KR102610691B1 - 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 hmgb1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 시스템 - Google Patents

헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 hmgb1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 숙주 세포 내의 특정 유전자를 타겟으로 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 방법을 통해 헤르페스 바이러스 유전자의 발현을 감소시켜 비리온 생산을 효과적으로 감소시킬 수 있는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물을 제공한다. 또한 HMGB1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 HMGB1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 시스템 {Composition for the treatment of herpes virus infection and HMGB1-targeted drug screening system}
본 발명은 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물 및 HMGB1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 시스템에 관한 것으로서, 더 상세하게는 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 방법을 이용한 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물 및, HMGB1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인간 헤르페스 바이러스 계열에 속하는 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV)는 카포시 육종, 원발성 삼출 림프종, 다발성 캐슬만병 및 KSHV 염증성 사이토카인 증후군 등을 유발한다(Goncalves PH et al., Curr Opin HIV AIDS, 12:47-56. 2017). 상기 바이러스는 숙주 세포의 세포 내 환경을 재구성하여 바이러스 자손의 생산을 증폭하고 항-바이러스 반응을 파괴한다. 사실, 몇몇 KSHV 단백질은 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 것으로 보고된 반면, 특정 숙주 단백질은 KSHV의 수명주기에서 중요한 역할을 할 수 있다(Zhang F et al., PLoS Pathog 15:e1007628. 2019).
한편 고 이동성 그룹 박스 1 단백질(HMGB1)은 중요한 염색질 단백질로 핵에서 DNA를 구성하고 뉴클레오솜, 전사인자 및 히스톤과의 상호작용을 통해 전사를 조절한다. 또한, HMGB1은 리더리스 분비 경로(leaderless secretory pathway)를 통해 세포에서 분비될 수 있고 상기 분비된 HMGB1은 RAGE(Advanced glycation end-products) 수용체와 TLR(Toll-like receptors)에 결합하여 염증의 사이토카인 매개체 역할을 한다(Sims GP et al., Annu Rev Immunol. 28:367-88. 2010). 결과적으로 HMGB1은 NF-κB, MAPKs(mitogen-activated protein kinases) 및 phosphoinositide 3-kinase을 포함한 다운스트림 신호전달 경로의 구성요소를 활성화하여 염증반응을 조절하고 세포 증식, 혈관신생, 세포 부착 및 이동을 촉진한다. 또한 HMGB1은 바이러스 성 전염병에서 병원성 역할을 하고 KSHV의 용해 복제를 조절하는 것으로 나타났다.
그러나 종래 연구에서 KSHV 수명주기 동안 HMGB1의 역할이 제안되었지만 KSHV에 감염된 세포에서 KSHV 수명주기에 대한 HMGB1의 광범위한 기능적 효과는 여전히 미개척 분야이다.
본 발명은 KSHV 잠복성 복제 검출 및 바이러스 불활성화 방법에 대한 기존 연구들과는 달리 숙주 세포 내의 특정 유전자를 타겟으로 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 방법을 통해 헤르페스 바이러스 유전자의 발현을 감소시켜 비리온 생산을 효과적으로 감소시킬 수 있는 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 헤르페스 바이러스 감염증 치료를 위해 일시적으로 HMGB1 단백질 발현을 억제시킬 수 있는 HMGB1을 표적으로 하는 약물 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 표적으로 하는 HMGB1(High mobility group box 1) 유전자 넉-아웃용 sgRNA가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 HMGB1 유전자 넉-아웃용 sgRNA; 및 Cas9 RNA를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물을 숙주 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 헤르페스 바이러스의 증식 억제방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, HMGB1 유전자를 발현하는 세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리된 세포로부터 상기 HMGB1 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 피검 물질이 처리되지 않은 대조군에 비해 상기 HMGB1 유전자의 발현 또는 활성을 유의하게 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물은 KSHV가 숙주에 감염되었을 때 숙주내에서 용해복제를 억제할 수 있는 HMGB1의 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 방법을 통한 KSHV 용해 복제를 효과적으로 억제함에 따라 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스의 비리온 생산을 억제할 수 있으므로 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스 감염증의 치료제 생산에 활용할 수 있다. 또한 일시적으로 HMGB1 단백질 발현을 억제시킬 수 있는 HMGB1을 표적으로 하는 약물을 스크리닝할 수 있어 헤르페스 바이러스 감염증 치료에 사용할 수 있는 약물을 선별할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1a는 KSHV-생산 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1의 발현을 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다. 세포 용해물은 용해 복제가 유도되거나 유도되지 않은 iSLK BAC16 세포에서 수득하였고 HMGB1 발현은 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 1b는 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1 발현을 관찰한 형광현미경 사진이다. iSLK BAC16 세포에서 HMGB1 발현을 면역형광 분석(빨간색)에 의해 시각화하였다; 핵은 DAPI(파란색)로 염색되었고 세포질 HMGB1은 흰색 화살표로 표시되었다. 스케일 바, 10 μm.
도 1c는 iSLK BAC16 세포에 의한 세포 외 공간으로의 HMGB1 분비를 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다. 용해 복제(-) 없이 또는 용해 복제 유도 후 24 또는 48시간 후에 iSLK BAC16 세포로부터 상등액을 수득하였다. Amicon Ultra 원심분리 필터(MW 10,000)를 사용하여 배양 상등액을 농축하고 웨스턴 블롯팅으로 분석했다.
도 1d는 iSLK BAC16 세포에서 수득한 상등액에서 HMGB1 발현의 밀도 측정 분석 결과를 나타내는 그래프이다. 통계적 유의성은 하기과 같이 표시된다. ** P <0.01, One-way ANOVA 테스트.
도 2a는 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1의 넉아웃에 관한 것으로 HMGB1의 Cas9 표적화 부위에서 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머를 나타내는 개요도이다. PCR 증폭용 합성 프라이머 및 CRISPR/Cas9 crRNA는 각각 자주색과 녹색으로 표시된다. iSLK BAC16 세포는 HMGB1에 대한 CRISPR/Cas9 시스템 및 gRNA를 사용하여 처리되었다. HMGB1를 넉아웃(KO)한 분리된 클론은 HMGB1 서열, HMGB1 단백질 발현 및 세포 증식에 대해 분석했다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 설계된 프라이머를 사용한 HMGB1 야생형(WT) 및 KO 클론에 대한 정량적 PCR 분석 그래프 및 겔 사진이다. 삼중 샘플 및 겔 전기영동(아래)의 대표적인 PCR 제품을 사용한 qPCR의 용융 곡선 분석(위)을 나타낸다.
도 2c는 WT 및 KO iSLK BAC16 세포에서 HMGB1 서열 분석 결과를 나타내는 개요도이다. WT 및 KO 클론의 HMGB1-FR PCR 산물을 T-벡터로 클로닝하고 서열을 10 개의 콜로니에서 기존의 시퀀싱으로 분석했다. KO 클론에서 HMGB1의 CRISPR/Cas9 표적 부위에 삽입된 뉴클레오티드는 빨간색 박스로 표시하였다.
도 2d는 WT 및 HMGB1-KO 세포에서 HMGB1 발현을 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다.
도 2e는 면역형광 분석을 통해 HMGB1의 발현을 관찰한 형광 이미지 사진이다. 스케일 바, 50 μm.
도 2f는 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포의 증식을 분석한 것으로 각 시점에서 트립판 블루로 염색된 죽은 세포를 배제한 살아있는 세포 수를 계수하여 분석한 그래프이다. ns, 유의하지 않음, Student 's t-test.
도 2g는 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포의 증식을 분석한 것으로 WST-1 생존력 테스트를 분석한 그래프이다. 통계적 유의성은 하기와 같이 표시된다. ns, 유의하지 않음, Student 's t-test.
도 3a는 HMGB1 넉아웃 iSLK BAC16 세포에서 KSHV 유전자, 숙주 세포 유전자및 miRNA의 발현을 분석한 것으로 (KSHV 용해 복제(유도-) 또는 (유도+)의 HMGB1 WT 대 KO iSLK BAC16 세포에 대한 유전자 발현 수준의 계층적 클러스터 맵이다. 야생형(WT) 및 HMGB1 넉아웃(KO) 세포의 전사체는 유전자 발현 옴니버스에 기탁된 데이터인 mRNA-seq로 분석하였다(접근번호, 157275, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE157275 및 172275, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE172275).
도 3b는 mRNA-seq 결과의 풍부한 온톨로지 클러스터(enriched ontology clusters)의 Metascape 경로를 분석한 그림이다. WT 세포와 비교하여 재활성화된 HMGB1-KO 세포에서 영향을 받는 상위 경로를 나타내었다.
도 3c는 KSHV 용해 복제(유도-) 또는 (유도+)에 따른 HMGB1 WT 대 KO iSLK BAC16 세포에 대한 miRNA 발현 수준을 나타내는 계층적 클러스터 맵이다.
도 3d는 KSHV 용해 복제(유도-) 또는 (유도+)에 따른 HMGB1 WT 대 KO iSLK BAC16 세포에 대한 KSHV 바이러스 유전자들의 Read Count 값을 비교 분석하여 히트 맵으로 나타낸 것이다.
도 4a는 HMGB1 넉아웃 iSLK BAC16 세포에서 KSHV의 유전자 발현을 분석한 것으로 정량적 RT-PCR(qPCR)에 의해 결정된 KSHV ORF72, ORF73, K13, ORF50, ORF59, K8, ORF74, ORF65 및 K8.1의 상대적 mRNA 발현 수준 결과를 분석한 그래프이다. KSHV 유전자 발현은 용해 복제 유도 후 HMGB1 넉아웃(KO) 및 야생형(WT) iSLK BAC16 세포에서 분석되었다. 통계적 유의성은 하기와 같이 표시된다. * P <0.05, ** P <0.01, Student's t- test.
도 4b는 KSHV ORF73, ORF50, K8.1 및 ORF57 단백질의 발현 수준을 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다. 표시된 숫자는 베타-액틴 신호에 의해 정규화된 각 표적 단백질 밴드에 대한 농도계 값이다.
도 5a는 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1을 사용한 핵산 리모델링을 분석한 것으로 용해 복제 부재시 HMGB1-상호작용 단백질에 대한 데이터를 관찰한 항체면역침강법 후 면역 블롯팅 겔 사진이다. 야생형(WT) 또는 HMGB1 넉아웃(KO) iSLK BAC16 세포로부터 제조된 세포 용해물을 항-HMGB1 항체로 침전시켰다. 토끼 IgG는 침전에 대한 음성 대조군으로 사용되었다. 상기 침전된 단백질은 항-HMGB1 항체, 항-KSHV ORF50 항체, 항-KSHV ORF73 항체, 항-HDAC1 항체 및 항-b-액틴 항체로 면역 블롯팅하여 분석했다.
도 5b는 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1을 사용한 핵산 리모델링을 분석한 것으로 용해 복제 유도시 HMGB1-상호작용 단백질에 대한 데이터를 관찰한 항체면역침강법 후 면역 블롯팅 겔 사진이다. 예상 단백질의 크기는 검은 색 화살표로 표시된다. 다른 단백질과 복합체 형태로 생각되는 밴드는 빨간색 화살표로 표시하였다.
도 6a는 HMGB1 넉아웃에 의한 신호 전달 경로의 억제를 관찰한 것으로 용해 복제 유도 후 48시간에 단백질 용해물을 수집하고 야생형(WT) 및 HMGB1-넉아웃(KO) iSLK BAC16 세포의 단백질 발현을 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다. HMGB1-넉아웃(KO) iSLK BAC16 세포에서 p38, JNK, 및 ERK의 활성화 수준의 변화를 조사하였다.
도 6b는 HMGB1 넉아웃에 의한 신호 전달 경로의 억제를 관찰한 것으로 웨스턴 블롯팅의 결과를 밀도 분석(densitometric analysis)으로 나타낸 그래프이다. * P <0.05, ** P <0.01; ns, 유의하지 않음, Student 's t-test.
도 6c는 HMGB1 넉아웃에 의한 신호 전달 경로의 억제를 관찰한 것으로 WT iSLK BAC16 세포배양 조건 배지 처리는 HMGB1 넉아웃 세포에서의 JNK 인산화를 회복시킴을 관찰한 겔 사진이다. WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포의 상등액을 사용하여 HMBG1-KO iSLK BAC16 세포를 1시간 동안 처리한 후 p-JNK를 웨스턴 블롯 분석으로 분석했다.
도 6d는 HMGB1 넉아웃에 의한 신호 전달 경로의 억제를 관찰한 것으로 KSHV의 용해 복제는 글리시리진에 의해 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 억제 여부를 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다. 용해 복제 유도 후 48시간에 글리시리진 유무에 관계없이 세포 용해물을 수집하고 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석했다. DMSO는 비히클 대조군으로 사용되었다.
도 7a는 HMGB1 넉아웃 iSLK BAC16 세포에서 감소된 KSHV 생산을 관찰한 것으로 야생형(WT) 및 HMGB1 넉아웃(KO) iSLK BAC16 세포에 의해 생성된 비리온 샘플에서 바이러스 단백질의 발현을 관찰한 웨스턴 블롯팅 겔 사진이다.
도 7b는 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포로부터 수집된 비리온의 KSHV 게놈 카피 수를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. ** P <0.01, Student 's t-test.
도 7c는 WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 분리된 비리온에 의해 감염된 인간제대정맥내피세포(HUVEC)의 현미경 이미지이다. 상기 형광 현미경 이미지에서 감염된 세포는 녹색 형광 단백질 발현으로 인해 녹색으로 표시된다. 스케일 바는 250 μm이다.
도 7d는 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 수득한 KSHV 비리온의 감염성에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7e는 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 수득한 KSHV 비리온의 감염성에 대한 유세포 분석 결과를 나타내는 그래프이다. ** P <0.01, Student 's t-test.
도 7f는 WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포로부터 분리된 KSHV 비리온으로 감염된 HUVEC에서 KSHV ORF73 mRNA의 발현을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 바이러스 감염 후 총 RNA를 추출하고 mRNA 발현을 RT-qPCR로 분석하였다. ** P <0.01, Student 's t-test.
도 7g는 WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 수득한 KSHV 비리온으로 감염된 HUVEC의 총 KSHV DNA 수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다. 감염 후 총 게놈 DNA를 추출하고 KSHV ORF26 용 프라이머를 사용하여 qPCR로 KSHV DNA를 정량화 하였다. 모든 그래프에서 통계적 유의성은 하기와 같이 표시하였다. ** P <0.01, Student 's t-test.
용어의 정의:
본 문서에서 사용되는 용어 "카포시 육종-관련 헤르페스 바이러스(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus, KSHV)"는 현재 발암바이러스(oncovirus)라 일컫는 인간 암 바이러스의 7종류 중 하나이다. 또한 카포시 육종-관련 헤르페스바이러스는 인간 헤르페스 바이러스의 8번째 종류이기도 하다. 이것의 공식적인 이름은 세계 바이러스 분류 위원회(International Committee on Taxonomy of Viruses, ITCV)에서 HHV-8로 명명했다. 다른 헤르페스바이러스들과 마찬가지로 KSHV란 이름과 HHV-8이란 이름으로 통용된다. 상기 바이러스는 AIDS환자에게서 흔히 발생하는 카포시육종(Kaposi's Sarcoma)을 일으킬 뿐만 아니라 원발성삼출성림프종(Primary effusion lymphoma, PEL)과 다심성 캐슬맨 질병(multicentric Castleman's disease)의 원인이 된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "비리온(virion)"은 캡시드와 핵산으로 이루어진 온전한 형태의 바이러스 입자를 의미한다. 간단한 비리온은 핵산과 이를 둘러싼 단백질구조물(capsid)로 구성되어 있고 핵산은 DNA 혹은 RNA 중 한 가지이며, 캡시드는 1종 또는 2종이상의 단백질이 규칙적으로 배열되어 껍질모양을 형성한다. 캡시드와 핵산의 결합체를 뉴크래오캡시드라 하며 이를 외피(envelope)로 다시 둘러싸고 있는 복잡한 구조의 비리온도 있다. 외피는 당단백질의 돌기가 있는 이중의 지질막으로 구성되어 있다.
본 문서에서 사용되는 용어 "HMGB1(High mobility group box 1)"은 암포 테린(amphoterin,)으로도 알려진 고 이동성 그룹 박스 1 단백질은 인간에서 HMGB1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. HMGB1은 다양한 질병에서 복잡한 역할을 하는 많은 세포 내/외 생물학적 기능을 가지고 있고 특정 바이러스 감염에서 HMGB1은 바이러스 수명주기와 병인에 영향을 미친다.
본 문서에서 사용되는 용어 "단일-가이드 RNA(single guide RNA)"는 자연적으로 발생하는 2-피스 가이드 RNA 복합체의 버전으로 단일 연속 서열로 구성되었다. 단순화된 단일 가이드 RNA는 Cas9 단백질이 게놈 편집을 위해 특정 DNA 서열을 결합하고 절단하도록 지시하는 데 사용된다.
본 문서에서 사용되는 용어 "넉-아웃(knock-out)"은 특정 유전자 위치에 상동유전자 재조합에 의하여 변이된 유전자를 도입하여 특정 유전자의 발현이 일어나지 않도록 하는 것을 말한다.
본 문서에서 사용되는 용어 "CRISPR/Cas9(clustered reg㎕atory interspaced short palindromic repeat)"는 유전자가위이며 구성성분인 sgRNA는 특정 DNA 염기배열 20bp를 인식할 수 있는 능력을 가지고 있고 Cas9 단백질은 sgRNA와 결합한 특정 DNA을 절단하는 능력이 있는 것으로 보고되고 있다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 표적으로 하는 HMGB1(High mobility group box 1) 유전자 넉-아웃용 sgRNA가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 HMGB1 유전자 넉-아웃용 sgRNA; 및 Cas9 RNA를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물이 제공된다.
상기 조성물에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스는 단순포진바이러스 1형(Herpes Simplex Virus 1, HSV1), 단순포진바이러스 2형(Herpes Simplex Virus 2, HSV2), 수두대상포진바이러스(Varicella zoster virus), 엡스타인바바이러스(Epstein-Barr virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 장미진바이러스(HHV-6: Human Herpesvirus 6, 및 HHV-7: Human Herpesvirus 7) 또는 카폭시 육종 헤르페스 바이러스(HHV-8)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물을 숙주 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 헤르페스 바이러스의 증식 억제방법이 제공된다.
상기 억제방법에 있어서, 상기 헤르페스 바이러스는 단순포진바이러스 1형(Herpes Simplex Virus 1, HSV1), 단순포진바이러스 2형(Herpes Simplex Virus 2, HSV2), 수두대상포진바이러스(Varicella zoster virus), 엡스타인바바이러스(Epstein-Barr virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 장미진바이러스(HHV-6: Human Herpesvirus 6, 및 HHV-7: Human Herpesvirus 7) 또는 카폭시 육종 헤르페스 바이러스(HHV-8)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, HMGB1 유전자를 발현하는 세포에 피검 물질을 처리하는 단계; 상기 피검 물질이 처리된 세포로부터 상기 HMGB1 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 피검 물질이 처리되지 않은 대조군에 비해 상기 HMGB1 유전자의 발현 또는 활성을 유의하게 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 세포는 iSLK BAC16일 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효량은 환자의 환부의 종류, 적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.
본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.
상기 조성물은 상기 담체 외에 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러 상기 "약학적으로 허용가능한"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 포유동물에 투여시, 활성 성분의 신속한 방출, 또는 지속 또는 지연된 방출이 가능하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 비경구, 예를 들면 좌제, 경피, 정맥, 복강, 근육내, 병변내, 비강, 척추관내 투여로 투여될 수 있으며, 또한 서방형 또는 연속적 또는 반복적 방출을 위한 이식장치를 사용하여 투여될 수 있다. 투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다.
종래 연구에 의하면 HMGB1은 엡스타인-바 바이러스 및 인간 T-세포 림프성 바이러스 I 형을 포함한 특정 바이러스에 감염된 후 숙주 세포에서 상향조절되기 때문에 바이러스 수명주기에 영향을 미친다고 보고하였다. 바이러스에 감염된 세포에서 HMGB1은 세포 기능과 바이러스 복제에 영향을 미친다. B형 간염 바이러스 X 단백질은 HMGB1에 결합하여 간세포에서 자가포식(autophagy)을 유발하는 것으로 보고되었다(Fu S et al., Mol Oncol. 12:322-338. 2018). 또한 HMGB1은 인플루엔자 바이러스 리보핵 단백질의 핵단백질 성분에 결합하여 바이러스 중합 효소의 전사/복제 활성을 향상시킨다. KSHV와 관련하여 종래 연구에서는 HMGB1이 KSHV 표적 유전자의 RTA 반응 요소에 결합하는 KSHV 복제 및 전사 활성화인자(RTA)를 향상시킨다는 것을 입증했다(Song MJ et al., J Virol. 78:12940-50. 2004). 또한 HMGB1은 RTA와 함께 KSHV ORF50 프로모터에 결합하고 상승적으로 상향조절한다고 보고했다. 그러나 종래 연구에서 KSHV 수명주기 동안 HMGB1의 역할이 제안되었지만 KSHV에 감염된 세포에서 KSHV 수명주기에 대한 HMGB1의 광범위한 기능적 효과는 완전히 밝혀지지 않았다. 특히, 세포 외 HMGB1 발현과 KSHV 생산 세포에 대한 조절 효과에 대해서는 알려진 바가 거의 없다
구체적으로 다중 숙주 단백질은 잠복(latent) 및 용해 복제(lytic replication) 동안 카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)의 유전자 발현에 영향을 미친다. 고 이동성 그룹 박스 1(HMGB1)은 세포 내부의 고도로 보존된 염색체 단백질과 세포 외부의 원형 손상 관련 분자 패턴 분자 역할을 한다. HMGB1은 바이러스 성 전염병에서 병원성 역할을 하고 KSHV의 용해 복제를 조절하는 것으로 나타났다. 그러나 KSHV에 감염된 세포에서 KSHV 수명 주기에 대한 기능적 영향은 완전히 밝혀지지 않았다.
본 발명자들은 KSHV-생산 iSLK BAC16 세포주에서 CRISPR/Cas9 매개 HMGB1 넉아웃을 이용하여 KSHV 비리온 생산에서 세포 내 및 세포 외 HMGB1의 역할을 조사했다. 세포 내 HMGB1은 다양한 단백질과 복합체를 형성했으며, HMGB1 상호작용 단백질의 풍부도(abundance)는 잠복 및 용해 복제 동안 변경되었다. 바이러스 유전자의 발현은 HMGB1-넉아웃 iSLK BAC16 세포에서 용해 복제 동안 약화되었으며, 야생형 세포에 비해 감염성 비리온의 생산이 현저하게 감소했다. HMGB1이 KSHV 생산에 영향을 미치는 과정은 감염된 세포 내부 또는 외부에서 발생할 수 있다. 예컨대, 여러 세포 및 바이러스 단백질이 뉴클레오솜 복합체에서 세포 내 HMGB1과 상호작용하는 반면 세포 외 HMGB1은 JNK 인산화를 유도하여 용해 복제를 향상시킨다. 결론적으로 본 발명은 HMGB1이 용해 복제 동안 감염성 KSHV 자손의 생성에 영향을 미치는 중요한 세포 보조 인자임을 나타낸다. 본 발명은 세포 내 및 세포 외 HMGB1이 효율적인 KSHV 복제에 필요하다는 것을 시사하므로 상기 HMGB1은 KSHV 생산 조절에 효과적인 치료 표적이 될 수 있다.
본 발명은 KSHV 잠복성 복제 검출 및 바이러스 불활성화 방법에 대한 기존 특허들과는 달리, KSHV가 숙주에 감염되었을 때 숙주내에서 용해 복제를 억제할 수 있는 숙주세포내의 특정유전자를 타겟으로 하는 것으로 국내 및 국외에서 최초로 보고되는 연구 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실험 및 재료
세포배양 및 시약
본 발명에서 사용된 iSLK BAC16 세포는 10% 우태아 혈청(FBS, GenDEPOT, Katy, TX), 1% 항생제 항진균(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA), 제네티신(250 μg/mL, Thermo Fisher Scientific) 및 퓨로마이신(1 μg/mL, Thermo Fisher Scientific)을 첨가한 고 포도당 Dulbecco`s modified Eagle`s medium (WelGene, Gyeongsan, South Korea)에서 배양하였다. 상기 BAC16은 감염을 모니터링하기 위해 GFP를 인코딩하는 카세트가 포함되어 있는데 iSLK BAC16 세포는 안정된 잠복 감염을 달성하기 위해 하이그로마이신(hygromycin)과 함께 선택되었다. HUVEC는 PromoCell(Heidelberg, Germany)에서 구입하여 세포 성장 첨가제를 포함하는 내피세포성장배지 2(PromoCell)에서 배양했다. 모든 세포는 37℃에서 95% 공기와 5% CO2를 포함하는 가습 환경에서 배양되거나 유지되었고 글리시리진(Glycyrrhizin)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입했다.
웨스턴 블로팅
웨스턴 블로팅에 사용된 총 단백질은 20 mM Tris-HCl(pH 6.8), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100 또는 0.1 mM NaF, 0.1 mM PMSF, 1 mM 베타-글리세로포스페이트 및 0.1 mM 나트륨 오르토 바나데이트가 첨가된 RIPA 버퍼(LPS 솔루션, 대전, 대한민국)를 포함하는 세포 용해 버퍼를 사용하여 수득하였다. 단백질 현탁액을 4℃에서 15분 동안 배양한 다음 14,000ㅧg 조건으로 15분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 수집하였고 단백질 농도를 bicinchoninic acid 분석(Pierce, Rockford, IL)으로 측정하였다. 그 후 상기 단백질을 10% 및 15% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels에서 분리하고 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이송하였다. 상기 멤브레인은 0.1% TBST 용액 (0.1% Tween 20을 포함하는 1x Tris 완충 식염수)에 5% 탈지유가 들어있는 로커에서 4℃ 조건으로 밤새 차단되었다. 1차 항체를 TBST의 5% 소혈청알부민(BSA)에 희석하고 밤새 4℃에서 교반하여 샘플과 반응시켰다. 면역표지된 단백질은 Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 및 Chemidoc 터치 이미징 시스템 (Bio-Rad Laboratories) 또는 자기방사법(autoradiography) 필름을 사용하여 시각화되었다. 또한 면역 검출은 HMGB1(Abcam, Cambridge, MA), HHV8 ORF50, 총 p38 MAPK, 인산화된 p38 MAPK(Thr180/Tyr182), 총 JNK1/2 및 인산화된 ERK(Thr202/Tyr204) (Bioss, Woburn, MA); β-액틴에 대한 마우스 항체(Sigma), HDAC1, HHV-8 K8.1A/B, HHV8 ORF57 및 인산화된 JNK(Thr183/Tyr185)(Santa Cruz, Santa Cruz, CA); 및 HHV8 LNA에 대한 마우스 항체(Abcam)를 사용하여 수행하였다. 2차 항체에는 HRP 결합 염소 항-마우스 IgG(Bethyl, Montgomery, TX), 서양 고추냉이 과산화효소(HRP)-결합 염소 항-토끼 IgG(Bethyl) 및 HRP-결합 염소 항-마우스 IgG(Bethyl)가 포함된다. 웨스턴 블롯 분석에서 단백질 밴드의 정량화는 Image Lab 6.1 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다.
면역형광 분석
면역형광 분석을 위해 세포 단층을 실온(RT)에서 30분 동안 4% 파라포름 알데히드에 고정하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척했다. 그 후 고정된 세포는 RT에서 15분 동안 0.25% Triton X-100/PBS로 투과하였다. 그 후 4℃에서 30분 동안 3% BSA/PBS로 차단한 후, 샘플을 3% BSA/TBST에서 토끼 단일클론 항-HMGB1 항체(Abcam)와 함께 RT에서 1시간 동안 배양했다. 이어서 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS로 세척한 후, 21개의 샘플을 3% BSA를 포함하는 PBS에서 Alexa Fluor 568-결합된 항 토끼 IgG 항체(Thermo Fisher Scientific)와 함께 RT에서 30분 동안 배양했다. PBS에서 500 ng/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) 용액을 사용하여 핵을 1분 동안 염색했다. 이어서 샘플은 FluorSave Reagent(Sigma)에 장착되었고 Nikon Eclipse E400 현미경(Nikon, Tokyo, Japan), Nikon Digital site DS433U2 (Nikon)를 사용하여 이미지를 수득하였으며 NIS element F(Nikon)를 사용하여 분석했다.
CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 HMGB1 넉아웃 클론 설정
HMGB1에 대한 합성 gRNA의 경우 crRNA(카탈로그 번호 A35509, chr13 : 30463559 ~ 30463537) 및 tracrRNA는 Thermo Fisher Scientific에서 구입했다. CRISPR 가이드 RNA 어닐링 조건은 Invitrogen ™ TrueGuide ™ 지침에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, crRNA 및 tracrRNA는 1x TE 버퍼에 용해되어 최종 농도가 100 μM이 되었다. 그 후 혼합물은 하기 단계를 사용하여 Bio-Rad CFX 96 열 순환기에서 gRNA로 합성되었다: 1) 95℃에서 5분; 2) -2℃/s의 램프 속도에서 95℃ ~ 78℃; 3) 78℃에서 10분; 4) -0.1℃/s의 램프 속도에서 78℃ ~ 25℃; 5) 25℃에서 5분. CRISPR RNA 혼합물과 TrueCut™ Cas9 Protein v2는 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 Transfection Reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 iSLK BAC16으로 형질전환되었다. gRNA(서열번호 2)와 Cas9 단백질 모두 0.15 μM의 최종 농도로 첨가되었다. 형질전환 3일 후, 상기 세포를 배양 웰에서 분리하고 그 수를 1 mL 당 8개로 조정하였고 그 다음, 상기 세포를 100 μL/웰로 96-웰 플레이트에 파종하였다. 그 후 단일 콜로니가 성장하는 웰을 찾기 위해 플레이트를 세포 성장에 대해 스캔했다. 상기 콜로니의 세포는 트립신을 처리하여 해리되고 새롭고 더 큰 배양 접시에서 배양되었으며 각 클론에 대한 단백질 추출물을 수집한 후 웨스턴 블롯팅을 통해 HMGB1의 KO를 확인하였다. 상기 gRNA의 서열을 하기 표 1에 요약하였다.
sgRNA의 염기서열 정보
명칭 염기서열(5'-->3') 서열번호
guide RNA TTTCTAAGAAGTGCTCAGAG 1
돌연변이 동정을 위한 qPCR 분석
게놈 DNA는 DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 배양된 세포에서 수득했다. CRISPR/Cas9 넉아웃에 의한 HMGB1의 PCR 증폭 효율의 차이를 확인하기 위해 두 쌍의 프라이머를 설계했다. 첫 번째는 Cas9 표적 서열 외부에 결합하도록 설계되었고(서열번호 2) 다른 하나는 Cas9 표적 서열의 측면에 위치한다(서열번호 3). qPCR을 수행하기 전에 일반적인 PCR을 실행하여 qPCR 및 클로닝을 위한 외부 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 수득하였다. qPCR을 수행하기 전에 일반적인 PCR을 수행하여 qPCR 및 클로닝을 위한 외부 프라이머를 사용하여 DNA 단편을 수득하였다. 증폭조건은 제조사의 지침에 따라 Solg™ 2x Taq PCR Pre-Mix (Solgent, 대전, 대한민국)를 사용하여 하기와 같이 수행했다: 95℃에서 5분 동안 변성, 35사이클 동안 증폭: 95℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초, 최종 연장 72℃에서 5분). 증폭된 단편을 정량화하고 후속 qPCR에 대해 동일한 양으로 조정했다. TB green fast qPCR Mix(Takara, Kyoto, Japan)는 qPCR을 사용한 용융 곡선 분석에 사용되었다. qPCR 사이클링 조건은 95℃에서 30초 동안 변성, 40 사이클 동안 증폭(95℃에서 5 초, 60℃에서 30 초)으로 설정되었다. PCR 산물을 증폭한 후 65℃에서 95℃ 사이에서 0.5℃ 단위로 용융 곡선 분석을 수행했으며 PCR 산물을 확인하기 위해 2% 아가로즈/TBE 겔에 올려 밴드를 확인했다. 상기 프라이머를 포함하여 본 발명에서 사용한 모든 프라이머의 핵산 서열을 하기 표 2에 요약하였다.
프라이머 핵산서열 정보
프라이머 서열(5' -> 3') 서열번호
Cas9 F GAAAAATAACTAAACATGGGCAA 2
Cas9 R CCACTACGAGAATGCCAA 3
M13 F GTAAAACGACGGCCAG 4
M13 R CAGGAAACAGCTATGAC 5
ORF50s TGG TGG AAG ATG TGT GCATT 6
ORF50as CTC CGT GAG GAT CCG AAT AA 7
ORF65s ACT ATC TCG TGT TCT TAA TTG C 8
ORF65as ATG ATC CCGCCT TTG AAT 9
ORF73s CCA GGA AGT CCC ACA GTG TT 10
ORF73as AGA CAC AGG ATG GGA TGG AG 11
ORF26 F GGA GAT TGC CAC CGT TTA 12
ORF26 R ACTGCA TAA TTT GGA TGT AGT C 13
GAPDHs GGT ATC GTG GAA GGA CTC 14
GAPDHas GTA GAG GCA GGG ATG ATG 15
T-벡터 클로닝을 통한 HMGB1-KO 클론의 시퀀싱 분석
제조사의 지침에 따라 TOPcloner TA Kit(Enzynomics, 대전, 대한민국)를 이용하여 PCR 산물을 벡터에 삽입하여 E. coli DH5α로 형질전환시켰다. 상기 형질전환된 대장균을 40 μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에서 배양한 다음 재조합 클론을 회수하고 40 μg/mL 암피실린을 포함하는 Terrific broth(Sigma)에서 37℃ 조건으로 밤새 배양했다. 플라스미드는 플라스미드 미니 키트(MGmed, 서울, 대한민국)를 사용하여 분리하였고 시퀀싱 분석은 Bionics(한국 서울)에서 수행하였다. 먼저 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Waltham, MA)를 사용하여 PCR을 수행했고 PCR 산물을 세척한 후 Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer(Applied Biosystems)를 사용하여 서열을 분석했다. TOPcloner TA Kit에 포함된 M13F(서열번호 4) 및 M13R(서열번호 5)을 시퀀싱 프라이머로 사용했다. 참조 서열(Homo sapiens chromosome 13, GRCh38.p13 Primary Assembly 30,456,704에서 30,617,597, NCBI, NC_000013.11) 및 분석된 서열은 SnapGene v5.2.4(GSL Biotech LLC, CA, USA)를 사용하여 정렬되었다.
WST-1 세포 생존력 분석
세포 증식은 WST-1 세포 증식 시약(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 분석하였다. WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포(5 x 103)를 96웰 배양 플레이트 (SPL 생명 과학, 대한민국, 포천)에 파종하고 1 ~ 3 일 동안 배양한 후 37℃ 및 5 % CO2에서 90분 동안 WST-1(1:10 희석)로 처리하였다. 450 nm에서의 흡광도는 마이크로 플레이트 리더(Molecular 장치, 실리콘 밸리, 캘리포니아)를 사용하여 분석하였다.
TruSeq 가닥 mRNA 샘플 준비
제조사의 지침에 따라 Ribospin Ⅱ 키트(GeneAll Biotechnology, 대한민국 서울)를 사용하여 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 총 RNA를 추출했다. RNA 농도 및 무결성은 Quant-IT RiboGreen (Thermo Fisher Scientific) 및 TapeStation RNA 스크린 테이프(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)를 사용하여 평가하였다. 호모 사피엔스 및 인간 헤르페스 바이러스 전사체 시퀀싱은 제조업체의 프로토콜 (Illumina, Inc., San Diego, CA)에 따라 수행되었다. Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit(Illumina, Inc.)를 사용하여 각 샘플에 대해 1 μg의 총 RNA로 라이브러리를 독립적으로 준비했다. 워크 플로우의 첫번째 단계는 폴리-T-부착 자기 비드를 사용하여 mRNA 분자를 포함하는 폴리-A를 정제하는 것이다. 정제 후, mRNA는 상승된 온도에서 2가 양이온 용액의 존재하에 작은 조각으로 단편화되었다. 절단된 RNA 단편은 SuperScript II 역전사 효소(Thermo Fisher Scientific) 및 무작위 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA로 복사되었다. 이어서 DNA 중합 효소 I, RNase H 및 dUTP를 사용하여 두번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그런 다음 상기 cDNA 단편은 최종 복구 프로세스, 단일 "A" 염기 추가 및 어댑터 연결을 거쳤다. 그런 다음 생성물을 정제하고 PCR로 농축하여 최종 cDNA 라이브러리를 생성했다. 라이브러리는 qPCR Quantification Protocol Guide(Sigma)에 따라 Illumina 시퀀싱 플랫폼에 대한 KAPA Library Quantification 키트를 사용하여 정량화되었고 TapeStation D1000 ScreenTape(Agilent Technologies)를 사용하여 검증되었다. 색인된 라이브러리는 Illumina NovaSeq(Illumina, Inc.)에 제출되었으며, paired-end(2x100bp) 시퀀싱은 Macrogen Incorporated(대한민국 대전)에서 수행되었다.
호모 사피엔스 및 인간 헤르페스 바이러스 8 전사체 시퀀싱 결과의 mRNA-Seq 및 데이터 분석
시퀀서의 원시 판독은 분석 전에 낮은 품질과 어댑터 시퀀스를 제거하기 위해 전처리되었다. 그런 다음 처리된 판독을 정렬을 위해 두 가지 유형의 인덱스를 사용하는 bowtie를 사용하여 호모 사피엔스(GRCh37) 및 인간 헤르페스 바이러스 8 균주(GK18) 빌드에 정렬했다(전역, 전체-게놈 인덱스 및 수만 개의 작은 로컬 인덱스). 상기 두 가지 유형의 인덱스는 Bowtie2와 같은 Burrows-Wheeler 변환을 기반으로 동일한 Ferragina-Manzini 인덱스를 사용하여 구성하였다. StringTie(https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/)를 사용하여 전사 어셈블리 및 풍부도 추정을 수행했다. 샘플에서 0개 이상의 판독 카운트 값이 있는 유전자는 제외되었다. log2 변환을 용이하게 하기 위해 필터링된 유전자의 각 판독 카운트 값에 1을 추가했다. 필터링된 데이터는 log2 변환되고 M값 정규화의 절사 평균(Trimmed Mean)의 대상이 되었다. 발현 수준 차이의 통계적 유의성은 그룹 간 차이가 없다고 가정하고 귀무가설을 사용하여 edgeR에서 exactTest로 배 변화(fold change) 데이터를 분석하여 결정되었다. 허위 발견율(False discovery rate)은 Benjamini-Hochberg 알고리즘을 사용하여 P 값을 조정하여 제어되었다. 차별적으로 발현된 유전자 세트의 경우, 유사성의 척도로 완전한 연결과 유클리드 거리(Euclidean distance)를 사용하여 계층적 클러스터링 분석을 수행했다. 유전자 온톨로지(www.geneontology.org)를 기반으로 유의하게 차별적으로 발현된 유전자에 대한 유전자 농축, 기능적 주석 분석 및 경로 분석을 수행했다. 모르페우스(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)를 사용하여 유전자 발현 수준의 변화를 분석했다. 또한 메타스케이프 유전자 주석 및 분석 리소스(http://metascape.org)를 사용하여 막대 그래프 요약과 경로 및 프로세스 농축 분석을 수행했다.
정량적 실시간 역전사 PCR(RT-qPCR)
Ribospin Ⅱ RNA 분리 키트(Geneall Biotechnology)를 사용하여 배양된 세포에서 총 RNA를 수집했다. cDNA를 합성하기 위한 총 RNA의 역전사는 Takara RT Master Mix Ⅱ(Takara, Shiga, Japan)를 사용하여 수행되었다. RT-qPCR은 Takara SYBR FAST qPCR Mix(Takara)를 사용하여 수행되었고 사이클링 조건은 하기와 같다: 95℃에서 30초, 95℃에서 5초 동안 40사이클, 60℃에서 10초. 증폭된 산물의 특이성은 용융 커브 분석을 통해 확인하였다. 모든 샘플은 3중으로 처리되었고 유전자 발현 수준은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)의 유전자 발현 수준에 의해 표준화되었다. 상기 RT-qPCR에 사용된 프라이머는 지노테크(Daejeon, South Korea)에서 합성하였다(표 2 참조).
면역침강 분석
세포 용해물은 토끼 항-HMGB1 항체(Abcam) 또는 토끼 단일클론 항체 IgG XP 대조군(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)과 함께 4℃에서 밤새 배양되었고 항원-항체 복합체는 Pierce protein A/G Agarose(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 RT에서 2시간 동안 침전되었다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이, 면역 침전된 복합체를 제거하고 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
KSHV 생산 및 HUVEC 감염
용해 복제를 유도하기 위해, iSLK BAC16 세포를 1.2 mM 부티르산 나트륨(Sigma) 및 50 μg/mL 독시사이클린(Sigma)으로 48시간 동안 처리했다. 그 후, 상기 배양 배지를 수집하고, 4℃에서 10분 동안 2,000ㅧg에서 원심분리하여 배양 상등액으로부터 세포 파편을 제거하였다. 그 후 상등액을 다시 100,000 g의 조건으로 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상기 바이러스 펠렛을 저온 PBS에 재현탁하고 바이러스 스톡을 사용할 때까지 -80℃에서 보관했다. WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포로부터 제조된 KSHV 스톡은 5 μg/mL의 폴리브렌(Santa Cruz)을 포함하는 Opti-MEM으로 HUVECS에 감염시키 위해 사용하였다. KSHV로 HUVEC의 감염은 25℃에서 1시간 동안 2,000 x g에서 원심분리하여 수행되었다. 원심분리 후 상기 배지를 내피세포 성장 배지 2(PromoCell)로 변경한 다음 상기 HUVEC를 95% 공기와 5% CO2가 포함된 환경에서 37℃로 밤새 배양했다. WT 또는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 추출한 qPCR KSHV 샘플에 의한 KSHV 게놈 DNA의 상대적 카피 수 정량화는 DNA 외부 비리온 입자를 제거하기 위해 37℃에서 10분 동안 DNase I(Enzynomics, Daejeon, South Korea)으로 처리하였다. 그 후, DNase I의 비활성화를 위해 DNase I 처리된 바이러스를 75℃에서 10분 동안 가열했다. 바이러스 DNA는 제조사의 지침에 따라 DNeasy 혈액 및 조직 DNA 준비 키트(Qiagen)로 분리하였다. 실시간 PCR은 Takara SYBR FAST qPCR Mix(Takara)를 사용하여 수행되었고 사이클링 조건은 하기와 같다: 95℃에서 30초, 95℃에서 5초 동안 40 사이클, 60℃에서 10초.
KSHV 감염성의 유세포 분석
GFP를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 KSHV BAC16으로 감염된 세포를 트립신-EDTA 용액(Sigma)으로 분리하고 1% FBS가 첨가된 PBS에 재현탁시켰다. KSHV 감염성은 Guavaㄾ easyCyte™ Flow Cytometer(Luminex Corporation, Austin, TX)를 사용하여 측정한 GFP의 발현으로 분석하였고 InCyte 3.1 소프트웨어(Luminex Corporation)를 사용하여 분석했다.
통계 분석
각 실험은 3회 이상 독립적으로 수행되었으며 대표적인 결과가 표시되었다. 그래프에서 결과는 평균 ㅁ 표준편차로 표시되었다. Two-tailed Student 's t-test는 서로 다른 그룹 간의 데이터를 비교하는 데 사용되었고 두 개 이상의 그룹, one-way ANOVA 테스트가 사용되었다. 데이터는 P <0.05 일 때 유의하게 차이가 있는 것으로 간주되었고 차이의 통계적 유의성은 하기와 같이 표시되었다: * P <0.05, ** P <0.01.
실시예1: KSHV 생산 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1의 발현
HMGB1은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 및 인간 면역 결핍 바이러스 1(Saidi H et al., PLoS One. 3:e3601. 2008)을 포함한 여러 바이러스의 복제에 필요한 중요한 세포 분자이다. 또한 HMGB1은 KSHV의 수명주기에 영향을 미치는 것으로 알려졌다(Song MJ et al., J Virol. 78:12940-50. 2004). 그러나 KSHV 생산 세포주에서의 정확한 역할은 완전히 밝혀지지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 바이러스 자손 생산에 대한 HMGB1의 효과를 조사하기 위해 KSHV-생산 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1을 넉아웃시켰다. 그러나 CRISPR/Cas9-매개 넉아웃 프로세스 동안 희석을 제한하여 단일세포 클론을 분리해야하므로 결과 해석을 복잡하게 만드는 세포 이질성이 발생할 수 있다. 이러한 문제를 회피하기 위해 CRISPR/Cas9 매개 넉아웃 전에 KSHV를 운반하는 iSLK BAC16 세포에서 단일 클론을 분리한 다음 추가 실험에 사용했고 iSLK BAC16 세포의 분리된 클론에서 HMGB1 발현을 분석하였다. KSHV의 재활성화를 자극하기 위해 iSLK BAC16 세포를 독시사이클린(doxycycline)과 부티르산 나트륨(sodium butyrate)으로 처리하여 용해 복제를 유도했다.
그 결과, 유사한 양의 HMGB1이 웨스턴 블롯팅에 의해 잠복 및 재활성화된 iSLK BAC16 세포의 전체 세포 용해물에서 검출되었다(도 1a). 또한, 면역형광 분석(IFA)에서 HMGB1에 대한 강한 신호가 핵에서 검출된 반면, 세포질에서는 용해 복제가 유도되지 않는 한 HMGB1이 관찰되지 않았다. 용해 복제시 HMGB1이 핵에서 강하게 발현되었지만 세포질에서 약한 신호만 검출되었다(도 1b, 흰색 화살표). 상기 결과는 KSHV의 용해 복제 유도가 핵에서 세포질로 HMGB1의 전좌를 촉진하여 재활성화된 KSHV에 감염된 세포에서 HMGB1의 세포 외 분비를 유도했을 수 있음을 시사하는 것이다. 또한 세포 외 HMGB1이 iSLK BAC16 세포에 의해 분비되는지 확인하기 위해 재활성화 유무에 관계없이 iSLK BAC16 세포 배양물에서 상등액을 수집했다(도 1c 및 1d). 재활성화가 없는 경우 iSLK BAC16 세포의 세포 외 HMGB1이 웨스턴 블롯팅에서 투명 밴드로 검출되었다. 재활성화 후, 시간이 지남에 따라 상등액에서 HMGB1의 풍부도(abundance)가 현저하게 증가하는 것을 관찰하였다.
바이러스에 감염된 세포에서 HMGB1의 분비를 보여주는 유사한 결과가 다른 헤르페스 바이러스를 포함한 다른 바이러스 감염 세포 연구에서 보고되었다(Borde C et al., PLoS One. 6:e16145. 2011). 본 발명의 상기 결과는 용해 복제 유도 없이도 HMGB1이 iSLK BAC16 세포에서 분비되고 iSLK BAC16 세포 재활성화 후에 더 많은 양의 HMGB1이 분비될 수 있음을 나타내었다.
실시예 2: iSLK BAC16 세포에서 HMGB1의 넉아웃
본 발명자들은 Cas9 단백질과 HMGB1-표적화 gRNA로 구성된 리보핵단백질 복합체를 iSLK BAC16 세포로 형질전환시켜 HMGB1을 넉아웃했다. 그 후 각 개별 클론을 제한 희석(limiting dilution) 기법을 사용하여 분리하고 HMGB1 발현을 웨스턴 블롯팅으로 분석하여 넉아웃(KO) 클론을 분리했다. 상기 HMGB1의 KO를 확인하기 위해 PCR 기반 유전형 분석법을 사용하여 유전자 돌연변이를 검출했다. 한 쌍의 프라이머는 Cas9 절단 부위 외부에서 설계되었고(프라이머 F 및 R), 다른 하나는 Cas9 절단 부위를 표적으로 삼았다(프라이머 S, 도 2a). 따라서 HMGB1-FR은 야생형(WT) 및 돌연변이 대립 유전자를 모두 증폭시킬 수 있는 반면에 HMGB1-SR은 WT 대립 유전자를 증폭시켰다. 따라서 새로 획득한 돌연변이는 HMGB1-SR의 증폭을 방해한다.
WT 및 KO 클론에 대한 정량적 PCR(qPCR) 결과는 WT 클론보다 KO 클론에 대해 검출된 더 적은 증폭된 PCR 산물이 다른 용융 피크를 나타냈다(도 2b). 후속 시퀀싱을 위한 단일-복제 돌연변이 DNA 단편을 생성하기 위해 HMGB1-FR에서 생성된 PCR 산물을 T-클로닝 벡터에 클로닝하여 기존 시퀀싱 분석을 사용하여 분석한 10개의 콜로니를 생성했다. 이론적으로 인간 게놈에는 두 개의 대립 유전자가 있으므로 두 개의 다른 돌연변이가 예상되었다. 그러나 모든 콜로니는 Cas9 표적 부위에 추가 'A'삽입과 함께 동일한 돌연변이를 나타냈다(도 2c). 상기 결과는 두 대립 유전자가 동일한 돌연변이를 가질 수 있음을 시사한다. 그러나 10개의 콜로니만을 사용한 분석에서 단 하나의 대립 유전자만 검출될 가능성은 배제할 수 없다. WT 및 KO iSLK BAC16 클론에서 HMGB1 발현은 웨스턴 블롯팅 및 IFA에 의해 분석되었다(도 2d 및 2e). KSHV BAC16에 감염된 세포는 상기 세포에 GFP 카세트가 존재하기 때문에 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현한다. HMGB1의 제거에도 불구하고, KO 클론의 세포 형태 및 증식은 WT 세포에 비해 크게 영향을 받지 않았다(도 2e 내지 2g).
실시예 3: 세포 및 바이러스 유전자 발현 프로파일링
HMGB1 넉아웃 iSLK BAC16 세포 RNA 분리물에서 세포 및 바이러스 유전자 발현 프로파일링은 재활성화의 부재 또는 후에 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포로부터 제조되었다. HMGB1-KO iSLK BAC16 세포의 유전자 발현 프로파일은 호모 사피엔스 전사체 서열분석(Homo sapiens transcriptome sequencing)을 사용하여 두 개의 독립적인 실험에서 분석되었다. WT 및 HMGB1-KO 추출물 간의 발현 수준이 2배 이상 또는 0.5배 이하인 유전자는 차별적으로 발현되는 것으로 간주되었다. 그 결과, 잠복 세포 및 재활성화 세포 모두에서 유전자 발현 프로파일은 HMGB1의 KO에 의해 영향을 받았다(도 3). 특히, 용해 복제의 유도는 WT 대조군과 비교하여 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 1,025개 유전자(502개 상향조절 및 522개 하향조절됨)의 발현에 상당한 변화를 유발하였다. 상기 1,025개의 유전자를 계층적 클러스터링으로 클러스터링하여 히트맵을 생성하고(도 3a) Metascape 유전자 목록 분석(도 3b)을 사용하여 온톨로지 클러스터에서 농후 경로(pathways enriched)를 동정하기 위해 분석했다. 상기 분석은 글루코코르티코이드 수용체 경로(glucocorticoid receptor pathway), 고슴도치 신호전달 경로(Hedgehog signaling pathway), 막 횡단 수용체 단백질 티로신 키나제 신호전달 경로(transmembrane receptor protein tyrosine kinase signaling pathway), 칼슘 신호 전달경로(calcium signaling pathway), p53 전사 유전자 네트워크(p53 transcriptional gene network), 히포 신호전달 경로(Hippo signaling pathway), g 단백질 결합 수용체 신호전달 경로(g protein-coupled receptor signaling pathway)의 양성 조절, STAT 캐스케이드의 양성 조절, 음성 다세포 유기체 성장 조절, 섬유아세포성장인자 수용체 신호 전달 경로(fibroblast growth factor receptor signaling pathway) 조절, 아데닐 레이트 사이클라제 활성화 G 단백질 결합 수용체 신호전달 경로(adenylate cyclase-activating G protein-coupled receptor signaling pathway), STAT3 신호 전달경로 조절 회로 및 재활성화된 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1-KO에 의해 주로 영향을 받는 과정으로서 Hippo-Merlin 신호 조절 장애를 밝혀냈다
또한, 72개의 microRNA(miRNA)의 발현은 대조군 세포에 비해 재활성화된 HMGB1-KO 세포에서 현저하게(≥ 1.5 배) 변경되었다(36개의 miRNA는 상향조절되었고 36개의 miRNA는 하향조절되었다). 상기 miRNA는 계층적 클러스터링으로 클러스터링되어 히트맵을 생성했으며(도 3c) Metascape 유전자 목록 분석은 miRNA에 의한 유전자 침묵, 발아 혈관신생의 음성 조절, 세포 분화의 음성 조절, 생물학적 과정의 음성조절, 세포증식 및 신호전달은 재활성화된 iSLK BAC16 세포에서 HMGB1-KO에 특히 민감하게 나타났다. 종합하면, 상기 결과는 HMGB1이 iSLK BAC16 세포에서 mRNA의 발현뿐만 아니라 miRNA의 발현도 조절한다는 것을 시사하는 것이다.
또한 동일한 조건에서, 발현이 변경된 86개의 KSHV 유전자를 계층적 클러스터링으로 클러스터링하여 히트맵을 생성했다(도 3d). 잠복 상태에서 LANA의 발현은 WT 세포에 비해 HMGB1-KO 세포에서 하향조절되었다. 더욱이, 용해 복제의 유도는 WT 및 HMGB1-KO 세포 모두에서 많은 KSHV 유전자의 발현을 상향조절했다. 그러나, 대부분의 바이러스 유전자는 WT 세포에 비해 HMGB1-KO 세포에서 저 발현되어 HMGB1이 잠복 및 용해 복제 동안 KSHV 유전자 발현을 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: HMGB1 넉아웃에 의한 KSHV 유전자 발현의 변경
RNA-seq 분석으로 수득한 바이러스 유전자의 차등 발현 프로파일을 검증하기 위해 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 9개의 선택된 KSHV 유전자에 대해 정량적 RT-PCR을 수행했다(도 4a). 용해 복제 유도 시, 잠복 유전자인 KSHV ORF73의 전사 수준은 시간이 지남에 따라 증가했다. KSHV ORF73 발현은 용해 복제 동안 HMGB1-KO 세포에서 증가했지만 WT 세포에서 보다 현저히 낮았다. 더욱이, 즉시 초기(ORF50), 초기(ORF59, K8 및 ORF74) 및 후기 용해 KSHV 유전자(ORF65 및 K8.1)의 mRNA 발현 수준도 WT 세포에 비해 HMGB1-KO 세포에서 현저히 낮게 발현되었다. 흥미롭게도 ORF72 및 K13의 mRNA 발현은 RNA-seq 분석과 일치하는 용해 복제 유도 동안 WT 세포에서와 비교하여 KO 세포에서 증가했다. KSHV 단백질의 웨스턴 블로팅은 정량적 RT208 PCR 데이터와 일치하는 결과를 추가로 입증했다(도 4b). 재활성화 후 분석된 모든 바이러스 단백질은 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 검출되었으나 발현 수준은 WT 세포에서보다 낮았다. WT 및 HMGB1-KO 세포로부터의 바이러스 단백질(KSHV ORF73 및 ORF50)의 발현 수준은 mRNA 발현과 상관관계가 있으며, 이는 HMGB1이 바이러스 mRNA 발현의 조절을 통해 KSHV 재활성화 동안 바이러스 단백질 발현을 향상시켰음을 시사한다.
실시예 5: KSHV의 재활성화 과정에서 HMGB1의 뉴클레오솜 리모델링
KSHV 용해 복제는 ORF50으로 인코딩된 즉각적인-초기 단백질 RTA의 발현에 의해 시작될 수 있다. KSHV RTA는 즉각적인 초기 프로모터 영역에서 여러 숙주 세포 단백질과 함께 뉴클레오솜 복합체(nucleosome complex)를 형성하는 것으로 알려졌다(Aneja KK et al., Front Microbiol. 8:613. 2017). HDACs(Histone deacetylases)는 뉴클레오솜 복합체와 관련이 있으며 RTA의 안정적인 억제에 기여하는 반면 부티르산 나트륨에 의한 히스톤 아세틸화는 뉴클레오솜 리모델링과 RTA 전사의 활성화를 유발한다(Lu F et al., J Virol. 77:11425-35. 2003). 종래 연구에서는 KSHV RTA와 HMGB1 복합체가 KSHV ORF50 프로모터의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 보고하였다. 따라서 본 발명자들은 HMGB1이 iSLK BAC16 세포의 뉴클레오솜 복합체에 참여하는지 확인하기 위해 HMGB1 상호 작용 단백질을 면역침전법으로 분석했다(도 5). 그 결과, RTA는 잠복 감염이 있는 iSLK BAC16 세포에서 검출되지 않은 반면(도 5a), 면역 침전된 RTA 단백질은 재활성화된 WT 세포에서 관찰되었다 (도 5b). 또한 HMGB1이 ORF73 단백질과 상호 작용한다는 것을 확인했는데, 이는 종래 연구의 결과와 일치했다(Shamay M et al., J Virol 86:5179-91. 2012).
HDAC1과 HMGB1 간의 상호 작용은 잠재 복제 중에 감지되었다. 그러나 재활성화 후 HMGB1 면역침전제에서는 HDAC1 단백질이 관찰되지 않았다. 상기 결과는 KSHV 재활성화 동안 뉴클레오솜 변형에 대해 보고된 종래 결과와 일치한다(Lu F et al., J Virol. 77:11425-35. 2003). HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 어떤 단백질도 HMGB1과 공동 면역침전(co-immunoprecipitated)되지 않았다. 종합하면, 본 발명의 결과는 HMGB1이 iSLK BAC16 세포에서 바이러스 및 숙주 단백질과 뉴클레오솜 복합체를 형성한다는 것을 나타낸다. 따라서, HMGB1이 KSHV 유전자의 RTA-매개 발현을 촉진하는 것으로 이전에 보고된 연구를, 뉴클레오솜에서 바이러스 및 숙주 세포 단백질과 복합체를 형성하는 HMGB1이 뉴클레오솜 리모델링에 의해 재활성화 과정 동안에 바이러스 유전자 발현을 조절하는 것은 타당한 결과이다.
실시예 6: HMGB1의 RTA 관련 신호 경로 유도
전사 조절을 위한 핵 보조인자로서의 세포 내 역할 외에도 HMGB1은 세포에서 분비된 후 세포 외 기능을 수행한다. 세포 외 HMGB1은 RAGE 및 TLR과 같은 특정 수용체에 결합하여 MAP 키나아제 및 NF-κB와 같은 여러 신호 전달 경로를 활성화한다(Harris HE et al., Nat Rev Rheumatol. 8:195-202. 2012). MEK/ERK, JNK 및 p38 MAPK 경로와 같은 특정 특이적 신호 경로는 RTA 프로모터를 활성화하여 KSHV 재활성화를 향상시킨다(Xie J et al., Virology. 371:139-54. 2008). 이러한 신호 발생 이벤트와 HMGB1 사이의 관계를 조사하기 위해 본 발명자들은 재활성화 과정에서 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포에서 MEK/ERK, JNK 및 p38 MAPK 경로의 활성 수준을 비교했다(도 6a). 그 결과, 용해 복제 유도 후 ERK 및 p38의 인산화(p-)가 WT와 KO 세포간에 유사했지만, WT 세포에 비해 KO 세포에서 p-JNK 억제가 관찰되었다(도 6a 및 6b). 상기 도 1c와 d에서 볼 수 있듯이, iSLK BAC16 세포는 HMGB1을 세포 외 배지로 분비하여 재활성화 후 세포 외 HMGB1 수준을 증가시킨다. 세포 외 HMGB1이 RAGE에 결합하여 JNK를 활성화할 수 있다는 점을 감안할 때, HMGB1-KO 및 WT 세포에서 p-JNK 발현 수준의 차이는 세포 외 HMGB1의 작용에 기인할 수 있다. 따라서 WT 또는 HMGB1-KO 세포의 조절 배지는 KO 세포를 처리하여 JNK 인산화에 대한 효과를 조사하기 위해 사용되었다(도 6c). 본 발명자들은 p-JNK가 KO 세포에서 유래된 배지로 처리된 것에 비해 WT 세포에서 유래된 조건 배지로 처리된 세포에서 고도로 상향조절된다는 것을 발견했다. HMGB1이 이러한 신호 전달 캐스케이드와 KSHV의 용해 복제에 영향을 미치는지 확인하기 위해 iSLK BAC16 세포를 HMGB1 억제제 글리시리진(glycyrrhizin)으로 처리했다. 상기 글리시리진은 p-JNK 발현 수준 감소와 상관 관계가 있는 용해 복제 유도를 억제했다(도 6d). 상기 결과는 세포 외 HMGB1이 KSHV 생산 세포에서 JNK의 인산화를 유도하며, 이는 KSHV의 향상된 용해 복제와 관련이 있음을 시사한다.
실시예 7: HMGB1 넉아웃에 의한 비리온 생산
본 발명자들은 비리온 생산이 HMGB1에 의해 영향을 받는지 조사하기 위해, 상기 실험에서와 동일한 배양 조건(동일한 수의 파종된 세포 및 동일한 부피의 배양 배지)에서 유지된 WT 및 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포로부터 바이러스 농축물을 수집하였다. 각 농축 바이러스 샘플의 바이러스 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 분석했다(도 7a). 그 결과 K8.1 및 gB와 같은 KSHV 외피 당단백질의 풍부도는 WT 세포의 바이러스에 비해 HMGB1-KO 세포의 바이러스에서 더 낮았다. KSHV 외피 단백질 ORF45의 양도 HMGB1-KO 세포에서 생성된 바이러스에서 더 낮았다. 또한 qPCR을 사용하여 수집된 바이러스 샘플에서 KSHV 게놈 카피수를 분석했다(도 7b). 예상대로 바이러스 카피 수는 WT 세포의 바이러스보다 HMGB1-KO 세포의 바이러스에서 현저히 낮았다. 이어서 본 발명자들은 인간제대정맥내피세포(HUVEC)를 WT 및 HMGB1-KO 세포에서 수득한 동일한 양의 바이러스로 감염시켰다. KSHV BAC16 세포는 숙주 세포의 KSHV 감염 후 GFP를 발현하도록 설계되었다(Brulois KF et al., J Virol. 86:9708-20. 2012). 따라서 감염된 세포의 GFP 발현을 측정하여 감염성을 모니터링 할 수 있다. 그 결과, 형광현미경을 사용하여 HMGB1-KO 세포에서 KSHV에 감염된 세포보다 WT 세포에서 KSHV에 감염된 HUVEC에서 훨씬 더 많은 GFP 발현 세포를 검출했다(도 7c). 유사하게, KSHV에 감염된 세포에서 유세포 분석에 의해 분석된 GFP 발현은 HMGB1-KO 세포의 KSHV에 비해 WT 세포의 KSHV에 감염된 세포에서 유의하게 더 높았다(도 7d 및 7e). WT 숙주 세포에서 KSHV로 감염된 HUVEC에서 KSHV ORF73의 mRNA 발현은 HMGB1-KO 세포에서 KSHV로 감염된 HUVEC에서 보다 더 높게 나타났다(도 7f). 감염 3시간 후, 바이러스에 감염된 세포에서 전체 게놈 DNA를 추출하고 KSHV ORF26용 프라이머로 qPCR을 수행했다(도 7g). 그 결과, 예상대로 바이러스 DNA의 총량은 HMGB1-KO 세포에서 KSHV로 감염된 HUVEC에서 보다 WT 숙주 세포에서 KSHV로 감염된 HUVEC에서 유의하게 높았으며, 이는 HMGB1-KO iSLK BAC16 세포의 바이러스 샘플 보다 WT iSLK BAC16 세포의 바이러스 샘플로 감염된 HUVEC에서 더 많은 KSHV 입자의 존재를 나타내는 것이다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
<110> EULJI UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMY COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for the treatment of herpes virus infection and HMGB1 targeted drug screening system <130> PD21-6099 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CRISPR/Cas9 guide RNA target sequence <400> 1 tttctaagaa gtgctcagag 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 F <400> 2 gaaaaataac taaacatggg caa 23 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 R <400> 3 ccactacgag aatgccaa 18 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 F <400> 4 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M13 R <400> 5 caggaaacag ctatgac 17 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF50s <400> 6 tggtggaaga tgtgtgcatt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF50as <400> 7 ctccgtgagg atccgaataa 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF65s <400> 8 actatctcgt gttcttaatt gc 22 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF65as <400> 9 atgatcccgc ctttgaat 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF73s <400> 10 ccaggaagtc ccacagtgtt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF73as <400> 11 agacacagga tgggatggag 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF26 F <400> 12 ggagattgcc accgttta 18 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF26 R <400> 13 actgcataat ttggatgtag tc 22 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHs <400> 14 ggtatcgtgg aaggactc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDHas <400> 15 gtagaggcag ggatgatg 18

Claims (7)

  1. 서열번호 1로 기재되는 핵산서열을 표적으로 하는 HMGB1(High mobility group box 1) 유전자 넉-아웃용 sgRNA; 및
    Cas9 RNA를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 헤르페스 바이러스는 단순포진바이러스 1형(Herpes Simplex Virus 1, HSV1), 단순포진바이러스 2형(Herpes Simplex Virus 2, HSV2), 수두대상포진바이러스(Varicella zoster virus), 엡스타인바바이러스(Epstein-Barr virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 장미진바이러스(HHV-6: Human Herpesvirus 6, 및 HHV-7: Human Herpesvirus 7) 또는 카폭시 육종 헤르페스 바이러스(HHV-8)인, 조성물.
  4. 제1항의 헤르페스 바이러스 감염증 치료용 조성물을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물의 헤르페스 바이러스의 증식 억제방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 헤르페스 바이러스는 단순포진바이러스 1형(Herpes Simplex Virus 1, HSV1), 단순포진바이러스 2형(Herpes Simplex Virus 2, HSV2), 수두대상포진바이러스(Varicella zoster virus), 엡스타인바바이러스(Epstein-Barr virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 장미진바이러스(HHV-6: Human Herpesvirus 6, 및 HHV-7: Human Herpesvirus 7) 또는 카폭시 육종 헤르페스 바이러스(HHV-8)인, 방법.
  6. HMGB1 유전자를 발현하는 세포에 피검 물질을 처리하는 단계;
    상기 피검 물질이 처리된 세포로부터 상기 HMGB1 유전자의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 피검 물질이 처리되지 않은 대조군에 비해 상기 HMGB1 유전자의 발현 또는 활성을 유의하게 감소시킨 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는, 헤르페스 바이러스 감염증 치료제의 스크리닝 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 세포는 iSLK BAC16인, 방법.
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