KR102595860B1 - 엑소좀-기반의 형광 금 나노클러스터 및 이를 이용한 세포 이미징 방법 - Google Patents

엑소좀-기반의 형광 금 나노클러스터 및 이를 이용한 세포 이미징 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엑소좀-기반의 형광 금 나노클러스터, 이것의 제조 방법 및 상기 형광 금 나노클러스터의 세포 이미징 용도에 관한 것이다.

Description

엑소좀-기반의 형광 금 나노클러스터 및 이를 이용한 세포 이미징 방법 {Exosome-based fluorescent gold nanoclusters and method for application of cell imaging}
본 발명은 엑소좀-기반의 형광 금 나노클러스터, 이것의 제조 방법 및 상기 형광 금 나노클러스터의 세포 이미징 용도에 관한 것이다.
최근 몇 년 동안 형광 금속 나노 클러스터는 바이오 이미징 또는 센싱 기술을 개발하는 데 적용되어 왔다. 특히, 단백질을 템플릿으로 하는 형광 금 나노 클러스터 (AuNCs)는 뛰어난 형광 특성과 생체 적합성으로 인해 바이오 이미징, 센싱 및 약물전달체로서 큰 주목을 받고 있다. 이러한 유형의 나노 물질의 대표적인 예로서 단백질 또는 핵산과의 상호 작용을 통해 합성되는 금, 은, 구리 및 백금 나노 클러스터를 들 수 있다. AuNCs는 일반적으로 단백질 템플릿에서 형성되는 반면, AgNCs 및 CuNCs는 핵산 템플릿에서 형성된다. 소 혈청 알부민은 AuNCs를 생성하는 데 사용된 최초의 단백질로 세포 이미징 및 생체 분자 감지에 널리 사용되었다. 또한 인슐린, 리소자임 및 트랜스페린과 같은 다른 단백질 템플릿이 형광 AuNCs의 합성에 사용되었다.
엑소좀(exosome)은 엔도좀 경로를 통해 대부분의 세포에서 분비되는 작은 소포체(50 ~ 150nm 크기)를 의미한다. 엑소좀은 모세포에서 유래한 단백질, 핵산, 지질과 같은 생체 분자를 캡슐화한다는 점에서 의학 분야에서 크게 주목을 받고 있다. 엑소좀이 암 전이에 기여하는 것으로 보고되었기 때문에, 최근 몇 년 동안 비침습성 암 진단을 위해 엑소좀이 제공하는 정보를 해독하는 데 많은 연구 노력이 집중되고 있다. 기원-특이적 마커 (EpCAM 및 MUC-1) 및 일반 마커 (HSP 70, TSG101, CD63 및 CD81)를 포함한 다양한 단백질을 포함하는 엑소좀이 보고되었다. 또한 안정적인 인지질 이중층 구조를 가진 엑소좀이 약물 전달 수단으로 사용되었다.
본 발명자들은 가혹한 조건이나 독성 화학 물질이 필요하지 않은 친환경적인 방식으로 금 나노 클러스터를 합성하기 위해 엑소좀 템플릿을 사용하는 방법을 연구하던 중 중성 및 알칼리성 pH범위에서 각각 청색 및 적색을 발광하는 두 개의 서로 다른 엑소좀 기반 AuNCs (exo-AuNCs)를 합성하였고, 상기 엑소좀 기반 AuNCs이 핵을 염색하는 것을 확인하여, 본원 발명의 엑소좀 기반 AuNCs를 세포 이미징 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.
이에 본 발명자들은, 본 발명자들은 가혹한 조건이나 독성 화학 물질이 필요하지 않은 친환경적인 방식으로 금 나노 클러스터를 합성하기 위해 엑소좀 템플릿을 사용하는 방법을 연구하던 중 중성 및 알칼리성 pH범위에서 각각 청색 및 적색을 발광하는 두 개의 서로 다른 엑소좀 기반 AuNCs (exo-AuNCs)를 합성하였고, 사익 엑소좀 기반 AuNCs이 핵을 염색하는 것을 확인하여, 본원 발명의 엑소좀 기반 AuNCs를 세포 이미징 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 하기의 단계를 포함하는 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 엑소좀을 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 엑소좀 및 금 이온 (Au ion) 염을 혼합하여 배양하는;
를 포함하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 생산한 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 포함하는 세포 이미징 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 엑소좀을 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 엑소좀 및 금 이온 (Au ion) 염을 혼합하여 배양하는;
를 포함하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 상기 방법으로 생산한 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제공할 수 있다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 포함하는 세포 이미징 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
(i) 엑소좀을 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 엑소좀 및 금 이온 (Au ion) 염을 혼합하여 배양하는;
를 포함하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 티로신 잔기는 이의 pKa (약 10)보다 높은 pH 값에서 강력한 환원 능력을 나타내며, 시스테인 잔기의 티올 그룹이 Au 이온에 단단히 결합하기 때문에 티로신 및 시스테인 잔기가 있는 다양한 단백질을 포함하는 엑소좀이 형광 금 나노클러스터의 형성을 매개할 것이라고 예상하였다. 이에 본 발명자 소태아혈청(Fetal bovine serum)에서 분리된 엑소좀 (6.25mg/mL; 1mL의 1X PBS) 및 HAuCl4 (1.25Mm; 1ml의 DW)를 실온에서 5분 동안 혼합한 뒤, NaOH를 이용하여 pH를 조절하고 진탕 배양기에서 3일 동안 37℃, 200rpm으로 배양하였다. 상기 엑소좀-금 나노입자 클러스터는 배양하는 pH에 따라서 각기 다른 형광 방출을 나타내었다. 460nm에서 최대 형광 강도를 가진 청색 형광 exo-AuNCs는 다양한 pH 값에서 합성되었으며, 그 중에 pH7에서 배양할 때 이의 형광 세기가 가장 높았다. 670nm에서 최대 발광 강도를 가진 적색 형광 exo-AuNCs는 pH 11.5에서만 합성되었다 (도 1). 높은 형광 신호를 가진 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs는 엑소좀과 Au 이온이 모두 존재할 때만 생성 되었다 (도 2).
상기 엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미한다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm이며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 상기 엑소좀은 생물학적 본 발명의 엑소좀은 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 유래 일 수 있다.
상기 금속 이온 염은 클로로(트리메틸포스핀)금(AuClP(CH3)3), 칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(KAuCl4), 염화금산나트륨(NaAuCl4), 염화금산(HAuCl4), 브롬화금산나트륨(NaAuBr4), 염화금(AuCl), 염화금(III)(AuCl3) 또는 브롬화금(AuBr3)일 수 있으며, 바람직하게는 염화금산 (HAuCl4)일 수 있다.
상기 (ii) 단계에서 염산 및 수산화나트륨을 이용하여 pH 5.5 내지 pH 11.5의 조건에서 배양하면 460 nm에서 형광을 방출하면 청색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터가 합성될 수 있으며, 바람직하게는 pH 7.0 내지 pH 11.5일 수 있으며, 더 바람직하게는 pH 7.0일 수 있다.
상기 (ii) 단계에서 수산화나트륨을 이용하여 pH 11 내지 pH 12의 조건에서 배양하면 670 nm에서 형광을 방출하는 적색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터가 합성될 수 있으며, 바람직하게는 pH 11.5일수 있다.
본 발명자들은 상기 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs의 최적화 조건을 각각 실험하였다. 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs는 모두 1.25 mM의 Au 이온 농도에서 가장 높은 형광 강도를 나타내었다 (도 3A). 청색 형광 exo-AuNCs의 형광이 3일째까지 점진적으로 증가한 후 형광이 더 이상 증가하지 않은 반면, 적색 형광 exo-AuNCs는 1일 후 가장 높은 형광 강도에 도달했으며 그 이후에는 형광 강도가 감소하였다. (도 3B). 적색 형광 exo-AuNCs이 1일 후부터 감소하는 이유가 적색 형광 exo-AuNCs의 형성을 촉진하기 위해 사용된 높은 pH가 엑소좀을 손상시키기 때문이다. 상기 최적화 실험을 기반으로, 1.25 mM Au 이온과 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs에 대해 각각 3 일 및 1 일이 최적의 조건임을 확인하였다.
상기 청색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터는 상기 서술한 (ii) 단계에서 1일 내지 5일 동안 배양할 수 있으며 바람직하게는 3일 동안 배양할 수 있다.
상기 적색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터는 상기 서술한 (ii) 단계에서 1시간 내지 48시간 동안 배양할 수 있으며, 바람직하게는 24시간 동안 배양 할 수 있다.
상기 금 이온 염은 0.312 mM 내지 5mM의 농도로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.625 mM 내지 2.5mM일 수 있으며, 더 바람직하게는 1.25 mM일 수 있다.
상기 엑소좀의 농도는 1 mg/ml 내지 15 mg/ml의 농도로 포함할 수 있고, 바람직하게는 3 mg/ml 내지 9mg/ml의 농도로 포함될 수 있으며, 더 바람직하게는 6.25 mg/mL로 포함할 수 있다.
상기 최적의 조건으로 합성한 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs의 특성을 조사한 결과, exo-AuNCs 모두에서 200nm 미만의 크기로 소포 모양을 유지하였고, 엑소좀 소포체의 독특한 모양을 유지하고 있으며, 엑소좀의 크기와 수가 각각 청색 형광 exo―AuNCs은 136.2±3.1 nm 및 2.01 Х 1010 particles/mL이었고, 적색 형광 exo―AuNCs은 116 ±5.9 nm 및 1.63 Х 1010 particles/mL이고, 청색 형광 exo―AuNCs 및 적색 형광 exo―AuNCs은 각각 8개(청색 형광 exo―AuNCs) 및 25개(적색 형광 exo―AuNCs)의 Au 원자를 포함하고 있는 것을 확인하였다. . Au8NC의 4f5/2 및 4f7/2 결합 에너지 피크는 각각 88.48 eV 및 84.28 eV였으며, Au25NC는 각각 87.58eV와 83.68eV였으며, 이는 Au8NC가 Au25NC보다 상대적으로 작다는 것을 확인하였다 (도 4).
본 발명은 상기의 방법으로 생산한 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제공할 수 있다.
본 발명은 상기의 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 포함하는, 세포 이미징용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 MTT 분석을 사용하여 exo-AuNCs의 세포 독성을 평가한 결과, 청색 형광 exo-AuNCs는 1mg/mL까지 MCF-7 (인간 유방암), HeLa (인간 자궁경부암), HT29 (인간 대장암)에서 세포 독성을 나타내지 않았다. 5mg/mL 농도에서는 상기 세 개의 세포주 모두에 매우 독성이 있었다. 반대로, 최대 10mg/mL 농도의 적색 형광 exo-AuNCs는 세포 독성을 나타내지 않았다. 세 가지 세포 유형 모두 고농도에서 적색 형광 exo-AuNCs가 있을 때 더 잘 성장했으며, 오히려 이 화합물이 세포 성장에 유익한 영향을 미친 것으로 해석된다 (도 5). 전반적으로, 적색 형광 exo-AuNCs는 세포에 대한 독성이 적고 우수한 생체 적합성을 나타냈다.
본 발명자들은 적색 형광 exo-AuNCs를 사용하여 세포 이미징을 수행한 결과, 세 종의 세포주 모두에서 적색 형광 exo-AuNCs는 표시된 것처럼 밝은 적색으로 핵을 효과적으로 염색하였다 (도 6). 이러한 결과는 양전하를 가진 형광 나노 물질이 세포 핵을 염색 할 수 있고, 이를 이용하여 형광 exo-AuNCs가 새로운 바이오 이미징 프로브로 유용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따른 금 나노클러스터의 제조방법은 엑소좀 템플릿을 사용하여 형광 금속 나노 클러스터를 합성하는 새로운 방법으로서, 가혹한 실험 조건이나 독성 화학 물질없이 실온에서 엑소좀과 Au이온의 혼합물을 간단히 배양하여 생산이 가능하다는 장점을 제공한다. 또한, 반응 조건을 최적화하여 발광 파장이 각각 460nm 및 670nm 인 청색 (Au8NC) 및 적색 발광 (Au25NC) exo-AuNCs를 제조함으로써, 이 나노클러스터는 세포에 독성이 적고 생장에도 유리하므로 생체적합성이 우수한 세포 이미징 조성물로 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따라 합성된 exo-AuNCs의 특성을 확인한 결과로서, (A)는 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs의 형성에 미치는 pH의 효과를 보여주는 결과이고, (B)는 360nm 에서 발광하는 청색 및 적색 exo-AuNCs의 RFI를 보여주는 결과이며, (C)는 exo-AuNCs의 UV-Vis 흡수 스펙트럼 결과이다.
도 2는 본 발명에 따라 합성된 exo-AuNCs의 합성 결과로서, (A)는 청색 방출 exo-AuNCs의 460nm의 방출 강도를 측정한 결과이고, (B)는 적색 방출 exo-AuNCs의 670nm 방출 강도를 측정한 결과이다.
도 3는 Exo-AuNCs의 합성을 위한 최적의 조건을 보여주는 결과로서, (A)는 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs의 형성에 Au 이온 농도의 영향을 보여주는 결과이고 (엑소좀 농도는 6.25 mg/mL로 고정되고, 다양한 Au 이온 농도 (0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 및 5mM)으로 합성한 뒤 형광 강도를 460nm (청색) 및 670nm (적색)의 발광 파장에서 최대 형광 강도로 나누어 계산하였다. 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs 모두 360 nm에서 여기되었다), (B)는 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs의 형성에 대한 반응 시간의 영향을 보여준 결과이다 (서로 다른 반응 시간 (0 ~ 7 일)에서의 형광 강도를 460nm (청색) 및 670nm (적색)의 발광 파장에서 최대 형광 강도로 나누어 계산하였다. 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs 모두 360 nm에서 여기되었다.)
도 4은 엑소좀의 특징을 확인한 결과로서, (A 및 B)는 청색 형광 exo-AuNCs (왼쪽; A) 및 적색 형광 exo-AuNCs (오른쪽; B)의 주사 전자 현미경 (FE-SEM) 이미지 및 에너지 분산 형 X- 선 미세 분석 결과이고, (C 및 D)는 청색 형광 exo-AuNCs (왼쪽, C) 및 적색 형광 exo-AuNCs (오른쪽, D)의 나노 입자 추적 분석결과이며, (E) 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs의 X 선 광전자 분광법 스펙트럼 결과이다.
도 5는 Exo-AuNCs의 세포 독성을 확인한 결과로서, (A)는 청색 형광 exo-AuNCs 결과이고, (B)는 적색 형광 exo-AuNCs의 결과이다. MCF-7, HeLa 및 HT29 세포를 다양한 농도의 또는 청색 형광 exo-AuNCs 적색 형광 exo-AuNCs (0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 mg/mL)을 처리한 뒤 24 시간 동안 배양하였다.
도 6는 적색 Exo-AuNCs를 이용한 형광 이미징 사진 결과이다. 세포막은 5-dodecanoylaminofluorescein (500 μM)으로 대조 염색되었고, 적색 형광 exo-AuNCs의 농도는 3.125 mg/ mL이다.
이하, 본 명세서를 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세히 설명한다. 그러나, 본 명세서에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 명세서의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 본 명세서의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 명세서를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험의 재료
소 태아 혈청(FBS; Sigma-Aldrich, USA), ExoQuick-TC 시약 (SBI, 미국), 인산염 완충 식염수 (PBS; Biosesang, 대한민국), 금 (III) 염화물 삼수화물 (HAuCl4; Sigma-Aldrich, USA), 탈이온 멸균수 (DW; Bioneer, 대한민국), Macrosep Advance Centrifugal Device (30kDa; Pall Corporation, USA), Micro BCATM 단백질 분석 키트 (Thermo Scientific, USA), DMEM/high glucose (미국 하이 클론), RPMI-1640 (미국 하이 클론), MEM (한국 웰진), 페니실린-스트렙토마이신 (미국 깁코), 3-(4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-diphenyltertrazolium bromide (MTT; Invitrogen, USA) 및 5-dodecanoylaminofluorescein (DAF; Invitrogen, USA)를 사용하였다.
실시예 2. Exo-AuNCs의 합성
엑소좀은 제조업체의 프로토콜에 따라 ExoQuick-TC 시약을 사용하여 FBS에서 분리하였다. FBS는 Macrosep Advance Centrifugal Device에서 15 분 동안 3000 xg에서 먼저 원심 분리하였다. 이렇게 농축된 엑소좀이 포함된 잔류물을 새로운 멸균 튜브로 옮기고 ExoQuick-TC 시약과 5:1 비율로 혼합하였다. 4℃에서 밤새 배양한 후, 혼합물을 1500 xg에서 30분 동안 원심 분리하였다. 튜브 바닥에 형성된 펠렛을 방해하지 않고 상층액을 제거하였다. 마지막으로 엑소좀이 포함된 펠렛을 1x PBS로 2회 세척하고 PBS에 재현탁하여 다음 사용까지 -20 ℃에서 보관하였다. 1mL의 1x PBS (pH 7.4)의 엑소좀 (6.25mg/mL)과 1mL DW의 HAuCl4 (1.25mM)를 실온에서 5분 동안 혼합하였다. 엑소좀 농도는 Micro BCATM 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화 하였다. NaOH를 이용하여 pH를 조절하고 진탕 배양기에서 3일 동안 37℃, 200rpm으로 배양하였다. 상기 합성한 exo-AuNCs을 Spectramax iD5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Device, USA)를 사용하여 준비된 exo-AuNCs의 흡광도와 형광 스펙트럼을 측정하였다. 도 1A와 B에서 볼 수 있듯이, 다양한 pH 값에서 460nm에서 최대 발광 강도를 가진 청색 형광 exo-AuNCs이 합성 되었고, 그 중에 pH 7에서 배양한 청색 exo-AuNCs의 형광 세기가 가장 높았다. 670nm에서 최대 발광 강도를 가진 적색 형광 exo-AuNCs는 pH 11.5에서만 합성되었다. 높은 형광 신호를 가진 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs는 엑소좀과 Au 이온이 모두 존재할 때만 생성되었다 (도 2). 흡광도 분석을 사용하여 AuNCs보다 큰 Au 나노 입자가 형성되지 않았다 (도 1C).
실시예 3. exo-AuNCs 합성 조건을 최적화
본 발명자들은 exo-AuNCs 합성 조건을 최적화하였다. pH 값 (도 1A) 외에도 Au 이온의 농도와 반응 시간이 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs의 형성에 중요 할 것이라고 가정하였다. 이에 Au 농도를 달리하여 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs에서 각각의 합성의 최적화 조건을 확인하였다. 엑소좀 농도는 6.25 mg/mL로 고정하고, 다양한 Au 이온 농도 (0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 및 5mM)로 하여 실시예 2와 같이 exo-AuNCs 합성하여 이의 형광 강도를 측정하였다. 도 3A에서 볼 수 있듯이 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs는 모두 1.25 mM의 Au 이온 농도에서 가장 높은 형광 강도를 나타냈다. 엑소좀의 배양 시간에 따른 청색 형광 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs의 각각의 exo-AuNCs 합성의 최적화 조건을 확인하였다. 도 3B의 결과와 같이, 청색 형광 exo-AuNCs의 형광이 3일째까지 점진적으로 증가한 후 형광이 더 이상 증가하지 않은 반면, 적색 형광 exo-AuNCs는 1일 후 가장 높은 형광 강도에 도달했으며 그 이후에는 형광 강도가 감소하였다. 1일 후에 형광이 감소하는 이유는 적색 형광 exo-AuNCs의 형성을 촉진하기 위해 사용된 높은 pH가 엑소좀을 손상 시키기 때문이다. 상기 최적화 실험을 기반으로, 1.25 mM Au 이온과 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs에 대해 각각 3 일 및 1 일이 최적의 조건임을 확인하였다.
실시예 4. Exo-AuNCs의 특성 확인
실시예 3과 같이 최적화한 조건에서 exo-AuNCs를 합성한 후, exo-AuNCs는 전자 현미경 (FE-SEM; SU8010, Hitachi, Japan)을 사용하여 이미지화되어 엑소좀의 고유한 모양이 유지되었는지 확인하였다. 도 4A 및 도 4B와 같이, 청색 형광 (왼쪽; A) 및 적색 형광 (오른쪽; B) exo-AuNCs 모두에서 200nm 미만의 크기로 소포 모양을 유지하였다. 최적의 합성 조건에서 (청색: 6.25 mg/mL 엑소좀, 1.25 mM Au이온, 37 ℃, pH 7에서 3 일 동안 배양, 적색: 6.25 mg/mL 엑소좀, 1.25 mM Au 이온, 37 ℃에서 pH 11.5의 조건에서 하루 동안 배양) 엑소좀 소포체의 독특한 모양을 유지할 수 있음을 확인하였다. EDX 분석을 통해 Au 이온이 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs 모두에 존재하는 것을 확인하였다. (도 4B). exo--AuNCs 나노 입자 추적 분석 (NTA; NS300, Malvern-Panalytical, UK)을 사용하여 엑소좀의 크기와 수를 측정하였다. 도 4C 및 도 4D와 같이, 엑소좀의 크기와 수가 각각 청색 형광 exo―AuNCs은 136.2±3.1 nm 및 2.01 Х 1010 particles/mL이었고, 적색 형광 exo―AuNCs은 116 ±5.9 nm 및 1.63 Х 1010 particles/mL 이었다. exo--AuNCs 합성 조건이 엑소좀의 물리적 특성을 변경하지 않는다는 것을 확인하였다. X-선 광전자 분광법 (XPS; K-Alpha, Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs에서 Au 입자의 수를 확인하였다. 청색 형광 exo―AuNCs 및 적색 형광 exo―AuNCs은 각각 8개(청색 형광 exo―AuNCs) 및 25개(적색 형광 exo―AuNCs)의 Au 원자를 포함하고 있는 것을 확인하였다. 도 4E와 같이 Au8NC와 Au25NC는 모두 4f5/2 및 4f7/2 결합 에너지 피크를 공통으로 가졌다. Au8NC의 4f5/2 및 4f7/2 결합 에너지 피크는 각각 88.48 eV 및 84.28 eV였으며, Au25NC는 각각 87.58eV와 83.68eV였으며, 이는 Au8NC가 Au25NC보다 상대적으로 작다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 Au8NC보다 상대적으로 큰 크기의 Au25NC가 Au(I)로 둘러싸인 Au(0) 코어로 구성되어 있으며 Au8NC보다 결합 에너지 피크가 작다는 사실과 일치한다. 주사 전자 현미경, 에너지 분산 X 선 미세 분석, 나노 입자 추적 분석 및 X 선 광전자 분광법을 사용하여 AuNCs가 엑소좀에서 성공적으로 형성되었음을 확인하였다.
실시예 5. 청색 형광 exo―AuNCs 및 적색 형광 exo―AuNCs의 세포 독성 확인
본 발명자들은 MTT 분석을 사용하여 exo-AuNCs의 세포 독성을 평가하였다. MCF-7 (인간 유방암), HeLa (인간 자궁경부암), HT29 (인간 대장암) 세포주는 대한 세포주 은행 (KCLB; Korea)에서 구입하여 5% CO2, 37 ℃에서 배양하였다. MCF-7 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. HeLa 및 HT29 세포는 RPMI 1640 배지를 각각 MEM 및 DMEM으로 교체한 것을 제외하고는 MCF-7 세포와 동일한 조건에서 배양하였다. MCF-7, HeLa 및 HT29 세포를 96웰 배양 플레이트 (웰당 1 x 104)에 각각 RPMI 1640, MEM 및 DMEM에 분주하였다. 5% CO2, 37℃ 조건에서 24 시간 배양한 후, 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 다양한 농도의 exo-AuNCs (0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 mg/ml) 포함하는 신선한 배지로 옮겨 24 시간 동안 배양하였다. Exo-AuNCs의 농도는 Micro BCATM 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화된 엑소좀 농도를 기반으로 하였다. 이후, 20 μL의 MTT 용액 (5mg/mL)을 첨가하고 세포를 4 시간 동안 배양하였다. 마지막으로, 10 % SDS를 첨가하고 세포를 추가로 24 시간 동안 배양 하였다. 595 nm에서 생성된 흡광도 신호를 측정하여 세포 생존율(%)을 측정하였다. 상이한 농도 (0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 mg/mL)에서 청색 exo-AuNCs 및 적색 형광 exo-AuNCs를 사용하여 상이한 세포주에 처리하였다. 도 5A에서 볼 수 있듯이 최대 1mg/mL 농도의 청색 형광 exo-AuNCs는 세포 독성을 나타내지 않았다. 그러나 5mg/mL, 10mg/mL를 처리한 세포주 모두에서 독성이 있었다. 반대로, 최대 10mg/mL 농도의 적색 형광 exo-AuNCs는 세포 독성을 나타내지 않았다. 세 가지 세포 유형 모두 고농도에서 적색 형광 exo-AuNCs가 있을 때 더 잘 성장했으며, 오히려 이 화합물이 세포 성장에 유익한 영향을 미친 것으로 해석된다. 전반적으로, 적색 형광 exo-AuNCs는 세포에 대한 독성이 적고 우수한 생체 적합성을 나타냈다.
실시예 6. 청색 형광 exo―AuNCs 및 적색 형광 exo―AuNCs을 이용한 세포 이미징
본 발명자들은 적색 형광 exo-AuNCs를 사용하여 세포 이미징을 수행하였다. MCF-7, HeLa 및 HT29 세포를 검은색 96-웰 배양 플레이트 (웰당 1 x 104 세포)에 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. DPBS로 3회 세척하고 4 % 파라포름알데히드로 15분간 고정한 후, 세포를 exo-AuNCs (3.125 mg/mL)와 함께 6시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 DW로 3회 세척한 후, 세포를 DAF (500 μM)로 15분 동안 대조 염색하고 DW로 3회 세척하였다. 마지막으로 다음 조건에서 형광 현미경 (KI-2000F; Korea Lab Tech)을 사용하여 이미지를 얻었다. 필터 큐브 1 (여기: 330-385 nm; 장벽: 420 nm)을 사용하여 여기 및 발광 파장이 있는 exo-AuNCs를 이미지화 하였다. 각각 360 nm 및 670 nm; 필터 큐브 2 (여기: 450-480nm; 장벽: 515nm)를 사용하여 각각 460nm 및 520nm의 여기 및 발광 파장으로 DAF를 이미지화 하였다. 적색 형광 exo-AuNCs을 사용한 이유는 형광 특성과 생체 적합성이 청색 발광보다 우수하기 때문이다. 세포를 적색 형광 exo-AuNCs로 염색한 후, 세포막을 DAF로 대조 염색하였다. 세 종의 세포주 모두에서 적색 형광 exo-AuNCs는 밝은 적색으로 표시된 것처럼 핵을 효과적으로 염색하였다 (도 6). 이러한 결과는 양전하를 가진 형광 나노 물질이 세포 핵을 염색 할 수 있음을 보여주고 있다. 상기 실험 결과는 형광 exo-AuNCs가 새로운 바이오 이미징 프로브로 유용할 수 있음을 보여주고 있다.
엑소좀 템플릿을 사용하여 형광 AuNCs의 합성을위한 새로운 방법을 개발하였다. 바이오 마커 분석 또는 약물 전달에 초점을 맞춘 대부분의 엑소좀 관련 연구에서 사용되는 방법과 다릅니다. 반응 조건을 최적화하여 다양한 분석 도구를 사용하여 성공적으로 특성화 한 발광 파장이 각각 460nm 및 670nm 인 청색 (Au8NC) 및 적색 발광 (Au25NC) exo-AuNCs를 합성하는데 성공하였다. 특히, 형광 exo-AuNCs는 가혹한 실험 조건이나 독성 화학 물질없이 실온에서 엑소좀과 Au 이온의 혼합물을 간단히 배양하여 생산되었다. 또한, 적색 형광 exo-AuNCs는 큰 Stokes 이동을 보였고 세포 독성을 나타내지 않았으며 다양한 세포주에서 핵 염색에 성공적으로 사용되었습니다. 엑소좀의 수많은 고유 한 기능을 고려할 때 exo-AuNCs가 바이오 이미징을위한 다목적 플랫폼으로 사용할 수 있다. 또한 주사 전자 현미경, 에너지 분산 X 선 미세 분석, 나노 입자 추적 분석 및 X 선 광전자 분광법을 사용하여 AuNCs가 엑소좀에서 성공적으로 형성되었음을 입증하였다. 중요한 것은 적색 형광 exo-AuNCs이 청색 형광 exo-AuNCs보다 더 큰 Stokes 이동과 더 강한 형광 강도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 청색 형광 exo-AuNCs는 고농도 (≥5 mg/mL)에서 세포 독성 이었지만 청색 및 적색 형광 exo-AuNCs는 MCF-7, HeLa 및 HT29 세포와 호환되었다. 적색 형광 exo-AuNCs는 핵을 성공적으로 염색했으며 막 염색 염료와 호환되었다. 이것은 세포 이미징 응용을 위해 형광 나노 물질을 엑소좀을 이용해 합성하는 최초의 연구이다 엑소좀은 거의 모든 유형의 세포에서 분비되어 자연적으로 생성되기 때문에 제안 된 방법은 다목적 나노 물질의 저비용 생산을 위한 전략이 될 수 있다.

Claims (10)

  1. (i) 엑소좀을 준비하는 단계; 및
    (ii) 상기 엑소좀 및 금 이온 (Au ion) 염을 혼합하여 배양하는 단계;
    를 포함하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법으로서,
    상기 (ii) 단계에서 염산 및 수산화나트륨을 이용하여 pH 5.5 내지 pH 11.5의 조건에서 배양하면 460 nm에서 형광을 방출하는 청색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터가 합성되고,
    상기 (ii) 단계에서 수산화나트륨을 이용하여 pH 11 내지 pH 12의 조건에서 배양하면 670 nm에서 형광을 방출하는 적색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터가 합성되고,
    상기 금 이온 (Au ion) 염은 상기 엑소좀에 존재하는 단백질에 부착되고,
    상기 금 이온 염은 1.25 mM의 농도로 포함되는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 금 이온 염은 클로로(트리메틸포스핀)금(AuClP(CH3)3), 칼륨테트라클로로아우르산염(Ⅲ)(KAuCl4), 염화금산나트륨(NaAuCl4), 염화금산(HAuCl4), 브롬화금산나트륨(NaAuBr4), 염화금(AuCl), 염화금(III)(AuCl3) 또는 브롬화금(AuBr3)인, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 청색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터는 상기 (ii) 단계에서 1일 내지 5일 동안 배양하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 적색 형광 엑소좀-금 나노입자 클러스터는 상기 (ii) 단계에서 1시간 내지 48시간 동안 배양하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 엑소좀의 농도는 1 mg/ml 내지 15 mg/ml의 농도로 포함하는, 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 제조하는 방법.
  9. 제 1항의 방법으로 제조된, 엑소좀-금 나노입자 클러스터.
  10. 제 9항의 엑소좀-금 나노입자 클러스터를 포함하는, 세포 이미징용 조성물.
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