는 담체 또는 제약상 허용되는 부형제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 제약상 허용되는 부형제가 활성 제약 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 치료 조성물에서 그의 사용이 고려된다. 추가의 활성 제약 성분, 예컨대 다른 약물이 또한 기재된 조성물 및 방법에 혼입될 수 있다.“Pharmaceutically acceptable carrier” or “pharmaceutically acceptable excipient” is intended to include any and all solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents, and inert ingredients. The use of such pharmaceutically acceptable carriers or pharmaceutically acceptable excipients for active pharmaceutical ingredients is well known in the art. Any conventional pharmaceutically acceptable carrier or pharmaceutically acceptable excipient is contemplated for use in the therapeutic compositions of the invention, except where the active pharmaceutical ingredient is incompatible. Additional active pharmaceutical ingredients, such as other drugs, may also be incorporated into the described compositions and methods.

용어 "치료", "치료하는", "치료하다" 등은 목적하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/거나, 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포함하고, 다음을 포함한다: (a) 질환에 대한 소인이 있을 수는 있지만 아직 질환을 갖는 것으로 진단되지는 않은 대상체에서 질환 발생을 예방하는 것; (b) 질환을 억제하는 것, 즉, 그의 발생 또는 진행을 정지시키는 것; 및 (c) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환의 퇴행을 야기하고/거나 1종 이상의 질환 증상을 완화시키는 것. "치료"는 또한 질환 또는 상태의 부재 하에서도 약리학적 효과를 제공하기 위한 작용제의 전달을 포괄하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "치료"는 면역 반응을 도출하거나, 또는 예를 들어 백신의 경우에, 질환 상태의 부재 하에 면역을 부여할 수 있는 조성물의 전달을 포괄한다.The terms “treatment,” “treating,” “treating,” and the like refer to obtaining a desired pharmacological and/or physiological effect. The effect may be prophylactic in terms of completely or partially preventing the disease or its symptoms and/or may be therapeutic in terms of partial or complete cure of the disease and/or adverse effects attributable to the disease. As used herein, “treatment” includes any treatment of a disease in a mammal, especially a human, and includes: (a) a person who may be predisposed to the disease but has not yet been diagnosed as having the disease; preventing disease from occurring in a subject; (b) inhibiting the disease, i.e. stopping its development or progression; and (c) alleviating the disease, i.e., causing regression of the disease and/or alleviating one or more disease symptoms. “Treatment” is also intended to encompass the delivery of an agent to provide a pharmacological effect even in the absence of a disease or condition. For example, “treatment” encompasses the delivery of a composition that can elicit an immune response or, for example in the case of a vaccine, confer immunity in the absence of a disease state.

핵산 또는 단백질의 부분에 대해 사용되는 경우 용어 "이종"은 핵산 또는 단백질이 자연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 전형적으로 새로운 기능적 핵산이 제조되도록 배열된 비관련 유전자들로부터의 2개 이상의 서열, 예를 들어 한 공급원으로부터의 프로모터 및 또 다른 공급원으로부터의 코딩 영역을 갖도록 재조합적으로 생산된다. 유사하게, 이종 단백질은 단백질이 자연에서 서로에 대해 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함한다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 융합 단백질).The term "heterologous" when used in reference to a portion of a nucleic acid or protein indicates that the nucleic acid or protein contains two or more subsequences that are not found in identical relationship to each other in nature. For example, nucleic acids are typically produced recombinantly to have two or more sequences from unrelated genes arranged to produce a new functional nucleic acid, e.g., a promoter from one source and a coding region from another source. . Similarly, a heterologous protein indicates that the protein contains two or more subsequences that are not found in the same relationship to each other in nature (e.g., a fusion protein).

용어 "급속 확장"은 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 3배 (또는 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 또는 9배), 보다 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 10배 (또는 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, 또는 90배), 또는 보다 바람직하게는 1주의 기간에 걸쳐 적어도 약 100배의 항원-특이적 TIL의 수의 증가를 의미한다. 다수의 급속 확장 프로토콜이 본원에 약술된다.The term “rapid expansion” refers to at least about 3-fold (or 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, or 9-fold) over a period of one week, and more preferably at least about 10-fold over a period of one week. (or 20-, 30-, 40-, 50-, 60-, 70-, 80-, or 90-fold), or more preferably at least about 100-fold the number of antigen-specific TILs over a period of one week. means an increase in A number of rapid expansion protocols are outlined herein.

본원에서의 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"은 대상체의 혈류를 떠나 종양으로 이동한 백혈구로서 원래 수득되는 세포의 집단을 의미한다. TIL은 CD8⁺ 세포독성 T 세포 (림프구), Th1 및 Th17 CD4⁺ T 세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포 및 M1 대식세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. TIL은 1차 및 2차 TIL 둘 다를 포함한다. "1차 TIL"은 본원에 약술된 바와 같은 환자 조직 샘플로부터 수득된 것 (때때로 "새로 수거된" 것으로 지칭됨)이고, "2차 TIL"은 벌크 TIL 및 확장된 TIL ("REP TIL" 또는 "REP-후 TIL")을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 논의된 바와 같이 확장 또는 증식된 임의의 TIL 세포 집단이다. 특정 실시양태에서, 용어 "1차 TIL"은 rTIL 및 eTIL과 rTIL의 혼합물을 포함할 수 있다.As used herein, “tumor infiltrating lymphocytes” or “TIL” refers to a population of cells originally obtained as white blood cells that have left the subject's bloodstream and migrated to the tumor. TILs include, but are not limited to, CD8 ⁺ cytotoxic T cells (lymphocytes), Th1 and Th17 CD4 ⁺ T cells, natural killer cells, dendritic cells, and M1 macrophages. TIL includes both primary and secondary TIL. “Primary TILs” are those obtained from patient tissue samples (sometimes referred to as “freshly harvested”) as outlined herein, and “secondary TILs” are bulk TILs and expanded TILs (“REP TILs” or Any TIL cell population that has been expanded or proliferated as discussed herein, including but not limited to “post-REP TIL”). In certain embodiments, the term “primary TIL” may include rTIL and mixtures of eTIL and rTIL.

본원에서의 "세포의 집단" (TIL 포함)은 공통 특성을 공유하는 다수의 세포를 의미한다. 일반적으로, 집단은 수가 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰개의 범위이고, 상이한 TIL 집단은 상이한 수를 포함한다. 예를 들어, IL-2의 존재 하의 1차 TIL의 초기 성장은 대략 1 x 10⁸개 세포의 벌크 TIL의 집단을 생성한다. REP 확장은 주입을 위해 1.5 x 10⁹ 내지 1.5 x 10¹⁰개 세포의 집단을 제공하도록 일반적으로 수행된다.As used herein, “population of cells” (including TILs) refers to a number of cells that share common characteristics. Typically, populations range in number from 1 x 10 ⁶ to 1 x 10 ¹⁰ , with different TIL populations containing different numbers. For example, initial growth of primary TILs in the presence of IL-2 produces a population of bulk TILs of approximately 1 x 10 ⁸ cells. REP expansion is typically performed to provide a population of 1.5 x 10 ⁹ to 1.5 x 10 ¹⁰ cells for injection.

용어 "말초 혈액 단핵 세포" 및 "PBMC"는 림프구 (예컨대 T 세포, B 세포 및 NK 세포) 및 단핵구를 포함한, 둥근 핵을 갖는 말초 혈액 세포를 지칭한다. 바람직하게는, 말초 혈액 단핵 세포는 방사선 조사된 동종 말초 혈액 단핵 세포이다. PBMC는 항원-제시 세포의 유형이다.The terms “peripheral blood mononuclear cells” and “PBMC” refer to peripheral blood cells with round nuclei, including lymphocytes (such as T cells, B cells, and NK cells) and monocytes. Preferably, the peripheral blood mononuclear cells are irradiated allogeneic peripheral blood mononuclear cells. PBMCs are a type of antigen-presenting cell.

본원에서의 "동결보존된 TIL"은 1차, 벌크 또는 확장된 TIL (REP TIL)이 약 -150℃ 내지 -60℃의 범위에서 처리 및 저장되는 것을 의미한다. 동결보존을 위한 일반적 방법은 또한 본원 다른 곳에 기재된다. 명확성을 위해, "동결보존된 TIL"은 rTIL을 포함한 1차 TIL의 공급원으로서 사용될 수 있는 동결된 조직 샘플과 구별가능하다.As used herein, “cryopreserved TIL” means primary, bulk or expanded TIL (REP TIL) that has been processed and stored in the range of about -150°C to -60°C. General methods for cryopreservation are also described elsewhere herein. For clarity, “cryopreserved TIL” is distinguishable from frozen tissue samples that can be used as a source of primary TIL, including rTIL.

본원에서의 "해동된 동결보존된 TIL"은 이전에 동결보전된 다음, 세포 배양 온도 또는 환자에게 TIL이 투여될 수 있는 온도를 포함하나 이에 제한되지는 않는 실온 이상의 온도로 복귀하도록 처리된 TIL (예컨대 rTIL)의 집단을 의미한다.As used herein, “thawed cryopreserved TIL” refers to TIL that has been previously cryopreserved and then processed to return to temperatures above room temperature, including but not limited to cell culture temperatures or temperatures at which TILs may be administered to patients ( For example, it refers to a group of rTIL).

2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "서열 동일성", "퍼센트 동일성" 및 "서열 퍼센트 동일성"은 최대 상응성을 위해 비교 및 정렬되었을 때 (필요하다면 갭이 도입됨) 동일하거나, 또는 명시된 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭하고, 이때 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 수득하는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 적합한 프로그램은, 예를 들어 미국 정부의 국립 생물 정보 센터 BLAST 웹 사이트로부터 이용가능한 BLAST 프로그램 모음을 포함한다. 2개의 서열 사이의 비교는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되고, 반면에 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. ALIGN, ALIGN-2 (제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코), 또는 DNASTAR로부터 이용가능한 메그얼라인(MegAlign)은 서열을 정렬하는데 사용될 수 있는 추가의 공중 이용가능한 소프트웨어 프로그램이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정한 정렬 소프트웨어에 의한 최대 정렬을 위해 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트 파라미터가 사용된다.The terms "sequence identity", "percent identity" and "sequence percent identity" in the context of two or more nucleic acids or polypeptides are identical when compared and aligned (gaps introduced where necessary) for maximum correspondence, or a specified percentage. refers to two or more sequences or subsequences having identical nucleotides or amino acid residues, where any conservative amino acid substitutions are not considered part of the sequence identity. Percent identity can be determined using sequence comparison software or algorithms or by visual inspection. Various algorithms and software that can be used to obtain alignments of amino acid or nucleotide sequences are known in the art. Suitable programs for determining percent sequence identity include, for example, the collection of BLAST programs available from the U.S. government's National Center for Biological Information BLAST website. Comparison between two sequences can be performed using the BLASTN or BLASTP algorithm. BLASTN is used to compare nucleic acid sequences, while BLASTP is used to compare amino acid sequences. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, CA), or MegAlign, available from DNASTAR, are additional publicly available software programs that can be used to align sequences. A person skilled in the art can determine appropriate parameters for maximum alignment by specific alignment software. In certain embodiments, the default parameters of the alignment software are used.

용어 "보존적 아미노산 치환"은 항원에 대한 항체의 결합을 파기하지 않는 아미노산 서열 변형을 의미한다. 보존적 아미노산 치환은 한 부류의 아미노산을 동일한 부류의 아미노산에 의해 치환하는 것을 지칭하며, 여기서 부류는 공통 물리화학적 아미노산 측쇄 특성, 및 예를 들어 표준 데이호프(Dayhoff) 빈도 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정된 바와 같은, 자연에서 발견되는 동종 단백질에서의 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6종의 일반적 부류가 카테고리화되었고, 다음을 포함한다: 부류 I (Cys); 부류 II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 부류 III (Asn, Asp, Gln, Glu); 부류 IV (His, Arg, Lys); 부류 V (Ile, Leu, Val, Met); 및 부류 VI (Phe, Tyr, Trp). 예를 들어, Asp를 또 다른 부류 III 잔기, 예컨대 Asn, Gln 또는 Glu로 치환하는 것이 보존적 치환이다. 따라서, 단백질에서의 예측되는 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 부류의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 항원 결합을 제거하지 않는 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187; Kobayashi, et al., Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999); 및 Burks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417] 참조).The term “conservative amino acid substitution” refers to an amino acid sequence modification that does not abrogate the binding of an antibody to its antigen. Conservative amino acid substitution refers to the substitution of an amino acid of one class by an amino acid of the same class, where the class is determined by common physicochemical amino acid side chain properties and, for example, by the standard Dayhoff frequency exchange matrix or the BLOSUM matrix. Defined by the high frequency of substitutions in homologous proteins found in nature, as determined. Six general classes of amino acid side chains have been categorized and include: Class I (Cys); Class II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Class III (Asn, Asp, Gln, Glu); Class IV (His, Arg, Lys); Class V (Ile, Leu, Val, Met); and class VI (Phe, Tyr, Trp). For example, replacement of Asp with another class III residue such as Asn, Gln or Glu is a conservative substitution. Accordingly, a predicted non-essential amino acid residue in the protein is preferably replaced with another amino acid residue of the same class. Methods for identifying amino acid conservative substitutions that do not eliminate antigen binding are well known in the art (e.g., Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187; Kobayashi, et al. , Protein Eng. 1999, 12, 879-884 (1999); and Burks, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 412-417).

"PEG화"는 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에, 전형적으로 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 융합 단백질 또는 그의 단편을 지칭한다. PEG화는, 예를 들어 항체의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C₁-C₁₀) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 왔던 PEG의 형태 중 임의의 것을 포괄하는 것으로 의도된다. PEG화될 단백질 또는 항체는 비-글리코실화 단백질 또는 항체일 수 있다. PEG화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 0154316 및 EP 0401384 및 미국 특허 번호 5,824,778 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다.“PEGylated” refers to a modified antibody or fusion protein or fragment thereof that is reacted with PEG, typically a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more polyethylene glycol (PEG) groups are attached to the antibody or antibody fragment. do. PEGylation can, for example, increase the biological (e.g. serum) half-life of the antibody. Preferably, PEGylation is carried out via acylation or alkylation reactions with reactive PEG molecules (or similar reactive water-soluble polymers). As used herein, the term “polyethylene glycol” refers to any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono (C ₁ -C ₁₀ ) alkoxy- or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide. It is intended to encompass. The protein or antibody to be PEGylated may be a non-glycosylated protein or antibody. Methods of PEGylation are known in the art and, for example, as described in European Patent Nos. EP 0154316 and EP 0401384 and U.S. Patent No. 5,824,778 (the disclosures of each of which are incorporated herein by reference), the antibodies of the invention can be applied to

용어 "OKT-3" (또한 본원에서 "OKT3"으로도 지칭됨)은 성숙 T 세포의 T 세포 항원 수용체에서 CD3 수용체에 대해 지시되는, 인간, 인간화, 키메라 또는 뮤린 항체를 포함한 모노클로날 항체 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 지칭하고, 상업적으로 입수가능한 형태, 예컨대 OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 순수, 밀테니 바이오테크, 인크.(Miltenyi Biotech, Inc.), 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 무로모납 또는 그의 변이체, 보존적 아미노산 치환, 당형태 또는 바이오시밀러를 포함한다. 무로모납의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 표 1에 제공된다 (서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2). OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)에 기탁되어 ATCC 수탁 번호 CRL 8001로 배정되어 있다. OKT-3을 생산할 수 있는 하이브리도마는 또한 유로피안 콜렉션 오브 오덴티케이티드 셀 컬처스(European Collection of Authenticated Cell Cultures) (ECACC)에 기탁되어 카탈로그 번호 86022706으로 배정되어 있다. 항-CD3 항체는 또한, T3 및 CD3ε으로도 알려져 있는 UHCT1 클론 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 바이오레전드(BioLegend)로부터 상업적으로 입수가능함)을 포함한다.The term “OKT-3” (also referred to herein as “OKT3”) refers to a monoclonal antibody, including human, humanized, chimeric or murine antibody, directed against the CD3 receptor on the T cell antigen receptor on mature T cells. Refers to biosimilars or variants thereof and commercially available forms such as OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) ) and muromonab or its variants, conservative amino acid substitutions, glycoforms or biosimilars. The amino acid sequences of the heavy and light chains of muromonab are provided in Table 1 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2). The hybridoma capable of producing OKT-3 has been deposited in the American Type Culture Collection and assigned ATCC accession number CRL 8001. Hybridomas capable of producing OKT-3 have also been deposited in the European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) and assigned catalog number 86022706. Anti-CD3 antibodies also include the UHCT1 clone, also known as T3 and CD3ε (commercially available from BioLegend, San Diego, CA).

표 1. 무로모납의 아미노산 서열.Table 1. Amino acid sequence of muromonap.

용어 "IL-2" (또한 본원에서 "IL2"로도 지칭됨)는 인터류킨-2로 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-2는, 예를 들어 문헌 [Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 및 Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-2의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 3). 예를 들어, 용어 IL-2는 IL-2의 인간, 재조합 형태, 예컨대 알데스류킨 (프로류킨(PROLEUKIN), 단일 사용 바이알당 2천2백만 IU로 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능함), 뿐만 아니라 미국 뉴햄프셔주 포츠머스 소재 셀게닉스, 인크.(CellGenix, Inc.) (셀그로(CELLGRO) GMP) 또는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드(ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.) (카탈로그 번호 CYT-209-b)에 의해 상업적으로 공급되는 재조합 IL-2의 형태 및 다른 판매업체로부터의 다른 상업적 등가물을 포괄한다. 알데스류킨 (데스-알라닐-1, 세린-125 인간 IL-2)은 대략 15 kDa의 분자량을 갖는 IL-2의 비글리코실화 인간 재조합 형태이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 알데스류킨의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 4). 용어 IL-2는 또한 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재 넥타 테라퓨틱스(Nektar Therapeutics)로부터 입수가능한 PEG화 IL2 전구약물 NKTR-214를 포함한, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2의 PEG화 형태를 포괄한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 NKTR-214 및 PEG화 IL-2는 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0328791 A1 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/065086 Al (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 접합된 IL-2의 대안적 형태는 미국 특허 번호 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 및 4902,502 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 IL-2의 제제는 미국 특허 번호 6,706,289 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.The term “IL-2” (also referred to herein as “IL2”) refers to the T cell growth factor known as interleukin-2, including its human and mammalian forms, conservative amino acid substitutions, glycoforms, and biosimilars. and all forms of IL-2, including variants. IL-2 is described, for example, in Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 and Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79, the disclosure of which is incorporated herein by reference. The amino acid sequence of recombinant human IL-2 suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 3). For example, the term IL-2 refers to human, recombinant forms of IL-2, such as aldesleukin (PROLEUKIN, commercially available from multiple suppliers at 22 million IU per single-use vial); as well as CellGenix, Inc. (CELLGRO GMP), Portsmouth, NH, USA, or ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA ( It covers the form of recombinant IL-2 commercially supplied under catalog number CYT-209-b) and other commercial equivalents from other vendors. Aldesleukin (des-alanyl-1, serine-125 human IL-2) is a non-glycosylated human recombinant form of IL-2 with a molecular weight of approximately 15 kDa. The amino acid sequence of aldesleukin suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 4). The term IL-2 also encompasses PEGylated forms of IL-2 as described herein, including the PEGylated IL2 prodrug NKTR-214, available from Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA. NKTR-214 and PEGylated IL-2 suitable for use in the present invention are described in U.S. Patent Application Publication No. US 2014/0328791 A1 and International Patent Application Publication No. WO 2012/065086 Al, the disclosures of which are incorporated herein by reference. It is listed. Alternative forms of conjugated IL-2 suitable for use in the present invention are described in U.S. Patent Nos. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261, and 4902,502, the disclosures of which are incorporated herein by reference. Preparations of IL-2 suitable for use in the present invention are described in U.S. Pat. No. 6,706,289, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

표 2. 인터류킨의 아미노산 서열.Table 2. Amino acid sequences of interleukins.

용어 "IL-4" (또한 본원에서 "IL4"로도 지칭됨)는 Th2 T 세포에 의해 및 호산구, 호염기구 및 비만 세포에 의해 생산되는, 인터류킨 4로 알려져 있는 시토카인을 지칭한다. IL-4는 나이브 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)의 Th2 T 세포로의 분화를 조절한다. 문헌 [Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70]. IL-4에 의한 활성화시, Th2 T 세포는 후속적으로 양성 피드백 루프에서 추가의 IL-4를 생산한다. IL-4는 또한 B 세포 증식 및 부류 II MHC 발현을 자극하고, IgE로의 부류 전환 및 B 세포로부터의 IgG₁ 발현을 유도한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-211) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크.(ThermoFisher Scientific, Inc.) (인간 IL-4 재조합 단백질, 카탈로그 번호 깁코(Gibco) CTP0043)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 5).The term “IL-4” (also referred to herein as “IL4”) refers to the cytokine known as interleukin 4, produced by Th2 T cells and by eosinophils, basophils, and mast cells. IL-4 regulates the differentiation of naive helper T cells (Th0 cells) into Th2 T cells. Steinke and Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70]. Upon activation by IL-4, Th2 T cells subsequently produce additional IL-4 in a positive feedback loop. IL-4 also stimulates B cell proliferation and class II MHC expression and induces class switch to IgE and IgG ₁ expression from B cells. Recombinant human IL-4 suitable for use in the present invention is available from Prospec-Tani Technogenes Limited, East Brunswick, NJ (catalog number CYT-211) and ThermoFisher Scientific, Waltham, MA. , Inc.) (human IL-4 recombinant protein, catalog number Gibco CTP0043). The amino acid sequence of recombinant human IL-4 suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 5).

용어 "IL-7" (또한 본원에서 "IL7"로도 지칭됨)은 기질 및 상피 세포로부터, 뿐만 아니라 수지상 세포로부터 수득될 수 있는, 인터류킨 7로 알려져 있는 글리코실화 조직-유래 시토카인을 지칭한다. 문헌 [Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904]. IL-7은 T 세포의 발생을 자극할 수 있다. IL-7은 IIL-7 수용체 알파 및 공통 감마 쇄 수용체로 이루어진 이종이량체인 IL-7 수용체에 결합하며, 이는 일련의 신호에서 흉선 내에서의 T 세포 발생 및 말초 내에서의 생존에 중요하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-4는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-254) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-7 재조합 단백질, 카탈로그 번호 깁코 PHC0071)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-7의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 6).The term “IL-7” (also referred to herein as “IL7”) refers to the glycosylated tissue-derived cytokine known as interleukin 7, which can be obtained from stromal and epithelial cells, as well as dendritic cells. Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 can stimulate the development of T cells. IL-7 binds to the IL-7 receptor, a heterodimer consisting of IIL-7 receptor alpha and a common gamma chain receptor, in a cascade of signals that are important for T cell development in the thymus and survival in the periphery. Recombinant human IL-4 suitable for use in the present invention is available from Prospec-Tani Technogenes Limited, East Brunswick, NJ (catalog number CYT-254) and Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA. (Human IL-7 recombinant protein, catalog number Gibco PHC0071). The amino acid sequence of recombinant human IL-7 suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 6).

용어 "IL-15" (또한 본원에서 "IL15"로도 지칭됨)는 인터류킨-15로 알려져 있는 T 세포 성장 인자를 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-2의 모든 형태를 포함한다. IL-15는, 예를 들어 문헌 [Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. IL-15는 IL-2와 β 및 γ 신호전달 수용체 서브유닛을 공유한다. 재조합 인간 IL-15는 12.8 kDa의 분자 질량을 갖는, 114개의 아미노산 (및 N-말단 메티오닌)을 함유하는 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-15는 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-230-b) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-15 재조합 단백질, 카탈로그 번호 34-8159-82)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-15의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 7).The term “IL-15” (also referred to herein as “IL15”) refers to the T cell growth factor known as interleukin-15, including its human and mammalian forms, conservative amino acid substitutions, glycoforms, and biosimilars. and all forms of IL-2, including variants. IL-15 is described, for example, in Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32, the disclosure of which is incorporated herein by reference. IL-15 shares β and γ signaling receptor subunits with IL-2. Recombinant human IL-15 is a single non-glycosylated polypeptide chain containing 114 amino acids (and an N-terminal methionine), with a molecular mass of 12.8 kDa. Recombinant human IL-15 was purchased from Prospec-Tani Technogenes Limited, East Brunswick, NJ (catalog number CYT-230-b) and Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA. (Human IL-15 recombinant protein, catalog number 34-8159-82). The amino acid sequence of recombinant human IL-15 suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 7).

용어 "IL-21" (또한 본원에서 "IL21"로도 지칭됨)은 인터류킨-21로 알려져 있는 다면발현성 시토카인 단백질을 지칭하고, 인간 및 포유동물 형태, 그의 보존적 아미노산 치환, 당형태, 바이오시밀러 및 변이체를 포함한 IL-21의 모든 형태를 포함한다. IL-21은, 예를 들어 문헌 [Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. IL-21은 주로 자연 킬러 T 세포 및 활성화된 인간 CD4⁺ T 세포에 의해 생산된다. 재조합 인간 IL-21은 15.4 kDa의 분자 질량을 갖는, 132개의 아미노산을 함유하는 단일 비-글리코실화 폴리펩티드 쇄이다. 재조합 인간 IL-21은 미국 뉴저지주 이스트 브런즈윅 소재 프로스펙-타니 테크노진 리미티드 (카탈로그 번호 CYT-408-b) 및 미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크. (인간 IL-21 재조합 단백질, 카탈로그 번호 14-8219-80)를 포함한 다수의 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 재조합 인간 IL-21의 아미노산 서열은 표 2에 제공된다 (서열식별번호: 8).The term “IL-21” (also referred to herein as “IL21”) refers to the pleiotropic cytokine protein known as interleukin-21 and has its human and mammalian forms, conservative amino acid substitutions, glycoforms, and biopsy forms. Includes all forms of IL-21, including Miller and variants. IL-21 is described, for example, in Spolski and Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014, 13, 379-95, the disclosure of which is incorporated herein by reference. IL-21 is mainly produced by natural killer T cells and activated human CD4 ⁺ T cells. Recombinant human IL-21 is a single non-glycosylated polypeptide chain containing 132 amino acids with a molecular mass of 15.4 kDa. Recombinant human IL-21 was purchased from Prospec-Tani Technogenes Limited, East Brunswick, NJ (catalog number CYT-408-b) and Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA. (Human IL-21 Recombinant Protein, Cat. No. 14-8219-80). The amino acid sequence of recombinant human IL-21 suitable for use in the present invention is provided in Table 2 (SEQ ID NO: 8).

용어 "바이오시밀러"는 미국에서 허가된 참조 생물학적 제품과 임상 불활성 성분에서의 부차적 차이에도 불구하고 고도로 유사한, 모노클로날 항체 또는 융합 단백질을 포함한 생물학적 제품을 의미하며, 제품의 안전성, 순도 및 효력의 관점에서 생물학적 제품과 참조 제품 사이에 임상적으로 의미있는 차이는 존재하지 않는다. 추가로, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 이미 유럽 의약품청에 의해 사용에 대해 인가된 또 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다. 생물학적 제품 또는 생물학적 의약은 박테리아 또는 효모와 같은 생물학적 공급원에 의해 제조되거나 그로부터 유래된 의약이다. 이들은 비교적 작은 분자, 예컨대 인간 인슐린 또는 에리트로포이에틴, 또는 복잡한 분자, 예컨대 모노클로날 항체로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 참조 IL-2 단백질이 알데스류킨 (프로류킨)인 경우에, 알데스류킨과 관련하여 약물 규제 기관에 의해 승인된 단백질은 알데스류킨에 대한 "바이오시밀러"이거나 또는 알데스류킨의 "바이오시밀러"이다. 유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약은 이미 유럽 의약품청 (EMA)에 의해 사용에 대해 인가된 또 다른 생물학적 의약과 유사한 생물학적 의약이다. 유럽에서의 유사한 생물학적 용도에 대한 관련 법적 기준은 개정된, 규정 (EC) 번호 726/2004의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4)이고, 따라서 유럽에서, 바이오시밀러는 규정 (EC) 번호 726/2004의 조항 6 및 명령 2001/83/EC의 조항 10(4) 하에 인가되거나, 인가를 위해 승인되거나 또는 인가를 위한 용도의 대상일 수 있다. 이미 인가된 원래의 생물학적 의약품은 유럽에서 "참조 의약품"으로 지칭될 수 있다. 바이오시밀러로 간주되기 위한 제품에 대한 일부 요건은 유사 생물학적 의약품에 대한 CHMP 가이드라인에 약술되어 있다. 추가로, 모노클로날 항체 바이오시밀러와 관련된 가이드라인을 포함한 제품 특이적 가이드라인은 EMA에 의해 제품별 기준으로 제공되고 그의 웹사이트에 공개되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 품질 특징, 생물학적 활성, 작용 메카니즘, 안전성 프로파일 및/또는 효능에 있어서 참조 의약품과 유사할 수 있다. 추가로, 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있거나 사용을 위해 의도될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 품질 특징을 갖는 것으로 생각될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 생각될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 생각될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 바와 같은 바이오시밀러는 참조 의약품과 유사하거나 고도로 유사한 효능을 갖는 것으로 생각될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 유럽에서의 바이오시밀러는 EMA에 의해 인가된 참조 의약품에 비교된다. 그러나, 일부 경우에, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 지역 밖에서 인가된 생물학적 의약품 (비-EEA 인가된 "비교자")에 비교될 수 있다. 이러한 연구는, 예를 들어 특정 임상 및 생체내 비-임상 연구를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 인가된 비교자와 비교되었거나 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 단백질, 예컨대 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분) 및 융합 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 유의하게 영향을 미치지 않는 아미노산 구조에서의 부차적 변형 (예를 들어 아미노산의 결실, 부가 및/또는 치환을 포함함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 그의 참조 의약품의 아미노산 서열에 대해 97% 이상, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는 참조 의약품의 번역후 변형과 상이한 1개 이상의 번역후 변형, 예를 들어 이에 제한되지는 않을지라도, 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및/또는 말단절단을 포함할 수 있으며, 단 이러한 상이함이 의약품의 안전성 및/또는 효능에 변화를 일으키지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 동일하거나 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 배타적인 것은 아닐지라도, 바이오시밀러는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있으며, 단 이러한 상이함이 참조 의약품과 연관된 안전성 우려를 해결하거나 해결하도록 의도된 경우에 그러한 패턴을 가질 수 있다. 추가적으로, 바이오시밀러는, 예를 들어 그의 강도, 제약 형태, 제제, 부형제 및/또는 제시에 있어서 참조 의약품을 벗어날 수 있으며, 단 의약품의 안전성 및 효능은 손상되지 않는다. 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여, 예를 들어 약동학 (PK) 및/또는 약역학 (PD) 프로파일에 있어서의 차이를 포함할 수 있으나, 인가되거나 인가에 적합한 것으로 간주되도록 여전히 참조 의약품과 충분히 유사한 것으로 생각된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 참조 의약품과 비교하여 상이한 결합 특징을 나타내며, 여기서 상이한 결합 특징은 유사한 생물학적 제품으로서의 인가를 위한 장벽이 되지 않는 것으로 EMA와 같은 규제 기관에 의해 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 또한 다른 국가 및 지역 규제 기관에 의해 동의어로 사용된다.The term “biosimilar” means a biological product containing a monoclonal antibody or fusion protein that is highly similar to a reference biological product licensed in the United States notwithstanding minor differences in the clinically inactive ingredients, safety, purity, and potency of the product. In terms of , there are no clinically meaningful differences between the biological product and the reference product. Additionally, a similar biological or “biosimilar” medicinal product is a biological medicinal product that is similar to another biological medicinal product that has already been authorized for use by the European Medicines Agency. The term “biosimilar” is also used synonymously by other national and regional regulatory agencies. A biological product or biological medicine is a medicine made by or derived from a biological source, such as bacteria or yeast. These may consist of relatively small molecules, such as human insulin or erythropoietin, or complex molecules, such as monoclonal antibodies. For example, if the reference IL-2 protein is aldesleukin (proleukin), then the protein approved by drug regulatory agencies in relation to aldesleukin is either a “biosimilar” to aldesleukin or It is a “biosimilar” of Ryukin. In Europe, a similar biological or “biosimilar” medicine is a biological medicine that is similar to another biological medicine that has already been authorized for use by the European Medicines Agency (EMA). The relevant legal standards for similar biological uses in Europe are Article 6 of Regulation (EC) No 726/2004 and Article 10(4) of Directive 2001/83/EC, as amended, and therefore in Europe, biosimilars are regulated. may be authorized, approved for authorization or subject to authorization under Article 6 of (EC) No. 726/2004 and Article 10(4) of Directive 2001/83/EC. Original biological medicinal products that have already been authorized may be referred to as “reference medicinal products” in Europe. Some requirements for a product to be considered a biosimilar are outlined in the CHMP Guidelines for Similar Biological Medicinal Products. Additionally, product-specific guidelines, including those relating to monoclonal antibody biosimilars, are provided by the EMA on a product-specific basis and are published on its website. Biosimilars as described herein may be similar to a reference drug product in quality characteristics, biological activity, mechanism of action, safety profile and/or efficacy. Additionally, a biosimilar may be used or is intended for use to treat the same condition as the reference drug. Accordingly, biosimilars as described herein can be considered to have similar or highly similar quality characteristics to the reference drug product. Alternatively or additionally, a biosimilar as described herein may be considered to have similar or highly similar biological activity to the reference drug product. Alternatively or additionally, a biosimilar as described herein may be considered to have a similar or highly similar safety profile to the reference drug product. Alternatively or additionally, a biosimilar as described herein may be considered to have similar or highly similar efficacy to the reference drug product. As described herein, biosimilars in Europe are compared to reference medicinal products authorized by the EMA. However, in some cases, biosimilars may be compared in certain studies to biological medicinal products licensed outside the European Economic Area (non-EEA licensed “comparators”). Such studies include, for example, certain clinical and in vivo non-clinical studies. As used herein, the term “biosimilar” also refers to a biological medicinal product that has been or can be compared with a non-EEA authorized comparator. Certain biosimilars are proteins, such as antibodies, antibody fragments (e.g., antigen-binding portions), and fusion proteins. Protein biosimilars may have amino acid sequences with minor modifications in the amino acid structure (including, for example, deletions, additions, and/or substitutions of amino acids) that do not significantly affect the function of the polypeptide. A biosimilar may comprise an amino acid sequence that has at least 97% sequence identity, for example, 97%, 98%, 99%, or 100%, to the amino acid sequence of its reference drug product. A biosimilar may contain one or more post-translational modifications that differ from the post-translational modifications of the reference drug product, including, but not limited to, glycosylation, oxidation, deamidation, and/or truncation, provided that: The differences do not change the safety and/or efficacy of the drug product. Biosimilars may have the same or different glycosylation patterns as the reference drug. In particular, but not exclusively, biosimilars may have different glycosylation patterns, provided that such differences address or are intended to address safety concerns associated with the reference drug product. Additionally, a biosimilar may deviate from the reference drug product, for example, in its strength, pharmaceutical form, formulation, excipients and/or presentation, provided that the safety and efficacy of the drug product are not compromised. A biosimilar may contain differences, for example, in the pharmacokinetic (PK) and/or pharmacodynamic (PD) profile compared to the reference drug product, but still be sufficiently similar to the reference drug product to be approved or considered suitable for licensure. It is thought that In certain circumstances, a biosimilar exhibits different binding characteristics compared to the reference medicinal product, where the different binding characteristics are considered by regulatory agencies such as the EMA not to be a barrier to licensure as a similar biological product. The term “biosimilar” is also used synonymously by other national and regional regulatory agencies.

본원에 사용된 용어 "변이체"는 참조 항체의 아미노산 서열 내 또는 그에 인접한 특정 위치에서의 1개 이상의 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 참조 항체의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 융합 단백질을 포괄하나 이에 제한되지는 않는다. 변이체는 참조 항체의 아미노산 서열과 비교하여 그의 아미노산 서열에 1개 이상의 보존적 치환을 포함할 수 있다. 보존적 치환은, 예를 들어 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 변이체는 참조 항체의 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지한다. 용어 변이체는 또한 PEG화 항체 또는 단백질을 포함한다.As used herein, the term “variant” refers to an antibody or fusion protein comprising an amino acid sequence that differs from the amino acid sequence of a reference antibody by one or more substitutions, deletions, and/or additions at specific positions within or adjacent to the amino acid sequence of the reference antibody. Includes, but is not limited to. A variant may contain one or more conservative substitutions in its amino acid sequence compared to the amino acid sequence of the reference antibody. Conservative substitutions may include, for example, substitution of similarly charged or uncharged amino acids. The variant retains the ability to specifically bind to the antigen of the reference antibody. The term variant also includes pegylated antibodies or proteins.

"PEG화"는 1개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기가 항체, 항체 단편 또는 단백질에 부착되는 조건 하에, 전형적으로 PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응하는 변형된 항체 또는 그의 단편을 지칭한다. PEG화는, 예를 들어 항체 또는 단백질의 생물학적 (예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, PEG화는 반응성 PEG 분자 (또는 유사한 반응성 수용성 중합체)와의 아실화 반응 또는 알킬화 반응을 통해 수행된다. 본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 다른 단백질, 예컨대 모노 (C₁-C₁₀) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 유도체화하기 위해 사용되어 왔던 PEG의 형태 중 임의의 것을 포괄하는 것으로 의도된다. PEG화될 항체 또는 단백질은 비-글리코실화 항체일 수 있다. PEG화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 유럽 특허 번호 EP 0154316 및 EP 0401384에 기재된 바와 같이, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다.“PEGylated” refers to a modified antibody or fragment thereof that is reacted with PEG, typically a reactive ester or aldehyde derivative of PEG, under conditions in which one or more polyethylene glycol (PEG) groups are attached to the antibody, antibody fragment or protein. . PEGylation can, for example, increase the biological (e.g., serum) half-life of an antibody or protein. Preferably, PEGylation is carried out via acylation or alkylation reactions with reactive PEG molecules (or similar reactive water-soluble polymers). As used herein, the term “polyethylene glycol” refers to any of the forms of PEG that have been used to derivatize other proteins, such as mono (C ₁ -C ₁₀ ) alkoxy- or aryloxy-polyethylene glycol or polyethylene glycol-maleimide. It is intended to encompass. The antibody or protein to be PEGylated may be a non-glycosylated antibody. PEGylation methods are known in the art and can be applied to the antibodies of the invention, for example as described in European Patent Nos. EP 0154316 and EP 0401384.

용어 "혈액 악성종양"은 포유동물의 혈액, 골수, 림프절 및 림프계의 조직을 포함하나 이에 제한되지는 않는 조혈 및 림프성 조직의 암 및 종양을 지칭한다. 혈액 악성종양은 또한 "액상 종양"으로도 지칭된다. 혈액 악성종양은 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 림프종 (CLL), 소림프구성 림프종 (SLL), 급성 골수 백혈병 (AML), 만성 골수 백혈병 (CML), 급성 단핵구성 백혈병 (AMoL), 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 용어 "B 세포 혈액 악성종양"은 B 세포에 영향을 미치는 혈액 악성종양을 지칭한다.The term “hematological malignancy” refers to cancers and tumors of the hematopoietic and lymphoid tissues, including but not limited to blood, bone marrow, lymph nodes, and tissues of the lymphatic system in mammals. Hematologic malignancies are also referred to as “liquid tumors.” Hematologic malignancies include acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lymphocytic lymphoma (CLL), small lymphocytic lymphoma (SLL), acute myeloid leukemia (AML), chronic myeloid leukemia (CML), and acute monocytic leukemia (AMoL). , including but not limited to Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma. The term “B cell hematologic malignancy” refers to a hematologic malignancy that affects B cells.

용어 "고형 종양"은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 비정상적 조직 덩어리를 지칭한다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 용어 "고형 종양 암"은 악성, 신생물성 또는 암성 고형 종양을 지칭한다. 고형 종양 암은 육종, 암종 및 림프종, 예컨대 폐, 유방, 전립선, 결장, 직장 및 방광의 암을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 고형 종양의 조직 구조는 실질 (암 세포), 및 암 세포가 분산되어 있으며 지지성 미세환경을 제공할 수 있는 지지성 기질 세포를 포함한 상호의존성 조직 구획을 포함한다.The term “solid tumor” refers to an abnormal mass of tissue that typically does not contain cysts or areas of fluid. Solid tumors can be benign or malignant. The term “solid tumor cancer” refers to a malignant, neoplastic or cancerous solid tumor. Solid tumor cancers include, but are not limited to, sarcomas, carcinomas, and lymphomas, such as cancers of the lung, breast, prostate, colon, rectum, and bladder. The tissue architecture of solid tumors includes interdependent tissue compartments, including the parenchyma (cancer cells) and supportive stromal cells in which cancer cells are dispersed and can provide a supportive microenvironment.

용어 "액상 종양"은 사실상 유체인 비정상적 세포 덩어리를 지칭한다. 액상 종양 암은 백혈병, 골수종 및 림프종, 뿐만 아니라 다른 혈액 악성종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 액상 종양으로부터 수득된 TIL은 또한 골수 침윤 림프구 (MIL)로 본원에서 지칭될 수 있다.The term “liquid tumor” refers to an abnormal mass of cells that is fluid in nature. Liquid tumor cancers include, but are not limited to, leukemia, myeloma, and lymphoma, as well as other hematological malignancies. TILs obtained from liquid tumors may also be referred to herein as bone marrow infiltrating lymphocytes (MIL).

본원에 사용된 용어 "미세환경"은 전체로서의 고형 또는 혈액 종양 미세환경 또는 미세환경 내의 세포의 개별 하위세트를 지칭할 수 있다. 본원에 사용된 종양 미세환경은 문헌 [Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473]에 기재된 바와 같이, "신생물 형질전환을 촉진하고, 종양 성장 및 침습을 지지하고, 종양을 숙주 면역으로부터 보호하고, 치료 내성을 조성하고, 우세한 전이가 번성하도록 틈을 제공하는 세포, 가용성 인자, 신호전달 분자, 세포외 매트릭스 및 기계적 신호"의 복합 혼합물을 지칭한다. 종양이 T 세포에 의해 인식될 항원을 발현하지만, 미세환경에 의한 면역 억제 때문에 면역계에 의한 종양 클리어런스는 드물다.As used herein, the term “microenvironment” may refer to the solid or hematologic tumor microenvironment as a whole or to individual subsets of cells within the microenvironment. The tumor microenvironment as used herein is described in Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473, to “promote neoplastic transformation, support tumor growth and invasion, and refers to a “complex mixture of cells, soluble factors, signaling molecules, extracellular matrix, and mechanical signals that protect against host immunity, foster therapeutic resistance, and provide an opening for dominant metastases to thrive.” Although tumors express antigens that will be recognized by T cells, tumor clearance by the immune system is rare due to immunosuppression by the microenvironment.

종양을 파괴하는 방법을 기재하기 위해 본원에 사용된 용어 "단편화", "단편" 및 "단편화된"은 기계적 단편화 방법, 예컨대 종양 조직을 분쇄, 절편화, 분할 및 세절하는 것뿐만 아니라 종양 조직의 물리적 구조를 파괴하는 임의의 다른 방법을 포함한다.As used herein to describe methods of destroying a tumor, the terms “fragmentation,” “fragmentation,” and “fragmented” include mechanical fragmentation methods, such as crushing, sectioning, splitting, and mincing tumor tissue, as well as Including any other method of destroying its physical structure.

용어 "약" 또는 "대략"은 값의 통계적으로 의미있는 범위 내에 있다는 것을 의미한다. 이러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 한 자릿수 이내, 바람직하게는 50% 이내, 보다 바람직하게는 20% 이내, 보다 더 바람직하게는 10% 이내, 및 보다 더 바람직하게는 5% 이내에 있을 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용가능한 변동은 연구 하의 특정한 시스템에 좌우되고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지될 수 있다. 더욱이, 본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 치수, 크기, 제제, 파라미터, 형상 및 다른 양 및 특징이 정확하지 않고 정확할 필요는 없지만, 목적하는 바에 따라, 허용오차, 전환 인자, 반올림, 측정 오차 등 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 인자를 반영하면서, 대략적이고/거나 더 크거나 더 작을 수 있다는 것을 의미한다. 일반적으로, 치수, 크기, 제제, 파라미터, 형상 또는 다른 양 또는 특징은 그러하다고 명백히 언급되어 있든지 아니든지 간에 "약" 또는 "근사"이다. 매우 상이한 크기, 형상 및 치수의 실시양태가 기재된 배열을 사용할 수 있다는 것이 주목된다.The terms “about” or “approximately” mean within a statistically significant range of values. This range may be within one order of magnitude, preferably within 50%, more preferably within 20%, even more preferably within 10%, and even more preferably within 5% of the given value or range. The allowable variations encompassed by the terms “about” or “approximately” will depend on the particular system under study and will be readily appreciated by one of ordinary skill in the art. Moreover, as used herein, the terms "about" and "approximately" mean that dimensions, sizes, formulations, parameters, shapes and other quantities and characteristics are not and do not necessarily have to be exact, but may include tolerances, conversion factors and rounding as desired. , means that it may be approximate and/or larger or smaller, reflecting measurement error, etc. and other factors known to those skilled in the art. Generally, a dimension, size, formulation, parameter, shape or other quantity or characteristic is “about” or “approximate” whether or not explicitly stated as such. It is noted that very different sizes, shapes and dimensions of the embodiments may be used in the described arrangements.

원래 및 보정된 형태로 첨부된 청구범위에 사용될 때 과도적 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"은 언급되지 않은 추가의 청구항 요소 또는 단계가 (존재하는 경우) 청구범위의 범주로부터 배제되는 것과 관련하여 청구항 범주를 규정한다. 용어 "포함하는"은 포함적 또는 개방적인 것으로 의도되고, 임의의 추가의 언급되지 않은 요소, 방법, 단계 또는 물질을 배제하지 않는다. 용어 "이루어진"은 청구항에 명시된 것 이외의 임의의 요소, 단계 또는 물질을 배제하고, 후자의 경우에, 명시된 물질(들)과 통상적으로 연관된 불순물을 배제한다. 용어 "본질적으로 이루어진"은 청구항의 범주를 명시된 요소, 단계 또는 물질(들) 및 청구된 발명의 기초적이며 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 본 발명을 구현하는 본원에 기재된 모든 조성물, 방법 및 키트는, 대안적 실시양태에서, 과도적 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 어느 것에 의해 보다 구체적으로 정의될 수 있다.The transitional terms “comprising,” “consisting essentially of,” and “consisting of” when used in the appended claims in their original and amended forms mean that additional claim elements or steps (if any) that are not recited are included in the scope of the claim. Specifies the scope of the claims with respect to what is excluded from. The term “comprising” is intended to be inclusive or open-ended and does not exclude any additional unstated elements, methods, steps or substances. The term “consisting of” excludes any element, step or substance other than those specified in the claim and, in the latter case, impurities customarily associated with the specified substance(s). The term “consisting essentially of” limits the scope of a claim to the specified element, step or material(s) and does not materially affect the basic and novel feature(s) of the claimed invention. All compositions, methods and kits described herein that embody the invention may, in alternative embodiments, be more specifically defined by any of the transitional terms “comprising,” “consisting essentially of,” and “consisting of.” .

의심을 피하기 위해, 본 발명의 특정한 측면, 실시양태 또는 실시예와 관련하여 기재된 특정한 특색 (예를 들어 정수, 특징, 값, 용도, 질환, 화학식, 화합물 또는 군)은 본원에 기재된 임의의 다른 측면, 실시양태 또는 실시예와 비상용성이지 않은 한 그에 적용가능한 것으로 이해될 것으로 의도된다. 따라서 이러한 특색은 적절한 경우에 본원에 정의된 임의의 정의, 청구범위 또는 실시양태와 관련하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 모든 특색 (임의의 첨부 청구범위, 요약서 및 도면 포함) 및/또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 과정의 모든 단계는, 이러한 특색 및/또는 단계 중 적어도 일부가 상호 배타적인 경우의 조합을 제외하고는, 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 발명은 임의의 개시된 실시양태의 임의의 세부사항에 한정되지 않는다. 본 발명은 본 명세서 (임의의 첨부 청구범위, 요약서 및 도면 포함)에서 개시된 특색의 임의의 신규한 것 또는 신규한 조합, 또는 그와 같이 개시된 임의의 방법 또는 과정의 단계의 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확대된다.For the avoidance of doubt, any particular feature (e.g., integer, characteristic, value, use, disease, formula, compound or group) described in connection with a particular aspect, embodiment or example of the invention does not refer to any other aspect described herein. , are intended to be understood as applicable to the embodiments or examples to the extent they are not incompatible with them. Accordingly, these features may be used, where appropriate, in connection with any definition, claim, or embodiment defined herein. All features disclosed herein (including any accompanying claims, abstracts and drawings) and/or all steps of any method or process so disclosed, unless at least some of such features and/or steps are mutually exclusive. Except for combination, they can be combined in any combination. The invention is not limited to any details of any disclosed embodiment. The invention does not apply to any novel or novel combination of features disclosed in the specification (including any accompanying claims, abstract and drawings), or to any novel or novel combination of features of any method or process so disclosed, or Expands to arbitrary new combinations.

잔유 종양 침윤 림프구를 확장시키는 방법How to Expand Residual Tumor Infiltrating Lymphocytes

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 종양의 소화 후에 잔유 종양 침윤 림프구 (rTIL)를 확장시키는 방법을 포함한다.In one embodiment, the invention includes a method of expanding residual tumor infiltrating lymphocytes (rTIL) following digestion of a tumor as described herein.

한 실시양태에서, 본 발명은 적어도 1종의 rTIL을 포함하는 rTIL의 집단을 IL-2와 접촉시켜 rTIL을 확장시키는 것을 포함하는, rTIL을 확장시키는 방법을 포함한다.In one embodiment, the invention includes a method of expanding rTILs, comprising contacting a population of rTILs comprising at least one rTIL with IL-2 to expand the rTILs.

한 실시양태에서, 본 발명은 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 단계를 포함하는, rTIL의 집단을 확장시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 종양을 효소 배지에 넣고, 대략 1분 동안 기계적으로 단편화할 수 있다. 이어서, 혼합물을 5% CO₂ 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 다시 대략 1분 동안 기계적으로 단편화할 수 있다. 5% CO₂ 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후에, 종양을 세번째로 대략 1분 동안 기계적으로 단편화할 수 있다. 제3 기계적 파괴 후에, 큰 조직 조각이 존재하는 경우, 5% CO₂ 하에 37℃에서 30분 추가의 인큐베이션을 수행하거나 또는 수행하지 않으면서, 1 또는 2회의 추가의 기계적 분리를 샘플에 적용할 수 있다. 최종 인큐베이션의 종료 후에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 사멸 세포를 함유하는 경우, 피콜을 사용하는 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 제거할 수 있다. 24-웰 플레이트 (코스타(Costar) 24-웰 세포 배양 클러스터, 편평 바닥; 코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 뉴욕주 코닝)에서 TIL 배양을 개시하였으며, 각각의 웰에 IL-2 (6000 IU/mL; 키론 코포레이션(Chiron Corp.), 캘리포니아주 에머리빌)를 갖는 2 mL의 완전 배지 (CM) 중 1x10⁶개 종양 소화 세포 또는 대략 1-8 mm³ 크기의 1개 종양 단편을 시딩할 수 있다. CM은 10% 인간 AB 혈청, 25mM Hepes 및 10 mg/mL 겐타미신에 의해 보충된 글루타맥스(GlutaMAX)가 존재하는 RPMI 1640으로 이루어진다. 40 mL 용량 및 10 cm² 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 기체-투과성 플라스크 (지-렉스(G-Rex) 10; 윌슨 울프 매뉴팩처링(Wilson Wolf Manufacturing), 뉴 브라이톤)에서 배양을 개시할 수 있고, 각각의 플라스크에 IL-2를 갖는 10-40 mL의 CM 중 10-40x10⁶개 생존 종양 소화 세포 또는 5-30개 종양 단편을 로딩할 수 있다. 지-렉스 10 및 24-웰 플레이트를 5% CO₂ 하에 37℃에서 가습 인큐베이터 내에서 인큐베이션할 수 있고, 배양 개시 5일 후에, 배지의 절반을 제거하고 신선한 CM 및 IL-2로 대체할 수 있고, 제5일 후 배지의 절반을 2-3일마다 교체할 수 있다. 본원 다른 곳에 기재된 바와 같이, T-175 플라스크 및 기체-투과성 백 또는 기체-투과성 지-렉스 플라스크를 사용하여 TIL에 대한 급속 확장 프로토콜 (REP)을 수행할 수 있다. T-175 플라스크에서의 REP의 경우, 1x10⁶개 rTIL을 각각의 플라스크에서 150 mL의 배지 중에 현탁시킬 수 있다. rTIL을 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)에 의해 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 (50/50 배지) 중에서 배양할 수 있다. T-175 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 배지의 절반을 제5일에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교체할 수 있다. 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 L 백에서 합할 수 있고, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM-V를 300 mL의 TIL 현탁액에 첨가할 수 있다. 각각의 백 내 세포의 수를 매일 또는 2일마다 계수할 수 있고, 신선한 배지를 첨가하여 세포 수가 0.5 내지 2.0x10⁶개 세포/mL를 유지하도록 할 수 있다. 100 cm² 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 플라스크 (예를 들어, 본원 다른 곳에 기재된 바와 같은, 윌슨 울프 매뉴팩처링의 지-렉스 100)에서의 REP의 경우, 5x10⁶ 또는 10x10⁶개 TIL을 3000 IU/mL의 IL-2 및 30 ng/mL의 항-CD3 항체 (OKT-3)에 의해 보충된 400 mL의 50/50 배지 중에서 배양할 수 있다. 지-렉스100 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 분리해내고, 원심분리 병에 넣고, 10분 동안 1500 rpm (491 g)으로 원심분리할 수 있다. 수득한 TIL 펠릿을 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 50/50 배지로 재현탁시키고, 다시 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL이 지-렉스 100 플라스크에서 연속적으로 확장될 때, 제7일에 각각의 지-렉스100에서의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지 중에 현탁시키고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취물로 분할할 수 있고, 이를 사용하여 3개의 지-렉스100 플라스크에 시딩할 수 있다. 이어서, 5% 인간 AB 혈청 및 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 약 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. 이어서, 지-렉스100 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후에 3000 IU/mL의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 지-렉스100 플라스크에 첨가할 수 있다. 이것 후에, 배양 제14일에 세포를 수거함으로써 REP를 완료할 수 있다.In one embodiment, the invention provides a method for treating a population of rTILs, comprising steps as described in Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Provides a way to expand . For example, tumors can be placed in enzyme medium and mechanically fragmented for approximately 1 minute. The mixture can then be incubated at 37° C. under 5% CO ₂ for 30 minutes and then mechanically fragmented again for approximately 1 minute. After incubation at 37° C. under 5% CO ₂ for 30 minutes, the tumor can be mechanically fragmented a third time for approximately 1 minute. After the third mechanical disruption, if large tissue fragments are present, the sample can be subjected to one or two additional mechanical separations, with or without an additional incubation of 30 minutes at 37° C. under 5% CO ₂ . there is. After the end of the final incubation, if the cell suspension contains large numbers of red blood cells or dead cells, density gradient separation using Ficoll can be performed to remove these cells. TIL cultures were initiated in 24-well plates (Costar 24-well cell culture cluster, flat bottom; Corning Incorporated, Corning, NY), with IL-2 (6000 IU) added to each well. /mL; Chiron Corp., Emeryville, CA) can be seeded with 1x10 ⁶ tumor digested cells or 1 tumor fragment measuring approximately 1-8 mm ³ in 2 mL of complete medium (CM). there is. CM consists of RPMI 1640 with GlutaMAX supplemented with 10% human AB serum, 25mM Hepes, and 10 mg/mL gentamicin. Cultures can be initiated in a gas-permeable flask (G-Rex 10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton) with a 40 mL capacity and a 10 cm ² gas-permeable silicon bottom; Each flask can be loaded with 10-40x10 ⁶ viable tumor digested cells or 5-30 tumor fragments in 10-40 mL of CM with IL-2. Z-Rex 10 and 24-well plates can be incubated in a humidified incubator at 37°C in 5% CO ₂ and after 5 days of initiation of culture, half of the medium can be removed and replaced with fresh CM and IL-2. , after day 5, half of the medium can be replaced every 2-3 days. As described elsewhere herein, the rapid expansion protocol (REP) for TILs can be performed using T-175 flasks and gas-permeable bags or gas-permeable Z-Rex flasks. For REP in T-175 flasks, 1x10 ⁶ rTILs can be suspended in 150 mL of medium in each flask. rTILs can be cultured in a 1 to 1 mixture of CM and AIM-V media (50/50 media) supplemented with 3000 IU/mL of IL-2 and 30 ng/mL of anti-CD3 antibody (OKT-3). there is. T-175 flasks can be incubated at 37°C under 5% CO ₂ . Half of the medium can be replaced on day 5 using 50/50 medium with 3000 IU/mL of IL-2. On day 7, cells from two T-175 flasks were combined in a 3 L bag and 300 mL of AIM-V with 5% human AB serum and 3000 IU/mL of IL-2 were added to 300 mL of TIL. Can be added to suspension. The number of cells in each bag can be counted daily or every two days, and fresh medium can be added to maintain the cell number between 0.5 and 2.0x10 ⁶ cells/mL. For REP in a 500 mL volumetric flask with a 100 cm ² gas-permeable silicon bottom (e.g., G-Rex 100 from Wilson Wolf Manufacturing, as described elsewhere herein), 5x10 ⁶ or 10x10 ⁶ TILs were used to produce 3000 TILs. Cultures can be made in 400 mL of 50/50 medium supplemented with IU/mL of IL-2 and 30 ng/mL of anti-CD3 antibody (OKT-3). Z-Rex100 flasks can be incubated at 37°C under 5% CO ₂ . On day 5, 250 mL of supernatant can be separated, placed in a centrifuge bottle, and centrifuged at 1500 rpm (491 g) for 10 minutes. The resulting TIL pellet can be resuspended in 150 mL of fresh 50/50 medium with 3000 IU/mL of IL-2 and added back to the Z-Rex 100 flask. When TILs were serially expanded in Z-Rex 100 flasks, on day 7, TILs from each Z-Rex 100 were suspended in 300 mL of medium present in each flask, and the cell suspension was divided into three 100 mL aliquots. You can split it with water and use it to seed three G-Rex100 flasks. Approximately 150 mL of AIM-V with 5% human AB serum and 3000 IU/mL of IL-2 can then be added to each flask. The Z-Rex100 flasks can then be incubated at 37°C in 5% CO ₂ and after 4 days 150 mL of AIM-V with 3000 IU/mL of IL-2 is added to each Z-Rex100 flask. can do. After this, REP can be completed by harvesting the cells on day 14 of culture.

한 실시양태에서, 확장 방법 또는 암 치료 방법은 환자 종양 샘플로부터 TIL을 수득하는 단계를 포함한다. 환자 종양 샘플은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들어, TIL을 효소적 종양 소화물 및 예리한 박리로부터의 종양 단편 (약 1 내지 약 8 mm³ 크기)으로부터 배양할 수 있다. 이러한 종양 소화물은 효소 배지 (예를 들어, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI) 1640 완충제, 2 mM 글루타메이트, 10 mcg/mL 겐타미신, 30 단위/mL의 DNase 및 1.0 mg/mL의 콜라게나제) 중에서의 인큐베이션, 이어서 기계적 분리 (예를 들어, 조직 분리기 또는 단편화기를 사용함)에 의해 생산할 수 있다. 종양 소화물은 종양을 효소 배지에 넣고, 대략 1분 동안 종양을 기계적으로 단편화하고, 이어서 5% CO₂ 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 이어서 단지 작은 조직 조각만이 존재할 때까지 기계적 분리 및 상기 조건 하의 인큐베이션의 반복 주기에 의해 생산할 수 있다. 이 과정의 종료시에, 세포 현탁액이 다수의 적혈구 또는 사멸 세포를 함유하는 경우, 피콜 분지형 친수성 폴리사카라이드를 사용하는 밀도 구배 분리를 수행하여 이들 세포를 분리해낼 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 대안적 방법, 예컨대 미국 특허 출원 공개 번호 2012/0244133 A1에 기재된 것 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)을 사용할 수 있다. TIL을 확장시키는 방법 또는 암을 치료하는 방법에 대한 본원에 기재된 임의의 실시양태에서 임의의 상기 방법을 사용할 수 있다.In one embodiment, the method of expansion or treatment of cancer comprises obtaining TILs from a patient tumor sample. Patient tumor samples can be obtained using methods known in the art. For example, TILs can be cultured from enzymatic tumor digests and tumor fragments (about 1 to about 8 mm ³ in size) from sharp dissection. These tumor digests were digested in enzyme medium (e.g., Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 buffer, 2 mM glutamate, 10 mcg/mL gentamicin, 30 units/mL DNase, and 1.0 mg/mL collagenase). It can be produced by incubation followed by mechanical separation (e.g., using a tissue separator or fragmenter). Tumor digests were prepared by placing the tumor in enzyme medium, mechanically fragmenting the tumor for approximately 1 minute, followed by incubation at 37°C under 5% CO ₂ for 30 minutes, followed by mechanical separation until only small tissue fragments were present, and It can be produced by repeated cycles of incubation under conditions. At the end of this process, if the cell suspension contains large numbers of red blood cells or dead cells, density gradient separation using Ficoll branched hydrophilic polysaccharides can be performed to isolate these cells. Alternative methods known in the art can be used, such as those described in US Patent Application Publication No. 2012/0244133 A1, the disclosure of which is incorporated herein by reference. Any of the above methods may be used in any of the embodiments described herein for methods of expanding TILs or methods of treating cancer.

한 실시양태에서, 임의의 적합한 방법을 사용하여 기체 투과성 용기에서 rTIL의 REP를 수행할 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2015/189356 A1 및 WO 2015/189356 A1 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이, 예를 들어 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-15 (IL-15) 및/또는 인터류킨-21 (IL-21)의 존재 하에 비-특이적 T 세포 수용체 자극을 사용하여 rTIL을 급속히 확장시킬 수 있다. 비-특이적 T 세포 수용체 자극은, 예를 들어 약 30 ng/mL의 OKT-3, 모노클로날 항-CD3 항체 (미국 뉴저지주 라리탄 소재 오르토-맥네일(Ortho-McNeil) 또는 캘리포니아주 샌디에고 소재 밀테니 바이오테크, 인크.로부터 상업적으로 입수가능함)를 포함할 수 있다. 임의로 T 세포 성장 인자, 예컨대 300 IU/mL IL-2 또는 IL-15의 존재 하에, 임의로 벡터로부터 발현될 수 있는 암의 1종 이상의 항원 (그의 항원 부분, 예컨대 에피토프(들) 포함), 예컨대 인간 백혈구 항원 A2 (HLA-A2) 결합 펩티드, 예를 들어 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) 또는 gpl 00:209-217 (210M)에 의한 시험관내 TIL의 추가 자극에 의해 TIL을 급속히 확장시킬 수 있다. 다른 적합한 항원은, 예를 들어 NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 암 항원, MAGE-A3, SSX-2 및 VEGFR2, 또는 그의 항원 부분을 포함할 수 있다. 또한, HLA-A2-발현 항원-제시 세포 상으로 펄스된 암의 동일한 항원(들)에 의한 재자극에 의해 TIL을 급속히 확장시킬 수 있다. 대안적으로, TIL을, 예를 들어 방사선 조사된 자가 림프구 또는 방사선 조사된 HLA-A2+ 동종 림프구 및 IL-2에 의해 추가로 재자극할 수 있다.In one embodiment, REP of rTIL can be performed in a gas permeable vessel using any suitable method. Interleukin-2 (IL-2), for example, as described in International Patent Application Publication Nos. WO 2015/189356 A1 and WO 2015/189356 A1 (the disclosures of each of which are incorporated herein by reference); Non-specific T cell receptor stimulation in the presence of interleukin-15 (IL-15) and/or interleukin-21 (IL-21) can be used to rapidly expand rTILs. Non-specific T cell receptor stimulation can be achieved, for example, with about 30 ng/mL of OKT-3, a monoclonal anti-CD3 antibody (Ortho-McNeil, Raritan, NJ or San Diego, CA). Materials commercially available from Miltenyi Biotech, Inc.). One or more antigens of the cancer (including antigenic portions thereof, such as epitope(s)), such as human, that may be expressed from the vector, optionally in the presence of a T cell growth factor, such as 300 IU/mL IL-2 or IL-15. Additional stimulation of TILs in vitro with leukocyte antigen A2 (HLA-A2) binding peptides, e.g., 0.3 μM MART-1:26-35 (27 L) or gpl 00:209-217 (210 M), rapidly stimulates TILs. It can be expanded. Other suitable antigens may include, for example, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, tyrosinase cancer antigen, MAGE-A3, SSX-2 and VEGFR2, or antigenic portions thereof. Additionally, TILs can expand rapidly by restimulation with the same antigen(s) of the cancer pulsed onto HLA-A2-expressing antigen-presenting cells. Alternatively, TILs can be further restimulated with, for example, irradiated autologous lymphocytes or irradiated HLA-A2+ allogeneic lymphocytes and IL-2.

한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 5000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배지, 약 5000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 5800 mL 내지 약 8700 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL을 확장시키는 방법은 약 1000 mL 내지 약 2000 mL의 세포 배지, 약 2000 mL 내지 약 3000 mL의 세포 배양 배지, 약 3000 mL 내지 약 4000 mL의 세포 배양 배지, 약 4000 mL 내지 약 5000 mL의 세포 배양 배지, 약 5000 mL 내지 약 6000 mL의 세포 배양 배지, 약 6000 mL 내지 약 7000 mL의 세포 배양 배지, 약 7000 mL 내지 약 8000 mL의 세포 배양 배지, 약 8000 mL 내지 약 9000 mL의 세포 배양 배지, 약 9000 mL 내지 약 10000 mL의 세포 배양 배지, 약 10000 mL 내지 약 15000 mL의 세포 배양 배지, 약 15000 mL 내지 약 20000 mL의 세포 배양 배지, 또는 약 20000 mL 내지 약 25000 mL의 세포 배양 배지를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 1종 이하의 유형의 세포 배양 배지를 사용한다. 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어 AIM-V 세포 배지 (L-글루타민, 50 μM 스트렙토마이신 술페이트, 및 10 μM 겐타미신 술페이트) 세포 배양 배지 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)를 사용할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 유리하게는 TIL의 수를 확장시키는데 요구되는 배지의 양 및 배지의 유형의 수를 감소시킨다. 한 실시양태에서, TIL의 수를 확장시키는 것은 3일마다 또는 4일마다보다 더 빈번하지 않게 세포를 공급하는 것을 포함할 수 있다. 기체 투과성 용기에서 세포의 수를 확장시키는 것은 세포를 확장시키는데 필요한 공급 빈도를 감소시킴으로써 세포의 수를 확장시키는데 필요한 절차를 단순화한다.In one embodiment, a method of expanding a TIL comprises using about 5000 mL to about 25000 mL of cell culture medium, about 5000 mL to about 10000 mL of cell culture medium, or about 5800 mL to about 8700 mL of cell culture medium. It can be included. In one embodiment, the method of expanding TIL comprises: from about 1000 mL to about 2000 mL of cell culture medium, from about 2000 mL to about 3000 mL of cell culture medium, from about 3000 mL to about 4000 mL of cell culture medium, from about 4000 mL About 5000 mL of cell culture medium, about 5000 mL to about 6000 mL of cell culture medium, about 6000 mL to about 7000 mL of cell culture medium, about 7000 mL to about 8000 mL of cell culture medium, about 8000 mL to about 9000 mL of cell culture medium, about 9000 mL to about 10000 mL of cell culture medium, about 10000 mL to about 15000 mL of cell culture medium, about 15000 mL to about 20000 mL of cell culture medium, or about 20000 mL to about 25000 mL. It may include using a cell culture medium. In one embodiment, expanding the number of TILs uses one or less types of cell culture media. Any suitable cell culture medium, such as AIM-V cell medium (L-glutamine, 50 μM streptomycin sulfate, and 10 μM gentamicin sulfate) cell culture medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) ) can be used. In this regard, the method of the present invention advantageously reduces the amount of media and the number of types of media required to expand the number of TILs. In one embodiment, expanding the number of TILs may include feeding cells no more frequently than every 3 days or every 4 days. Expanding the number of cells in a gas permeable container simplifies the procedures required to expand the number of cells by reducing the feeding frequency required to expand the cells.

한 실시양태에서, 급속 확장은 기체 투과성 용기를 사용하여 수행된다. 이러한 실시양태는 세포 집단이 약 5 x 10⁵개 세포/cm²에서 10 x 10⁶ 내지 30 x 10⁶개 세포/cm²로 확장되게 한다. 한 실시양태에서, 이러한 확장은 공급 없이 일어난다. 한 실시양태에서, 이러한 확장은 배지가 기체-투과성 플라스크 내 약 10 cm의 높이에 있는 한 공급 없이도 일어난다. 한 실시양태에서 이것은 공급은 없으나 1종 이상의 시토카인의 첨가가 있다. 한 실시양태에서, 시토카인은 시토카인과 배지를 혼합할 어떠한 필요성도 없이 볼루스로 첨가될 수 있다. 이러한 용기, 장치 및 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, TIL을 확장시키는데 사용되었으며, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2014/0377739 A1, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/210036 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0115617 A1, 국제 공개 번호 WO 2013/188427 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2011/0136228 A1, 미국 특허 번호 8,809,050, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2011/072088 A2, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2016/0208216 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2012/0244133 A1, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2012/129201 A1, 미국 특허 출원 공개 번호 US 2013/0102075 A1, 미국 특허 번호 8,956,860, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2013/173835 A1, 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2015/0175966 A1 (이들의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 문헌 [Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.In one embodiment, rapid expansion is performed using a gas permeable container. This embodiment allows the cell population to expand from about 5 x 10 ⁵ cells/cm ² to 10 x 10 ⁶ to 30 x 10 ⁶ cells/cm ² . In one embodiment, this expansion occurs without feeding. In one embodiment, this expansion occurs without feeding as long as the medium is at a height of about 10 cm in the gas-permeable flask. In one embodiment there is no feeding but addition of one or more cytokines. In one embodiment, the cytokine can be added as a bolus without any need to mix the cytokine and medium. Such vessels, devices and methods are known in the art and have been used to expand TIL and are described in U.S. Patent Application Publication No. US 2014/0377739 A1, International Patent Application Publication No. WO 2014/210036 A1, and U.S. Patent Application Publication No. US 2013/0115617 A1, International Patent Application Publication No. WO 2013/188427 A1, United States Patent Application Publication No. US 2011/0136228 A1, United States Patent Application Publication No. 8,809,050, International Patent Application Publication No. WO 2011/072088 A2, United States Patent Application Publication No. US 2016/0208216 A1, US Patent Application Publication No. US 2012/0244133 A1, International Patent Application Publication No. WO 2012/129201 A1, US Patent Application Publication No. US 2013/0102075 A1, US Patent Application Publication No. 8,956,860, International Patent Application Publication No. WO 2013/173835 A1 , and U.S. Patent Application Publication No. US 2015/0175966 A1, the disclosures of which are incorporated herein by reference. This method is also described in Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 10 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 10 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교체 후에 1 내지 3억개의 TIL을 제공한다.In one embodiment, the gas permeable container is a Z-Rex 10 Flask (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel includes a 10 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable container contains a 40 mL cell culture medium volume. In one embodiment, the gas permeable container provides 1 to 300 million TILs after two medium changes.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 100 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 450 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교체 후에 10 내지 30억개의 TIL을 제공한다.In one embodiment, the gas permeable container is a Z-Rex 100 flask (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel includes a 100 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable container contains a 450 mL cell culture medium capacity. In one embodiment, the gas permeable container provides 1 to 3 billion TILs after two medium changes.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 100M 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 1000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교체 없이 10 내지 30억개의 TIL을 제공한다.In one embodiment, the gas permeable container is a G-Rex 100M Flask (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel includes a 100 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable container contains a 1000 mL cell culture medium volume. In one embodiment, the gas permeable container provides 1 to 3 billion TILs without medium replacement.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 100L 플라스크 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 100 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2000 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 배지 교체 없이 10 내지 30억개의 TIL을 제공한다.In one embodiment, the gas permeable vessel is a G-Rex 100L flask (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel includes a 100 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable container contains a 2000 mL cell culture medium capacity. In one embodiment, the gas permeable container provides 1 to 3 billion TILs without medium replacement.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 24 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서 각각의 웰은 2 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서 각각의 웰은 8 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교체 후에 웰당 2 내지 6천만개의 세포를 제공한다.In one embodiment, the gas permeable container is a G-Rex 24 well plate (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel comprises a plate with wells, where each well comprises 2 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable vessel comprises a plate with wells, where each well contains a volume of 8 mL cell culture medium. In one embodiment, the gas permeable vessel provides 2 to 60 million cells per well after two medium changes.

한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 지-렉스 6 웰 플레이트 (윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션, 미국 미네소타주 뉴 브라이톤)이다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서 각각의 웰은 10 cm² 기체 투과성 배양 표면을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 웰을 갖는 플레이트를 포함하며, 여기서 각각의 웰은 40 mL 세포 배양 배지 용량을 포함한다. 한 실시양태에서, 기체 투과성 용기는 2회의 배지 교체 후에 웰당 1 내지 3억개의 세포를 제공한다.In one embodiment, the gas permeable container is a G-Rex 6 well plate (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). In one embodiment, the gas permeable vessel comprises a plate with wells, where each well comprises 10 cm ² gas permeable culture surface. In one embodiment, the gas permeable vessel comprises a plate with wells, where each well contains a volume of 40 mL cell culture medium. In one embodiment, the gas permeable vessel provides 1 to 300 million cells per well after two media changes.

한 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내 세포 배지는 비여과된다. 비여과 세포 배지의 사용은 세포의 수를 확장시키는데 필요한 절차를 단순화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 기체 투과성 용기 내 세포 배지는 베타-메르캅토에탄올 (BME)이 결여되어 있다.In one embodiment, the cell medium in the first and/or second gas permeable vessel is unfiltered. The use of unfiltered cell media can simplify the procedures needed to expand the number of cells. In some embodiments, the cell medium within the first and/or second gas permeable container is devoid of beta-mercaptoethanol (BME).

한 실시양태에서, 포유동물로부터 종양 조직 샘플을 수득하는 단계; 내부에 세포 배지를 함유하는 제1 기체 투과성 용기에서 종양 조직 샘플을 배양하는 단계; 종양 조직 샘플로부터 TIL을 수득하는 단계; 내부에 세포 배지를 함유하는 제2 기체 투과성 용기에서 TIL의 수를 확장시키는 단계를 포함하는 방법의 지속기간은 약 14 내지 약 42일의 지속기간, 예를 들어 약 28일이다.In one embodiment, obtaining a tumor tissue sample from the mammal; culturing the tumor tissue sample in a first gas permeable vessel containing cell medium therein; Obtaining TILs from tumor tissue samples; The duration of the method comprising expanding the number of TILs in a second gas permeable vessel containing cell medium therein is a duration of about 14 to about 42 days, for example about 28 days.

한 실시양태에서, 급속 확장에서의 rTIL 대 PBMC의 비는 약 1 대 25, 약 1 대 50, 약 1 대 100, 약 1 대 125, 약 1 대 150, 약 1 대 175, 약 1 대 200, 약 1 대 225, 약 1 대 250, 약 1 대 275, 약 1 대 300, 약 1 대 325, 약 1 대 350, 약 1 대 375, 약 1 대 400, 또는 약 1 대 500이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서의 rTIL 대 PBMC의 비는 1 대 50 내지 1 대 300이다. 한 실시양태에서, 급속 확장에서의 rTIL 대 PBMC의 비는 1 대 100 내지 1 대 200이다.In one embodiment, the ratio of rTIL to PBMC in rapid expansion is about 1 to 25, about 1 to 50, about 1 to 100, about 1 to 125, about 1 to 150, about 1 to 175, about 1 to 200, About 1 to 225, about 1 to 250, about 1 to 275, about 1 to 300, about 1 to 325, about 1 to 350, about 1 to 375, about 1 to 400, or about 1 to 500. In one embodiment, the ratio of rTIL to PBMC in rapid expansion is 1 to 50 to 1 to 300. In one embodiment, the ratio of rTIL to PBMC in rapid expansion is 1 to 100 to 1 to 200.

한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (rTIL:PBMC)의 비는 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:105, 1:110, 1:115, 1:120, 1:125, 1:130, 1:135, 1:140, 1:145, 1:150, 1:155, 1:160, 1:165, 1:170, 1:175, 1:180, 1:185, 1:190, 1:195, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, 1:450, 및 1:500으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (rTIL:PBMC)의 비는 약 1:90이다. 바람직한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (rTIL:PBMC)의 비는 약 1:95이다. 바람직한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (TIL:PBMC)의 비는 약 1:100이다. 바람직한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (TIL:PBMC)의 비는 약 1:105이다. 바람직한 실시양태에서, rTIL 대 PBMC (TIL:PBMC)의 비는 약 1:110이다.In one embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (rTIL:PBMC) is 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1: 45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100, 1:105, 1:110, 1:115, 1:120, 1:125, 1:130, 1:135, 1:140, 1:145, 1:150, 1:155, 1:160, 1:165, 1: 170, 1:175, 1:180, 1:185, 1:190, 1:195, 1:200, 1:225, 1:250, 1:275, 1:300, 1:350, 1:400, It is selected from the group consisting of 1:450, and 1:500. In a preferred embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (rTIL:PBMC) is about 1:90. In a preferred embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (rTIL:PBMC) is about 1:95. In a preferred embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (TIL:PBMC) is about 1:100. In a preferred embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (TIL:PBMC) is about 1:105. In a preferred embodiment, the ratio of rTIL to PBMC (TIL:PBMC) is about 1:110.

한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 추가로 IL-2를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 3000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 1000 IU/mL, 약 1500 IU/mL, 약 2000 IU/mL, 약 2500 IU/mL, 약 3000 IU/mL, 약 3500 IU/mL, 약 4000 IU/mL, 약 4500 IU/mL, 약 5000 IU/mL, 약 5500 IU/mL, 약 6000 IU/mL, 약 6500 IU/mL, 약 7000 IU/mL, 약 7500 IU/mL, 또는 약 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 1000 내지 2000 IU/mL, 2000 내지 3000 IU/mL, 3000 내지 4000 IU/mL, 4000 내지 5000 IU/mL, 5000 내지 6000 IU/mL, 6000 내지 7000 IU/mL, 7000 내지 8000 IU/mL, 또는 8000 IU/mL의 IL-2를 포함한다.In one embodiment, the cell culture medium further comprises IL-2. In a preferred embodiment, the cell culture medium comprises about 3000 IU/mL of IL-2. In one embodiment, the cell culture medium has a concentration of about 1000 IU/mL, about 1500 IU/mL, about 2000 IU/mL, about 2500 IU/mL, about 3000 IU/mL, about 3500 IU/mL, about 4000 IU/mL. , about 4500 IU/mL, about 5000 IU/mL, about 5500 IU/mL, about 6000 IU/mL, about 6500 IU/mL, about 7000 IU/mL, about 7500 IU/mL, or about 8000 IU/mL. Contains IL-2. In one embodiment, the cell culture medium has 1000 to 2000 IU/mL, 2000 to 3000 IU/mL, 3000 to 4000 IU/mL, 4000 to 5000 IU/mL, 5000 to 6000 IU/mL, 6000 to 7000 IU/mL. , 7000 to 8000 IU/mL, or 8000 IU/mL of IL-2.

한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 OKT-3 항체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 30 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 약 0.1 ng/mL, 약 0.5 ng/mL, 약 1 ng/mL, 약 2.5 ng/mL, 약 5 ng/mL, 약 7.5 ng/mL, 약 10 ng/mL, 약 15 ng/mL, 약 20 ng/mL, 약 25 ng/mL, 약 30 ng/mL, 약 35 ng/mL, 약 40 ng/mL, 약 50 ng/mL, 약 60 ng/mL, 약 70 ng/mL, 약 80 ng/mL, 약 90 ng/mL, 약 100 ng/mL, 약 200 ng/mL, 약 500 ng/mL, 및 약 1 μg/mL의 OKT-3 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 배양 배지는 0.1 ng/mL 내지 1 ng/mL, 1 ng/mL 내지 5 ng/mL, 5 ng/mL 내지 10 ng/mL, 10 ng/mL 내지 20 ng/mL, 20 ng/mL 내지 30 ng/mL, 30 ng/mL 내지 40 ng/mL, 40 ng/mL 내지 50 ng/mL, 및 50 ng/mL 내지 100 ng/mL의 OKT-3 항체를 포함한다.In one embodiment, the cell culture medium includes OKT-3 antibody. In a preferred embodiment, the cell culture medium comprises about 30 ng/mL of OKT-3 antibody. In one embodiment, the cell culture medium has about 0.1 ng/mL, about 0.5 ng/mL, about 1 ng/mL, about 2.5 ng/mL, about 5 ng/mL, about 7.5 ng/mL, about 10 ng/mL. , about 15 ng/mL, about 20 ng/mL, about 25 ng/mL, about 30 ng/mL, about 35 ng/mL, about 40 ng/mL, about 50 ng/mL, about 60 ng/mL, about 70 ng/mL, about 80 ng/mL, about 90 ng/mL, about 100 ng/mL, about 200 ng/mL, about 500 ng/mL, and about 1 μg/mL of OKT-3 antibody. In one embodiment, the cell culture medium is 0.1 ng/mL to 1 ng/mL, 1 ng/mL to 5 ng/mL, 5 ng/mL to 10 ng/mL, 10 ng/mL to 20 ng/mL, 20 ng/mL to 30 ng/mL, 30 ng/mL to 40 ng/mL, 40 ng/mL to 50 ng/mL, and 50 ng/mL to 100 ng/mL of OKT-3 antibody.

한 실시양태에서, TIL에 대한 급속 확장 방법은 이전에 기재된 바와 같은 T-175 플라스크 및 기체 투과성 백 (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) 또는 기체 투과성 배양용기 (미국 미네소타주 뉴 브라이톤 소재 윌슨 울프 매뉴팩처링 코포레이션으로부터 상업적으로 입수가능한 지-렉스 플라스크)를 사용하여 수행될 수 있다. T-175 플라스크에서의 TIL 급속 확장을 위해, 150 mL의 배지 중에 현탁된 1 x 10⁶개 TIL을 각각의 T-175 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL을 mL당 3000 IU (주사 단위)의 IL-2 및 mL당 30 ng의 항-CD3 항체 (예를 들어, OKT-3)에 의해 보충된 CM 및 AIM-V 배지의 1 대 1 혼합물 중에서 배양할 수 있다. T-175 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 배양할 수 있다. 배지의 절반을 제5일에 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 50/50 배지를 사용하여 교체할 수 있다. 제7일에, 2개의 T-175 플라스크로부터의 세포를 3 L 백에서 합할 수 있고, 5% 인간 AB 혈청 및 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 300 mL의 AIM V를 300 ml의 TIL 현탁액에 첨가하였다. 각각의 백 내 세포의 수를 매일 또는 2일마다 계수하였고, 신선한 배지를 첨가하여 세포 수가 0.5 내지 2.0 x 10⁶개 세포/mL를 유지하도록 하였다.In one embodiment, the rapid scale-up method for TIL uses T-175 flasks and gas permeable bags as previously described (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) or a gas permeable culture vessel (G-Rex Flask, commercially available from Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN). For rapid expansion of TILs in T-175 flasks, 1 x 10 ⁶ TILs suspended in 150 mL of medium can be added to each T-175 flask. TILs are cultured in a 1 to 1 mixture of CM and AIM-V medium supplemented with 3000 IU (injection units) of IL-2 per mL and 30 ng of anti-CD3 antibody (e.g., OKT-3) per mL. can do. T-175 flasks can be cultured at 37°C under 5% CO ₂ . Half of the medium can be replaced on day 5 using 50/50 medium with 3000 IU of IL-2 per mL. On day 7, cells from two T-175 flasks can be combined in a 3 L bag and 300 mL of AIM V with 5% human AB serum and 3000 IU of IL-2 per mL are added to 300 ml of TIL suspension. was added to. The number of cells in each bag was counted daily or every two days, and fresh medium was added to maintain the cell number between 0.5 and 2.0 x 10 ⁶ cells/mL.

한 실시양태에서, 100 cm 기체-투과성 규소 바닥을 갖는 500 mL 용량 기체 투과성 플라스크 (미국 미네소타주 뉴 브라이톤 소재 윌슨 울프 매뉴팩처링으로부터 상업적으로 입수가능한 지-렉스 100)에서의 TIL 급속 확장을 위해, 5 x 10⁶ 또는 10 x 10⁶개 TIL을 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2 및 mL당 30 ng의 항-CD3 (OKT-3)에 의해 보충된 50/50 배지 중에서 배양할 수 있다. 지-렉스100 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있다. 제5일에, 250 mL의 상청액을 분리해내고, 원심분리 병에 넣고, 10분 동안 1500 rpm (분당 회전수; 491 x g)으로 원심분리할 수 있다. TIL 펠릿을 5% 인간 AB 혈청, mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 신선한 배지로 재현탁시키고, 다시 원래 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. TIL이 지-렉스 100 플라스크에서 연속적으로 확장될 때, 제7일에 각각의 지-렉스 100에서의 TIL을 각각의 플라스크에 존재하는 300 mL의 배지 중에 현탁시킬 수 있고, 세포 현탁액을 3개의 100 mL 분취물로 분할할 수 있고, 이를 사용하여 3개의 지-렉스 100 플라스크에 시딩할 수 있다. 이어서, 5% 인간 AB 혈청 및 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 플라스크에 첨가할 수 있다. 지-렉스 100 플라스크를 5% CO₂ 하에 37℃에서 인큐베이션할 수 있고, 4일 후에 mL당 3000 IU의 IL-2를 갖는 150 mL의 AIM-V를 각각의 지-렉스 100 플라스크에 첨가할 수 있다. 배양 제14일에 세포를 수거할 수 있다.In one embodiment, for rapid expansion of TIL in a 500 mL capacity gas permeable flask (G-Rex 100, commercially available from Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) with a 100 cm gas-permeable silicon bottom, 5 x 10 ⁶ or 10 x 10 ⁶ TILs were cultured in 50/50 medium supplemented with 5% human AB serum, 3000 IU of IL-2 per mL and 30 ng of anti-CD3 (OKT-3) per mL. You can. Z-Rex100 flasks can be incubated at 37°C under 5% CO ₂ . On day 5, 250 mL of supernatant can be separated, placed in a centrifuge bottle, and centrifuged at 1500 rpm (revolutions per minute; 491 xg) for 10 minutes. The TIL pellet can be resuspended in 150 mL of fresh medium with 5% human AB serum, 3000 IU of IL-2 per mL and added back to the original Z-Rex 100 flask. When TILs are serially expanded in Z-Rex 100 flasks, on day 7 TILs from each Z-Rex 100 can be suspended in 300 mL of medium present in each flask, and the cell suspension is divided into three 100 mL cells. Can be split into mL aliquots and used to seed three Z-Rex 100 flasks. Then, 150 mL of AIM-V with 5% human AB serum and 3000 IU of IL-2 per mL can be added to each flask. Z-Rex 100 flasks can be incubated at 37°C in 5% CO ₂ and after 4 days 150 mL of AIM-V with 3000 IU of IL-2 per mL can be added to each Z-Rex 100 flask. there is. Cells can be harvested on day 14 of culture.

한 실시양태에서, TIL은 하기와 같이 제조될 수 있다. 2 mM 글루타민 (미디어테크, 인크.(Mediatech, Inc.), 버지니아주 마나사스), 100 U/mL 페니실린 (인비트로젠 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies)), 100 μg/mL 스트렙토마이신 (인비트로젠 라이프 테크놀로지스), 5% 열-불활성화 인간 AB 혈청 (밸리 바이오메디칼, 인크.(Valley Biomedical, Inc.), 버지니아주 윈체스터) 및 600 IU/mL rhIL-2 (키론(Chiron), 캘리포니아주 에머리빌)에 의해 보충된 AIM-V 배지 (인비트로젠 라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드)로 구성된 완전 배지 (CM) 중에서 2 mm³ 종양 단편을 배양한다. 고형 종양의 효소적 소화를 위해, 종양 시편을 RPMI-1640 내로 다이싱하고, 세척하고, 15-22℃에서 5분 동안 800 rpm으로 원심분리하고, 효소적 소화 완충제 (RPMI-1640 중 0.2 mg/mL 콜라게나제 및 30 단위/ml의 DNase) 중에 재현탁시키고, 이어서 실온에서 밤새 회전시켰다. 단편으로부터 확립된 TIL을 CM 중에서 3-4주 동안 성장시키고 새로 확장시킬 수 있거나 또는 10% 디메틸술폭시드 (DMSO)를 갖는 열-불활성화 HAB 혈청 중에 동결보존시키고 연구 시까지 -180℃에서 저장할 수 있다. 복수 수집물로부터 수득된 종양 연관 림프구 (TAL)를 3 x 10⁶개 세포/웰 (24 웰 플레이트의 웰)로 CM 중에 시딩하였다. TIL 성장을 저전력 도립 현미경을 사용하여 약 격일마다 검사하였다.In one embodiment, TIL can be prepared as follows. 2 mM glutamine (Mediatech, Inc., Manassas, VA), 100 U/mL penicillin (Invitrogen Life Technologies), 100 μg/mL streptomycin (Invitrogen) Life Technologies), 5% heat-inactivated human AB serum (Valley Biomedical, Inc., Winchester, VA) and 600 IU/mL rhIL-2 (Chiron, Emeryville, CA) 2 mm ³ tumor fragments are cultured in complete medium (CM) consisting of AIM-V medium (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) supplemented with ). For enzymatic digestion of solid tumors, tumor specimens were diced into RPMI-1640, washed, centrifuged at 800 rpm for 5 min at 15-22°C, and incubated in enzymatic digestion buffer (0.2 mg/ml in RPMI-1640). mL collagenase and 30 units/ml DNase) and then rotated overnight at room temperature. TILs established from fragments can be grown in CM for 3-4 weeks and expanded de novo or cryopreserved in heat-inactivated HAB serum with 10% dimethylsulfoxide (DMSO) and stored at -180°C until studies. there is. Tumor associated lymphocytes (TAL) obtained from ascites collections were seeded in CM at 3 x 10 ⁶ cells/well (well of a 24 well plate). TIL growth was examined approximately every other day using a low-power inverted microscope.

한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 용기에서 확장된다. 기체-투과성 용기는 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0106717 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 것을 포함한, 관련 기술분야에 공지된 방법, 조성물 및 장치를 사용하여 PBMC를 사용하여 TIL을 확장시키는데 사용되었다. 한 실시양태에서, TIL은 기체-투과성 백에서 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 수리(Xuri) 세포 확장 시스템 W25 (지이 헬스케어(GE Healthcare))를 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, TIL은 기체 투과성 백에서 TIL을 확장시키는 세포 확장 시스템, 예컨대 수리 세포 확장 시스템 W5 (지이 헬스케어)로도 알려져 있는 웨이브(WAVE) 바이오리액터 시스템을 사용하여 확장된다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 100 mL, 약 200 mL, 약 300 mL, 약 400 mL, 약 500 mL, 약 600 mL, 약 700 mL, 약 800 mL, 약 900 mL, 약 1 L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4 L, 약 5 L, 약 6 L, 약 7 L, 약 8 L, 약 9 L, 약 10 L, 약 11 L, 약 12 L, 약 13 L, 약 14 L, 약 15 L, 약 16 L, 약 17 L, 약 18 L, 약 19 L, 약 20 L, 약 25 L, 및 약 30 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 50 내지 150 mL, 150 내지 250 mL, 250 내지 350 mL, 350 내지 450 mL, 450 내지 550 mL, 550 내지 650 mL, 650 내지 750 mL, 750 내지 850 mL, 850 내지 950 mL, 및 950 내지 1050 mL로 이루어진 군으로부터 선택된 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 1 L 내지 2 L, 2 L 내지 3 L, 3 L 내지 4 L, 4 L 내지 5 L, 5 L 내지 6 L, 6 L 내지 7 L, 7 L 내지 8 L, 8 L 내지 9 L, 9 L 내지 10 L, 10 L 내지 11 L, 11 L 내지 12 L, 12 L 내지 13 L, 13 L 내지 14 L, 14 L 내지 15 L, 15 L 내지 16 L, 16 L 내지 17 L, 17 L 내지 18 L, 18 L 내지 19 L, 및 19 L 내지 20 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 0.5 L 내지 5 L, 5 L 내지 10 L, 10 L 내지 15 L, 15 L 내지 20 L, 20 L 내지 25 L, 및 25 L 내지 30 L로 이루어진 군으로부터 선택된 부피 범위를 갖는 기체 투과성 세포 백을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 30분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 24시간, 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일, 약 21일, 약 22일, 약 23일, 약 24일, 약 25일, 약 26일, 약 27일, 및 약 28일의 요동 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 30분 내지 1시간, 1시간 내지 12시간, 12시간 내지 1일, 1일 내지 7일, 7일 내지 14일, 14일 내지 21일, 및 21일 내지 28일의 요동 시간을 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2회 요동/분, 약 5회 요동/분, 약 10회 요동/분, 약 20회 요동/분, 약 30회 요동/분, 및 약 40회 요동/분의 요동 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2회 요동/분 내지 5회 요동/분, 5회 요동/분 내지 10회 요동/분, 10회 요동/분 내지 20회 요동/분, 20회 요동/분 내지 30회 요동/분, 및 30회 요동/분 내지 40회 요동/분의 요동 속도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 약 2°, 약 3°, 약 4°, 약 5°, 약 6°, 약 7°, 약 8°, 약 9°, 약 10°, 약 11°, 및 약 12°의 요동 각도를 이용한다. 한 실시양태에서, 세포 확장 시스템은 2° 내지 3°, 3° 내지 4°, 4° 내지 5°, 5° 내지 6°, 6° 내지 7°, 7° 내지 8°, 8° 내지 9°, 9° 내지 10°, 10° 내지 11°, 및 11° 내지 12°의 요동 각도를 이용한다.In one embodiment, the TIL expands in a gas-permeable container. Gas-permeable containers can be prepared to produce TIL using PBMCs using methods, compositions, and devices known in the art, including those described in U.S. Patent Application Publication No. 2005/0106717 A1, the disclosure of which is incorporated herein by reference. It was used to expand. In one embodiment, the TIL is expanded in a gas-permeable bag. In one embodiment, TILs are expanded using a cell expansion system that expands TILs in a gas permeable bag, such as the Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). In one embodiment, TILs are expanded using a cell expansion system that expands TILs in a gas permeable bag, such as the WAVE bioreactor system, also known as the Repair Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). In one embodiment, the cell expansion system has a volume of about 100 mL, about 200 mL, about 300 mL, about 400 mL, about 500 mL, about 600 mL, about 700 mL, about 800 mL, about 900 mL, about 1 L, about 2 L, about 3 L, about 4 L, about 5 L, about 6 L, about 7 L, about 8 L, about 9 L, about 10 L, about 11 L, about 12 L, about 13 L, about 14 L , about 15 L, about 16 L, about 17 L, about 18 L, about 19 L, about 20 L, about 25 L, and about 30 L. In one embodiment, the cell expansion system is 50 to 150 mL, 150 to 250 mL, 250 to 350 mL, 350 to 450 mL, 450 to 550 mL, 550 to 650 mL, 650 to 750 mL, 750 to 850 mL, 850 mL. and a gas permeable cell bag having a volume range selected from the group consisting of -950 mL, and 950-1050 mL. In one embodiment, the cell expansion system is 1 L to 2 L, 2 L to 3 L, 3 L to 4 L, 4 L to 5 L, 5 L to 6 L, 6 L to 7 L, 7 L to 8 L. , 8 L to 9 L, 9 L to 10 L, 10 L to 11 L, 11 L to 12 L, 12 L to 13 L, 13 L to 14 L, 14 L to 15 L, 15 L to 16 L, 16 A gas permeable cell bag having a volume range selected from the group consisting of L to 17 L, 17 L to 18 L, 18 L to 19 L, and 19 L to 20 L. In one embodiment, the cell expansion system is selected from the group consisting of 0.5 L to 5 L, 5 L to 10 L, 10 L to 15 L, 15 L to 20 L, 20 L to 25 L, and 25 L to 30 L. It contains a gas permeable cell bag having a volume range. In one embodiment, the cell expansion system is administered for about 30 minutes, about 1 hour, about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 24 hours, about 2 days, about 3 days, about 4 days, about 5 days, about 6 days, about 7 days, about 8 days, about 9 days, about 10 days , about 11 days, about 12 days, about 13 days, about 14 days, about 15 days, about 16 days, about 17 days, about 18 days, about 19 days, about 20 days, about 21 days, about 22 days, about Fluctuating times of 23 days, about 24 days, about 25 days, about 26 days, about 27 days, and about 28 days are used. In one embodiment, the cell expansion system is 30 minutes to 1 hour, 1 hour to 12 hours, 12 hours to 1 day, 1 day to 7 days, 7 days to 14 days, 14 days to 21 days, and 21 days to 28 days. Take advantage of the fluctuating times of the day. In one embodiment, the cell expansion system has a pulse rate of about 2 oscillations/min, about 5 oscillations/min, about 10 oscillations/min, about 20 oscillations/min, about 30 oscillations/min, and about 40 oscillations/min. Use the shaking speed of minutes. In one embodiment, the cell expansion system has a pulse rate of 2 to 5 oscillations/min, 5 to 10 oscillations/min, 10 to 20 oscillations/min, 20 oscillations/min. Rocking speeds of between 30 rockings/min and 30 rockings/min to 40 rockings/min are used. In one embodiment, the cell expansion system has an angle of about 2°, about 3°, about 4°, about 5°, about 6°, about 7°, about 8°, about 9°, about 10°, about 11°, and A swing angle of approximately 12° is used. In one embodiment, the cell expansion system is 2° to 3°, 3° to 4°, 4° to 5°, 5° to 6°, 6° to 7°, 7° to 8°, 8° to 9°. , using swing angles of 9° to 10°, 10° to 11°, and 11° to 12°.

한 실시양태에서, rTIL을 확장시키는 방법은 우수한 종양 반응성을 위해 rTIL을 선택하는 단계를 추가로 포함한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 선택 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2016/0010058 A1 (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 방법이 우수한 종양 반응성을 위한 TIL의 선택에 사용될 수 있다.In one embodiment, the method of expanding rTILs further comprises selecting the rTILs for good tumor responsiveness. Any selection method known in the art may be used. For example, the methods described in US Patent Application Publication No. 2016/0010058 A1, the disclosure of which is incorporated herein by reference, can be used to select TILs for good tumor responsiveness.

rTIL의 특징Characteristics of rTIL

한 실시양태에서, 본 발명의 rTIL은 1종 이상의 T 세포 소진 마커에 의해 특징화된 소진된 T 세포 표현형을 나타낸다. 한 실시양태에서, 본 발명의 rTIL은 유동 세포측정 분석을 사용하여 1종 이상의 T 세포 소진 마커에 의해 특징화된 소진된 T 세포 표현형을 나타낸다. 한 실시양태에서, T 세포 소진 마커는 PD-1이다. 한 실시양태에서, T 세포 소진 마커는 LAG3이다. 한 실시양태에서, T 세포 소진 마커는 TIM3이다.In one embodiment, rTILs of the invention exhibit an exhausted T cell phenotype characterized by one or more T cell exhaustion markers. In one embodiment, rTILs of the invention exhibit an exhausted T cell phenotype characterized by one or more T cell exhaustion markers using flow cytometric analysis. In one embodiment, the T cell exhaustion marker is PD-1. In one embodiment, the T cell exhaustion marker is LAG3. In one embodiment, the T cell exhaustion marker is TIM3.

한 실시양태에서, rTIL에서의 PD-1 발현은 eTIL에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 PD-1 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다.In one embodiment, PD-1 expression in rTILs is at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% compared to eTILs. %, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, PD-1 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least It is reduced by 10 times.

한 실시양태에서, rTIL에서의 LAG3 발현은 eTIL에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 LAG3 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 LAG3 발현은 유동 세포측정법에 의해 검출불가능하다.In one embodiment, LAG3 expression in rTIL is at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, reduced by at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, LAG3 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. is reduced by In one embodiment, LAG3 expression in rTILs is undetectable by flow cytometry.

한 실시양태에서, rTIL에서의 TIM3 발현은 eTIL에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 TIM3 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 TIM3 발현은 유동 세포측정법에 의해 검출불가능하다.In one embodiment, TIM3 expression in rTIL is at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, reduced by at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, TIM3 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. is reduced by In one embodiment, TIM3 expression in rTILs is undetectable by flow cytometry.

한 실시양태에서, rTIL에서의 TIGIT 발현은 eTIL에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 TIGIT 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 TIGIT 발현은 유동 세포측정법에 의해 검출불가능하다.In one embodiment, TIGIT expression in rTIL is at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, reduced by at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, TIGIT expression in rTIL is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTIL. is reduced by In one embodiment, TIGIT expression in rTIL is undetectable by flow cytometry.

한 실시양태에서, rTIL에서의 CTLA-4 발현은 eTIL에 비해 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 CTLA-4 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 CTLA-4 발현은 유동 세포측정법에 의해 검출불가능하다.In one embodiment, CTLA-4 expression in rTILs is at least 5%, at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80% compared to eTILs. %, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, CTLA-4 expression in rTIL is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least It is reduced by 10 times. In one embodiment, CTLA-4 expression in rTIL is undetectable by flow cytometry.

한 실시양태에서, rTIL에서의 CD69 발현은 eTIL에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 증가된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 CD69 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 증가된다.In one embodiment, CD69 expression in rTIL is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, increased by at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, CD69 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. increases as much as

한 실시양태에서, rTIL에서의 S1PR1 (스핑고신-1-포스페이트 수용체 1) 발현은 eTIL에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 감소된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 S1PR1 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 감소된다.In one embodiment, S1PR1 (sphingosine-1-phosphate receptor 1) expression in rTILs is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70% compared to eTILs. %, at least 80%, at least 90%, at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, S1PR1 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. is reduced by

한 실시양태에서, rTIL에서의 텔로미어 길이는 eTIL에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 증가된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 텔로미어 길이는 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 증가된다.In one embodiment, the telomere length in rTIL is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, increased by at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, the telomere length in rTIL is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTIL. increases as much as

한 실시양태에서, rTIL에서의 CD28 발현은 eTIL에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 증가된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 CD28 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 증가된다.In one embodiment, CD28 expression in rTIL is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, increased by at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, CD28 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. increases as much as

한 실시양태에서, rTIL에서의 CD27 발현은 eTIL에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 또는 적어도 150%만큼 증가된다. 한 실시양태에서, rTIL에서의 CD27 발현은 eTIL에 비해 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 또는 적어도 10배만큼 증가된다.In one embodiment, CD27 expression in rTIL is at least 10%, at least 20%, at least 30%, at least 40%, at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, increased by at least 100%, at least 110%, at least 120%, at least 130%, at least 140%, or at least 150%. In one embodiment, CD27 expression in rTILs is at least 2-fold, at least 3-fold, at least 4-fold, at least 5-fold, at least 6-fold, at least 7-fold, at least 8-fold, at least 9-fold, or at least 10-fold compared to eTILs. increases as much as

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 추가의 단계를 수행하기 전에 또는 본원에 기재된 REP 단계의 완료 후에, 수송, 해동 및/또는 환자에 대한 투여 전에, 저장 배지 (예를 들어, 5% DMSO를 함유하는 배지)에서의 eTIL 및/또는 rTIL의 임의적인 동결보존을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 본원에 기재된 추가의 단계를 수행하기 전에 동결보존된 TIL (예를 들어 동결보존된 eTIL, 동결보존된 rTIL, 또는 그의 조합 또는 혼합물)을 해동시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 단계는 eTIL 및/또는 rTIL의 추가의 또는 반복된 확장 (예를 들어, 재REP)일 수 있으며, 이는 해동된 세포에서, 예를 들어 IL-2, OKT-3, 및/또는 일반적으로 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC; 또는 대안적으로, 항원 제시 세포 사용)를 포함하는 피더 세포 (예를 들어, 항원 제시 세포)를 포함하는 보충된 세포 배양 배지를 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 추가의 확장 단계는 적어도 14일 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 배지는 또한 IL-2 단독보다는 IL-2, IL-15 및/또는 IL-23의 조합을 함유할 수 있다.In some embodiments, the methods described herein are stored in a storage medium (e.g., 5 % DMSO). In some embodiments, the methods described herein include thawing cryopreserved TIL (e.g., cryopreserved eTIL, cryopreserved rTIL, or combinations or mixtures thereof) prior to performing additional steps described herein. can do. In some embodiments, the additional step may be further or repeated expansion (e.g., re-REP) of eTILs and/or rTILs, which may be performed in thawed cells, e.g., IL-2, OKT-3, and/or typically comprising peripheral blood mononuclear cells (PBMCs; or alternatively, using antigen presenting cells). and wherein an additional expansion step may be performed for at least 14 days. In some embodiments, such media may also contain a combination of IL-2, IL-15, and/or IL-23 rather than IL-2 alone.

본원에 논의된 바와 같이, 동결보존은 TIL 확장 방법 전체에 걸쳐 수많은 지점에서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 확장 후 벌크 TIL 집단 (예를 들어, eTIL, rTIL, 또는 그의 조합 또는 혼합물)을 동결보존시킬 수 있다. 동결보존은 일반적으로 TIL 집단을 동결 용액, 예를 들어 85% 보체 불활성화된 AB 혈청 및 15% 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 넣어 이루어질 수 있다. 용액 중의 세포를 극저온 바이알에 넣고, -80℃에서 24시간 동안 저장하며, 임의로 동결보존을 위한 기체상 질소 동결기에 전달한다. 문헌 [Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL을 5% DMSO 중에서 동결보존시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TIL을 세포 배양 배지 플러스 5% DMSO 중에서 동결보존시킬 수 있다.As discussed herein, cryopreservation can occur at numerous points throughout the TIL expansion method. In some embodiments, bulk TIL populations (e.g., eTILs, rTILs, or combinations or mixtures thereof) may be cryopreserved after expansion. Cryopreservation can generally be achieved by placing the TIL population in a freezing solution, for example, 85% complement inactivated AB serum and 15% dimethyl sulfoxide (DMSO). Cells in solution are placed in cryogenic vials, stored at -80°C for 24 hours, and optionally transferred to a gaseous nitrogen freezer for cryopreservation. See Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. In some embodiments, TILs described herein can be cryopreserved in 5% DMSO. In some embodiments, TILs described herein can be cryopreserved in cell culture medium plus 5% DMSO.

적절한 경우, 본원에 기재된 동결보존된 세포, 예컨대 동결보존된 rTIL을 동결기로부터 분리해내고, 용액의 대략 4/5가 해동될 때까지 37℃ 수조에서 해동시킨다. 세포를 일반적으로 완전 배지 중에 재현탁시키고, 임의로 1회 이상 세척한다. 일부 실시양태에서, 해동된 TIL을 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 생존율에 대해 계수 및 평가할 수 있다.When appropriate, cryopreserved cells described herein, such as cryopreserved rTILs, are removed from the freezer and thawed in a 37°C water bath until approximately 4/5 of the solution is thawed. Cells are generally resuspended in complete medium and optionally washed one or more times. In some embodiments, thawed TILs can be counted and assessed for viability as known in the art.

종양을 소화시켜 rTIL을 수득하는 방법How to obtain rTIL by digesting a tumor

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 종양을 1종 이상의 효소를 사용하여 소화시키는 단계를 포함한다. 종양의 소화에 적합한 효소는 문헌 [Volvitz, et al., BMC Neuroscience 2016, 17, 30] (이의 개시내용이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.In one embodiment, the method of obtaining rTIL includes digesting the tumor using one or more enzymes. Enzymes suitable for digestion of tumors are described in Volvitz, et al., BMC Neuroscience 2016, 17, 30, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

일부 실시양태에서, 본 발명은 종양 조직 또는 그의 부분을 포함할 수 있는 종양을 데옥시리보뉴클레아제, 콜라게나제, 히알루로니다제 또는 그의 조합을 사용하여 소화시키는 단계를 포함하는, rTIL을 수득하는 방법을 포함할 수 있다.In some embodiments, the invention provides an rTIL comprising digesting a tumor, which may comprise tumor tissue or portions thereof, using a deoxyribonuclease, collagenase, hyaluronidase, or a combination thereof. It may include a method of obtaining it.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 DNA 백본 내 포스포디에스테르 연결의 가수분해성 절단을 촉매하여 DNA를 분해하는 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 (DNase)를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 및 적어도 1종의 다른 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제 I이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 데옥시리보뉴클레아제 II이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 소 췌장으로부터의 데옥시리보뉴클레아제 I (시그마(Sigma) D5025 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현되는 소로부터의 재조합 데옥시리보뉴클레아제 I (시그마 D2821 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 재조합 인간 데옥시리보뉴클레아제 I (또한 제넨테크, 인크.로부터 풀모자임(PULMOZYME)으로 상업적으로 입수가능한, 도르나제 알파로도 알려져 있는 rhDNAase I)이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 소 비장으로부터의 데옥시리보뉴클레아제 II (시그마 D8764 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 데옥시리보뉴클레아제는 돼지 비장으로부터의 데옥시리보뉴클레아제 II (시그마 D4138 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 임의의 상기 데옥시리보뉴클레아제는 종양 소화물에 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 데옥시리보뉴클레아제의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 5,783,433; 6,391,607; 7,407,785; 및 7,297,526, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/108244 A1 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using any enzyme that degrades DNA by catalyzing hydrolytic cleavage of phosphodiester linkages in the DNA backbone. In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using deoxyribonuclease (DNase). In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using a deoxyribonuclease and at least one other enzyme. In one embodiment, the deoxyribonuclease is deoxyribonuclease I. In one embodiment, the deoxyribonuclease is deoxyribonuclease II. In one embodiment, the deoxyribonuclease is deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Sigma D5025 or equivalent). In one embodiment, the deoxyribonuclease is recombinant bovine deoxyribonuclease I (Sigma D2821 or equivalent) expressed in Pichia pastoris . In one embodiment, the deoxyribonuclease is recombinant human deoxyribonuclease I (rhDNAase I, also known as Dornase alpha, commercially available as PULMOZYME from Genentech, Inc.) am. In one embodiment, the deoxyribonuclease is deoxyribonuclease II from bovine spleen (Sigma D8764 or equivalent). In one embodiment, the deoxyribonuclease is deoxyribonuclease II from porcine spleen (Sigma D4138 or equivalent). In one embodiment, any of the above deoxyribonucleases are present in the tumor digest. The preparation and properties of deoxyribonucleases suitable for use in the present invention are described in U.S. Pat. No. 5,783,433; 6,391,607; 7,407,785; and 7,297,526, and International Patent Application Publication No. WO 2016/108244 A1, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 콜라겐 내 펩티드 연결의 절단을 촉매하여 콜라겐을 분해하는 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 콜라게나제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 콜라게나제 및 적어도 1종의 다른 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 콜라게나제는 클로스트리디움 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)으로부터의 콜라게나제이다. 한 실시양태에서, 콜라게나제는 클로스트리디오펩티다제 A이다. 한 실시양태에서, 콜라게나제는 콜라게나제 I이다. 한 실시양태에서, 콜라게나제는 콜라게나제 II이다. 한 실시양태에서, 콜라게나제는 클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터의 콜라게나제 (시그마 C5138 또는 등가물)이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 콜라게나제의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 3,201,325; 3,705,083; 3,821,364; 5,177,017; 5,422,261; 5,989,888; 9,211,316 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using any enzyme that degrades collagen by catalyzing the cleavage of peptide linkages in collagen. In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using collagenase. In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using collagenase and at least one other enzyme. In one embodiment, the collagenase is collagenase from Clostridium histolyticum . In one embodiment, the collagenase is clostridiopeptidase A. In one embodiment, the collagenase is collagenase I. In one embodiment, the collagenase is collagenase II. In one embodiment, the collagenase is collagenase from Clostridium histolyticum (Sigma C5138 or equivalent). The preparation and properties of collagenase suitable for use in the present invention are described in U.S. Pat. No. 3,201,325; 3,705,083; 3,821,364; 5,177,017; 5,422,261; 5,989,888; No. 9,211,316, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 히알루론산의 분해를 촉매하는 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 히알루로니다제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 히알루로노글루코시다제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 소 고환으로부터의 히알루로니다제 유형 I (시그마 H3506 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 양 고환으로부터의 히알루로니다제 유형 II (시그마 H2126 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 히알루로니다제 유형 III이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 소 고환으로부터의 히알루로니다제 유형 IV (유형 IV-S) (시그마 H3884 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 양 고환으로부터의 히알루로니다제 유형 V (시그마 H6254 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 소 고환으로부터의 히알루로니다제 유형 VIII (시그마 H3757 또는 등가물)이다. 한 실시양태에서, 히알루로니다제는 재조합 인간 히알루로니다제 (할로자임, 인크.(Halozyme, Inc.)로부터 힐레넥스(HYLENEX)로 상업적으로 입수가능함)이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 히알루로니다제의 제조 및 특성은 미국 특허 번호 4,820,516; 5,593,877; 6,057,110; 6,123,938; 7,767,429; 8,202,517; 8,431,124 및 8,431,380 (이들 각각의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using any enzyme that catalyzes the breakdown of hyaluronic acid. In one embodiment, the method of obtaining rTIL includes digesting the tumor using hyaluronidase. In one embodiment, the method of obtaining rTIL includes digesting the tumor using hyaluronoglucosidase. In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type I from bovine testis (Sigma H3506 or equivalent). In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type II (Sigma H2126 or equivalent) from sheep testes. In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type III. In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type IV (Type IV-S) from bovine testis (Sigma H3884 or equivalent). In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type V (Sigma H6254 or equivalent) from sheep testes. In one embodiment, the hyaluronidase is hyaluronidase type VIII from bovine testis (Sigma H3757 or equivalent). In one embodiment, hyaluronidase is recombinant human hyaluronidase (commercially available as HYLENEX from Halozyme, Inc.). The preparation and properties of hyaluronidase suitable for use in the present invention are described in U.S. Pat. No. 4,820,516; 5,593,877; 6,057,110; 6,123,938; 7,767,429; 8,202,517; 8,431,124 and 8,431,380, the disclosures of each of which are incorporated herein by reference.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 및 히알루로니다제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 및 콜라게나제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 히알루로니다제 및 콜라게나제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제, 히알루로니다제 및 콜라게나제를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다.In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using deoxyribonuclease and hyaluronidase. In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using deoxyribonuclease and collagenase. In one embodiment, the method of obtaining rTIL includes digesting the tumor using hyaluronidase and collagenase. In one embodiment, a method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using deoxyribonuclease, hyaluronidase, and collagenase.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 및 히알루로니다제 및 적어도 1종의 추가의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제 및 콜라게나제 및 적어도 1종의 추가의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 히알루로니다제 및 콜라게나제 및 적어도 1종의 추가의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 데옥시리보뉴클레아제, 히알루로니다제 및 콜라게나제 및 적어도 1종의 추가의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함한다. 임의의 상기 실시양태에서, 추가의 효소는 카세이나제, 클로스트리파인, 트립신 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.In one embodiment, the method of obtaining rTIL comprises digesting the tumor using deoxyribonuclease and hyaluronidase and at least one additional enzyme. In one embodiment, the method of obtaining rTILs includes digesting the tumor using deoxyribonuclease and collagenase and at least one additional enzyme. In one embodiment, the method of obtaining rTIL comprises digesting the tumor using hyaluronidase and collagenase and at least one additional enzyme. In one embodiment, the method of obtaining rTIL comprises digesting the tumor using deoxyribonuclease, hyaluronidase, and collagenase and at least one additional enzyme. In any of the above embodiments, the additional enzyme is selected from the group consisting of caseinase, clostripain, trypsin, and combinations thereof.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하고, 소화 전, 소화 동안 또는 소화 후에 종양을 기계적으로 파괴 또는 단편화하는 단계를 추가로 포함한다.In one embodiment, the method of obtaining rTILs comprises digesting the tumor using any of the enzymes described above, and further comprising mechanically disrupting or fragmenting the tumor before, during, or after digestion. .

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 15분, 30분, 45분, 1시간, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 및 48시간으로 이루어진 군으로부터 선택된 기간에 걸쳐 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the digestion is 15 minutes, 30 minutes, 45 minutes, 1 hour, 90 minutes, 2 hours, 3 hours. performed over a period of time selected from the group consisting of 4 hours, 5 hours, 6 hours, 7 hours, 8 hours, 9 hours, 10 hours, 11 hours, 12 hours, 18 hours, 24 hours, 36 hours, and 48 hours. do.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 90분, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 36시간, 및 약 48시간으로 이루어진 군으로부터 선택된 기간에 걸쳐 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the digestion takes about 15 minutes, about 30 minutes, about 45 minutes, about 1 hour, about 90 minutes. , about 2 hours, about 3 hours, about 4 hours, about 5 hours, about 6 hours, about 7 hours, about 8 hours, about 9 hours, about 10 hours, about 11 hours, about 12 hours, about 18 hours, about It is performed over a period of time selected from the group consisting of 24 hours, about 36 hours, and about 48 hours.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 15분 미만, 30분 미만, 45분 미만, 1시간 미만, 90분 미만, 2시간 미만, 3시간 미만, 4시간 미만, 5시간 미만, 6시간 미만, 7시간 미만, 8시간 미만, 9시간 미만, 10시간 미만, 11시간 미만, 12시간 미만, 18시간 미만, 24시간 미만, 36시간 미만, 및 48시간 미만으로 이루어진 군으로부터 선택된 기간에 걸쳐 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the digestion takes less than 15 minutes, less than 30 minutes, less than 45 minutes, less than 1 hour, less than 90 minutes. , less than 2 hours, less than 3 hours, less than 4 hours, less than 5 hours, less than 6 hours, less than 7 hours, less than 8 hours, less than 9 hours, less than 10 hours, less than 11 hours, less than 12 hours, less than 18 hours, 24 It is performed over a period of time selected from the group consisting of less than an hour, less than 36 hours, and less than 48 hours.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 15분 초과, 30분 초과, 45분 초과, 1시간 초과, 90분 초과, 2시간 초과, 3시간 초과, 4시간 초과, 5시간 초과, 6시간 초과, 7시간 초과, 8시간 초과, 9시간 초과, 10시간 초과, 11시간 초과, 12시간 초과, 18시간 초과, 24시간 초과, 36시간 초과, 및 48시간 초과로 이루어진 군으로부터 선택된 기간에 걸쳐 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the digestion is for more than 15 minutes, more than 30 minutes, more than 45 minutes, more than 1 hour, more than 90 minutes. , more than 2 hours, more than 3 hours, more than 4 hours, more than 5 hours, more than 6 hours, more than 7 hours, more than 8 hours, more than 9 hours, more than 10 hours, more than 11 hours, more than 12 hours, more than 18 hours, 24 It is performed over a period of time selected from the group consisting of over time, over 36 hours, and over 48 hours.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 30분 내지 1시간, 1시간 내지 2시간, 2시간 내지 3시간, 3시간 내지 4시간, 4시간 내지 5시간, 5시간 내지 6시간, 6시간 내지 12시간, 12시간 내지 18시간, 18시간 내지 24시간, 및 24시간 내지 48시간으로 이루어진 군으로부터 선택된 기간에 걸쳐 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the digestion is 30 minutes to 1 hour, 1 hour to 2 hours, 2 hours to 3 hours, 3 conducted over a period of time selected from the group consisting of 4 hours to 4 hours, 4 hours to 5 hours, 5 hours to 6 hours, 6 hours to 12 hours, 12 hours to 18 hours, 18 hours to 24 hours, and 24 hours to 48 hours. do.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 및 약 80℃로 이루어진 군으로부터 선택된 온도에서 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein digestion is performed at about 20°C, about 25°C, about 30°C, about 35°C, about 40°C. , about 45°C, about 50°C, about 55°C, about 60°C, about 65°C, about 70°C, about 75°C, and about 80°C.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화는 20℃ 내지 25℃, 25℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 35℃, 35℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 45℃, 45℃ 내지 50℃, 50℃ 내지 약 55℃, 55℃ 내지 60℃, 60℃ 내지 65℃, 65℃ 내지 70℃, 70℃ 내지 75℃, 및 75℃ 내지 80℃로 이루어진 군으로부터 선택된 온도에서 수행한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein digestion is performed at 20° C. to 25° C., 25° C. to 30° C., 30° C. to 35° C., 35° C. 40°C to 40°C, 40°C to 45°C, 45°C to 50°C, 50°C to about 55°C, 55°C to 60°C, 60°C to 65°C, 65°C to 70°C, 70°C to 75°C, and 75°C. It is carried out at a temperature selected from the group consisting of ℃ to 80℃.

한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화의 시간 및 온도는 종양 잔유물 (사전-REP 후)이 소화되는 경우 각각 감소한다. 한 실시양태에서, rTIL을 수득하는 방법은 상기 기재된 임의의 효소를 사용하여 종양을 소화시키는 단계를 포함하며, 여기서 소화의 시간 및 온도는 전체 종양 단편 (사전-REP 부재)이 소화되는 경우 각각 증가한다.In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the time and temperature of digestion are each reduced as tumor remnants (after pre-REP) are digested. . In one embodiment, a method of obtaining rTILs comprises digesting a tumor using any of the enzymes described above, wherein the time and temperature of digestion are each increased when the entire tumor fragment (without pre-REP) is digested. do.

rTIL 대 eTIL 비를 조정하는 방법How to adjust rTIL to eTIL ratio

한 실시양태에서, 본원에 기재된 암의 치료에 사용하기 위한 치료 TIL 생성물이 바람직한 rTIL 대 eTIL 비를 함유할 수 있도록, eTIL에 대한 rTIL의 농도를 본원에 기재된 바와 같은 임의의 확장 및 소화 단계 (사전-REP 포함)를 사용하여 조정 또는 제어할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 eTIL을 eTIL과 rTIL의 혼합물로부터 제거하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 rTIL을 eTIL과 rTIL의 혼합물로부터 제거하는 방법을 제공한다.In one embodiment, the concentration of rTIL relative to eTIL is adjusted to allow the therapeutic TIL product for use in the treatment of cancer described herein to contain the desired rTIL to eTIL ratio following any expansion and digestion steps as described herein (prior to -REP included) can be used to adjust or control. In one embodiment, the invention provides a method of removing eTIL from a mixture of eTIL and rTIL. In one embodiment, the invention provides a method of removing rTIL from a mixture of eTIL and rTIL.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, eTIL 및/또는 rTIL은 초기 확장 단계 전에, 제1 확장 단계 (예를 들어, 사전-REP)에서, 및/또는 제2 확장 단계 (예를 들어, REP)에서 배양물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, eTIL은 본원에 기재된 배양 또는 확장 단계에 따라 1, 2, 3회 또는 그 초과의 확장을 통해 개별적으로 배양될 수 있고, 선택된 rTIL 대 eTIL 비로 rTIL 및 eTIL의 집단에 첨가될 수 있다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, rTIL은 본원에 기재된 배양 또는 확장 단계에 따라 1, 2, 3회 또는 그 초과의 확장을 통해 개별적으로 배양될 수 있고, 선택된 rTIL 대 eTIL 비의 rTIL과 eTIL의 혼합물을 제공하도록 eTIL의 집단에 첨가될 수 있다.In some embodiments of the methods of the invention, eTILs and/or rTILs are administered prior to the initial expansion step, in a first expansion step (e.g., pre-REP), and/or in a second expansion step (e.g., REP). It can be added to the culture. In some embodiments of the methods of the invention, eTILs can be cultured individually through 1, 2, 3 or more expansions according to the culture or expansion steps described herein, and the rTILs and eTILs are grown at a selected rTIL to eTIL ratio. Can be added to the group. In some embodiments of the methods of the invention, rTILs can be cultured individually through 1, 2, 3 or more expansions according to the culture or expansion steps described herein, and the rTILs and eTILs at a selected rTIL to eTIL ratio. can be added to the population of eTIL to provide a mixture of

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 eTIL은 생성된 rTIL/eTIL 혼합물에서 선택된 rTIL 대 eTIL 비를 제공하도록 rTIL의 집단에 첨가될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 따라 제조된 rTIL은 생성된 rTIL/eTIL 혼합물에서 선택된 rTIL 대 eTIL 비를 제공하도록 eTIL의 집단에 첨가될 수 있다.In one embodiment, eTILs prepared according to the methods described herein can be added to a population of rTILs to provide a selected rTIL to eTIL ratio in the resulting rTIL/eTIL mixture. In one embodiment, rTILs prepared according to the methods described herein can be added to a population of eTILs to provide a selected rTIL to eTIL ratio in the resulting rTIL/eTIL mixture.

한 실시양태에서, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 치료는 환자에게 치료 유효량의 TIL을 전달하는 것을 포함하고, 여기서 TIL 중 rTIL 대 eTIL의 비 (예를 들어, 선택된 rTIL 대 eTIL 비)는 약 0:100, 약 1:99, 약 5:95, 약 10:90, 약 15:85, 약 20:80, 약 25:75, 약 30:70, 약 35:65, 약 40:60, 약 45:55, 약 50:50, 약 55:45, 약 60:40, 약 65:35, 약 70:30, 약 75:25, 약 80:20, 약 85:15, 약 90:10, 약 95:5, 약 99:1, 및 약 100:0 rTIL 대 eTIL로 이루어진 군으로부터 선택된다.In one embodiment, the invention provides a method of treating cancer, wherein the treatment comprises delivering a therapeutically effective amount of a TIL to a patient, wherein the ratio of rTIL to eTIL in the TIL (e.g., a selected rTIL to eTIL B) is about 0:100, about 1:99, about 5:95, about 10:90, about 15:85, about 20:80, about 25:75, about 30:70, about 35:65, about 40 :60, about 45:55, about 50:50, about 55:45, about 60:40, about 65:35, about 70:30, about 75:25, about 80:20, about 85:15, about 90 :10, about 95:5, about 99:1, and about 100:0 rTIL to eTIL.

한 실시양태에서, rTIL 대 eTIL 비는 통상의 기술자에 의해 필요에 따라 eTIL에 비해 rTIL을 풍부화시키거나 감소시키는데 사용될 수 있는 선택 방법을 사용하여 조정된다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1 및 CTLA-4를 포함한 소진 마커의 결여를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 증진된 CD69 발현을 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 우수한 미토콘드리아 질량을 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 세포 표면 단백질의 하위세트를 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 표현형을 기반으로 한다. 한 실시양태에서, 선택 방법은 기능을 기반으로 한다.In one embodiment, the rTIL to eTIL ratio is adjusted using selection methods that can be used by those skilled in the art to enrich or reduce rTIL relative to eTIL as needed. In one embodiment, the selection method is based on the lack of exhaustion markers including TIM3, LAG3, TIGIT, PD-1, and CTLA-4. In one embodiment, the selection method is based on enhanced CD69 expression. In one embodiment, the selection method is based on superior mitochondrial mass. In one embodiment, the selection method is based on a subset of cell surface proteins. In one embodiment, the selection method is based on phenotype. In one embodiment, the selection method is based on function.

한 실시양태에서, rTIL 대 eTIL 비는 바람직한 비가 얻어질 때까지 동일한 세포 배양 배지에서 rTIL 및 eTIL을 공동-배양함으로써 조정된다. 한 실시양태에서, rTIL 대 eTIL 비는 바람직한 비가 얻어질 때까지, 확장 동안 상이한 시점에서 세포 배양 배지에 rTIL 또는 eTIL을 첨가하는 것을 포함하여, 동일한 세포 배양 배지에서 rTIL 및 eTIL을 공동-배양함으로써 조정된다. 한 실시양태에서, rTIL 성장은 IL-4, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21을 포함한, IL-2 이외의 시토카인의 첨가에 의해 세포 배양 배지에서 우선적으로 확장된다.In one embodiment, the rTIL to eTIL ratio is adjusted by co-culturing rTIL and eTIL in the same cell culture medium until the desired ratio is obtained. In one embodiment, the rTIL to eTIL ratio is adjusted by co-culturing rTIL and eTIL in the same cell culture medium, including adding rTIL or eTIL to the cell culture medium at different time points during expansion, until the desired ratio is obtained. do. In one embodiment, rTIL growth is preferentially expanded in cell culture medium by the addition of cytokines other than IL-2, including IL-4, IL-7, IL-15, and/or IL-21.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제공된 rTIL 대 eTIL의 비 (예를 들어, 선택된 rTIL 대 eTIL 비)는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% rTIL 대 eTIL일 수 있다.In one embodiment, the ratio of rTIL to eTIL provided by the methods described herein (e.g., the selected rTIL to eTIL ratio) is at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. , 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24 %, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57% , 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, It may be 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9% rTIL to eTIL.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제공된 rTIL 대 eTIL의 비 (예를 들어, 선택된 rTIL 대 eTIL 비)는 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% rTIL 대 eTIL일 수 있다.In one embodiment, the ratio of rTIL to eTIL (e.g., a selected rTIL to eTIL ratio) provided by a method described herein is at most 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. , 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24 %, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57% , 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, It may be 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9% rTIL to eTIL.

한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제공된 rTIL 대 eTIL의 비 (예를 들어, 선택된 rTIL 대 eTIL 비)는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% rTIL 대 eTIL일 수 있다.In one embodiment, the ratio of rTIL to eTIL (e.g., a selected rTIL to eTIL ratio) provided by a method described herein is about 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. , 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24 %, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57% , 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74 %, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, It may be 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, or 99.9% rTIL to eTIL.

암 및 다른 질환을 치료하는 방법How to Treat Cancer and Other Diseases

본원에 기재된 rTIL 및 rTIL과 eTIL의 조합은 인간에서 질환을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들은 과다증식성 장애를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 암이다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 고형 종양 암이다. 일부 실시양태에서, 고형 종양 암은 흑색종, 이중-불응성 흑색종 (즉, 화학요법 및 체크포인트 차단을 포함한 적어도 2종의 선행 치료에 대해 불응성인 흑색종), 난소암, 자궁경부암, 비소세포 폐암 (NSCLC), 폐암, 방광암, 유방암, 인간 유두종 바이러스에 의해 야기된 암, 두경부암, 신암, 신세포 암종 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 과다증식성 장애는 혈액 악성종양 (또는 액상 종양 암)이다. 일부 실시양태에서, 혈액 악성종양은 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 미만성 대 B 세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 rTIL 및 rTIL과 eTIL의 조합은 또한 본원에 기재된 바와 같은 장애를 치료하는데 및 하기 단락에서 사용될 수 있다.The rTILs and combinations of rTILs and eTILs described herein can be used in methods of treating disease in humans. In one embodiment, they are for use in treating hyperproliferative disorders. In some embodiments, the hyperproliferative disorder is cancer. In some embodiments, the hyperproliferative disorder is a solid tumor cancer. In some embodiments, the solid tumor cancer is melanoma, double-refractory melanoma (i.e., melanoma that is refractory to at least two prior treatments, including chemotherapy and checkpoint blockade), ovarian cancer, cervical cancer, arsenic cancer, It is selected from the group consisting of NSCLC, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, cancer caused by human papilloma virus, head and neck cancer, renal cancer, renal cell carcinoma, and sarcoma. In some embodiments, the hyperproliferative disorder is a hematological malignancy (or liquid tumor cancer). In some embodiments, the hematological malignancy is a group consisting of acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia, acute lymphoblastic leukemia, diffuse large B-cell lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, Hodgkin's lymphoma, follicular lymphoma, and mantle cell lymphoma. is selected from The rTILs and combinations of rTILs and eTILs described herein can also be used to treat disorders as described herein and in the paragraphs below.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

본원에 기재된 방법의 일부 실시양태에서, 적어도 복수의 eTIL을 제거하는 단계는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 100%의 eTIL을 제거하는 것을 포함한다.In some embodiments of the methods described herein, removing at least a plurality of eTILs includes removing at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27% , 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44 %, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77% , 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, or 100% of the eTIL.

나타낸 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 관리하는데 있어서 본원에 기재된 화합물 및 화합물의 조합의 효능은 인간 질환의 치료에 대한 안내를 제공하는, 관련 기술분야에 공지된 다양한 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 예를 들어, 난소암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; 및 Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12]에 기재되어 있다. 췌장암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은 문헌 [Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294]에 기재되어 있다. 유방암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212]에 기재되어 있다. 흑색종에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664]에 기재되어 있다. 폐암에 대한 치료 효능을 결정하기 위한 모델은, 예를 들어 문헌 [Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; 및 Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32]에 기재되어 있다.The efficacy of the compounds and combinations of compounds described herein in treating, preventing and/or managing an indicated disease or disorder can be tested using a variety of models known in the art to provide guidance for the treatment of human diseases. there is. For example, models for determining treatment efficacy for ovarian cancer are described, for example, in Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; and Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12]. A model for determining treatment efficacy for pancreatic cancer is described in Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294]. Models for determining treatment efficacy for breast cancer are described, for example, in Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212]. Models for determining treatment efficacy for melanoma are described, for example, in Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853-859]. Models for determining treatment efficacy for lung cancer are described, for example, in Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Models for determining treatment efficacy for lung cancer are described, for example, in Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; and Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32].

IL-2의 공-투여Co-administration of IL-2

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(a) 본원에 기재된 방법에 방법에 따라 암의 치료를 필요로 하는 환자로부터 절제된 종양으로부터 rTIL을 수득하는 단계;(a) obtaining rTILs from a tumor resected from a patient in need of treatment for cancer according to the methods described herein;

(b) 환자에게 rTIL을 투여하기 전에 환자를 비-골수절제 림프구고갈 요법으로 치료하는 단계;(b) treating the patient with a non-myeloablative lymphodepleting therapy prior to administering the rTIL to the patient;

(c) 환자에게 치료 유효량의 rTIL을 투여하는 단계; 및(c) administering a therapeutically effective amount of rTIL to the patient; and

(d) 환자에게 rTIL을 투여한 다음 날에 시작하여 환자를 IL-2 요법으로 치료하는 단계(d) treating the patient with IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient.

를 포함하는, 암의 치료를 필요로 하는 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.Provides a method of treating cancer in a patient requiring treatment of cancer, including.

한 실시양태에서, IL-2 요법은 고용량 IL-2 요법을 포함하며, 여기서 고용량 IL-2 요법은 치료상 유효한 부분의 제3 TIL 집단을 투여한 다음 날에 시작하여 정맥내로 투여되는 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하고, 여기서 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회 용량에 대해, 내성까지 8시간마다 15분 볼루스 정맥내 주입을 사용하여 600,000 또는 720,000 IU/kg (환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 9일의 휴약 후, 이러한 스케줄은 총 최대 28회 용량을 위해, 또 다른 14회 용량에 대해 반복될 수 있다.In one embodiment, the IL-2 therapy comprises high-dose IL-2 therapy, wherein the high-dose IL-2 therapy is aldesleukin administered intravenously starting the day after administration of the therapeutically effective portion of the third TIL population. or a biosimilar or variant thereof, wherein aldesleukin or a biosimilar or variant thereof is administered at 600,000 or 720,000 IU/using a 15-minute bolus intravenous infusion every 8 hours until tolerated, for up to 14 doses. It is administered in doses of kg (patient body mass). After a 9-day washout, this schedule can be repeated for another 14 doses, for a total of up to 28 doses.

한 실시양태에서, IL-2 요법은 고용량 IL-2 요법을 포함하며, 여기서 고용량 IL-2 요법은 치료상 유효한 부분의 제3 TIL 집단을 투여한 다음 날에 시작하여 정맥내로 투여되는 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체를 포함하고, 여기서 알데스류킨 또는 그의 바이오시밀러 또는 변이체는 최대 14회 용량에 대해, 내성까지 8시간마다 15분 볼루스 정맥내 주입을 사용하여 0.037 mg/kg 또는 0.044 mg/kg (환자 체질량)의 용량으로 투여된다. 9일의 휴약 후, 이러한 스케줄은 총 최대 28회 용량을 위해, 또 다른 14회 용량에 대해 반복될 수 있다.In one embodiment, the IL-2 therapy comprises high-dose IL-2 therapy, wherein the high-dose IL-2 therapy is aldesleukin administered intravenously starting the day after administration of the therapeutically effective portion of the third TIL population. or a biosimilar or variant thereof, wherein aldesleukin or a biosimilar or variant thereof is administered at 0.037 mg/kg or It is administered at a dose of 0.044 mg/kg (patient body mass). After a 9-day washout, this schedule can be repeated for another 14 doses, for a total of up to 28 doses.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

한 실시양태에서, IL-2 요법은 점강 IL-2 요법을 포함한다. 점강 IL-2 요법은 문헌 [O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 및 Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9] (이의 개시내용은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되었다. 한 실시양태에서, 점강 IL-2 요법은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 4.5 x 10⁶ IU/m²를 포함한다. 이러한 치료 주기는 최대 4 주기 동안 28일마다 반복될 수 있다. 한 실시양태에서, 점강 IL-2 요법은 제1일에 18,000,000 IU/m², 제2일에 9,000,000 IU/m², 및 제3일 및 제4일에 4,500,000 IU/m²를 포함한다.In one embodiment, the IL-2 therapy comprises intravenous IL-2 therapy. Intravenous IL-2 therapy is described in O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 and Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9, the disclosures of which are incorporated herein by reference. In one embodiment, the intravenous IL-2 therapy is 18 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 6 hours, followed by 18 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 12 hours, then 24 hours. 18 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 72 hours, followed by 4.5 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 72 hours. This treatment cycle can be repeated every 28 days for up to 4 cycles. In one embodiment, the intravenous IL-2 regimen comprises 18,000,000 IU/m ² on day 1, 9,000,000 IU/m ² on day 2, and 4,500,000 IU/m ² on days 3 and 4.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(i) 환자에게 rTIL을 투여한 다음 날에 시작하여 환자를 점강 IL-2 요법으로 치료하는 단계를 포함하며,(i) treating the patient with intravenous IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient,

여기서 점강 IL-2 요법은 6시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 12시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 24시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 18 x 10⁶ IU/m², 이어서 72시간에 걸쳐 정맥내로 투여되는 4.5 x 10⁶ IU/m²를 포함하고, 이는 최대 4 주기 동안 28일마다 반복되는 것인,Here, the intravenous IL-2 therapy is 18 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 6 hours, followed by 18 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 12 hours, followed by 24 hours. 18 x 10 ⁶ IU/m ² , followed by 4.5 x 10 ⁶ IU/m ² administered intravenously over 72 hours, repeated every 28 days for up to 4 cycles.

한 실시양태에서, IL-2 요법은 PEG화 알데스류킨을 포함한, PEG화 IL-2의 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, IL-2 요법은 1, 2, 4, 6, 7, 14 또는 21일마다 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로의 PEG화 IL-2의 투여를 포함한다.In one embodiment, IL-2 therapy comprises administration of PEGylated IL-2, including PEGylated aldesleukin. In one embodiment, IL-2 therapy comprises administration of PEGylated IL-2 at a dose of 0.10 mg/day to 50 mg/day every 1, 2, 4, 6, 7, 14, or 21 days.

한 실시양태에서, 본 발명은In one embodiment, the invention

(b) 종양 조직을 단편화하는 단계;(b) fragmenting the tumor tissue;

(i) 환자에게 rTIL을 투여한 다음 날에 시작하여 환자를 PEG화 IL-2 요법으로 치료하는 단계를 포함하며,(i) treating the patient with PEGylated IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient,

여기서 PEG화 IL-2 요법은 1, 2, 4, 6, 7, 14 또는 21일마다 0.10 mg/일 내지 50 mg/일의 용량으로의 PEG화 IL-2의 투여를 포함하는 것인,wherein the PEGylated IL-2 therapy comprises administration of PEGylated IL-2 at a dose of 0.10 mg/day to 50 mg/day every 1, 2, 4, 6, 7, 14 or 21 days.

화학요법에 의한 비-골수절제 림프구고갈Non-myeloablative lymphodepletion by chemotherapy

한 실시양태에서, 본 발명은 암을 rTIL의 집단으로 치료하는 방법을 포함하며, 여기서 환자는 본 발명에 따른 rTIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료된다. 일부 실시양태에서, rTIL의 집단은 eTIL의 집단과 함께 제공될 수 있으며, 여기서 환자는 본 발명에 따른 rTIL 및 eTIL의 주입 전에 비-골수절제 화학요법으로 사전-치료된다. 한 실시양태에서, 비-골수절제 화학요법은 2일 (rTIL 주입 전 제27일 및 제26일) 동안 시클로포스파미드 60 mg/kg/d 및 5일 (rTIL 주입 전 제27일 내지 제23일) 동안 플루다라빈 25 mg/m²/d이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 비-골수절제 화학요법 및 rTIL 주입 (제0일) 후에, 환자는 생리학적 내성까지 8시간마다 720,000 IU/kg으로 정맥내로 IL-2의 정맥내 주입을 받는다.In one embodiment, the invention comprises a method of treating cancer with a population of rTILs, wherein the patient is pre-treated with non-myeloablative chemotherapy prior to injection of rTILs according to the invention. In some embodiments, a population of rTILs may be provided together with a population of eTILs, where the patient is pre-treated with non-myeloablative chemotherapy prior to injection of rTILs and eTILs according to the invention. In one embodiment, the non-myeloablative chemotherapy is administered with cyclophosphamide 60 mg/kg/d for 2 days (days 27 and 26 prior to rTIL injection) and 5 days (days 27 to 23 prior to rTIL injection). days), fludarabine is 25 mg/m ² /d. In one embodiment, after non-myeloablative chemotherapy according to the invention and rTIL infusion (day 0), the patient receives an intravenous infusion of IL-2 at 720,000 IU/kg intravenously every 8 hours until physiological tolerance. .

실험적 소견은 종양-특이적 T 림프구의 입양 전달 전 림프구고갈이 조절 T 세포 및 면역계의 경쟁 요소의 제거 ("시토카인 싱크")에 의해 치료 효능을 증진시키는데 주요 역할을 하는 것으로 나타낸다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태는 본 발명의 rTIL의 도입 전에 환자에 대해 림프구고갈 단계 (때때로 또한 "면역억제 조건화"로 지칭됨)를 이용한다.Experimental findings indicate that lymphodepletion prior to adoptive transfer of tumor-specific T lymphocytes plays a major role in enhancing therapeutic efficacy by eliminating regulatory T cells and competing elements of the immune system (“cytokine sink”). Accordingly, some embodiments of the invention utilize a lymphodepletion step (sometimes also referred to as “immunosuppressive conditioning”) to the patient prior to introduction of the rTILs of the invention.

일반적으로, 림프구고갈은 플루다라빈 또는 시클로포스파미드 (활성 형태는 마포스파미드로 지칭됨) 및 그의 조합의 투여를 사용하여 달성된다. 이러한 방법은 문헌 [Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, 및 Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357] (이들 모두는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.Typically, lymphodepletion is achieved using the administration of fludarabine or cyclophosphamide (the active form is referred to as maphosphamide) and combinations thereof. This method is described in Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, and Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357, all of which are incorporated herein by reference in their entirety.

일부 실시양태에서, 플루다라빈은 0.5 μg/mL -10 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 1 μg/mL 플루다라빈의 농도로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈은 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일¸ 25 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 35 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 또는 45 mg/kg/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 35 mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 플루다라빈 치료는 25 mg/kg/일로 4-5일 동안 투여된다.In some embodiments, fludarabine is administered at a concentration of 0.5 μg/mL -10 μg/mL fludarabine. In some embodiments, fludarabine is administered at a concentration of 1 μg/mL fludarabine. In some embodiments, fludarabine treatment is administered for 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7 days or more. In some embodiments, fludarabine is administered at 10 mg/kg/day, 15 mg/kg/day, 20 mg/kg/day, 25 mg/kg/day, 30 mg/kg/day, 35 mg/kg/day. , 40 mg/kg/day, or 45 mg/kg/day. In some embodiments, fludarabine treatment is administered at 35 mg/kg/day for 2-7 days. In some embodiments, fludarabine treatment is administered at 35 mg/kg/day for 4-5 days. In some embodiments, fludarabine treatment is administered at 25 mg/kg/day for 4-5 days.

일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 0.5 μg/mL -10 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드의 활성 형태인 마포스파미드는 시클로포스파미드의 투여에 의해 1 μg/mL의 농도로 수득된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 또는 그 초과 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 100 mg/m²/일, 150 mg/m²/일, 175 mg/m²/일¸ 200 mg/m²/일, 225 mg/m²/일, 250 mg/m²/일, 275 mg/m²/일, 또는 300 mg/m²/일의 투여량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드는 정맥내로 (i.v.) 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 35 mg/kg/일로 2-7일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250 mg/m²/일 i.v.로 4-5일 동안 투여된다. 일부 실시양태에서, 시클로포스파미드 치료는 250 mg/m²/일 i.v.로 4일 동안 투여된다.In some embodiments, maphosphamide, the active form of cyclophosphamide, is obtained by administration of cyclophosphamide at a concentration of 0.5 μg/mL-10 μg/mL. In some embodiments, maphosphamide, the active form of cyclophosphamide, is obtained at a concentration of 1 μg/mL by administration of cyclophosphamide. In some embodiments, cyclophosphamide treatment is administered for 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, or 7 days or more. In some embodiments, cyclophosphamide is administered at 100 mg/m ² /day, 150 mg/m ² /day, 175 mg/m ² /day, 200 mg/m ² /day, 225 mg/m ^{2 /day, 250 mg/m 2} /day. It is administered at a dosage of mg/m ² /day, 275 mg/m ² /day, or 300 mg/m ² /day. In some embodiments, cyclophosphamide is administered intravenously (iv). In some embodiments, cyclophosphamide treatment is administered at 35 mg/kg/day for 2-7 days. In some embodiments, cyclophosphamide treatment is administered at 250 mg/m ² /day iv for 4-5 days. In some embodiments, cyclophosphamide treatment is administered at 250 mg/m ² /day iv for 4 days.

일부 실시양태에서, 림프구고갈은 환자에게 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 함께 투여함으로써 수행된다. 일부 실시양태에서, 4일에 걸쳐 플루다라빈은 25 mg/m²/일 i.v.로 투여되고 시클로포스파미드는 250 mg/m²/일 i.v.로 투여된다.In some embodiments, lymphodepletion is performed by coadministering fludarabine and cyclophosphamide to the patient. In some embodiments, fludarabine is administered at 25 mg/m ² /day iv and cyclophosphamide is administered at 250 mg/m ² /day iv over 4 days.

한 실시양태에서, 림프구고갈은 2일 동안 60 mg/m²/일의 용량으로의 시클로포스파미드의 투여에 이어서 5일 동안 25 mg/m²/일의 용량으로의 플루다라빈의 투여에 의해 수행된다.In one embodiment, lymphodepletion is achieved by administration of cyclophosphamide at a dose of 60 mg/m ² /day for 2 days followed by administration of fludarabine at a dose of 25 mg/m ² /day for 5 days. is carried out by

제약 조성물, 투여량 및 투여 요법Pharmaceutical compositions, dosages and administration regimens

한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 확장된 rTIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 rTIL의 현탁액이다. 본 발명의 방법을 사용하여 확장된 rTIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, rTIL은 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 이는 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.In one embodiment, rTILs expanded using the methods of the invention are administered to a patient as a pharmaceutical composition. In one embodiment, the pharmaceutical composition is a suspension of rTIL in sterile buffer. rTILs expanded using the methods of the invention may be administered by any suitable route as known in the art. Preferably, rTIL is administered as a single intra-arterial or intravenous infusion, which preferably lasts approximately 30 to 60 minutes. Other suitable routes of administration include intraperitoneal, intrathecal and intralymphatic administration.

한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 확장된 rTIL 및 eTIL은 제약 조성물로서 환자에게 투여된다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 멸균 완충제 중 rTIL 및 eTIL의 현탁액이다. 본 발명의 방법을 사용하여 확장된 rTIL 및 eTIL은 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는, rTIL 및 eTIL은 단일 동맥내 또는 정맥내 주입으로서 투여되며, 이는 바람직하게는 대략 30 내지 60분 지속된다. 다른 적합한 투여 경로는 복강내, 척수강내 및 림프내 투여를 포함한다.In one embodiment, rTILs and eTILs expanded using the methods of the invention are administered to a patient as a pharmaceutical composition. In one embodiment, the pharmaceutical composition is a suspension of rTIL and eTIL in sterile buffer. rTILs and eTILs expanded using the methods of the invention may be administered by any suitable route as known in the art. Preferably, rTIL and eTIL are administered as a single intra-arterial or intravenous infusion, which preferably lasts approximately 30 to 60 minutes. Other suitable routes of administration include intraperitoneal, intrathecal and intralymphatic administration.

rTIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 2.3x10¹⁰내지 약 13.7x10¹⁰개 rTIL이 투여되고, 특히 암이 흑색종인 경우, 평균적으로 대략 7.8x10¹⁰개 rTIL이 투여된다. 한 실시양태에서, 약 1.2x10¹⁰내지 약 4.3x10¹⁰개의 rTIL이 투여된다.Any suitable dose of rTIL may be administered. Preferably, about 2.3x10 ¹⁰ to about 13.7x10 ¹⁰ rTILs are administered, with an average of approximately 7.8x10 ¹⁰ rTILs being administered, especially if the cancer is melanoma. In one embodiment, between about 1.2x10 ¹⁰ and about 4.3x10 ¹⁰ rTILs are administered.

rTIL 및 eTIL의 임의의 적합한 용량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 약 2.3x10¹⁰내지 약 13.7x10¹⁰개 rTIL 및 eTIL이 투여되고, 특히 암이 흑색종인 경우, 평균적으로 대략 7.8x10¹⁰개 rTIL 및 eTIL이 투여된다. 한 실시양태에서, 약 1.2x10¹⁰내지 약 4.3x10¹⁰개의 rTIL 및 eTIL이 투여된다.Any suitable dose of rTIL and eTIL may be administered. Preferably, about 2.3x10 ¹⁰ to about 13.7x10 ¹⁰ rTILs and eTILs are administered, particularly when the cancer is melanoma, on average approximately 7.8x10 ¹⁰ rTILs and eTILs are administered. In one embodiment, between about 1.2x10 ¹⁰ and about 4.3x10 ¹⁰ rTILs and eTILs are administered.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 수는 약 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰, 1x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹, 9x10¹¹, 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹², 9x10¹², 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³, 및 9x10¹³개이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 수는 1x10⁶ 내지 5x10⁶, 5x10⁶ 내지 1x10⁷, 1x10⁷ 내지 5x10⁷, 5x10⁷ 내지 1x10⁸, 1x10⁸ 내지 5x10⁸, 5x10⁸ 내지 1x10⁹, 1x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 5x10¹², 및 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 범위이다.In some embodiments, the number of rTILs provided in the pharmaceutical compositions of the invention is about 1x10 ⁶ , 2x10 ⁶ , 3x10 ⁶ , 4x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 6x10 ⁶ , 7x10 ⁶ , 8x10 ⁶ , 9x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 2x10 ⁷ , 3x10 ⁷ , 4x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , 6x10 ⁷ , 7x10 ⁷ , 8x10 ^{7 , 9x10 7} ^, 1x10 ⁸ , 2x10 ⁸ , 3x10 ⁸ , 4x10 ⁸ , 5x10 8 , 6x10 ⁸ , 7x10 ⁸ , 8x10 ⁸ , 9x10 ⁸ , ^1x10 ⁹ , 2x10 ⁹ , 3x10 ⁹ , 4x10 ⁹ , 5x10 ⁹ , 6x10 ⁹ , 7x10 ⁹ , 8x10 ⁹ , 9x10 ⁹ , 1x10 ¹⁰ , 2x10 ¹⁰ , 3x10 10 , 4x10 ¹⁰ , 5x10 ¹⁰ , 6x10 ¹⁰ , 7x10 ¹⁰ , 8x10 ¹⁰ , ^9x10 ¹⁰ , 1x10 ¹¹ , 2x10 ¹¹ , 3x10 ¹¹ , 4x10 ¹¹ , 5x10 ¹¹ , 6x10 11 , 7x10 ¹¹ , 8x10 ¹¹ , 9x10 ¹¹ , 1x10 ¹² , 2x10 ¹² , 3x10 ¹² , 4x10 ¹² , 5x10 ¹² , ^{6x10 12} ^, 7x10 ¹² , There are 8x10 ¹² , 9x10 ¹² , 1x10 ¹³ , 2x10 ¹³ , 3x10 ¹³ , 4x10 ¹³ , 5x10 ¹³ , 6x10 ¹³ , 7x10 ¹³ , 8x10 ¹³ , and 9x10 ¹³ . In one embodiment, the number of rTILs provided in the pharmaceutical composition of the invention is 1x10 ⁶ to 5x10 ⁶ , 5x10 ⁶ to 1x10 ⁷ , 1x10 ⁷ to 5x10 ⁷ , 5x10 ⁷ to 1x10 ^{8 , 1x10 8} ^to 5x10 ⁸ , 5x10 ⁸ to 1x10 ⁹ , 1x10 ⁹ to 5x10 ⁹ , 5x10 ⁹ to 1x10 ¹⁰ , 1x10 ¹⁰ to 5x10 ¹⁰ , 5x10 ¹⁰ to 1x10 ¹¹ , 5x10 ¹¹ to 1x10 ¹² , 1x10 ¹² to 5x10 ¹² , and 5x10 ¹² It ranges from 1x10 to ¹³ pieces.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 수는 약 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰, 1x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹, 9x10¹¹, 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹², 9x10¹², 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³, 및 9x10¹³개이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 수는 1x10⁶ 내지 5x10⁶, 5x10⁶ 내지 1x10⁷, 1x10⁷ 내지 5x10⁷, 5x10⁷ 내지 1x10⁸, 1x10⁸ 내지 5x10⁸, 5x10⁸ 내지 1x10⁹, 1x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 5x10¹², 및 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 범위이다.In some embodiments, the number of rTILs and eTILs provided in the pharmaceutical compositions of the invention is about 1x10 ⁶ , 2x10 ⁶ , 3x10 ⁶ , 4x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 6x10 ⁶ , 7x10 ⁶ , 8x10 ⁶ , 9x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 2x10 ⁷ , 3x10 ⁷ , 4x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , 6x10 ⁷ , 7x10 ⁷ , 8x10 ⁷ , 9x10 ⁷ , 1x10 ⁸ , 2x10 ⁸ , 3x10 ⁸ , 4x10 ⁸ , 5x10 ⁸ , 6x10 ⁸ , 7x 10 ⁸ , 8x10 ⁸ , 9x10 ⁸ , 1x10 ⁹ , 2x10 ⁹ , 3x10 ⁹ , 4x10 ⁹ , 5x10 ⁹ , 6x10 9 , 7x10 ⁹ , 8x10 ⁹ , 9x10 ⁹ , 1x10 ¹⁰ , 2x10 ¹⁰ , 3x10 ¹⁰ , 4x10 ¹⁰ , 5x 10 ¹⁰ , 6x10 ¹⁰ , ^{7x10 10} ^, 8x10 ¹⁰ , 9x10 ¹⁰ , 1x10 ¹¹ , 2x10 ¹¹ , 3x10 11 , 4x10 ¹¹ , 5x10 ¹¹ , 6x10 ^{11 , 7x10 11 , 8x10 11} ^, ^{9x10 11} ^, 1x10 ¹² , ^2x10 ¹² , 3 x10 ^{12 , 4x10 12} ^{, 5x10 12} ^, 6x10 ¹² , 7x10 There are ¹² , 8x10 ¹² , 9x10 ¹² , 1x10 ¹³ , 2x10 ¹³ , 3x10 ¹³ , 4x10 ¹³ , 5x10 ¹³ , 6x10 ¹³ , 7x10 ¹³ , 8x10 ¹³ , and 9x10 ¹³ . In one embodiment, the number of rTILs and eTILs provided in the pharmaceutical composition of the invention is 1x10 ⁶ to 5x10 ⁶ , 5x10 ⁶ to 1x10 ⁷ , 1x10 ⁷ to 5x10 ⁷ , 5x10 ⁷ to 1x10 ^{8 , 1x10 8} ^to 5x10 ⁸ , 5x10 ⁸ to 1x10 ⁹ , 1x10 ⁹ to 5x10 ⁹ , 5x10 ⁹ to 1x10 ¹⁰ , 1x10 10 to ^{5x10 10 , 5x10 10 to 1x10 11 , 5x10 11 to 1x10 12 , 1x10 12 to 5x10 12} ^, ^and ⁵ ^It ^ranges ^from ^{x10 12} ^to 1x10 ¹³ .

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 농도는, 예를 들어 제약 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.In some embodiments, the concentration of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is, for example, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% , 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009 %, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0. 0003%, 0.0002% or Less than 0.0001% w/w, w/v or v/v.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 농도는, 예를 들어 제약 조성물의 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v 또는 v/v 미만이다.In some embodiments, the concentration of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is, for example, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% of the pharmaceutical composition. %, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01% , 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.00 04%, 0.0003%, 0.0002 % or less than 0.0001% w/w, w/v or v/v.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 농도는 제약 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.In some embodiments, the concentration of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% of the pharmaceutical composition. % 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.7 5% , 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 1 0.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009% , 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0 003%, 0.0002% or 0.0001 % w/w, w/v, or v/v is greater.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 농도는 제약 조성물의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% 또는 0.0001% w/w, w/v, 또는 v/v 초과이다.In some embodiments, the concentration of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50% of the pharmaceutical composition. , 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15 %, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10. 50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75 %, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50 %, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004 %, 0.0003%, 0.0002% or greater than 0.0001% w/w, w/v, or v/v.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.In some embodiments, the concentration of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is from about 0.0001% to about 50%, from about 0.001% to about 40%, from about 0.01% to about 30%, from about 0.02% to about 29% of the pharmaceutical composition. , about 0.03% to about 28%, about 0.04% to about 27%, about 0.05% to about 26%, about 0.06% to about 25%, about 0.07% to about 24%, about 0.08% to about 23%, about 0.09% to about 22%, about 0.1% to about 21%, about 0.2% to about 20%, about 0.3% to about 19%, about 0.4% to about 18%, about 0.5% to about 17%, about 0.6% from about 16%, from about 0.7% to about 15%, from about 0.8% to about 14%, from about 0.9% to about 12%, or from about 1% to about 10% w/w, w/v or v/v. .

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.0001% 내지 약 50%, 약 0.001% 내지 약 40%, 약 0.01% 내지 약 30%, 약 0.02% 내지 약 29%, 약 0.03% 내지 약 28%, 약 0.04% 내지 약 27%, 약 0.05% 내지 약 26%, 약 0.06% 내지 약 25%, 약 0.07% 내지 약 24%, 약 0.08% 내지 약 23%, 약 0.09% 내지 약 22%, 약 0.1% 내지 약 21%, 약 0.2% 내지 약 20%, 약 0.3% 내지 약 19%, 약 0.4% 내지 약 18%, 약 0.5% 내지 약 17%, 약 0.6% 내지 약 16%, 약 0.7% 내지 약 15%, 약 0.8% 내지 약 14%, 약 0.9% 내지 약 12% 또는 약 1% 내지 약 10% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.In some embodiments, the concentration of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is from about 0.0001% to about 50%, from about 0.001% to about 40%, from about 0.01% to about 30%, from about 0.02% to about 0.02% of the pharmaceutical composition. 29%, about 0.03% to about 28%, about 0.04% to about 27%, about 0.05% to about 26%, about 0.06% to about 25%, about 0.07% to about 24%, about 0.08% to about 23% , about 0.09% to about 22%, about 0.1% to about 21%, about 0.2% to about 20%, about 0.3% to about 19%, about 0.4% to about 18%, about 0.5% to about 17%, about 0.6% to about 16%, about 0.7% to about 15%, about 0.8% to about 14%, about 0.9% to about 12% or about 1% to about 10% w/w, w/v or v/v. It is a range.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.In some embodiments, the concentration of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is from about 0.001% to about 10%, from about 0.01% to about 5%, from about 0.02% to about 4.5%, from about 0.03% to about 4% of the pharmaceutical composition. , about 0.04% to about 3.5%, about 0.05% to about 3%, about 0.06% to about 2.5%, about 0.07% to about 2%, about 0.08% to about 1.5%, about 0.09% to about 1%, about It ranges from 0.1% to about 0.9% w/w, w/v or v/v.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 농도는 제약 조성물의 약 0.001% 내지 약 10%, 약 0.01% 내지 약 5%, 약 0.02% 내지 약 4.5%, 약 0.03% 내지 약 4%, 약 0.04% 내지 약 3.5%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.06% 내지 약 2.5%, 약 0.07% 내지 약 2%, 약 0.08% 내지 약 1.5%, 약 0.09% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.9% w/w, w/v 또는 v/v의 범위이다.In some embodiments, the concentration of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is from about 0.001% to about 10%, from about 0.01% to about 5%, from about 0.02% to about 4.5%, from about 0.03% to about 0.03% of the pharmaceutical composition. 4%, about 0.04% to about 3.5%, about 0.05% to about 3%, about 0.06% to about 2.5%, about 0.07% to about 2%, about 0.08% to about 1.5%, about 0.09% to about 1% , ranging from about 0.1% to about 0.9% w/w, w/v or v/v.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.In some embodiments, the amount of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g. , 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g , 0.0002 g, or 0.0001 g or less.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 양은 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g, 또는 0.0001 g 이하이다.In some embodiments, the amount of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g , 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, It is less than or equal to 0.0003 g, 0.0002 g, or 0.0001 g.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.In some embodiments, the amount of rTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g. g , 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0. 0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g , 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, It is greater than 9 g, 9.5 g, or 10 g.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL의 양은 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, 또는 10 g 초과이다.In some embodiments, the amount of rTIL and eTIL provided in the pharmaceutical composition of the invention is 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.00 9 g, 0.0095 g, 0.01 g , 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0 .095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g, or greater than 10 g.

본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL은 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 담당 의사의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. rTIL의 임상적으로-확립된 투여량이 또한 적절한 경우에 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여되는 제약 조성물의 양, 예컨대 rTIL의 투여량은 치료될 인간 또는 포유동물, 장애 또는 상태의 중등도, 투여 속도, 활성 제약 성분의 배치 및 치료 의사의 판단에 좌우될 것이다.The rTILs provided in the pharmaceutical compositions of the invention are effective over a wide dosage range. The exact dosage will depend on the route of administration, the form in which the compound is administered, the sex and age of the subject being treated, the weight of the subject being treated, and the preference and experience of the attending physician. Clinically-established doses of rTIL may also be used where appropriate. The amount of pharmaceutical composition, such as the dosage of rTIL, administered using the methods herein will depend on the human or mammal being treated, the severity of the disorder or condition, the rate of administration, the disposition of the active pharmaceutical ingredient, and the judgment of the treating physician.

본 발명의 제약 조성물에 제공된 rTIL 및 eTIL은 넓은 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 정확한 투여량은 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 치료될 대상체의 성별 및 연령, 치료될 대상체의 체중, 및 담당 의사의 선호도 및 경험에 좌우될 것이다. rTIL 및 eTIL의 임상적으로-확립된 투여량이 또한 적절한 경우에 사용될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 투여되는 제약 조성물의 양, 예컨대 rTIL 및 eTIL의 투여량은 치료될 인간 또는 포유동물, 장애 또는 상태의 중등도, 투여 속도, 활성 제약 성분의 배치 및 치료 의사의 판단에 좌우될 것이다.The rTILs and eTILs provided in the pharmaceutical compositions of the present invention are effective over a wide dosage range. The exact dosage will depend on the route of administration, the form in which the compound is administered, the sex and age of the subject being treated, the weight of the subject being treated, and the preference and experience of the attending physician. Clinically-established doses of rTIL and eTIL may also be used where appropriate. The amount of pharmaceutical composition administered using the methods herein, such as the dosage of rTIL and eTIL, will depend on the human or mammal being treated, the severity of the disorder or condition, the rate of administration, the disposition of the active pharmaceutical ingredient, and the judgment of the treating physician. will be.

일부 실시양태에서, rTIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, rTIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 1개월 1회, 2주마다 1회, 1주 1회, 또는 격일 1회일 수 있다. rTIL의 투여는 필요한 한 계속될 수 있다.In some embodiments, rTILs can be administered as a single dose. Such administration may be by injection, for example intravenous injection. In some embodiments, rTILs may be administered in multiple doses. Administration may be once, twice, three times, four times, five times, six times, or more than six times per year. Administration may be once a month, once every two weeks, once a week, or once every other day. Administration of rTIL may continue as long as needed.

일부 실시양태에서, rTIL 및 eTIL은 단일 용량으로 투여될 수 있다. 이러한 투여는 주사, 예를 들어 정맥내 주사에 의할 수 있다. 일부 실시양태에서, rTIL은 다중 용량으로 투여될 수 있다. 투여는 1년에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 또는 6회 초과일 수 있다. 투여는 1개월 1회, 2주마다 1회, 1주 1회, 또는 격일 1회일 수 있다. rTIL 및 eTIL의 투여는 필요한 한 계속될 수 있다.In some embodiments, rTIL and eTIL can be administered in a single dose. Such administration may be by injection, for example intravenous injection. In some embodiments, rTILs may be administered in multiple doses. Administration may be once, twice, three times, four times, five times, six times, or more than six times per year. Administration may be once a month, once every two weeks, once a week, or once every other day. Administration of rTIL and eTIL may continue as long as needed.

일부 실시양태에서, rTIL의 유효 투여량은 약 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰, 1x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹, 9x10¹¹, 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹², 9x10¹², 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³, 및 9x10¹³개이다. 일부 실시양태에서, rTIL의 유효 투여량은 1x10⁶ 내지 5x10⁶, 5x10⁶ 내지 1x10⁷, 1x10⁷ 내지 5x10⁷, 5x10⁷ 내지 1x10⁸, 1x10⁸ 내지 5x10⁸, 5x10⁸ 내지 1x10⁹, 1x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 5x10¹², 및 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL is about 1x10 ⁶ , 2x10 ⁶ , 3x10 ⁶ , 4x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 6x10 ⁶ , 7x10 ⁶ , 8x10 ⁶ , 9x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 2x10 ⁷ , 3x10 ⁷ , 4x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , 6x10 ⁷ , 7x10 ⁷ , 8x10 ⁷ , 9x10 ⁷ , 1x10 ⁸ , 2x10 ⁸ , 3x10 ⁸ , 4x10 ⁸ , 5x10 ⁸ , 6x10 ⁸ , 7x10 ⁸ , 8x10 8 , 9x10 ⁸ , 1x10 ⁹ , 2x10 ⁹ , ^3x10 ⁹ , 4x10 ⁹ , 5x10 ⁹ , 6x10 ⁹ , 7x10 ⁹ , 8x10 ⁹ , 9x10 ⁹ , 1x10 ¹⁰ , 2x10 ¹⁰ , 3x10 ¹⁰ , 4x10 ¹⁰ , 5x10 ¹⁰ , 6x10 10 , 7x10 ¹⁰ , 8x10 ¹⁰ , 9x10 ¹⁰ , ^1x10 ¹¹ , 2x10 ¹¹ , 3x10 ¹¹ , 4x10 ¹¹ , 5x10 11 , 6x10 ¹¹ , 7x10 ¹¹ , 8x10 ^{11 , 9x10 11 , 1x10 12} ^, ^{2x10 12} ^, 3x10 ¹² , 4x10 ¹² , 5x1 0 ¹² , 6x10 ¹² , 7x10 ¹² , ^{8x10 12} ^, 9x10 ¹² , 1x10 ¹³ , 2x10 ¹³ , 3x10 ¹³ , 4x10 ¹³ , 5x10 13 , 6x10 ¹³ , 7x10 ¹³ , 8x10 ¹³ ^, and 9x10 ¹³ . In some embodiments, ^the effective dosage of RTIL is 1x10 ⁶ to 5x10 ⁶ , 5x10 ⁶ to 1x10 ⁷ , 1x10 ⁷ to 5x10 ⁷ , 5x10 ⁷ to 1x10 ⁸ , 1x10 ⁸ , 5x10 ⁸ , ^5x10 ⁸ They range from 5x10 ⁹ , 5x10 ⁹ to 1x10 ¹⁰ , 1x10 ¹⁰ to 5x10 ¹⁰ , 5x10 ¹⁰ to 1x10 ¹¹ , 5x10 ¹¹ to 1x10 ¹² , 1x10 ¹² to 5x10 ¹² , and 5x10 ¹² to 1x10 ¹³ .

일부 실시양태에서, rTIL 및 eTIL의 유효 투여량은 약 1x10⁶, 2x10⁶, 3x10⁶, 4x10⁶, 5x10⁶, 6x10⁶, 7x10⁶, 8x10⁶, 9x10⁶, 1x10⁷, 2x10⁷, 3x10⁷, 4x10⁷, 5x10⁷, 6x10⁷, 7x10⁷, 8x10⁷, 9x10⁷, 1x10⁸, 2x10⁸, 3x10⁸, 4x10⁸, 5x10⁸, 6x10⁸, 7x10⁸, 8x10⁸, 9x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹, 3x10⁹, 4x10⁹, 5x10⁹, 6x10⁹, 7x10⁹, 8x10⁹, 9x10⁹, 1x10¹⁰, 2x10¹⁰, 3x10¹⁰, 4x10¹⁰, 5x10¹⁰, 6x10¹⁰, 7x10¹⁰, 8x10¹⁰, 9x10¹⁰, 1x10¹¹, 2x10¹¹, 3x10¹¹, 4x10¹¹, 5x10¹¹, 6x10¹¹, 7x10¹¹, 8x10¹¹, 9x10¹¹, 1x10¹², 2x10¹², 3x10¹², 4x10¹², 5x10¹², 6x10¹², 7x10¹², 8x10¹², 9x10¹², 1x10¹³, 2x10¹³, 3x10¹³, 4x10¹³, 5x10¹³, 6x10¹³, 7x10¹³, 8x10¹³, 및 9x10¹³개이다. 일부 실시양태에서, rTIL 및 eTIL의 유효 투여량은 1x10⁶ 내지 5x10⁶, 5x10⁶ 내지 1x10⁷, 1x10⁷ 내지 5x10⁷, 5x10⁷ 내지 1x10⁸, 1x10⁸ 내지 5x10⁸, 5x10⁸ 내지 1x10⁹, 1x10⁹ 내지 5x10⁹, 5x10⁹ 내지 1x10¹⁰, 1x10¹⁰ 내지 5x10¹⁰, 5x10¹⁰ 내지 1x10¹¹, 5x10¹¹ 내지 1x10¹², 1x10¹² 내지 5x10¹², 및 5x10¹² 내지 1x10¹³개의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL and eTIL is about 1x10 ⁶ , 2x10 ⁶ , 3x10 ⁶ , 4x10 ⁶ , 5x10 ⁶ , 6x10 ⁶ , 7x10 ⁶ , 8x10 ⁶ , 9x10 ⁶ , 1x10 ⁷ , 2x10 ⁷ , 3x10 ⁷ , 4x10 ⁷ , 5x10 ⁷ , 6x10 ⁷ , 7x10 ⁷ , 8x10 ⁷ , 9x10 ⁷ , 1x10 ⁸ , 2x10 ⁸ , 3x10 ⁸ , 4x10 ⁸ , 5x10 ⁸ , 6x10 ⁸ , 7x10 8 , 8x10 ⁸ , 9x10 ⁸ , 1x10 ⁹ , ^2x10 ⁹ , 3x10 ⁹ , 4x10 ⁹ , 5x10 ⁹ , 6x10 ⁹ , 7x10 ⁹ , 8x10 ⁹ , 9x10 ⁹ , 1x10 ¹⁰ , 2x10 ¹⁰ , 3x10 ¹⁰ , 4x10 ¹⁰ , 5x10 ^{10 , 6x10 10} , 7x10 ¹⁰ , 8x10 ¹⁰ , 9x10 ¹⁰ , ^1x10 ¹¹ , 2x10 ¹¹ , 3x10 ¹¹ , 4x10 ¹¹ , 5x10 11 , 6x10 ¹¹ , 7x10 ¹¹ , 8x10 ¹¹ , 9x10 ¹¹ , 1x10 ¹² , 2x10 ¹² , 3x10 ¹² , 4x10 ¹² , 5x10 ¹² , 6x10 ¹² , 7x10 ¹² , ^{8x10 12} ^, There are 9x10 ¹² , 1x10 ¹³ , 2x10 ¹³ , 3x10 ¹³ , 4x10 ¹³ , 5x10 ¹³ , 6x10 ¹³ , 7x10 ¹³ , 8x10 ¹³ , and 9x10 ¹³ . In some embodiments, the effective dosage of rTIL and eTIL is 1x10 ⁶ to 5x10 ⁶ , 5x10 ⁶ to 1x10 ⁷ , 1x10 ⁷ to 5x10 ^{7 , 5x10 7} ^to 1x10 ⁸ , 1x10 ⁸ to 5x10 ⁸ , 5x10 ⁸ to 1x10 ⁹ , 1x1 0 ⁹ to 5x10 ⁹ , 5x10 ⁹ to 1x10 ¹⁰ , 1x10 ¹⁰ to 5x10 ¹⁰ , 5x10 ¹⁰ to 1x10 ¹¹ , 5x10 ¹¹ to 1x10 ¹² , 1x10 ¹² to 5x10 ¹² , and 5x10 ¹² to 1x10 ¹³ It is a range of dogs.

일부 실시양태에서, rTIL의 유효 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL is about 0.01 mg/kg to about 4.3 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 3.6 mg/kg, about 0.3 mg/kg to about 3.2 mg/kg, about 0.35 mg. /kg to about 2.85 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 2.85 mg/kg, about 0.3 mg to about 2.15 mg/kg, about 0.45 mg/kg to about 1.7 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 1.3 mg/kg, about 0.3 mg/kg to about 1.15 mg/kg, about 0.45 mg/kg to about 1 mg/kg, about 0.55 mg/kg to about 0.85 mg/kg, about 0.65 mg/kg to about 0.8 mg /kg, about 0.7 mg/kg to about 0.75 mg/kg, about 0.7 mg/kg to about 2.15 mg/kg, about 0.85 mg/kg to about 2 mg/kg, about 1 mg/kg to about 1.85 mg/kg , about 1.15 mg/kg to about 1.7 mg/kg, about 1.3 mg/kg to about 1.6 mg/kg, about 1.35 mg/kg to about 1.5 mg/kg, about 2.15 mg/kg to about 3.6 mg/kg, About 2.3 mg/kg to about 3.4 mg/kg, about 2.4 mg/kg to about 3.3 mg/kg, about 2.6 mg/kg to about 3.15 mg/kg, about 2.7 mg/kg to about 3 mg/kg, about 2.8 mg/kg to about 3 mg/kg, or about 2.85 mg/kg to about 2.95 mg/kg.

일부 실시양태에서, rTIL 및 eTIL의 유효 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 4.3 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 3.2 mg/kg, 약 0.35 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 2.85 mg/kg, 약 0.3 mg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 0.15 mg/kg 내지 약 1.3 mg/kg, 약 0.3 mg/kg 내지 약 1.15 mg/kg, 약 0.45 mg/kg 내지 약 1 mg/kg, 약 0.55 mg/kg 내지 약 0.85 mg/kg, 약 0.65 mg/kg 내지 약 0.8 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 0.75 mg/kg, 약 0.7 mg/kg 내지 약 2.15 mg/kg, 약 0.85 mg/kg 내지 약 2 mg/kg, 약 1 mg/kg 내지 약 1.85 mg/kg, 약 1.15 mg/kg 내지 약 1.7 mg/kg, 약 1.3 mg/kg mg 내지 약 1.6 mg/kg, 약 1.35 mg/kg 내지 약 1.5 mg/kg, 약 2.15 mg/kg 내지 약 3.6 mg/kg, 약 2.3 mg/kg 내지 약 3.4 mg/kg, 약 2.4 mg/kg 내지 약 3.3 mg/kg, 약 2.6 mg/kg 내지 약 3.15 mg/kg, 약 2.7 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 약 2.8 mg/kg 내지 약 3 mg/kg, 또는 약 2.85 mg/kg 내지 약 2.95 mg/kg의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL and eTIL is about 0.01 mg/kg to about 4.3 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 3.6 mg/kg, about 0.3 mg/kg to about 3.2 mg/kg, about 0.35 mg/kg to about 2.85 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 2.85 mg/kg, about 0.3 mg to about 2.15 mg/kg, about 0.45 mg/kg to about 1.7 mg/kg, about 0.15 mg/kg to about 1.3 mg/kg, about 0.3 mg/kg to about 1.15 mg/kg, about 0.45 mg/kg to about 1 mg/kg, about 0.55 mg/kg to about 0.85 mg/kg, about 0.65 mg/kg to about 0.8 mg/kg, about 0.7 mg/kg to about 0.75 mg/kg, about 0.7 mg/kg to about 2.15 mg/kg, about 0.85 mg/kg to about 2 mg/kg, about 1 mg/kg to about 1.85 mg /kg, about 1.15 mg/kg to about 1.7 mg/kg, about 1.3 mg/kg mg to about 1.6 mg/kg, about 1.35 mg/kg to about 1.5 mg/kg, about 2.15 mg/kg to about 3.6 mg/ kg, about 2.3 mg/kg to about 3.4 mg/kg, about 2.4 mg/kg to about 3.3 mg/kg, about 2.6 mg/kg to about 3.15 mg/kg, about 2.7 mg/kg to about 3 mg/kg, It ranges from about 2.8 mg/kg to about 3 mg/kg, or from about 2.85 mg/kg to about 2.95 mg/kg.

일부 실시양태에서, rTIL의 유효 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL is from about 1 mg to about 500 mg, from about 10 mg to about 300 mg, from about 20 mg to about 250 mg, from about 25 mg to about 200 mg, from about 1 mg to about 50 mg. , about 5 mg to about 45 mg, about 10 mg to about 40 mg, about 15 mg to about 35 mg, about 20 mg to about 30 mg, about 23 mg to about 28 mg, about 50 mg to about 150 mg, about 60 mg to about 140 mg, about 70 mg to about 130 mg, about 80 mg to about 120 mg, about 90 mg to about 110 mg, or about 95 mg to about 105 mg, about 98 mg to about 102 mg, about 150 mg. mg to about 250 mg, about 160 mg to about 240 mg, about 170 mg to about 230 mg, about 180 mg to about 220 mg, about 190 mg to about 210 mg, about 195 mg to about 205 mg, or about 198 to about 198 mg. This ranges from approximately 207 mg.

일부 실시양태에서, rTIL 및 eTIL의 유효 투여량은 약 1 mg 내지 약 500 mg, 약 10 mg 내지 약 300 mg, 약 20 mg 내지 약 250 mg, 약 25 mg 내지 약 200 mg, 약 1 mg 내지 약 50 mg, 약 5 mg 내지 약 45 mg, 약 10 mg 내지 약 40 mg, 약 15 mg 내지 약 35 mg, 약 20 mg 내지 약 30 mg, 약 23 mg 내지 약 28 mg, 약 50 mg 내지 약 150 mg, 약 60 mg 내지 약 140 mg, 약 70 mg 내지 약 130 mg, 약 80 mg 내지 약 120 mg, 약 90 mg 내지 약 110 mg, 또는 약 95 mg 내지 약 105 mg, 약 98 mg 내지 약 102 mg, 약 150 mg 내지 약 250 mg, 약 160 mg 내지 약 240 mg, 약 170 mg 내지 약 230 mg, 약 180 mg 내지 약 220 mg, 약 190 mg 내지 약 210 mg, 약 195 mg 내지 약 205 mg, 또는 약 198 내지 약 207 mg의 범위이다.In some embodiments, the effective dosage of rTIL and eTIL is from about 1 mg to about 500 mg, from about 10 mg to about 300 mg, from about 20 mg to about 250 mg, from about 25 mg to about 200 mg, from about 1 mg to about 50 mg, about 5 mg to about 45 mg, about 10 mg to about 40 mg, about 15 mg to about 35 mg, about 20 mg to about 30 mg, about 23 mg to about 28 mg, about 50 mg to about 150 mg , about 60 mg to about 140 mg, about 70 mg to about 130 mg, about 80 mg to about 120 mg, about 90 mg to about 110 mg, or about 95 mg to about 105 mg, about 98 mg to about 102 mg, About 150 mg to about 250 mg, about 160 mg to about 240 mg, about 170 mg to about 230 mg, about 180 mg to about 220 mg, about 190 mg to about 210 mg, about 195 mg to about 205 mg, or about It ranges from 198 to about 207 mg.

유효량의 rTIL 및/또는 eTIL은 유사한 유용성을 갖는 작용제에 대해 허용된 투여 방식 중 임의의 것에 의해, 예컨대 혈류 내로의 주입, 종양 내로의 주입, 동맥내 주사, 정맥내로, 복강내로, 비경구로, 근육내로, 피하로, 국소로, 비강내 투여에 의해, 이식에 의해, 또는 흡입에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.An effective amount of rTIL and/or eTIL can be administered by any of the accepted modes of administration for agents of similar utility, such as injection into the bloodstream, injection into a tumor, intraarterial injection, intravenously, intraperitoneally, parenterally, intramuscularly. It may be administered in single or multiple doses intravenously, subcutaneously, topically, by intranasal administration, by implantation, or by inhalation.

실시예Example

본원에 포괄된 실시양태는 하기 실시예를 참조하여 이제 기재된다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적으로만 제공되고, 본원에 포괄된 개시내용은 결코 이들 실시예에 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 오히려 본원에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 및 모든 변형을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다.Embodiments encompassed herein are now described with reference to the examples below. These examples are provided for illustrative purposes only, and the disclosure contained herein should in no way be construed as limited to these examples, but rather embraces any and all variations that become apparent as a result of the teachings provided herein. It should be interpreted as doing so.

실시예 1 - 종양 소화물로부터의 rTIL의 확장Example 1 - Expansion of rTILs from tumor digests

종양 잔유물을 하기 예시적인 절차에 따라 소화시켰다. 이러한 절차는 종양-침윤 림프구를 수득 및 단리하기 위해 신선한 인간 종양 샘플을 생존 단일-세포 현탁액으로 소화시키는 것을 기재하고, DNase-콜라게나제-히알루로니다제 (DCH) 방법 (본원에 기재된 바와 같음) 또는 인간 종양의 분리를 위한 MACS 인간 종양 분리 키트 (TDK) (밀테니 바이오테크, 인크., 미국 캘리포니아주 샌디에고) 소화 프로토콜을 사용할 수 있다.Tumor remnants were digested according to the exemplary procedure below. This procedure describes digestion of fresh human tumor samples into viable single-cell suspensions to obtain and isolate tumor-infiltrating lymphocytes, followed by the DNase-collagenase-hyaluronidase (DCH) method (as described herein). ) or the MACS Human Tumor Isolation Kit (TDK) (Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) digestion protocol for isolation of human tumors.

CM1 + IL-2 작업 배양 배지의 제조는 하기와 같다. 500 mL RPMI 1640, 200 mM L-글루타민 및 100 mL 인간 AB 혈청을 37℃에서의 수조에 넣어 적어도 30분 동안 평형화시킨다. 이러한 혼합물의 내용물을 수조로부터 생물안전 캐비닛으로, 냉장고에서 꺼낸 1000X β-ME 스톡 및 50 mg/mL 겐타미신 원액과 함께 옮긴다. RPMI 1640으로부터 50 mL를 제거하고, 다음을 첨가한다: 50 mL 인간 AB 혈청, 5mL 200 mM L-글루타민, 500 μL 1000X β-ME, 및 500 μL 50 mg/mL 겐타미신. 완전 배지 1에, 500 μL의 6000 U/mL 재구성된 인간 rhIL-2 (셀게닉스, 인크., 미국 뉴햄프셔주 포츠머스)를 첨가한다.Preparation of CM1 + IL-2 working culture medium is as follows. Equilibrate 500 mL RPMI 1640, 200 mM L-glutamine and 100 mL human AB serum in a water bath at 37°C for at least 30 minutes. Transfer the contents of this mixture from the water bath to a biosafety cabinet, along with the 1000X β-ME stock and 50 mg/mL gentamicin stock solution from the refrigerator. Remove 50 mL from RPMI 1640 and add: 50 mL human AB serum, 5 mL 200 mM L-glutamine, 500 μL 1000X β-ME, and 500 μL 50 mg/mL gentamicin. To complete medium 1, add 500 μL of 6000 U/mL reconstituted human rhIL-2 (Celgenics, Inc., Portsmouth, NH, USA).

10x DCH 원액은 하기 절차를 사용하여 제조하며, 이는 도 1에 도시되어 있다. 첫째로, 목적하는 작업 용액 농도를 수득하기 위해 각각의 효소를 재구성하는데 필요한 부피를 계산한다. 예를 들어 10,000 U/mL 작업 용액을 수득하기 위해 15 mL 중에 150,000 U (국제 단위)의 데옥시리보뉴클레아제를 재구성한다. 남은 작업 용액을 분취한다. 실온에서 앞서 상기에서 계산된 양의 멸균 행크 평형 염 용액 (HBSS, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재 시그마-알드리치 캄파니의 시그마 H6648, 또는 등가물) 중에 동결건조 효소를 재구성한다. 병의 옆 및 보호 호일로부터 임의의 잔류 분말을 제거한다. 완전히 재구성되도록 수회 상하로 피펫팅하고 와류시킨다. 100,000 U의 DNase (소 췌장으로부터의 데옥시리보뉴클레아제 I, 시그마 D5025 또는 등가물), 1 g의 콜라게나제 (클로스트리디움 히스톨리티쿰으로부터의 시그마 C5138 또는 등가물), 및 100 mg의 히알루로니다제 (양 고환으로부터의 유형 V, 시그마 H6254 또는 등가물)를 100 mL의 최종 부피의 멸균 HBSS에 첨가하여, 인간 종양을 위한 10x 삼중 효소 소화 원액을 수득한다. 남아있는 효소 작업 용액을 10,000 U/mL DNase, 10 mg/mL 콜라게나제 및 1 mg/mL 히알루로니다제 내로 분취한다. 100 mL 최종 부피의 10x DCH 원액은 하기 농도를 갖는다: DNase I 1000 U/mL, 콜라게나제 10 mg/mL, 및 히알루로니다제 1 mg/mL. 10x DCH 원액은 종양 소화를 위해 HBSS 중 1x DCH로 희석한다.The 10x DCH stock solution was prepared using the following procedure, which is depicted in Figure 1. First, calculate the volume required to reconstitute each enzyme to obtain the desired working solution concentration. For example, reconstitute 150,000 U (international units) of deoxyribonuclease in 15 mL to obtain a 10,000 U/mL working solution. Aliquot the remaining working solution. Reconstitute the lyophilized enzyme in the previously calculated amount of sterile Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, Sigma H6648 from Sigma-Aldrich Company, St. Louis, MO, or equivalent) at room temperature. Remove any residual powder from the sides of the bottle and the protective foil. Pipette up and down and vortex several times to ensure complete reconstitution. 100,000 U of DNase (deoxyribonuclease I from bovine pancreas, Sigma D5025 or equivalent), 1 g of collagenase (Sigma C5138 from Clostridium histolyticum or equivalent), and 100 mg of Hyaluronic Acid. Ronidase (Type V from sheep testes, Sigma H6254 or equivalent) is added to a final volume of 100 mL of sterile HBSS to obtain a 10x triple enzyme digest stock solution for human tumors. Aliquot the remaining enzyme working solution into 10,000 U/mL DNase, 10 mg/mL collagenase, and 1 mg/mL hyaluronidase. A 100 mL final volume of 10x DCH stock solution had the following concentrations: DNase I 1000 U/mL, collagenase 10 mg/mL, and hyaluronidase 1 mg/mL. The 10x DCH stock solution is diluted with 1x DCH in HBSS for tumor digestion.

공동으로, DCH 소화와 MACS TDK와의 비교를 위해, 원하는 경우에 제조업체 설명서에 따라 MACS TDK에 포함된 시약을 제조한다. -20℃에서 저장된 분취물을 실온에서 해동시킨다.In conjunction, for DCH digestion and comparison with MACS TDK, prepare reagents included in MACS TDK according to the manufacturer's instructions, if desired. Aliquots stored at -20°C are thawed at room temperature.

종양은 하기와 같이 소화를 위해 준비할 수 있다. 종양을 그의 1차 및 2차 패키징으로부터 제거하고, 바이알을 칭량하고, 질량을 기록하고, 생물안전 캐비닛으로 옮긴다. 종양을 단편으로 절단하거나 또는 종양을 세절한다. 소화 프로토콜에 사용할 여러 단편을 선택하고, 원하는 경우에 조직학 및 DNA 추출을 위해 추가의 단편을 유지한다.Tumors can be prepared for digestion as follows. Tumors are removed from their primary and secondary packaging, vials are weighed, mass recorded, and transferred to a biosafety cabinet. The tumor is cut into fragments or the tumor is minced. Select several fragments to use in the digestion protocol, and retain additional fragments for histology and DNA extraction if desired.

예시적인 DCH-기반 종양 소화 절차는 도 2에 도시되어 있으며, 하기 단계를 포함한다. 10x DCH 원액을 소화를 위한 1x 작업 농도로 희석하여야 한다. 종양의 소화를 위해 필요한 총 부피를 계산하며, 이는 종양 cm²당 약 5 mL의 용액이다. 1 부분 DCH를 9 부분 HBSS에 첨가함으로써 DCH 작업 용액을 1x로 희석한다. 종양 단편을 상기에서 계산된 부피의 HBSS 중에서 50 mL 플라콘 원추형 튜브로 옮긴다. 상기에서 계산된 양의 10x DCH를 첨가하고, 튜브를 캡핑하고, 임의로 밀봉한다. 1 내지 2시간 동안 일정하게 회전하는 37℃, 5% CO₂ 가습 인큐베이터 내의 MACS 튜브 로테이터 (밀테니 바이오테크, 인크., 미국 캘리포니아주 샌디에고)로 옮긴다. 대안적으로, 종양 단편을 실온에서 밤새, 또한 일정하게 회전시키면서 소화시킬 수 있다. 멸균 팔콘 원추형 튜브에 0.70 μm 스트레이너를 부착시킨다. 인큐베이터로부터 피펫을 사용하여 소화물을 수득하고, 스트레이너에 모든 소화 내용물을 첨가한다. 멸균 시린지 플런저의 버트를 사용하여 임의의 고체를 스트레이너를 통해 밀어넣는다. 튜브를 캡핑하며, 이는 DCH-소화된 rTIL을 함유한다. 세포를 소화 칵테일이 제거되도록 세척하고, 계수하고, 본원 다른 곳에 기재된 바와 같은 REP 확장을 위해 배지 중에 재현탁시킬 수 있다.An exemplary DCH-based tumor digestion procedure is depicted in Figure 2 and includes the following steps. The 10x DCH stock solution should be diluted to 1x working concentration for digestion. Calculate the total volume required for digestion of the tumor, which is approximately 5 mL of solution per cm ² of tumor. Dilute the DCH working solution 1x by adding 1 part DCH to 9 parts HBSS. Transfer the tumor fragments to a 50 mL flacon conical tube in the volume calculated above in HBSS. Add the amount of 10x DCH calculated above and cap the tube, optionally sealing. Transfer to a MACS tube rotator (Milteni Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) in a 37°C, 5% CO ₂ humidified incubator with constant rotation for 1 to 2 hours. Alternatively, tumor fragments can be digested overnight at room temperature with constant rotation. Attach a 0.70 μm strainer to a sterile Falcon conical tube. Obtain the digest from the incubator using a pipette and add all digest contents to a strainer. Use the butt of a sterile syringe plunger to push any solids through the strainer. Cap the tube, which contains DCH-digested rTIL. Cells can be washed to remove the digestion cocktail, counted, and resuspended in medium for REP expansion as described elsewhere herein.

사전-REP 단계가 rTIL과의 비교를 위한 eTIL을 제공하는 것이 바람직한 경우 (하기 실시예에서와 같이), DCH-소화된 rTIL을 사용하여 사전-REP를 위한 지-렉스 플라스크에 시딩한다. 필요한 수의 지-렉스 10 플라스크를 라벨링하고, 소화물을 첨가한다. CM1 + IL-2를 첨가하여 40 mL 최종 부피를 수득한다. 습기를 갖는 37℃에서의 5% CO₂ 인큐베이터에 플라스크를 넣는다. 세포 계수 및 생존율은 40 μL의 샘플 대 40 μL의 아크리딘 오렌지 및 아이오딘화프로피듐 이중 염색 용액 (AOPI) 용액을 사용하는 넥스셀롬(Nexcelom) 셀로미터 K2를 사용하여 수행할 수 있고, 필요에 따라 희석하면서 각각의 소화 또는 조건에 대해 이중으로 계수한다. 샘플을 잘 혼합하여 응집을 피하고, 각각의 샘플을 실행하기 직전에 AOPI를 피펫팅하여 생존율이 아이오딘화프로피듐의 세포독성 효과에 의해 불명료해지지 않도록 한다.If it is desirable for the pre-REP step to provide eTIL for comparison with rTIL (as in the examples below), DCH-digested rTIL is used to seed Z-Rex flasks for pre-REP. Label the required number of Z-Rex 10 flasks and add the digest. Add CM1 + IL-2 to obtain a final volume of 40 mL. Place the flask in a humidified 5% CO ₂ incubator at 37°C. Cell counting and viability can be performed using a Nexcelom Cellometer K2 using 40 μL of sample to 40 μL of acridine orange and propidium iodide double stain solution (AOPI) solution, as required. Count in duplicate for each digest or condition, diluting accordingly. Mix the samples well to avoid aggregation, and pipet AOPI immediately before running each sample to ensure that viability is not obscured by the cytotoxic effects of propidium iodide.

상기 기재된 DCH 절차는 여러 이유로 MACS TDK 효소적 소화 혼합물 및 절차보다 놀랍게도 우수한 것으로 밝혀졌다. MACS TDK 혼합물을 사용하여 3가지 독립적 실험을 수행하였다. 제1 실험은 흑색종 종양을 사용하여 수행하였으며, 여기서 MACS 시스템을 사용하여 rTIL에서의 CD4⁺/CD8⁺ 집단의 유의한 하향조절이 유동 세포측정법에 의해 관찰되었다. 이러한 효과는 DCH-소화된 rTIL에서는 관찰되지 않았으며, 이는 MACS 소화 절차가 표면 마커의 발현에 불리하게 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 제2 실험에서, 에스트로겐 수용체-양성 (ER+)/프로게스테론 수용체-양성 (PR+) 유방 종양을 사용하였고, DCH 소화는 명확한 물질을 유도한 반면, MACS 소화는 24-웰 지-렉스 플레이트에서 파편을 출현시켰으며, 이는 MACS 효소 칵테일에서의 불량한 소화를 나타낸다. 최종적으로, MACS TDK 효소적 소화 혼합물 및 절차를 사용하는 상이한 ER+/PR+ 유방 종양의 제2 소화는 rTIL의 불량한 수율 및 생존율 둘 다를 유도하였다.The DCH procedure described above was surprisingly found to be superior to the MACS TDK enzymatic digestion mixture and procedure for several reasons. Three independent experiments were performed using the MACS TDK mixture. The first experiment was performed using melanoma tumors, where significant downregulation of the CD4 ⁺ /CD8 ⁺ population in rTILs was observed by flow cytometry using the MACS system. This effect was not observed in DCH-digested rTIL, indicating that the MACS digestion procedure may adversely affect the expression of surface markers. In a second experiment, estrogen receptor-positive (ER+)/progesterone receptor-positive (PR+) breast tumors were used and DCH digestion led to clear material, whereas MACS digestion resulted in debris appearing in 24-well G-Rex plates. This indicates poor digestion in the MACS enzyme cocktail. Finally, secondary digestion of different ER+/PR+ breast tumors using the MACS TDK enzymatic digestion mixture and procedure resulted in both poor yield and survival of rTILs.

실시예 2 - 종양 소화물로부터의 rTIL의 표현형 특징화Example 2 - Phenotypic characterization of rTILs from tumor digests

사전-REP 동안, 종양-상주 TIL은 eTIL로서 이주하고, 증식한다. rTIL과의 비교를 위한 eTIL을 제조하는데 사용된 사전-REP의 길이는 세포 성장에 따라 11-21일 사이에서 달라질 수 있다. 잔류 종양 단편 (잔유물)을 정상적으로 폐기하고, 확장된 eTIL을 방사선 조사된 PBMC 피더, 항-CD3 및 IL-2와 함께 REP에 적용한다. 사전-REP 후 종양 잔유물에 남아있는 생존 TIL (rTIL)을 eTIL과 비교하여 그의 기능 및 표현형을 평가하기 위해 상기 기재된 바와 같이 실시예 1에 따라 소화시킨 후에 조사하였다.During pre-REP, tumor-resident TILs migrate and proliferate as eTILs. The length of pre-REP used to prepare eTIL for comparison with rTIL can vary between 11-21 days depending on cell growth. Residual tumor fragments (remnants) are discarded normally and expanded eTILs are applied to REP with irradiated PBMC feeders, anti-CD3 and IL-2. Surviving TILs (rTILs) remaining in tumor remnants after pre-REP were examined after digestion according to Example 1 as described above to evaluate their function and phenotype compared to eTILs.

흑색종, 두경부, 유방, 신장, 췌장, 폐 및 결장직장 종양에서의 종양 잔유물 및 사전-REP 현탁액으로부터의 세포 집단 (즉, 확장된 세포 집단) (n=17)을 평가 및 비교하였다. 흥미롭게도, 본원에서 결정되고 LAG3, TIM-3, PD-1, CD69, CD45RO, CD27, CD56, CD57 및 HLA-DR을 포함한 다양한 마커의 차등 발현에 의해 나타난 바와 같이, rTIL은 eTIL과 일관되게 표현형상 구별된다. 종양 잔유물 및 사전-REP 집단의 REP는 대등한 확장을 가져왔으나, 사전-REP 결과와 유사하게, 표현형 시그너쳐는 LAG3, TIM-3, HLA-DR 및 CD28과 관련하여 2개의 집단 사이에서 달라졌다.Cell populations (i.e., expanded cell populations) from tumor remnants and pre-REP suspensions in melanoma, head and neck, breast, kidney, pancreas, lung, and colorectal tumors (n=17) were evaluated and compared. Interestingly, rTILs were expressed consistently with eTILs, as determined herein and shown by differential expression of various markers, including LAG3, TIM-3, PD-1, CD69, CD45RO, CD27, CD56, CD57, and HLA-DR. The shape is distinct. REP of the tumor remnant and pre-REP populations resulted in comparable expansion, but similar to the pre-REP results, the phenotypic signature differed between the two populations with respect to LAG3, TIM-3, HLA-DR, and CD28.

흑색종, 유방, 신장, 췌장, 폐 및 결장직장 종양으로부터 수득된 rTIL 및 eTIL (n = 9)을 평가 및 비교하였다. 다양한 마커의 차등 발현에 의해 결정된 바와 같이, 종양 rTIL은 eTIL과 일관되게 표현형상 구별된다 (표 3 및 도 3).rTILs and eTILs (n = 9) obtained from melanoma, breast, kidney, pancreas, lung, and colorectal tumors were evaluated and compared. Tumor rTILs are consistently phenotypically distinct from eTILs, as determined by differential expression of various markers (Table 3 and Figure 3).

표 3. 9종의 종양에 대한 표현형 특징화 결과의 요약.Table 3. Summary of phenotypic characterization results for nine tumors.

*P-값은 스튜던트 독립표본 T 검정을 사용하여 rTIL과 eTIL 사이의 차이를 나타낸다.*P-value indicates the difference between rTIL and eTIL using Student's independent samples t test.

eTIL과 비교한 rTIL에서의 근본적인 차이는 증가된 CD69 발현 (CD4⁺에서의 7배 중앙 형광 강도 (MFI)) (p<.0001), 감소된 LAG3 발현 (CD8⁺ T 세포에서의 2배 MFI) (p < 0.05) 및 TIM3 발현 (각각 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포에서의 3배 및 2배 MFI) (p < 0.05/0.01), 감소된 CD154 발현 (CD4⁺ T 세포에서의 3배 MFI) (p < 0.01), 및 감소된 CD56 발현 (5%) (p < 0.05)이었다. 놀랍게도, rTIL 및 eTIL의 REP는 실시예 4에 기재된 바와 같이, 사전-REP 결과와 유사하게, 대등한 확장을 가져왔다. rTIL의 표현형 시그너쳐는 REP 후에 실시예 4에 기재된 바와 같이, LAG3, TIM3 및 CD28의 개별 수준으로의 발현의 충실도로 지속되었다. 게다가, CD57은 말단 분화와 연관된 수용체이므로, 결과는 rTIL이 eTIL보다 덜 말단 분화된다는 것 (즉, 사멸할 가능성이 더 적다는 것)을 시사한다.The fundamental differences in rTILs compared to eTILs were increased CD69 expression (7-fold median fluorescence intensity (MFI) in CD4 ⁺ ) (p<.0001), and decreased LAG3 expression (2-fold MFI in CD8 ⁺ T cells). (p < 0.05) and TIM3 expression (3-fold and 2-fold MFI in CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells, respectively) (p < 0.05/0.01), and reduced CD154 expression (3-fold MFI in CD4 ⁺ T cells) ( p < 0.01), and reduced CD56 expression (5%) (p < 0.05). Surprisingly, REP of rTIL and eTIL resulted in comparable expansion, similar to the pre-REP results, as described in Example 4. The phenotypic signature of rTIL persisted after REP with fidelity of expression at the individual level of LAG3, TIM3, and CD28, as described in Example 4. Furthermore, since CD57 is a receptor associated with terminal differentiation, the results suggest that rTILs are less terminally differentiated (i.e., less likely to die) than eTILs.

도 3 및 표 3에서 보고된 결과는 eTIL 및 rTIL이 다양한 종양 조직학에서의 표현형 발현에 있어서 다르지만 일관된 차이를 나타낸다는 것을 제시한다. 가장 주목할 만하게, rTIL에서 소위 "소진 마커" (LAG3 및 TIM3)의 발현의 감소가 존재하였다. 흥미롭게도, PD-1은 eTIL 및 rTIL에서 유사하게 발현되었다. 추가적으로, eTIL과 비교하여 rTIL에서 CD69 발현의 증진이 존재하였지만, KLRG1은 2개의 집단 사이에서 유사하였다 (데이터는 제시되지 않음). 이것은 rTIL이 말단 분화되는 것처럼 보이지 않지만, 조직-상주 이펙터 기억 T 세포와 표현현상 유사하다는 추가의 증거를 제공한다.The results reported in Figure 3 and Table 3 suggest that eTILs and rTILs exhibit different but consistent differences in phenotypic expression in various tumor histologies. Most notably, there was a decrease in the expression of so-called “exhaustion markers” (LAG3 and TIM3) in rTILs. Interestingly, PD-1 was expressed similarly on eTILs and rTILs. Additionally, there was an enhancement of CD69 expression in rTIL compared to eTIL, but KLRG1 was similar between the two populations (data not shown). This provides further evidence that rTILs do not appear to be terminally differentiated, but are phenotypically similar to tissue-resident effector memory T cells.

종합적으로, 이들 결과는 종양에 남아있거나 종양 밖으로 확장 및 진행하는 세포 집단의 생물학, 및 이주 및 체류와 연관된 신호에서의 유의차를 확인하였다.Collectively, these results identified significant differences in the biology of cell populations that remain in the tumor or expand and progress out of the tumor, and in the signals associated with migration and retention.

실시예 3 - 종양 소화물로부터의 rTIL의 기능적 특징화Example 3 - Functional characterization of rTILs from tumor digests

T 세포 기능장애는 미토콘드리아 기능의 상실과 직접적으로 연관된다. 문헌 [Sharping, et al., Immunity 2016, 45, 374-88]. 더욱이, 미토콘드리아 생물발생을 지지하기 위한 T 세포의 재프로그램화는 종양내 T 세포 지속성 및 기능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 보다 대사적으로 활성인 T 세포는 종양에 대한 효율적인 면역 반응을 일으키는데 중추적이다. 기능적으로 eTIL 및 rTIL을 평가하기 위한 노력으로, eTIL 및 rTIL을 미토트랙커 및 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-다이아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스 (2-NBDG)를 통해 대사 능력의 관점에서 비교하였다. 2-NBDG는 글루코스 흡수를 측정하는데 사용될 수 있지만, 1차 대사 과정; 즉, 미토콘드리아에서의 전체 산화 또는 단지 당분해 및 락테이트의 생성을 구체화하지는 않는다. 미토트랙커 염료 (써모피셔 사이언티픽, 인크., 미국 매사추세츠주 월섬)는 미토콘드리아 질량을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법에 의한 eTIL 및 rTIL의 비교는 도 4에 제시된 바와 같이, rTIL에서의 글루코스 업데이트의 증진을 입증하였다. 이러한 결과는, 종양으로부터 직접적으로 유리된 rTIL이 더 당분해성일 것으로 예상되기 때문에 놀라운 것이며; 그러나, rTIL의 미토콘드리아 질량을 평가하였을 때, 이들은 eTIL과 비교하여 다소 증진된 미토트랙커 수준을 나타냈다. 이들 결과는, rTIL이 덜 활성일 것으로 예상되는 경우에도 eTIL보다 더 대사적으로 활성이었다는 것을 입증하고, rTIL이 eTIL보다 종양에 대한 면역 반응을 일으키는 더 큰 능력을 가질 수 있다는 것을 시사한다.T cell dysfunction is directly associated with loss of mitochondrial function. Sharping, et al., Immunity 2016, 45, 374-88. Moreover, reprogramming T cells to support mitochondrial biogenesis can increase intratumoral T cell persistence and function. Therefore, more metabolically active T cells are pivotal in generating an efficient immune response against tumors. In an effort to functionally evaluate eTILs and rTILs, eTILs and rTILs were analyzed using MitoTracker and 2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2- Deoxyglucose (2-NBDG) was compared in terms of metabolic capacity. 2-NBDG can be used to measure glucose uptake, but primary metabolic processes; That is, it does not specify total oxidation or only glycolysis and production of lactate in the mitochondria. Mitotracker dye (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) can be used to measure mitochondrial mass. Comparison of eTIL and rTIL by this approach demonstrated enhancement of glucose updating in rTIL, as shown in Figure 4. This result is surprising because rTILs released directly from tumors are expected to be more glycolytic; However, when the mitochondrial mass of rTILs was assessed, they showed somewhat enhanced mitotracker levels compared to eTILs. These results demonstrate that rTILs were more metabolically active than eTILs even when expected to be less active, and suggest that rTILs may have a greater ability to mount an immune response against tumors than eTILs.

그의 기능적 능력을 추가로 평가하기 위해, rTIL을 브레펠딘 A 및 항-CD3, 항-CD28 및 항-CD137 항체로 코팅된 비드 (미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모피셔 사이언티픽, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한 디나비즈(DYNABEADS), 카탈로그 번호 11162D)로 밤새 자극하고, IFN-γ를 측정하였다. 세포를 수거하고, 투과화 후 IFN-γ에 대해 세포내 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 결과는 도 5에 제시된다.To further evaluate their functional capacity, rTILs were incubated with beads coated with brefeldin A and anti-CD3, anti-CD28, and anti-CD137 antibodies (commercially available from Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). After overnight stimulation with DYNABEADS (catalog number 11162D), IFN-γ was measured. Cells were harvested, intracellularly stained for IFN-γ after permeabilization, and assessed by flow cytometry. The results are presented in Figure 5.

세포를 또한 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신에 의해 자극하여 TIL이 시토카인을 생성하는 능력을 평가하였다. 결과는 또한 도 5에 제시된다. 그랜자임 B, TNF-α 및 IL-17A 수준을 또한 평가하였다. rTIL과 eTIL 사이에서 IL-17A 차이는 무시할 만하였고 TNFα 또는 그랜자임 B에서의 차이는 없었다 (데이터는 제시되지 않음). 놀랍게도, eTIL과 비교하여 rTIL에서 항-CD3/항-CD28/항-CD137 비드 및 PMA/ 이오노마이신 조건에 있어서 CD4⁺ 하위세트에서 (그러나 CD8⁺ T 세포에서는 아님) 다소 상승된 수준의 IFN-γ가 관찰되었다 (n = 3). 이러한 데이터는 rTIL이 기능적 적격 세포이며 eTIL보다 더 큰 기능적 역량의 증거를 나타낸다는 것을 시사한다.Cells were also stimulated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and ionomycin to assess the ability of TILs to produce cytokines. The results are also presented in Figure 5. Granzyme B, TNF-α and IL-17A levels were also assessed. Between rTILs and eTILs, differences in IL-17A were negligible and there were no differences in TNFα or granzyme B (data not shown). Surprisingly, slightly elevated levels of IFN- in CD4 ⁺ subsets (but not in CD8 ⁺ T cells) in anti-CD3/anti-CD28/anti-CD137 beads and PMA/ionomycin conditions in rTILs compared to eTILs. γ was observed (n = 3). These data suggest that rTILs are functionally competent cells and show evidence of greater functional capacity than eTILs.

실시예 4 - 종양 소화물로부터의 rTIL 및 eTIL의 REP의 비교Example 4 - Comparison of REP of rTIL and eTIL from tumor digests

eTIL 및 rTIL을 방사선 조사된 PBMC 피더, 항-CD3 항체 (OKT3) 및 IL-2를 사용한 급속 확장 프로토콜 (REP)에 14일 동안 적용하였다. 생존율 및 세포 수를 3종의 독립적 종양 (n = 3)에서 이중으로 평가하였다. 표현형 발현을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 미니-REP 실험에서의 성공적인 개시가 rTIL 및 eTIL 둘 다에 대해 관찰되었다. 놀랍게도 rTIL이 eTIL과 비교하여 다소 증진된 수의 세포를 나타냈지만 (p < 0.08), 항-CD3 항체 및 피더를 사용한 TIL의 REP 성능은 유사하였다 (도 6A). 사전-REP에서 관찰된 바와 같이 (실시예 2), REP-후 수득된 eTIL 및 rTIL은 표현형상 구별되었다. 사전-REP에서 관찰된 많은 표현형 차이, 예컨대 rTIL에서의 LAG3 및 TIM3 발현의 감소는 REP 동안 보존되었다 (도 6B).eTILs and rTILs were subjected to a rapid expansion protocol (REP) using irradiated PBMC feeders, anti-CD3 antibody (OKT3) and IL-2 for 14 days. Survival and cell counts were assessed in duplicate in three independent tumors (n = 3). Phenotypic expression was assessed by flow cytometry. Successful initiation in mini-REP experiments was observed for both rTIL and eTIL. Surprisingly, although rTILs showed a slightly enhanced number of cells compared to eTILs (p < 0.08), the REP performance of TILs using anti-CD3 antibodies and feeders was similar (Figure 6A). As observed pre-REP (Example 2), eTILs and rTILs obtained post-REP were phenotypically distinct. Many of the phenotypic differences observed in pre-REP, such as reduction of LAG3 and TIM3 expression in rTILs, were preserved during REP (Figure 6B).

eTIL 및 rTIL의 추가의 특성은 (1) 심층 TCR 서열분석, (2) 공동-배양 증식 (시토카인 혼합물을 사용한 rTIL/eTIL 공동-배양) 및 추가의 기능적 검정, (3) 전사 프로파일링에 대한 검정 (예를 들어, 나노스트링 테크놀로지스 엔카운터(NCOUNTER) 시스템 사용)의 결과에 기초하여 비교할 수 있다. TCR 서열분석은 Vb 레퍼토리를 포함한, TCR 레퍼토리의 클론성 및/또는 다양성을 평가할 수 있다. 또한 rTIL을 eTIL과 비교하기 위해 텔로미어 길이를 평가할 수 있다.Additional characterization of eTILs and rTILs includes (1) in-depth TCR sequencing, (2) assays for co-culture proliferation (rTIL/eTIL co-culture using cytokine mixture) and additional functional assays, and (3) transcriptional profiling. Comparisons can be made based on the results (e.g., using the Nanostring Technologies NCOUNTER system). TCR sequencing can assess the clonality and/or diversity of the TCR repertoire, including the Vb repertoire. Additionally, telomere length can be assessed to compare rTILs with eTILs.

실시예 5 - rTIL 및 rTIL과 eTIL의 조합을 사용한 인간 질환의 치료Example 5 - Treatment of human disease using rTIL and combinations of rTIL and eTIL

본 발명의 rTIL은 본원에 기재된 바와 같은 암의 치료에 사용될 수 있다. 환자 종양으로부터의 rTIL의 확장 및 환자의 치료에 대한 전체 방법 흐름도는 도 7에 도시되어 있다. 방법은 제시된 바와 같이 환자에게 주입되는 TIL 생성물에서 rTIL 대 eTIL 비의 조정을 가능하게 한다. rTIL 대 eTIL의 비는 rTIL 및 eTIL에서의 CD69 및/또는 T-세포 소진 마커의 차등 발현에 기초하는, 친화도 검정 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 공지된 다른 세포 분류 검정에 의해 선택할 수 있다.rTILs of the invention can be used in the treatment of cancer as described herein. The overall method flow diagram for expansion of rTILs from a patient's tumor and treatment of the patient is shown in Figure 7. The method allows for adjustment of the rTIL to eTIL ratio in the TIL product infused into the patient as presented. The ratio of rTIL to eTIL can be selected by affinity assays or other cell sorting assays known by those skilled in the art, based on differential expression of CD69 and/or T-cell exhaustion markers in rTIL and eTIL. there is.

도 8에서, 환자 종양으로부터 rTIL을 수득하는 단계, REP 단계를 사용하여 사전-REP 후 종양 잔유물로부터 rTIL을 확장시키는 단계, 림프구고갈 및 환자 내로의 rTIL의 주입을 수행하는 단계의 예시적인 방법을 제시하는 시간선이 병행 eTIL 방법과 함께 제시된다.In Figure 8, an exemplary method is presented comprising the steps of obtaining rTILs from a patient tumor, expanding rTILs from post-REP tumor remnants using a REP step, performing lymphodepletion and injection of rTILs into the patient. A timeline is presented along with a parallel eTIL method.

실시예 6 - eTIL 및 rTIL에서의 Vβ 레퍼토리를 평가하기 위한 연구Example 6 - Study to evaluate Vβ repertoire in eTIL and rTIL

eTIL 및 rTIL을 다양성 및 빈도와 관련하여 Vβ T 세포 수용체 레퍼토리에서의 차이에 대해 평가하였다.eTILs and rTILs were evaluated for differences in the Vβ T cell receptor repertoire with respect to diversity and frequency.

연구에서, 6개의 사전-REP eTIL/rTIL 쌍을 하기 조직학으로부터 수거하였다: 난소암; 신암 (n=2); 및 유방암 (TNBC n=2, ER+PR+ n=1). 세포 펠릿을 RNA 추출 및 Vβ 서열분석을 위해 드라이 아이스 상에서 아이레퍼토리(iRepertoire) (미국 알라바마주 헌츠빌)로 수송하였다.In the study, six pre-REP eTIL/rTIL pairs were collected from the following histologies: ovarian cancer; Renal cancer (n=2); and breast cancer (TNBC n=2, ER+PR+ n=1). Cell pellets were transported on dry ice to iRepertoire (Huntsville, AL) for RNA extraction and Vβ sequencing.

이 연구의 결과는 도 9-10 및 14-16에 예시되어 있다. 특히, 도 9 및 10은 각각 다양성 점수 및 공유된 CDR3의 %를 예시한다. 추가로, 각각 난소 암종, 신암종 및 삼중 음성 유방 암종에 대해 상위 50개의 공유된 CDR3을 나타내는 3개의 클론형 그래프가 도 14, 15 및 16에 제시되어 있다.The results of this study are illustrated in Figures 9-10 and 14-16. In particular, Figures 9 and 10 illustrate the diversity score and % of shared CDR3, respectively. Additionally, three clonotype graphs showing the top 50 shared CDR3s for ovarian carcinoma, renal carcinoma, and triple negative breast carcinoma, respectively, are presented in Figures 14, 15, and 16.

놀랍게도, TCRvβ 레퍼토리의 다양성은 eTIL에서보다 rTIL에서 더 크다 (도 9). eTIL 및 rTIL에서의 총 CDR3의 대략 30-50%가 공유되며 (도 10), 이는 두 집단에서 총 CDR3의 많은 백분율이 차등 발현된다는 것을 입증한다. 그러나, 공유된 CDR3 중에서 상위 50개의 클론이 두 집단 사이에서 대부분 공유되었으며, 이는 eTIL 및 rTIL이 유사한 항원 특이성을 갖는 클론을 갖는다는 것을 시사한다 (도 14-16 참조). 더욱이, 상위 50개의 클론의 빈도는 달라졌으며, 이는 다시 eTIL 및 rTIL이 놀랍게도 구별되는 T 세포 집단이라는 것을 시사한다.Surprisingly, the diversity of the TCRvβ repertoire is greater in rTILs than in eTILs (Figure 9). Approximately 30-50% of total CDR3 in eTIL and rTIL are shared (Figure 10), demonstrating that a large percentage of total CDR3 is differentially expressed in the two populations. However, among the shared CDR3s, the top 50 clones were mostly shared between the two populations, suggesting that eTILs and rTILs have clones with similar antigen specificity (see Figures 14-16). Moreover, the frequencies of the top 50 clones varied, again suggesting that eTILs and rTILs are surprisingly distinct T cell populations.

실시예 7 - 공동-배양 증식 검정의 연구Example 7 - Study of co-culture proliferation assay

공동-배양시 rTIL이 eTIL의 증식 상태를 변경할 수 있는지 여부 (또는 그 반대의 경우)를 결정하기 위해 eTIL 및 rTIL을 평가하였다.eTILs and rTILs were evaluated to determine whether rTILs can change the proliferative state of eTILs (or vice versa) when co-cultured.

연구에서, 5개의 사전-REP eTIL/rTIL 쌍을 하기 조직학으로부터 수거하였다: 신암, 삼중-음성 유방암 (TNBC), 흑색종, 폐암 및 결장직장암. 종양 잔유물로부터 37℃에서 60분 효소적 소화에 의해 rTIL을 단리하였다. 2개의 구별되는 집단을 독립적으로 추적하기 위해 eTIL을 셀 트레이스 옐로우로 염색하고, rTIL을 셀 트레이스 레드로 염색하였다. 1e6개의 eTIL, 5e5개의 eTIL + 5e5개의 rTIL, 및 1e6개의 rTIL을 IL-2 +/- 및 OKT3 (항-CD3 항체)과 함께 37℃에서 4일 동안 배양하고, 유동 세포측정법에 의해 증식에 대해 평가하였다.In the study, five pre-REP eTIL/rTIL pairs were collected from the following histologies: renal cancer, triple-negative breast cancer (TNBC), melanoma, lung cancer, and colorectal cancer. rTILs were isolated from tumor remnants by enzymatic digestion for 60 minutes at 37°C. To track two distinct populations independently, eTILs were stained with Cell Trace Yellow and rTILs were stained with Cell Trace Red. 1e6 eTILs, 5e5 eTILs + 5e5 rTILs, and 1e6 rTILs were incubated with IL-2 +/- and OKT3 (anti-CD3 antibody) for 4 days at 37°C and assayed for proliferation by flow cytometry. evaluated.

이 연구의 결과는 도 11에 예시되어 있다. 도 11에서, 모든 5종의 종양에서의 CD4+ 또는 CD8+ 집단으로부터의 eTIL은, 셀 트레이스 염료에서의 이동 (또는 염료 희석)에 의해 입증된 바와 같이, eTIL 단독과 비교하였을 때 항-CD3 항체와 함께 rTIL과 공동-배양시 증식 능력의 증진을 나타냈다. 적색은 eTIL을 나타내고, 청색은 rTIL과 공동-배양된 경우의 eTIL을 나타낸다.The results of this study are illustrated in Figure 11. In Figure 11, eTILs from the CD4+ or CD8+ populations in all five tumors were associated with anti-CD3 antibodies compared to eTILs alone, as evidenced by migration (or dye dilution) in Cell Trace dye. It showed enhanced proliferation ability when co-cultured with rTIL. Red represents eTIL, and blue represents eTIL when co-cultured with rTIL.

실시예 8 - 공동-배양 증식 검정의 연구Example 8 - Study of co-culture proliferation assay

rTIL 및 eTIL의 유전자 발현 프로파일에서의 유사성 및/또는 차이를 확인하기 위해 eTIL 및 rTIL을 평가하였다.eTILs and rTILs were evaluated to determine similarities and/or differences in the gene expression profiles of rTILs and eTILs.

연구에서, 유전자 발현의 디지털 판독을 전달하기 위해 mRNA에 멀티플렉스화된 색-코딩 바코드를 사용하는, 나노스트링의 엔카운터 기술을 이용하였다. 6개의 매칭된 eTIL 및 rTIL 샘플로부터의 정제된 RNA (RN이지, 퀴아젠(Qiagen))를 써모사이클러에서 16시간 동안 엔카운터 이뮤놀로지 V2 패널 코드세트와 혼성화시켰다. 코드세트는 써모사이클링 동안 22bp 상호작용을 통해 표적 RNA와 멀티플렉스화되는 포획 및 리포터 프로브의 혼합물로 이루어져 있다. 샘플을 12-웰 스프린트(SPRINT) 카트리지 내로 로딩하고, 엔카운터 스프린트 장치에서 실행시켰다. 계수 데이터는 맞춤 RCC 포맷으로 송출되고, 유전자 명칭을 프로브 ID에 매칭하는 RLF 파일에 매칭된다. 엔솔버(nSolver) 3.0 (나노스트링 테크놀로지스, 인크.)에서 정규화 및 분석을 수행하였다.The study used NanoString's Encounter technology, which uses color-coded barcodes multiplexed on mRNA to deliver a digital readout of gene expression. Purified RNA (RN Easy, Qiagen) from six matched eTIL and rTIL samples was hybridized with the Encounter Immunology V2 Panel Codeset for 16 hours in a thermocycler. The codeset consists of a mixture of capture and reporter probes that are multiplexed with the target RNA through a 22bp interaction during thermocycling. Samples were loaded into 12-well SPRINT cartridges and run on an Encounter SPRINT device. Count data are exported in a custom RCC format and matched to RLF files that match gene names to probe IDs. Normalization and analysis were performed in nSolver 3.0 (Nanostring Technologies, Inc.).

이 연구의 결과는 도 12 및 13에 예시되어 있다. 도 12 및 도 13에 제시된 바와 같이, 유전자 발현 프로파일은 eTIL 및 rTIL을 비교할 때 유의하게 상이하다 (도 12에서의 열 지도 참조). eTIL과 비교하여 rTIL에서 유의하게 상향조절 또는 하향조절되는 여러 유전자가 존재한다 (도 13).The results of this study are illustrated in Figures 12 and 13. As shown in Figures 12 and 13, gene expression profiles are significantly different when comparing eTILs and rTILs (see heat map in Figure 12). There are several genes that are significantly upregulated or downregulated in rTIL compared to eTIL (Figure 13).

SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. <120> REMNANT TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME <130> 116983-5016-WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro 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Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab light chain <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-2 <400> 3 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 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Sequence <220> <223> recombinant human IL-4 <400> 5 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 6 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-7 <400> 6 Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 35 40 45 Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 50 55 60 Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 65 70 75 80 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 85 90 95 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 130 135 140 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-15 <400> 7 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser 115 <210> 8 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-21 <400> 8 Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 1 5 10 15 Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 20 25 30 Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 50 55 60 Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 85 90 95 Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 100 105 110 Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 115 120 125 Ser Glu Asp Ser 130 SEQUENCE LISTING <110> Iovance Biotherapeutics, Inc. <120> REMNANT TUMOR INFILTRATING LYMPHOCYTES AND METHODS OF PREPARING AND USING THE SAME <130> 116983-5016-WO <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab heavy chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser 180 185 190 Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser 195 200 205 Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Muromonab light chain <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Ala Asp Thr Ala Pro 100 105 110 Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn 130 135 140 Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn 145 150 155 160 Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 3 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-2 <400> 3 Met Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu 1 5 10 15 His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr 20 25 30 Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro 35 40 45 Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His 65 70 75 80 Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu 85 90 95 Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr 100 105 110 Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser 115 120 125 Ile Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> aldesleukin <400> 4 Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu 1 5 10 15 Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn 20 25 30 Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys 35 40 45 Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro 50 55 60 Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 65 70 75 80 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 85 90 95 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 100 105 110 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile 115 120 125 Ser Thr Leu Thr 130 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-4 <400> 5 Met His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn 1 5 10 15 Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp 20 25 30 Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg 35 40 45 Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr 50 55 60 Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln Phe His Arg His Lys Gln Leu 65 70 75 80 Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly 85 90 95 Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn 100 105 110 Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys 115 120 125 Ser Ser 130 <210> 6 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-7 <400> 6 Met Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val 1 5 10 15 Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly 20 25 30 Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys 35 40 45 Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg Ala Ala Arg Lys Leu 50 55 60 Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp Phe Asp Leu His Leu 65 70 75 80 Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr Gly Gln 85 90 95 Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys 100 105 110 Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp 115 120 125 Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn 130 135 140 Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His 145 150 <210> 7 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant human IL-15 <400> 7 Met Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu 1 5 10 15 Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val 20 25 30 His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu 35 40 45 Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val 50 55 60 Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn 65 70 75 80 Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn 85 90 95 Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile 100 105 110 Asn Thr Ser 115 <210> 8 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-21 <400> 8 Met Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val 1 5 10 15 Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro 20 25 30 Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys 35 40 45 Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg 50 55 60 Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr 65 70 75 80 Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp 85 90 95 Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser 100 105 110 Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly 115 120 125 Ser Glu Asp Ser 130

Claims

(a) fragmenting tumor tissue containing tumor infiltrating lymphocytes (TIL) from the patient;
(b) treating tumor tissue with first cell culture medium and interleukin 2 (IL-2) in a gas permeable container to provide tumor remnants and emergent TILs (eTILs);
(c) removing at least a plurality of eTILs;
(d) enzymatically digesting tumor remnants into tumor remnant cells using a digestion mixture; and
(e) Expansion of tumor residual cells with a second cell culture medium containing cell culture medium, irradiated feeder cells, OKT-3 antibody, and IL-2 in a gas permeable vessel, resulting in expanded numbers of residual tumor infiltrating lymphocytes ( It includes the step of providing rTIL (remnant tumor infiltrating lymphocyte),
wherein the rTIL expresses a reduced level of a T cell exhaustion marker compared to the eTIL, wherein the T cell exhaustion marker is selected from the group consisting of TIM3, LAG3, TIGIT, CTLA-4, and combinations thereof.
Method for producing residual tumor infiltrating lymphocytes (rTIL) for adoptive T cell therapy.

The method of claim 1, wherein the tumor tissue is melanoma tumor tissue, head and neck tumor tissue, breast tumor tissue, renal tumor tissue, pancreatic tumor tissue, glioblastoma tumor tissue, lung tumor tissue, colorectal tumor tissue, sarcoma tumor tissue, triple negative A method selected from the group consisting of breast tumor tissue, cervical tumor tissue, ovarian tumor tissue, and acute myeloid leukemia bone marrow or tumor tissue.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the irradiated feeder cells comprise irradiated allogeneic peripheral blood mononuclear cells.

3. The method of claim 1 or 2, wherein IL-2 is present in the second cell culture medium at an initial concentration of 3000 IU/mL and the OKT-3 antibody is present in the second cell culture medium at an initial concentration of 30 ng/mL. How to exist.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the expression of at least one T cell exhaustion marker on CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells in rTIL is reduced by at least 10% compared to eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the T cell exhaustion marker is LAG3 on CD8 ⁺ T cells and the expression of LAG3 in rTIL is reduced by at least 2-fold compared to eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the T cell exhaustion marker is TIM3 on CD8 ⁺ T cells and the expression of TIM3 in rTIL is reduced by at least 3-fold compared to eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the T cell exhaustion marker is TIM3 on CD4 ⁺ T cells and the expression of TIM3 in rTIL is reduced by at least 2-fold compared to eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the expression level of TIM3 and LAG3 in the rTIL is undetectable by flow cytometry.

3. The method of claim 1 or 2, wherein CD56 ⁺ expression in rTIL is reduced by at least 3-fold compared to CD56 ⁺ expression in eTIL.

The method of claim 1 or 2, wherein CD69 ⁺ expression in rTIL is increased by at least 2-fold compared to CD69 ⁺ expression in eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the digestion mixture comprises deoxyribonuclease, collagenase and hyaluronidase.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the first cell culture medium further comprises a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof.

3. The method of claim 1 or 2, wherein the second cell culture medium further comprises a cytokine selected from the group consisting of IL-4, IL-7, IL-15, IL-21, and combinations thereof.

3. The method of claim 1 or 2, further comprising cryopreserving an expanded number of rTILs to form a cryopreserved rTIL population.

16. The method of claim 15, further comprising thawing the cryopreserved rTIL population.

The method of claim 1 or 2, wherein the rTIL is free of eTIL.

3. The method of claim 1 or 2, wherein expanding the tumor residual cells with the second cell culture medium comprises adding eTIL to the second cell culture medium to provide a selected rTIL to eTIL ratio.

3. The method of claim 1 or 2, further comprising adding eTIL to rTIL to provide a selected rTIL to eTIL ratio.

19. The method of claim 18, wherein the selected rTIL to eTIL ratio is at least 1% rTIL to eTIL.

21. The method of claim 20, wherein the selected rTIL to eTIL ratio is at most 99.9% rTIL to eTIL.

19. The method of claim 18, wherein the selected rTIL to eTIL ratio is 1:99, 5:95, 10:90, 15:85, 20:80, 25:75, 30:70, 35:65, 40:60, 45:55 , a group consisting of 50:50, 55:45, 60:40, 65:35, 70:30, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5, and 99:1 rTIL versus eTIL. A method that is selected from .

1. A pharmaceutical composition comprising rTIL for use in a method of treating cancer in a patient in need thereof, wherein said treatment comprises delivering a therapeutically effective amount of rTIL to the patient, wherein said rTIL is used in the method of claim 1. A pharmaceutical composition prepared according to the invention.

(a) obtaining rTIL from a tumor resected from a patient in need of treatment for cancer according to the method of claim 1;
(b) treating the patient with a non-myeloablative lymphodepleting therapy prior to administering the rTIL to the patient;
(c) administering a therapeutically effective amount of rTIL to the patient, wherein the therapeutically effective amount of rTIL may optionally be cryopreserved and thawed prior to administration to the patient; and
(d) treating the patient with high-dose IL-2 therapy, starting the day after administering the rTIL to the patient.
A pharmaceutical composition comprising rTIL for use in a method of treating cancer in a patient in need thereof, comprising.

25. The pharmaceutical composition of claim 23 or 24, wherein a therapeutically effective amount of eTIL is mixed with rTIL.

25. The method of claim 24, wherein the non-myeloablative lymphodepleting therapy consists of administration of cyclophosphamide at a dose of 60 mg/m ² /day for 2 days followed by Fluda at a dose of 25 mg/m ² /day for 5 days. A pharmaceutical composition comprising the step of administering labine.

25. The method of claim 24, wherein the high dose IL-2 therapy comprises 600,000 or 720,000 IU/kg of aldesleukin or a biosimilar or variant thereof administered as a 15 minute bolus intravenous infusion every 8 hours until tolerance. A pharmaceutical composition that does.

25. The method of claim 23 or 24, wherein the cancer is melanoma, double-refractory melanoma, uveal melanoma, ovarian cancer, cervical cancer, lung cancer, bladder cancer, breast cancer, head and neck cancer, renal cell carcinoma, acute myeloid leukemia, colon. A pharmaceutical composition selected from the group consisting of rectal cancer and sarcoma.

29. The pharmaceutical composition of claim 28, wherein the cancer is breast cancer and the breast cancer is selected from the group consisting of triple negative breast cancer, estrogen receptor-positive breast cancer, progesterone receptor-positive breast cancer, and estrogen receptor-positive/progesterone receptor-positive breast cancer.

29. The pharmaceutical composition of claim 28, wherein the cancer is lung cancer and the lung cancer is selected from the group consisting of non-small cell lung cancer and small cell lung cancer.